ES2299849T3 - Ensayos de dna-primasa basados en fluorescencia. - Google Patents

Ensayos de dna-primasa basados en fluorescencia. Download PDF

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Abstract

Un método para ensayar la actividad de DNA-primasa que comprende proporcionar una mezcla de reacción que comprende un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifosfatos; incubar la mezcla de reacción de tal modo que los trifosfatos se polimerizan para formar RNA; y detectar directamente el RNA con un marcador fluorescente que se fija al RNA, en donde el paso de detección no requiere paso adicional alguno de separación del producto RNA de la mezcla de reacción incubada.

Description

Ensayos de DNA-primasa basados en fluorescencia.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para ensayar la actividad de DNA-primasa y métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de DNA-primasa.
Antecedentes
La DNA-primasa (primasa) es una enzima que cataliza la síntesis de iniciadores de RNA cortos sobre un molde de DNA durante la replicación del DNA (Frick et al., 2001, Annu. Rev. Biochem., 70: 39-80). En la horquilla de replicación del DNA, el DNA bicatenario parental es desenrollado por la helicasa (DnaB). La DNA-primasa (DnaG) utiliza el DNA monocatenario como molde y NTPs como sustratos para sintetizar iniciadores de RNA. Estos iniciadores de RNA tienen típicamente una longitud de 10-12 nucleótidos, y son utilizados por la DNA-polimerasa para sintetizar la cadena complementaria del DNA parental. Experimentos in vitro han demostrado que la actividad de primasa es estimulada significativamente por la helicasa (Lu et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12902-12907). La helicasa no sólo aumenta la afinidad de fijación primasa-DNA, sino que estimula también la actividad catalítica de la primasa (Johnson et al., 2000, Biochemistry, 39: 736-744). Las funciones críticas de las primasas en los procesos de replicación del DNA hacen que estas enzimas sean dianas atractivas para intervención terapéutica en enfermedades infecciosas y cáncer.
En el área de las enfermedades infecciosas, la primasa constituye una diana antibiótica excelente para el desarrollo de compuestos antibióticos y productos farmacéuticos por varias razones: 1) la primasa juega papeles fundamentales en la replicación del DNA y es esencial en todas las bacterias; 2) existen diferencias estructurales importantes entre las primasas de mamífero y las bacterianas; y 3) está disponible información de estructura cristalina tridimensional (3-D) para muchas primasas bacterianas.
Los ensayos de la actividad de DNA-primasa son importantes para la identificación de compuestos que modulan la primasa y que pueden utilizarse para terapia. Se han descrito ensayos de actividad de DNA-primasa que están basados en la incorporación de nucleósido-trifosfatos marcados detectablemente en un producto de polimerización y/o inmovilización y detección subsiguiente de un producto de polimerización (Johnson et al., 2000, Biochem., 39: 736-744; Earnshaw & Pope, 2001, J. Biomol. Screen., 6: 39-46; Zhang et al., 2002, Anal. Biochem., 304: 174-179; Patente U.S. No. 6.043.038; Patente U.S. No. 6.096.499; WO 98/59044).
Sumario
La presente invención proporciona métodos para ensayar la actividad de DNA-primasa que comprenden poner en contacto un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifosfatos, polimerizar los trifosfatos para formar RNA, y detectar el RNA con un marcador fluorescente que fija el RNA, en donde el paso de detección no requiere pasos adicionales de separación del producto RNA de la mezcla de reacción incubada.
La invención proporciona también métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de DNA-primasa que comprenden poner en contacto un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifos-fatos, con un compuesto de ensayo, polimerizar los trifosfatos para formar RNA, fijar un marcador fluorescente al RNA, y detectar una señal fluorescente de tal modo que se detecte directamente el RNA, en donde el paso de detección no requiere paso adicional alguno de separación del producto RNA de la mezcla de reacción incubada y en donde un cambio en la señal fluorescente en presencia del compuesto en comparación con la señal fluorescente en ausencia del compuesto indica que el compuesto modula la actividad de DNA-primasa.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico de líneas que representa la relación lineal entre la señal fluorescente y la concentración de RNA.
La Figura 2 es un gráfico de líneas que representa la linealidad de la actividad de primasa (fluorescencia) con el tiempo.
La Figura 3 es un gráfico de líneas que representa la linealidad entre la velocidad de reacción de la primasa y la concentración de primasa.
La Figura 4 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración de helicasa sobre la actividad de primasa.
La Figura 5 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración del molde de DNA sobre la actividad de primasa.
La Figura 6 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración de NTP sobre la actividad de primasa.
La Figura 7 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración de magnesio sobre la actividad de primasa.
La Figura 8 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración de NaCl sobre la actividad de primasa, en presencia y en ausencia de NTPs.
La Figura 9 es un gráfico de barras que representa el efecto de la composición de sales sobre la actividad de primasa. "-NTP" representa el control en el cual no se añade cantidad alguna de NTP. "+NTP" indica que se añadieron NTPs a la reacción. A, no se añadió sal adicional alguna; B, cloruro de amonio; C, sulfato de amonio; D, sulfato de sodio; E, cloruro de potasio; F, acetato de sodio; G, cloruro de calcio.
La Figura 10 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la concentración de DMSO sobre la actividad de primasa.
La Figura 11 es un gráfico que representa el efecto del pH sobre la actividad de primasa.
La Figura 12 es un gráfico de líneas que representa el efecto de la temperatura sobre la actividad de primasa.
La Figura 13 es un gráfico de barras que representa el efecto de los ciclos congelación-descongelación sobre la actividad de primasa (DnaG) y la actividad de helicasa (DnaB).
La Figura 14 es un gráfico de líneas que representa el efecto de las condiciones de almacenamiento (en hielo o a la temperatura ambiente) sobre la actividad de primasa.
La Figura 15 es un gráfico de líneas que representa la inhibición de la actividad de primasa por ddATP.
La Figura 16 es una imagen de un gel teñido con SYBR Green II de productos de reacción de primasa sometidos a electroforesis.
Descripción detallada
La presente invención proporciona métodos para ensayar la actividad de DNA-primasas, y métodos para cribado a fin de seleccionar compuestos que modulen la actividad de las DNA-primasas. La presente invención está basada en parte en el descubrimiento realizado por los autores de la invención de que pueden utilizarse eficazmente marcadores fluorescentes para monitorizar la actividad de DNA-primasa por detección del producto RNA.
Los ensayos de la presente invención están basados en la interacción entre RNA y un reactivo fluorescente que genera una señal fluorescente. Se ha encontrado que existe una relación lineal entre la señal fluorescente y la concentración de RNA sintetizado por la DNA-primasa incluso en presencia del molde de DNA (Figura 1). Así pues, no es necesario separar el molde o aislar el producto RNA. Este descubrimiento puede utilizarse en ensayos de actividad de DNA-primasa, por la medida directa de la formación de RNA, y en ensayos para identificar compuestos que modulen estas enzimas.
Los ensayos de la presente invención aprovechan la característica de que únicamente el producto polinucleótido polimerizado genera una señal fluorescente, mientras que los NTPs sustrato libres (no incorporados) no lo hacen. Por esta razón, los ensayos basados en fluorescencia de la presente invención no requieren procedimientos adicionales para separar el producto RNA de los NTPs sustrato. Los ensayos de la presente invención no requieren el uso de una fase sólida o procedimiento de separación, no requieren acoplamiento a reacciones enzimáticas o inmunológicas, y no requieren paso alguno de inmovilización. Dado que los ensayos basados en fluorescencia de la presente invención no dependen de interacciones complicadas de interfases o funciones de proteínas acopladas, proporcionan una medida muy específica de la actividad de la DNA-primasa.
Los ensayos de la presente invención son aplicables a formatos de cribado de alta potencia (HTS).
Las RNA-polimerasas constituyen una variedad de enzimas que tienen funciones y propiedades similares, en particular, la capacidad para sintetizar RNA. Las DNA-primasas representan una clase de RNA-polimerasa.
Un aspecto de la presente invención se refiere a métodos para ensayar la actividad de DNA-primasa. Estos ensayos pueden utilizarse para investigar o monitorizar la actividad enzimática, para detectar la actividad enzimática en una muestra, y para la evaluación de la calidad o aptitud del molde de ácido nucleico para soportar la actividad enzimática.
Los ensayos de actividad de DNA-primasa comprenden combinar un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifosfatos, en condiciones en las cuales la RNA-polimerasa o DNA-primasa es catalíticamente activa y polimeriza los trifosfatos para formar RNA. El RNA se pone en contacto con un marcador fluorescente que se fija al RNA, y se detecta una señal fluorescente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para cribado a fin de seleccionar moduladores de actividad de DNA-primasa. Los ensayos de cribado de moduladores comprenden combinar, en presencia y en ausencia de un compuesto de ensayo, un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa y ribonucleósido-trifosfatos en condiciones en las cuales la RNA-polimerasa o la DNA-primasa es catalíticamente activa y polimeriza los trifosfatos para formar RNA. El RNA se pone en contacto con un marcador fluorescente que se fija al RNA, y se detecta una señal fluorescente. La señal fluorescente detectada en presencia del compuesto de ensayo se compara con la señal fluorescente detectada en ausencia del compuesto de ensayo. Un cambio o alteración en la señal fluorescente detectada en presencia del compuesto en comparación con la señal fluorescente detectada en ausencia del compuesto es indicativo de un compuesto que modula la actividad de DNA-primasa.
Como se utiliza en esta memoria, los términos "modular" o "modula" en referencia a la actividad de DNA-primasa incluyen cualquier alteración medible, sea una inhibición o un aumento, de la actividad de DNA-primasa.
Cualquier DNA-primasa puede utilizarse en los ensayos de la presente invención. Se han identificado primasas en procariotas, con inclusión de bacterias, bacteriófagos, eucariotas, y virus de eucariotas.
Se conocen muchas secuencias de nucleótidos y aminoácidos de primasas bacterianas, que incluyen Bacillus subtilis (X03897), Clostridium acetobutylicum (Z23080), Escherichia coli (J01687), Haemophilus influenzae (L11044), Helicobacter pylori (AE000523), Lactococcus lactis (D10168), Legionella pneumophila (U63641), Listeria monocytogenes (U13165), Myxococcus xanthus (U20669), Mycoplasm genitalium (U39703), Mycoplasma pneumoniae
(1674174), Mycobacterium tuberculosis (Z83860), Pseudomonas putida (U85774), Rickettsia prowazekii (M95860), Salmonella typhimurium (M14427), Staphylococcus aureus (AB001896), Synechococcus elongatus (PCC7942), Cyanobacteria chroococcales (X94247), Synechocystis sp. (D90912), Cyanobacteria chroococcales (D90912).Primasas bacterianas adicionales para las cuales se conocen secuencias de nucleótidos y aminoácidos incluyen Aquifex aeolicus (AE000743), Bacillus stearothermophilus (AF106033), Borrelia burgdorferi (AE001171), Buchnera aphidicola (P32000), Campylobacter jejuni (CAB73626), Chlamydia trachomatis (3329259), Chlamydophila pneumoniae (AE001674), Deinococcus radiodurans (AAF10180), Mycobacterium smegmatis (AF027507), Neisseria meningitidis (CABS4964), Streptomyces coelicolorA3(2) (CAB51551), Thermotoga maritima (AAD36520), Treponema pallidum (3322781).
Primasas de bacteriófagos para las cuales se conocen secuencias de nucleótidos y aminoácidos incluyen, por ejemplo, T7 (proteína del gen 4) (P03692), T3 (proteína del gen 4) (P20315), P4 (proteína \alpha) (PRBPP4), y T4 (proteína del gen 41) (ADD42502).
El virus del Herpex simples tipo 1 es el prototipo para la familia de herpesvirus. Las proteínas UL5, UL8, y UL52 componen la enzima primasa/helicasa heterotrímera de este virus. Las primasas UL52 de herpesvirus incluyen Humana tipo 1, alfaherpesvirus (Acc# P10236), Equino tipo 1, alfaherpesvirus (Acc#M 86664:7064..10301), alfaherpesvirus Equino tipo 4 (Acc# AF030027:6658..9900), alfaherpesvirus Bovino tipo 1 (Acc#AJ004801: 4013..7237), alfaherpesvirus Humano tipo 3 (= virus zóster de la varicela) (Acc# P09270), alfaherpesvirus de la Pseudorrabia tipo 1 = alfaherpesvirus de los suidos (Acc#X-87246:1087..3963), betaherpesvirus humano tipo 7 (Acc# AF037218:68725..71310), betaherpesvirus humano tipo 6 (Acc# P52540), betaherpesvirus equino tipo 2 (Acc# S55651), gammaherpesvirus Saimiriína tipo 2 (Acc# M86409:6378..8885), gammaherpesvirus humano tipo 8 = herpesvirus de Kaposi (Acc# U93872:79735..82266), gammaherpesvirus Wildebeest tipo 1 = herpesvirus Alcelaphine (Acc #AF005370:81523..
54336), gammaherpesvirus humano tipo 4 = virus Epstein-Barr (Acc # P03193), betaherpesvirus del citomegalovirus humano (Acc# P17149), betaherpesvirus del citomegalovirus de ratón (Acc #L07319:3153..6047).
La actividad de primasas eucariotas está asociada típicamente con dos tipos de complejos multímeros. Las primasas implicadas en la replicación del DNA se encuentran generalmente en un complejo con DNA-polimerasa \alpha; estos complejos incluyen típicamente dos subunidades de primasa (Pri1 (49 kDa) y Pri2 (58 kDa)), así como DNA-polimerasa \alpha y una subunidad p70-90. La actividad de primasa se encuentra también como un heterodímero que está constituido por las subunidades Pri1 y Pri2. El sitio activo para la elongación del polímero de RNA se encuentra en la subunidad Pri1, en tanto que la iniciación implica generalmente la subunidad Pri2. Se han caracterizado secuencias de aminoácidos y nucleótidos para varias subunidades Pri1 de primasas eucariotas, que incluyen humanas (Acceso a Swissprot No. P49642, Genbank X74330), Mus musculus (GenBank J04620), Rattus norvegicus PID:g1763025, Drosophila melanogaster p50 (PID:g666989), Caenorhabditis elegans p48 (SP: P34471), Saccharomyces cerevisiae p48 (SP:P10363), Schizosaccharomyces pombe p53(Acc# Z98531: 22398... 23846), Plasmodium falciparum p53 (Acc# X99254:486 ... 3750). Arqueobacterias que tienen primasas que son similares a la Pri1 eucariota incluyen Methanococcus jannaschii (Acc# Q58249), Archaeoglobus fulgidus (Acc# AE001054:8352 ... 9434), y Methanobacterium thermoautotrophicum (Acc# AE000840:7684 ... 8655). Se han secuenciado primasas Pri2 a partir de Acc# P49643 humano, Mus musculus Acc #S45629, Caenorhabditis elegans (Acc #Z81137), Saccharomyces cerevisiae (Acc #P20457) y la planta Arabidopsis thaliana (Acc #AC002130:39565..46348).
La DNA-primasa puede obtenerse para uso en la presente invención de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. La DNA-primasa puede obtenerse por aislamiento o purificación a partir de fuentes naturales o puede expresarse utilizando tecnología recombinante. La primasa puede expresarse como una proteína diana simple o co-expresarse con otras proteínas. La primasa puede expresarse con o sin etiquetas peptídicas o proteínas de fusión. La primasa puede aislarse como un extracto de células, prepararse en forma sustancialmente pura como una proteína simple, o prepararse como un complejo proteínico. Se han descrito en la bibliografía numerosas técnicas para obtención de proteínas DNA-primasa, con inclusión de proteínas DNA-primasa bacterianas. Pueden utilizarse también en los ensayos de la presente invención porciones o fragmentos catalíticamente activos de DNA-primasa. Por ejemplo, el dominio catalítico de DNA-primasa de E. coli se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 111H-433K, el dominio catalítico para la DNA-primasa de H. influenzae se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 115T-434K, y el dominio catalítico para la DNA-primasa de S. pneumoniae se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 105S-455T).
Los ensayos de la presente invención se conducen en condiciones tales que la DNA-primasa es catalíticamente activa. Estas son condiciones en las cuales la DNA-primasa es capaz de polimerizar los ribonucleósido-trifosfatos del sustrato para formar RNA. Tales condiciones son conocidas por los expertos en la técnica. Pueden utilizarse una gran diversidad de condiciones de incubación, dependiendo de la enzima utilizada. Las condiciones de reacción en las cuales la DNA-primasa es activa in vitro se ilustran a continuación y/o son por lo demás conocidas en la técnica.
Los ensayos de la presente invención pueden realizarse en diferentes formatos.
En algunas realizaciones, se utiliza un formato de selección de alta capacidad (HTS). El formato HTS puede ejecutarse a temperaturas diferentes, pero es importante mantener una temperatura constante para la reacción y los controles. En algunas realizaciones, se utiliza la temperatura ambiente.
En algunas realizaciones, se utiliza un formato HTS y la reacción de la primasa se lleva a cabo en una placa de ensayo HTS en presencia de helicasa. En tales formatos, se utilizan concentraciones de DNA molde relativamente bajas. En los ensayos en que se seleccionan moduladores de primasa en un formato HTS en presencia de helicasa, los aciertos obtenidos del ensayo pueden incluir compuestos que interaccionan directamente con la primasa y aquéllos que modulan la actividad de primasa por interacciones con helicasa.
En algunas realizaciones de la presente invención, una premezcla que contiene DNA-primasa, helicasa, un molde de DNA, y el tampón de reacción se prepara para uso en formatos HTS de los ensayos. Se recomienda preparar la premezcla reciente para cada operación de HTS. Para almacenamiento a corto plazo, la premezcla debe guardarse en hielo.
En algunas realizaciones, se utiliza un formato HTS y la reacción de la primasa se lleva a cabo en una placa de ensayo HTS en ausencia de helicasa. En tales formatos, se utilizan concentraciones de DNA iniciador relativamente altas.
En algunas realizaciones de la presente invención, se utilizan formatos distintos de HTS.
Se describe también que el producto de la reacción de la primasa se aísla o se separa del molde de DNA antes de la detección. El molde de DNA puede retirarse por muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin carácter limitante, electroforesis, cromatografía o la utilización de reacciones enzimáticas. El aislamiento del producto RNA es útil para caracterizar la reacción de la primasa.
En los ensayos de la presente invención, el RNA se detecta utilizando un marcador fluorescente que se fija al RNA. En algunas realizaciones, la detección se realiza por medida de la intensidad de la fluorescencia generada por la interacción del marcador fluorescente y el RNA.
Cualquier tinte o marcador fluorescente que interaccione con RNA puede utilizarse en los ensayos de la presente invención. Tintes fluorescentes disponibles comercialmente pueden encontrarse en un catálogo de Molecular Probes. Por ejemplo, pueden utilizarse RiboGreen, SYBR Green II, y YO-Pro-1, para detectar moléculas de RNA. El reactivo fluorescente SYBR Green II es aproximadamente cuatro veces más sensible a RNA que a DNA. Adicionalmente, el fondo fluorescente debido al DNA puede sustraerse del ensayo. Pueden detectarse señales e intensidad de fluorescencia con lectores o escáneres de fluorescencia estándar conocidos en la técnica. El tinte o marcador fluorescente puede incluirse durante la reacción enzimática (síntesis de RNA) o puede añadirse después. En el caso en que el tinte o marcador se añade después de la reacción enzimática, no es necesaria incubación posterior.
Los ensayos de la presente invención utilizan ácidos nucleicos como moldes para la DNA-primasa. La DNA-primasa utiliza un molde de ácido nucleico y sintetiza un iniciador de RNA complementario. Moldes de cualquier secuencia que proporcione un sustrato al cual pueda fijarse la primasa, pueden utilizarse en los ensayos de la presente invención.
El molde de ácido nucleico utilizado en los ensayos de primasa de la invención pueden ser lineal o circular, DNA parcial o totalmente bicatenario, dependiendo de la fuente, la conveniencia, y la especificidad de la DNA-primasa diana. Si bien en realizaciones particulares, el material del molde es DNA, pueden emplearse en su sustitución otros ácidos nucleicos o análogos estructurales con tal que los mismos proporcionen un sustrato activo para la actividad de la DNA-primasa diana. Los moldes de ácido nucleico pueden ser de cualquier longitud suficiente para proporcionar un sustrato para la primasa, un molde para uno o más iniciadores nacientes detectables por el ensayo, y que es por lo demás aplicable a las condiciones y los requerimientos del ensayo. Los moldes de ácido nucleico pueden estar marcados o no marcados, modificados o no modificados.
En algunas realizaciones, se utilizan los moldes de ácido nucleico siguientes:
5'-(CT)_{17}GCAAAGC-3'
(SEQ ID NO: 1)
5'-(CT)_{16}GCAAAGC-3'
(SEQ ID NO: 2)
5'-(CT)_{16}ACC(CT)_{3}-3'
(SEQ ID NO: 3)
5'-(CT)_{16}GAAAATC-3'
(SEQ ID NO: 4)
5'-(CT)_{16}GTAAAAC-3'
(SEQ ID NO: 5)
5'-(CT)_{16}GGAAACC-3'
(SEQ ID NO: 6)
5'-(CT)_{16}AGT(CT)_{3}-3'
(SEQ ID NO: 7)
5'-(CT)_{16}CCAAAGG-3'
(SEQ ID NO: 8)
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, el molde de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8 se utiliza en ensayos de DNA-primasa de E. coli.
En algunas realizaciones, se utiliza el molde de ácido nucleido de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7 en ensayos de DNA-primasa de S. aureus.
En algunas realizaciones, se utiliza el molde de ácido nucleido de SEQ ID NO: 3 en ensayos de DNA-primasa de S. pneumoniae.
En algunas realizaciones, se utiliza el molde de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 4, 5, ó 6 en ensayos de DNA-primasa de H. influenzae.
Pueden proporcionarse moldes de DNA para uso en los ensayos de la presente invención de acuerdo con muchos métodos conocidos en la técnica, que incluyen síntesis química o enzimática, y aislamiento a partir de células.
Los ensayos de la presente invención pueden realizarse opcionalmente en presencia de proteínas replisoma tales como helicasa, proteína de fijación de DNA monocatenario, o DNA-polimerasa. En algunas realizaciones, se incluye helicasa en la mezcla de reacción. Aunque DnaB estimula la actividad de primasa, DnaB no es un componente esencial en la reacción de la primasa. El ensayo basado en fluorescencia no depende de la presencia de DnaB. En algunas realizaciones, se incluye DnaB (helicasa de E. coli) en la mezcla de reacción para estimular la actividad de primasa.
Los nucleósido-trifosfatos utilizados en los ensayos de la presente invención pueden encontrarse en formas modificadas o no modificadas que incluyen, pero sin carácter limitante, formas marcadas radiactivamente o marcadas por fluorescencia, o modificadas para propósitos de actividad o detección.
La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes, que tienen por objeto explicar varias realizaciones de la invención. Estos ejemplos no pretenden ser, ni deben interpretarse como, limitantes del alcance de la invención. Estará claro que la invención puede practicarse de manera distinta que la descrita particularmente en esta memoria.
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Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo HTS de DNA-primasa de E. coli basado en fluorescencia en presencia de helicasa
La reacción se llevó a cabo en una placa negra Costar de 384 pocillos. El volumen de reacción era 30 \mul. Las concentraciones finales en la reacción eran Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, Mg(OAc)_{2} 10 mM, DTT 10 mM, glutamato de potasio 25 mM, Brij-35 al 0,003%, DNA 200 nM, helicasa 25 nM, DNA-primasa de E. coli 75 nM, ATP 200 \muM y GTP 200 \muM. Para realizar el ensayo HTS, se incubaron 2 \mul de solución compuesto/DMSO o solución acuosa de DMSO con 23 \mul de una premezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 15 min. La premezcla de reacción era una solución de reacción concentrada 1,3 x sin NTPs. Después de la incubación, se añadieron 5 \mul de una solución sustrato con ATP 1,2 mM y GTP 1,2 mM para iniciar la reacción. La reacción se incubó a la temperatura ambiente durante 40 min. Se añadieron luego 25 \mul de una solución 30 X SYBR Green II con NaCl 1,2M y se midió la fluorescencia (excitación a 485 nm, emisión a 535 nm).
Ejemplo 2 Linealidad con el tiempo y la concentración de DNA primasa de E. coli
La reacción era lineal con el tiempo hasta que la relación de señal a ruido alcanzó 3,5-4,0. Más allá de dicho punto, la concentración de DNA libre era demasiado baja y se perdía la linealidad de la reacción. La escasez de NTPs tenía también un efecto sobre la linealidad de la reacción. En las condiciones de la reacción HTS, el intervalo de tiempo lineal era aproximadamente 40 min, y la relación de señal a ruido era aproximadamente 3 (Figura 2).
La linealidad entre la intensidad de fluorescencia y la concentración de primasa se muestra en la Figura 3. Una concentración de primasa mayor limitaba la linealidad de la reacción a un periodo de tiempo más corto. Cuando la concentración de primasa era aproximadamente 25 nM o menor, la señal de la reacción era insignificante dentro de 40 min.
Ejemplo 3 Dependencia de la concentración de helicasa de la actividad de DNA-primasa de E. coli
En ausencia de helicasa, la actividad de primasa era insignificante a concentraciones de DNA de 200 nM o menores. La actividad de primasa alcanzaba un máximo cuando la concentración de helicasa hexámera era aproximadamente 35 a aproximadamente 40 nM (Figura 4). Las concentraciones de helicasa mayores que 25-30 nM daban como resultado una reacción no lineal dentro de 40 min. Adicionalmente, las concentraciones altas de helicasa consumían rápidamente los NTPs.
Ejemplo 4 Dependencia de la concentración de DNA y NTP de la actividad de DNA-primasa de E. coli
Se utilizó DNA 7 (5'-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGCAAAGC-3' (SEQ ID NO: 1)) como el DNA molde en el ensayo de la DNA-primasa de E. coli. La velocidad de reacción de la primasa alcanzaba un máximo cuando la concentración de DNA era aproximadamente 300 nM. El valor K_{m} aparente para el DNA era
105 nM (Figura 5). La concentración de DNA en el ensayo HTS era 200 nM.
Los NTPs no sólo son utilizados por la primasa para sintetizar el RNA, sino que son hidrolizados también por la helicasa. En las condiciones de la reacción HTS, la helicasa 25 nM hidrolizaba los NTPs a una velocidad de
4,8 \muM/min. La Figura 6 muestra la dependencia de la velocidad inicial de la reacción de la primasa sobre la concentración total de NTP. El valor K_{m} aparente para NTP era 71 \muM. La concentración de NTP en el ensayo HTS era
200 \muM.
Ejemplo 5 Efecto de la concentración de magnesio sobre la actividad de DNA-primasa de E. coli
Como se muestra en la Figura 7, la concentración óptima de cloruro de magnesio en las condiciones del ensayo HTS era aproximadamente 10 a aproximadamente 15 mM. Una concentración mayor de magnesio inhibía la actividad de la primasa.
Ejemplo 6 Efecto de la concentración de sal/iónica sobre la actividad de DNA-primasa de E. coli
La actividad de la primasa era inhibida significativamente por altas concentraciones de sal (Figura 8). Por ejemplo, NaCl o KCl 50 mM inhibían aproximadamente el 50% de la actividad de la primasa. Cuando la concentración de NaCl era 200 mM o mayor, la actividad de primasa era insignificante. En el intervalo de concentración baja de sal, NaCl
0-5 mM, la reactividad de primasa era estable. La composición de sal afectaba también a la actividad enzimática, como se muestra en la Figura 9.
Ejemplo 7 Tolerancia al DMSO de la actividad de DNA-primasa de E. coli
La actividad de primasa no se veía afectada significativamente por DMSO a concentraciones de aproximadamente 0 a aproximadamente 2%, como se muestra en la Figura 10. DMSO a concentraciones de aproximadamente 0 a aproximadamente 2% no interferían tampoco con la interacción entre RNA y SYBR Green II.
Ejemplo 8 Dependencia del pH de la actividad de DNA-primasa de E. coli
El pH óptimo para la actividad de primasa era 7,5-8. Aunque la elección de tampones afectaba en cierto grado a la actividad enzimática, se observó que, por lo general, un pH mayor que 8,5 reducía la actividad enzimática y un pH inferior a 6 la anulaba prácticamente (Figura 11).
Ejemplo 9 Dependencia de la temperatura de la actividad de DNA-primasa de E. coli
La reacción de la primasa alcanzaba una tasa máxima a temperaturas próximas a 15ºC (Figura 12).
Ejemplo 10 Estabilidad enzimática de la DNA-primasa de E. coli
La primasa y la helicasa purificadas eran estables después de ciclos repetidos de congelación-descongelación, como se muestra en la Figura 13. Para comprobar la estabilidad de la premezcla que contenía primasa, helicasa, DNA y el tampón de reacción, la solución se incubó en hielo o a la temperatura ambiente (22,5ºC) durante periodos de tiempo diferentes, y se añadieron luego los NTPs para iniciar las reacciones. Los resultados (Figura 14) muestran que la actividad de primasa disminuía a una tasa de aproximadamente 1,7% por hora en hielo y una tasa de aproximadamente 3,5% por hora a temperatura ambiente.
Ejemplo 11 Validación del ensayo HTS
Utilizando un robot MultiMek 96 para la adición de los reactivos en las placas Costar de 384 pocillos, se obtuvieron tamaños de ventana comprendidos entre 10 y 15. La desviación inter-placas era aproximadamente 3%.
Ejemplo 12 CI_{50} de ddATP sobre la actividad de DNA primasa de E. coli
Se utilizó un didesoxi-NTP como control de inhibidor positivo para la reacción de la primasa. La Figura 15 muestra una medida de CI_{50} de la inhibición por ddATP. Dado que ddATP compite con NTP (en este caso, ATP) en la reacción de la primasa, el valor CI_{50} era dependiente de la concentración de sustrato (ATP). En las condiciones HTS utilizadas, el valor CI_{50} de ddATP era 10 \muM.
Ejemplo 13 Ensayo de formato no-HTS con DNA-primasa de E. coli
En este formato, el producto de reacción se aisló del molde de DNA antes de la detección. La solución de reacción de primasa, con molde de DNA 2 \muM, se cargó en un gel de poliacrilamida. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con una solución de SYBR Green II (Figura 16). El producto primasa formaba dúplex RNA-DNA en condiciones no desnaturalizantes, y se separaba del molde de DNA libre. El rendimiento de la reacción de primasa se calculó a partir de densidad de las bandas.
Ejemplo 14 Medida de la actividad del dominio catalítico de DNA-primasa. Clonación de los dominios catalíticos de DNA-primasa
Dominios catalíticos de DNA-primasa de E. coli (que codificaban los residuos de aminoácidos 111H-433K), H. influenzae (que codificaban los residuos de aminoácidos 115T-434K) y S. pneumoniae (que codificaban los residuos de aminoácidos 105S-455T) se clonaron, se expresaron en E. coli y se purificaron por columnas cromatográficas de intercambio iónico y de afinidad.
Dominio catalítico de DNA-primasa de E. coli
La mezcla de reacción de primasa estaba compuesta de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, KGlu 100 mM, Mg(OAc)_{2}
10 mM, DTT 10 mM, Brij-35 al 0,005%, glicerol al 10%, DNA-molde 2 \muM, ATP 100 \muM, GTP 100 \muM, dominio de primasa de E. coli 1 \muM. La reacción se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante 30 min, o se realizó un experimento de evolución temporal para observar la dependencia respecto al tiempo. Para determinar el nivel de RNA, se mezclaron 30 \mul de la mezcla de reacción con 30 \mul de SYBR II 30x y se midió la fluorescencia, o bien se cargó la mezcla de reacción (15 \mul) en un gel de TBE y se tiñó el gel con 1x SYBR II después de la electroforesis.
Dominio de primasa de S. pneumoniae
La mezcla de reacción de primasa estaba compuesta de MES 10 mM, pH 6,5, NH_{4}Cl 125 mM, Mg(OAc)_{2}
10 mM, CaCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, Brij-35 al 0,003%, molde de DNA 1 \muM, ATP 200 \muM, GTP 200 \muM, y dominio de primasa de S. pneumoniae 0,5 \muM. La reacción se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante 30 min, o se realizó un experimento de evolución temporal para observar la dependencia respecto al tiempo. Para determinar el nivel de RNA, se mezclaron 30 \mul de la mezcla de reacción con 30 \mul de SYBR II 30x y se midió la fluorescencia, o bien se cargó la mezcla de reacción (15 \mul) en un gel de TBE y se tiñó el gel con 1x SYBR II después de la electroforesis.
Dominio de la primasa de H. influenzae
La mezcla de reacción de primasa se componía de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NH_{4}Cl 125 mM, Mg(OAc)_{2} 10 mM, CaCl_{2} 5 mM, DTT 1 mM, Brij-35 al 0,003%, molde de DNA 2 \muM, ATP 200 \muM, GTP 200 \muM, dominio de primasa de H. influenzae 0,2 \muM. La reacción se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante 30 minutos, o se realizó un experimento de evolución temporal para observar la dependencia respecto al tiempo. Para determinar el nivel de RNA, se mezclaron 30 \mul de la mezcla de reacción con 30 \mul de SYBR II 30x y se midió la fluorescencia, o bien se cargó la mezcla de reacción (15 \mul) en un gel de TBE y se tiñó el gel con 1x SYBR II después de la electroforesis.
Los ejemplos que anteceden tienen por objeto ilustrar la invención y no deben interpretarse como limitantes de la invención en modo alguno.
<110> Astrazeneca AB
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<120> Ensayos de DNA-Primasa Basados en Fluorescencia
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<130> 100998-1 WO
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<140> PCT/US 04/016376
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<141> 2004-05-22
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<150> US 60/472, 967
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<151> 2003-05-23
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<160> 8
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 41
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Molde de DNA-primasa
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Claims (10)

1. Un método para ensayar la actividad de DNA-primasa que comprende
proporcionar una mezcla de reacción que comprende un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifosfatos;
incubar la mezcla de reacción de tal modo que los trifosfatos se polimerizan para formar RNA; y
detectar directamente el RNA con un marcador fluorescente que se fija al RNA, en donde el paso de detección no requiere paso adicional alguno de separación del producto RNA de la mezcla de reacción incubada.
2. Un método para identificar compuestos que modulan la actividad de DNA-primasa que comprende
poner en contacto un molde de ácido nucleico, una DNA-primasa, y ribonucleósido-trifosfatos, con al menos un compuesto de ensayo;
polimerizar los trifosfatos para formar RNA;
fijar un marcador fluorescente al RNA; y
detectar una señal fluorescente de tal modo que el RNA se detecta directamente, en donde el paso de detección no requiere paso adicional alguno de separación del producto RNA de la mezcla de reacción incubada y en donde un cambio en la señal fluorescente en presencia de dicho compuesto en comparación con la señal fluorescente en ausencia de dicho compuesto indica que dicho compuesto modula la actividad de DNA-primasa.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el marcador fluorescente se añade antes de la polimerización.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el marcador fluorescente se añade después de la polimerización.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la DNA-primasa es bacteriana.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la DNA-primasa se selecciona de DNA-primasa de E. coli, DNA-primasa de S. aureus, DNA-primasa de S. pneumoniae, y DNA-primasa de H. influenzae.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el marcador fluorescente se selecciona de SYBR Green II, RiboGreen, y YO-PRO-1.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el molde de ácido nucleico se selecciona de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, y SEQ ID NO: 8.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el ensayo se realiza en presencia de helicasa.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la detección se realiza por medida de la intensidad de fluorescencia.
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