ES2294804T3 - Antibioticos sinteticos. - Google Patents

Abstract

LAS COMPOSICIONES DE LA PRESENTE INVENCION ESTAN DESTINADAS A INHIBIR LA PROLIFERACION DE MICROORGANISMOS, ESPECIALMENTE HONGOS. DICHAS COMPOSICIONES ESTAN COMPUESTAS DE ANTIBIOTICOS SINTETIZADOS QUIMICAMENTE QUE COMPRENDEN CIERTOS ACIDOS AMINADOS. SE DESCRIBEN TAMBIEN UNOS PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION DE COMPOSICIONES DE ANTIBIOTICOS ESPECIFICOS PROCEDENTES DE BIBLIOTECAS QUE COMPRENDEN DICHAS COMPOSICIONES, ASI COMO PROCEDIMIENTOS DE PREVENCION DE LA PROLIFERACION MICROBIANA EN LAS PLANTAS Y EN LOS ANIMALES.

Description

Antibióticos sintéticos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones químicas sintéticas y a procedimientos de ensayo de dichas composiciones para determinar qué composiciones inhiben el crecimiento fúngico. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para prevenir, limitar o de otra manera tratar los daños fúngicos a los cultivos agrícolas y hortícolas, particularmente a semillas y productos agrícolas, incluyendo plantas maduras, tales como árboles. Ciertas composiciones y procedimientos de la invención pueden utilizarse para tratar enfermedades fúngicas no vegetales, tales como las de animales, incluyendo el ser humano. Las composiciones de la invención resultan especialmente útiles en el caso de condiciones que propician el desarrollo de enfermedad fúngica y en las que el control del crecimiento fúngico se consigue preferentemente con composiciones que no son tóxicas para las células no fúngicas.

Descripción de la técnica relacionada

Un problema común en la agricultura es la reducción del rendimiento y la pérdida de la cosecha causada por microorganismos patogénicos de las plantas. Por ejemplo, en Texas, las enfermedades del arroz, soja y algodón causadas por microorganismos patogénicos de plantas se estima que redujeron las producción del Estado en 15%, 13% y 27% en 1992, respectivamente. Además de las pérdidas de cultivos extensivos, también se producen pérdidas por enfermedad en plantas hortícolas y plantas silvícolas. La contaminación por hongos posterior a la recolección también puede conducir a la reducción del rendimiento y de los valores posteriores a la recolección del producto vegetal. Entre las estrategias actuales para el control de enfermedades se incluyen la plantación de cultivares resistentes y la utilización pesticidas y fungicidas conocidos.

Por desgracia, muchos de los compuestos químicos antifúngicos más efectivos muestran una persistencia no deseable en el medio ambiente. En otros casos, dichos compuestos químicos presentan una especificidad reducida para el organismo diana. En el caso de que resulten afectados organismos no diana por dichos compuestos químicos de especificidad reducida, no resulta infrecuente observar actividad biológica no deseada, incluyendo toxicidad humana (teratogenicidad, mutagenicidad, carcinogenicidad, etc.). La preocupación pública sobre la utilización de productos químicos externos en el medio ambiente proporciona un potente incentivo para el desarrollo de procedimientos alternativos de control de los hongos.

Entre las infecciones fúngicas agrícolas se incluyen enfermedades tanto vasculares como no vasculares. En el caso de las enfermedades no vasculares, pueden producirse condiciones tales como la peste de los semilleros y la podredumbre de las raíces. La peste de los semilleros (un síntomas de ataque patogénico del tejido de las semillas, por ejemplo de ataque fúngico) se produce como resultado del daño a las semillas y raíces de las plántulas durante la germinación, antes o después de la emergencia del suelo. Las semillas que experimentan peste de los semilleros no consiguen germinar, se ablandan, se encogen y finalmente se desintegran. La podredumbre de las raíces postemergencia debida a la infección por patógenos del tejido de la planta también es responsable de grandes reducciones de viabilidad de las plantas cultivadas.

Se ha intentado controlar la peste de los semilleros y la podredumbre de las raíces mediante la cría de plantas resistentes, con éxito variable. Sin embargo, no se han desarrollado cultivares completamente resistentes y las enfermedades microbianas siguen siendo una causa importante de pérdida de cosecha. Esta pérdida resulta especialmente evidente en los ambientes de crecimiento húmedos, o donde se planta repetidamente en las mismas parcelas. Algunas prácticas culturales mejoradas, aunque de algún valor, de manera similar no consiguen proporcionar una mejora suficiente.

Por ejemplo, los plátanos (familia Musaceae) son el fruto tropical más importante del mundo, con una producción anual superior a 62 millones de toneladas (si se incluye el plátano macho). Para el crecimiento adecuado de estas hierbas perennes de gran tamaño, se requiere una humedad elevada constante y temperatura tropical (16ºC a 35ºC). Estas mismas condiciones también resultan altamente conducentes a enfermedades importantes, tales como la enfermedad de banana-panama, enfermedad Sigatoka, raya negra de la hoja/Sigatoka negra, enfermedad Moko, enfermedad de la cabeza negra y virus del cogollo racemoso del plátano. La enfermedad Panama está causada por Fusarium oxysporum f.sp. cubense (razas 1, 2 y 4). La raya negra de la hoja/Sigatoka negra está causada por Mycosphaerella fijiensis. La enfermedad Moko está causada por Pseudomonas solanacearum.

El control biológico de las enfermedades fúngicas en plantas ha sido investigado con anterioridad. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.942.032 y nº 4.906.611. Estas patentes dan a conocer la producción y utilización de un producto antifúngico de origen natural ("AFP") producido a partir de especies de Pediococcus para el control de enfermedades posteriores a la cosecha, incluyendo la podredumbre causada por Mucor, moho gris y moho azul en fruta. La patente US nº 5.244.680 da a conocer la utilización de diversas especies de Cryptococcus para prevenir el deterioro posterior a la cosecha de la fruta. La patente US nº 5.049.379 da a conocer la utilización de un fungicida aislado a partir de Bacillus cereus, o la utilización del organismo mismo para controlar la infección de determinadas legumbres por Phytophthora megasperma f. sp. medicaginis y Phytophthora megasperma f. sp. glycinea. La utilización de agonistas microbianas para inhibir el crecimiento de hongos patogénicos, sin embargo, presenta severas limitaciones. Los efectos antagonistas del agente de control dependen del establecimiento y control del agente en el nicho ecológico particular en el que se encuentra el patógeno. Dicho establecimiento puede verse afectado por factores tanto abióticos como bióticos y el posterior crecimiento del microorganismo antagonista que, a su vez, afecta a la producción del agente antifúngico.

Otras investigaciones se han centrado en el aislamiento de compuestos antifúngicos de origen natural procedentes de especies de Pseudomonas. Un aislado de Pseudomonas, L-22-64 y de la levadura F-43-31 es capaz de controlar el moho azul de las manzanas (W.J. Janisiewicz, Phytopathology 78:194-198, 1988). Se ha identificado el agente antifúngico como pirrolnitrina (W.J. Janisiewicz y J. Poitmann, Phytophatology 78:1697-1700, 1988). Entre otros ejemplos de compuestos producidos naturalmente que presentan actividad antifúngica se incluyen: fenacina, floroglucinol y pioluteorina. En muchos casos, el componente activo de los agentes antifúngicos naturales no ha sido identificado ni caracterizado por completo. Debido a que muchos de estos agentes antifúngicos producidos naturalmente se encuentran pobremente caracterizados en el mejor de los casos, se desconoce cuál es el nivel de persistencia y de toxicidad de estos compuestos en el medio ambiente. Además, el hecho de que estos compuestos sean producidos por microbios en el medio ambiente sugiere que podrían presentar un espectro limitado de actividad antimicrobiana.

Existen péptidos que son efectores de una diversidad de procesos fisiológicos y pueden actuar como antimicrobianos inhibiendo el crecimiento de hongos y de otras células microbianas. Se han aislado de semillas de rábano varios péptidos antifúngicos ricos en cisteínas. Estos péptidos, con longitudes comprendidas entre 23 y 30 aminoácidos, presentan diversas actividades antifúngicas contra Alternaria brasicola, Botrytis cinerea, Fusarium culmorum, Pyricularia oryzae, Fusarium oxysporum y Verticillium dahliae (Terras et al., FEBS Letters 316:233, 1993; Terras et al., J. Biol. Chem. 267:15301, 1992). Los péptidos ricos en cisteínas también han sido aislados a partir de semillas de Mirabilis jalapa. Estos péptidos presentan actividad antifúngica contra Alternaria brassicola, Ascochyta pisi, Botrytis cinerea, Cercospora beticola, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Nectria haematocca, Phoma betea, Pyrenophora tritici-repentis, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae y Venturia inaequalis. Los péptidos también inhibieron el crecimiento de varias bacterias Gram-positivas (B.P.A. Cammue, J. of Biol. Chem. 267:2228, 1992). Se han aislado otros péptidos ricos en cisteínas de las semillas de Amaranthus caudatus (W.F. Broekaert et al., Biochemistry 31:4308, 1992). Sin embargo, el contenido de cisteínas de estos péptidos si se producen sintéticamente probablemente resultará en la polimerización del monómero péptido en agregados de dos o más monómeros. Estos agregados presentan una actividad antifúngica desconocida. De esta manera, la formación de agregados puede resultar en niveles variables de actividad y de especificidad.

Se han caracterizado con mayor detalle otros péptidos antifúngicos de origen natural. Se ha aislado un derivado de un dipéptido ("nitropeptina") con actividad inhibidora del crecimiento contra Pyricularia oryzae. El dipéptido se purificó a partir de Streptomyces xanthochromogenus (K. Ohba et al., The Journal of Antibiotics 40:709-713, 1986). Se cree que la nitropeptina es un inhibidor competitivo del metabolismo del ácido glutámico durante la síntesis de proteínas. Como tal, no resulta probable que sea un antimicrobiano efectivo en condiciones de crecimiento ricas en nutrientes o en organismos con capacidades de biosíntesis de ácido glutámico. También se ha demostrado que un decapéptido cíclico derivado naturalmente, la caloficina, muestra propiedades antimicrobianas (S.S. Moon, J. Org. Chem. 57:1097, 1992). Se descubrió que el péptido contenía varios aminoácidos modificados, incluyendo un residuo ácido D-aspártico y un residuo N-metil-asparagina y un residuo ácido graso [ácido (2R,3R,4S)-3-amino-2-hidroxi-4-metilpalmítico]. Sin embargo, los péptidos cíclicos son difíciles de sintetizar con pureza elevada y/o a tasas de recuperación elevadas debido a la química de la ciclización. Además, los péptidos antifúngicos de Bacillus subtilis se ha demostrado que controlan la podredumbre parda en melocotones (C.G. Guelderner et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 36:366-370, 1988). Los péptidos de origen natural, tales como la nisina, así como los ácidos antibióticos de origen natural, tales como el ácido propiónico, se han utilizado en la conservación de alimentos. Sin embargo, se desconoce generalmente el nivel de estabilidad ambiental y las toxicidades de dichos compuestos de origen natural. Además, en el caso de que dichos agentes antifúngicos se deriven de fuentes naturales, únicamente uno de los dos estereoisómeros demuestra típicamente la actividad antifúngica deseada.

La utilización de productos antifúngicos naturales aislados en cantidad comercial a partir de microorganismos resulta de utilidad limitada debido en gran parte a problemas de purificación. Resulta necesario el cultivo celular a gran escala del microorganismo productor del agente antifúngico para la purificación del agente antifúngico. En muchos casos, el aislado cultural responsable de la producción del agente antifúngico no es un aislado de fácil cultivo por lotes o resulta totalmente imposible cultivarlo por lotes (por ejemplo los patógenos obligados). Además, con frecuencia se requieren estrategias complicadas de purificación para purificar el producto activo hasta un nivel razonable de homogeneidad. Una desventaja sustancial de la utilización de agentes antifúngicos derivados naturalmente es el potencial de copurificación de productos secundarios microbianos no deseados, especialmente productos secundarios que resultan indeseablemente tóxicos. En muchos casos, estos factores conducen a elevados costes de producción y provocan que el aislamiento a gran escala de productos antifúngicos a partir de aislados naturales no resulta práctico. Las purificaciones pueden resultar todavía más difíciles en el caso de que resulten posibles las mezclas racemizadas en las que únicamente un estereoisómero es activo, o en el caso de que resulten posibles los enlaces disulfuro entre monómeros péptido.

La búsqueda de productos antimicrobianos para la utilización agrícola ha ido atrasada respecto a la búsqueda de dichos productos para la medicina humana. Por ejemplo, los péptidos sintéticos han emergido como herramientas de investigación útiles en el desarrollo de vacunas en investigación biomédica (Pinilla, C. et al., Vaccines 92:25, 1992). Dichos péptidos se han utilizado para resolver detalles de las interacciones antígeno-anticuerpo (Lerner, R.A., Nature 299:592, 1982), para mapear productos proteicos de genes específicos cerebrales (Gramsch, C. et al., Neurochem. 40:1220, 1983) y para preparar análogos óptimos de péptidos biológicamente activos (Cull, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:865, 1992; Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487, 1991) y en ensayos de microdilución para el desarrollo de nuevos péptidos antimicrobianos (contra S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans) (Houghten et al., 1991; Houghten et al., 1992a).

La patente US nº 5.245.535, incorporada a la presente memoria como referencia, da a conocer la utilización de péptidos y derivados de péptido para potenciar los efectos de los antibióticos utilizados en terapias antimicrobianas estándares. Los péptidos utilizados presentaban una longitud comprendida entre 14 y 50 residuos, eran de naturaleza necesariamente anfifílica y se predice que presentan características de formación de canales iónicos. Se sugiere que estos péptidos podrían funcionar desestabilizando las membranas celulares. Los péptidos dados a conocer están compuestos de secuencias tetraméricas de motivos definidos. El motivo incluye dos residuos hidrofóbicos contiguos y por lo menos un residuo básico, mientras que el residuo restante puede ser básico o neutro. Los residuos hidrofóbicos deben ser contiguos. Aunque se han determinado los modos de acción de determinados péptidos (ver, por ejemplo, Fiedler et al., 1982; Isono y Suzuki, 1979), típicamente no se han determinado los mecanismos que explican el modo de acción y especificidad de dichos péptidos. En los casos en los que dichos estudios se han llevado a cabo en la investigación fúngica, los estudios iniciales para determinar el modo de acción antifúngica de los péptidos implicaban un examen físico de los micelos y de las células para determinar si los péptidos podían perturbar las funciones membranales responsables del equilibrio osmótico, tal como se ha observado en otros péptidos (Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5449-5453, 1987). Entre otros modos potenciales de acción podrían incluirse interrupciones de la síntesis o del metabolismo macromolecular.

La patente US nº 5.126.257 da a conocer el aislamiento y la utilización de un péptido de origen natural derivado de extractos de leucocitos polimorfonucleares humanos lisados. El agente activo elimina bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Sin embargo, se desconoce su actividad contra los hongos. La patente US nº 4.725.576 da a conocer la utilización de péptidos para combatir las infecciones fúngicas. Los péptidos contienen por lo menos 14% de histidina. Se dan a conocer específicamente hexámeros de histidina que controlan las infecciones por Candida albicans y Streptococcus mutans.

Unos procedimientos desarrollados recientemente permiten la preparación de bibliotecas combinatoriales de péptidos sintéticos ("SPCL") compuestos de mezclas equimolares de péptidos libres que pueden utilizarse en procedimientos in vitro para determinar la bioactividad (Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487, 1991; Houghten, R.A. et al., Nature 354:84, 1991; Houghten, R.A. et al., BioTechniques 13:412, 1992). Las bibliotecas pueden estar constituidos por estereoisómeros D o L de aminoácido o combinaciones de aminoácidos L y D y/o aminoácidos de origen no natural. También se conocen otros procedimientos para sintetizar péptidos de secuencia definida. De manera similar, se conocen procedimientos preparativos de gran escala. También se conocen determinados procedimientos recombinantes de producción de péptidos (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.935.351). La publicación de solicitud de patente PCT número WO9608264 da a conocer la utilización de bibliotecas para identificar compuestos huérfanos útiles como inhibidores del crecimiento fúngico. Sin embargo, dicho documento no da a conocer las secuencias 32 a 47.

Las composiciones actuales para el control de las infecciones por patógeno fúngico presentan una utilidad limitada debido a su especificidad reducida, toxicidad humana y persistencia en el medio ambiente. A pesar de lo anterior, debido a la incapacidad de controlar suficientemente el crecimiento fúngico por resistencia reproductiva y prácticas culturales, resulta necesario encontrar agentes antifúngicos que no presenten dichas características no deseables. La utilización de microbios para controlar el crecimiento de los hongos en el medio ambiente resulta difícil. La utilización de productos antifúngicos naturales en cantidades comerciales a partir de microorganismos también presenta una utilidad limitada debido en gran parte a problemas de purificación, especialmente en el caso de que resulte necesario purificar mezclas racemizadas. Además, la búsqueda de agentes antifúngicos producidos naturalmente es un procedimiento que requiere mucho tiempo y con una probabilidad de éxito muy reducida. Incluso en el caso de que se localicen dichos péptidos de origen natural, la síntesis del péptido puede resultar problemática (por ejemplo formación de disulfuros, requisitos elevados de histidina, etc.). Resultan necesarios procedimientos y composiciones que proporcionen un medio para sintetizar y someter a ensayo con facilidad composiciones antifúngicas que no adolezcan de las mismas limitaciones que los péptidos de origen natural.

Breve sumario de la invención

La presente invención supera las desventajas de los fungicidas conocidos con anterioridad en los que las composiciones de la invención son especies definidas químicamente que se sintetizan y se purifican con facilidad. No dependen de la estabilidad genética ni de las propiedades de crecimiento de los microorganismos para la producción de los mismos. El tratamiento antimicrobiano que utiliza las composiciones y los procedimientos de la invención no requiere poner en contacto un producto agrícola con microbios vivos, impredecibles. Además, los procedimientos y composiciones de la presente invención proporcionan una serie de diferentes compuestos antibióticos que se ha demostrado que presentan una efectividad particular en el tratamiento de enfermedades fúngicas de plantas y animales.

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Las composiciones de la invención resultan efectivas en el control de las infecciones por patógeno fúngico aunque demuestran un elevado grado de especificidad para los hongos diana, toxicidad reducida y persistencia controlada en el medio ambiente. Mediante la utilización de los procedimientos de la invención resulta posible producir agentes antifúngicos en un periodo de tiempo mucho más corto y con una probabilidad de éxito considerablemente superior que el cribado de aislado naturales para dicha actividad. Debido a que los procedimientos de la invención pueden controlar la naturaleza química de los agentes antifúngicos producidos de esta manera, la síntesis y la purificación de los péptidos resulta mucho menos problemática (por ejemplo se elimina la cisteína).

Las composiciones de la presente invención comprenden péptidos de estructura química y características conocidas. La utilización de D-aminoácidos incrementa la estabilidad de algunos de estos compuestos al ser insensibles a las rutas comunes de degradación biológica que degradan los péptidos de L-aminoácidos. Por ejemplo, los péptidos de L-aminoácidos pueden estabilizarse mediante la adición de D-aminoácidos en uno o ambos extremos del péptido. Sin embargo, se encuentran disponibles rutas bioquímicas que degradarán incluso los D-aminoácidos en estos péptidos, de manera que la persistencia medioambiental de largo plazo no es un problema. Evidentemente, en el caso de que las composiciones de la invención actúen con rapidez o no requieran estabilización, los L-aminoácidos o mezclas de L-aminoácidos y D-aminoácidos, pueden resultar útiles. Al contrario que los agentes antifúngicos que únicamente funcionan como uno u otro estereoisómero, las composiciones de la invención funcionan bien en forma de uno u otro estereoisómero o en forma de una composición estereoisomérica mixta.

La investigación que llevó a la presente invención evaluó los SPCL para actividad contra patógenos fúngicos, incluyendo patógenos de plantas, así como de animales. La biblioteca se encontraba compuesta de 52.128.400 péptidos de seis residuos, estando compuesto cada péptido de D-aminoácidos y presentando extremos N-terminales no acetilados y extremos C-terminales amidados. Se utilizó un procedimiento iterativo para identificar las secuencias de péptido activo con un amplio espectro de actividad antifúngica. El procedimiento utilizó una biblioteca de hexapéptidos en los que los dos primeros aminoácidos en cada cadena de péptido se encontraban individual y específicamente definidos y estando los últimos cuatro aminoácidos constituidos por mezclas equimolares de 20 aminoácidos. Se evaluaron cuatrocientas (400)(20^{2}) mezclas diferentes de péptidos, consistiendo cada una de 130.321 (19^{4})(se eliminó la cisteína) hexámeros individuales. En dicha mezcla de péptidos, la concentración final de cada péptido era de 9,38 ng/ml, en una mezcla compuesta de 1,5 mg (mezcla de péptidos)/ml de solución. En dicho perfil de mezcla se supuso que un péptido medio presentaba un peso molecular de 785. Esta concentración era suficiente para permitir el ensayo de bioactividad. Posteriormente, se construyeron y se sometieron a ensayo péptidos que contenían aminoácidos D tanto como L.

La invención da a conocer composiciones de péptidos que pueden controlar patógenos fúngicos, principalmente los de plantas. Las composiciones de la invención comprenden una mezcla de péptidos derivados de aminoácidos que presentan una longitud de seis residuos. Entre otras composiciones de la invención se incluyen composiciones de péptidos sustancialmente homogéneas útiles como agentes antimicrobianos. Entre las composiciones adicionales de interés de la invención se incluyen composiciones de péptidos formuladas para la utilización, tales como las contenidas en microesferas.

Los péptidos de la invención pueden construirse utilizando una diversidad de precursores aminoácidos. Evidentemente los péptidos pueden ser composiciones homogéneas que contienen únicamente aminoácidos D, L o cíclicos (no racémicos). La estructura química de dichos aminoácidos (término que se utiliza en la presente memoria para incluir iminoácidos), con independencia de la configuración estereoisomérica, puede basarse en la de los diecinueve o veinte aminoácidos de origen natural: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), aspartato (Asp; D), glutamina (Gln; Q), glutamato (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), prolina (Pro; P), fenilalanina (Phe; F), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V). Se excluyó la cisteína (Cys; C) para evitar problemas por enlaces disulfuro en los productos. Las composiciones de la invención también pueden ser no homogéneos, conteniendo por ejemplo aminoácidos tanto D como L y/o aminoácidos cíclicos. Las composiciones de péptido también pueden contener aminoácidos diferentes de los aminoácidos de origen natural, tales como la norleucina, etc.

Más específicamente, las composiciones de la invención serán una de entre el grupo de péptidos dados a conocer en las secuencias ID nº 32 a 47. Estas secuencias, y las secuencias ID nº 1 a 31, indicadas a título comparativo, establecen un número de composiciones químicas precisas que se ha demostrado que presentan actividad antifúngica contra un espectro de hongos. En determinados casos, los péptidos de secuencias ID nº 1 a 47 presentarán secuencias completamente definidas.

En otros casos, la secuencia del péptido antifúngico se encontrará definida para únicamente algunos de los residuos aminoácidos C-terminales, dejando los residuos aminoácidos restantes definidos como proporciones equimolares. De esta manera, en cada alícuota de la SPCL que contiene un nº de ID de secuencia dado que contiene un residuo variable; los residuos variables se encontrarán uniformemente representados cada uno de ellos en cantidades equimolares por uno de entre diecinueve aminoácidos de origen natural diferentes en una u otra de las formas estereoisoméricas. Sin embargo, los residuos variables pueden definirse rápidamente utilizando los procedimientos de la invención para determinar los péptidos más efectivos para el control del crecimiento fúngico.

De esta manera, puede apreciarse en los Ejemplos siguientes que la secuencia C-terminal "FRXXXX" (Sec ID nº 1) mostró actividad antifúngica para un amplio espectro de hongos. Para facilitar la referencia, los péptidos en la presente memoria se escriben rutinariamente en una dirección C-terminal a N-terminal para designar la secuencia de síntesis. Sin embargo, es utilizada en el listado de secuencias la manera convencional N-terminal a C-terminal de informar las secuencias de aminoácidos. Por lo tanto, esta composición relativamente variable, puede describirse como una composición antibiótica de la invención, aunque resulta probable que no todos los componentes de la composición de péptidos mixtos posea actividad antibiótica. En la siguiente ronda de identificación de composiciones de péptidos antibióticos basada en la composición parental "FRXXXX" (sec ID nº 1) de actividad antibiótica conocida, las composiciones de péptido "FRLXXXX" (sec ID nº 9) se descubrió que mostraban una actividad antibiótica significativa. De manera similar a la composición parental de "FRXXXX" (sec ID nº 1), la composición de péptido "FRLXXXX" (sec ID nº 9) presenta una serie equimolar mixta de péptidos que representa los mismos diecinueve residuos aminoácidos, algunos de los cuales puede presentar actividad antibiótica, y otros de los cuales podrían no presentar dicha actividad antibiótica. Globalmente, sin embargo, la composición de péptido "FRLXXX" (sec ID nº 9) es ella misma una composición antibiótica de la invención. Este procedimiento puede llevarse a cabo hasta el punto en el que se producen y se someten a ensayo péptidos completamente definidos mediante los procedimientos de la invención para su actividad antibiótica. En estos casos, tal como se consiguió, por ejemplo, para "FRLHF" (sec ID nº 31), todos los residuos aminoácidos en un péptido de seis residuos serán conocidos.

Sin embargo, no resulta necesario que una composición peptídica de actividad antibiótica demostrable que se encuentre completamente definida respecto a cada residuo. De hecho, en determinados casos, especialmente en el caso de que se utilicen composiciones péptidos de la invención para tratar una serie de enfermedades fúngicas, cada una con un agente causativo diferente, resultan preferidas las composiciones péptido mixtas. Éste probablemente es el caso si se desea tratar una enfermedad fúngica con concentraciones inferiores de numerosos antibióticos, y no una concentración más elevada de una sola composición química. En otros casos, en los que, por ejemplo, debido al coste incrementado del ensayo o la producción de un antibiótico péptido completamente definido resulta prohibitivo, pueden resultar preferidas las composiciones de péptidos mixtas de la invención que presentan uno o más residuos aminoácidos variables. De esta manera, se han derivado las composiciones antibióticas que comprenden una mezcla equimolar de péptidos producidos en una biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos utilizando los procedimientos de la invención, y se ha demostrado que presentan actividad antibiótica deseable. Estas composiciones relativamente variables son específicamente las basadas en la secuencia de uno de los péptidos de las SEC. ID nº 1 a 24.

Las composiciones antibióticas de la invención también pueden comprender un portador. El portador es uno adecuado para la utilización en la aplicación de las composiciones antibióticas sobre plantas. En cualquier caso, el portador seleccionado debe ser un portador cuyas características químicas y/o físicas no interfieran significativamente con la actividad antibiótica de la composición péptido. Es conocido, por ejemplo, que determinados portadores microesfera pueden utilizarse con efectividad con composiciones proteináceas con el fin de administrar estas composiciones en un sitio de actividad preferido, tal como sobre una superficie tópica de una planta. También pueden utilizarse como portadores para las composiciones péptido de la invención, soluciones salinas, tampones y solventes farmacéuticamente aceptables y similares.

Las composiciones antibióticas están constituidas esencialmente por uno de los péptidos de las sec. ID nº 32 a 47 no presentan residuos variables. Estas composiciones se ha demostrado que inhiben el crecimiento de células fúngicas de hongos seleccionados de entre el grupo de hongos patogénicos constituido por especies de Fusarium, Rhizoctonia, Ceratocystis, Pythium, Mycosphaerella y Candida.

De manera similar, se describen procedimientos para inhibir el crecimiento de células fúngicas que comprenden poner en contacto la célula fúngica con una composición antibiótica que comprende por lo menos uno de los péptidos de entre las SEC. ID nº 1 a 31 a título comparativo. Utilizando las técnicas de la invención, se han sometido a ensayo hongos patogénicos seleccionados, algunos patógenos de plantas y otros patógenos de animales. Por lo tanto, los procedimientos de la invención se ha demostrado específicamente que resultan efectivos cuando la célula fúngica es una célula fúngica seleccionada de entre el grupo de hongos constituido por especies de Fusarium, Rhizoctonia, Ceratocystis, Pythium, Mycosphaerella y Candida.

Los procedimientos de la invención pueden aplicarse a células fúngicas que son las de un patógeno de una planta. En determinados casos preferidos, la parte u órgano vegetal que se trata es una semilla de un organismo vegetal susceptible. En otros, los procedimientos de la invención se aplican a células fúngicas de un patógeno de un animal, tal como un ser humano.

También se describe un procedimiento para la selección de composiciones antibióticas. El procedimiento comprende en primer lugar crear una biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos tal como se describe en la presente memoria. A continuación, tal como se describe adicionalmente en detalle en la presente memoria, se lleva a cabo una etapa de puesta en contacto de una batería de células fúngicas con alícuotas de la biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos, representando cada una de las alícuotas una mezcla equimolar de péptidos en los que por lo menos los dos residuos aminoácidos C-terminales son conocidos y siendo los residuos comunes para cada péptido. Tras dejar transcurrir un periodo apropiado para el crecimiento, se lleva a cabo una etapa siguiente en la que se mide el crecimiento de la batería de células fúngicas en comparación con células de control no tratadas. Finalmente, se realiza una determinación de cual de las alícuotas reduce en mayor grado el crecimiento de las células fúngicas en la batería de las mismas.

Evidentemente puede llevarse a cabo el mismo procedimiento en el que cada una de las alícuotas representa una mezcla equimolar de péptidos en la que son conocidos por lo menos tres, cuatro, cinco o más residuos aminoácidos C-terminales (dependiendo de la longitud total del último péptido en la SPCL). Típicamente, dichas alícuotas crecientemente definidas se someten a ensayo secuencialmente con el fin de seleccionar los mejores péptidos candidatos con éxito para ser sometidos a ensayo. De esta manera, una etapa adicional del procedimiento implica utilizar la determinación de qué alícuotas reducen el crecimiento de las células fúngicas globalmente en dicha batería de células fúngicas, con el fin de seleccionar qué alícuotas someter a ensayo a continuación de entre una biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos, en la que es conocido por lo menos un residuo aminoácido C-terminal adicional.

También se da a conocer un procedimiento de tratamiento de enfermedades fúngicas. El procedimiento comprende, en primer lugar, crear una biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos y poner en contacto alícuotas de la misma con una célula de un hongo que se cree que es el agente causativo de la enfermedad. A continuación, se lleva a cabo un procedimiento de selección de los alícuotas de la biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos que más reducen el crecimiento de la célula fúngica. Finalmente, la enfermedad se trata en un organismo vegetal susceptible a la enfermedad mediante la aplicación de la alícuota procedente de la biblioteca combinatorial de péptidos sintéticos, que más reduce el crecimiento de las células de agente causativo. La etapa de tratamiento puede comprender la aplicación tópica en el organismo susceptible, tal como pulverizaciones, nieblas, polvos y similares en el caso de plantas.

Los expertos en la materia apreciarán que los péptidos de la invención, tras la selección de los mismos pueden modificarse para que contengan sustituciones de aminoácidos funcionalmente equivalentes y conservar todavía características antifúngicas iguales o similares. Kyte y Doolittle (1982) han comentado de manera general la importancia del índice hidropático de aminoácidos en la provisión de función biológica a una proteína. Estos investigadores y otros han descubierto que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que presentan un índice o puntuación hidropática similar y conservar todavía una actividad biológica similar, si no idéntica. Tal como se muestra en la Tabla I posteriormente, se asigna a los aminoácidos un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y de carga. Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con la molécula sustrato. De manera similar, en péptidos en los que la estructura secundaria de los mismos no es un aspecto principal de la interacción del péptido, la posición dentro del péptido y la característica del residuo aminoácido determinan las interacciones que presenta el péptido en un sistema biológico. Se propone que la equivalencia funcional biológica puede mantenerse típicamente en el caso de que se intercambien aminoácidos con una diferencia no superior a +/-1 a 2 en el valor del índice, y más preferentemente igual o inferior a una diferencia de +/- 1.

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TABLA 1

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De esta manera, por ejemplo, la leucina, que presenta un índice hidropático de +4,5, puede sustituirse por valina (+4.2) o leucina (+3,8) y todavía obtener una proteína que presenta una actividad biológica similar. Alternativamente, en el otro extremo de la escala, puede sustituirse la lisina (-3,9) por arginina (-4,5), y de esta manera sucesivamente.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, dichas sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes grupo R, por ejemplo en términos de tamaño, carácter electrofílico, carga y similares. En general, aunque éstas no son las únicas de dichas sustituciones, las sustituciones preferidas que adoptan diversas de las características anteriores en consideración incluyen las siguientes:

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TABLA II

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Las composiciones péptido homogéneas se encuentran compuestas principalmente de una sola especie péptido activa de una secuencia bien definida. Pueden coexistir cantidades menores (inferiores a 20% en moles) de impurezas con el péptido en estas composiciones con la condición de que no interfieran en las propiedades inhibidoras del crecimiento del compuesto activo.

Para los fines de la presente invención, la expresión "ingrediente activo" se refiere al péptido que presenta la capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos diana. Entre los microorganismos diana se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los hongos que causan podredumbre de las raíces, peste de los semilleros, infecciones sistémicas, enfermedades vasculares e infecciones de determinadas áreas superficiales de las plantas. El microorganismo diana también puede incluir patógenos de animales y del ser humano, tales como infecciones por levadura, comunes en determinados estados de enfermedad del ser humano.

La presente invención proporciona además un procedimiento para la inhibición del crecimiento microbiano en plantas con las composiciones péptidos de la invención. Las infecciones fúngicas pueden prevenirse en diversas etapas del desarrollo del cultivo, incluyendo: la protección de semillas y plántulas, el crecimiento de plántulas y plantas, la protección de productos recolectados y el almacenamiento de productos. El procedimiento comprende recubrir una parte u órgano de la planta con las composiciones péptidos de la invención en una mezcla de recubrimiento que comprende un portador no interfiriente y una cantidad efectiva de la composición antimicrobiana. Alternativamente, la composición antimicrobiana puede mezclarse con un portador líquido no interfiriente y en contacto con semillas, plántulas, plantas o productos recolectados o puede introducirse sistémicamente en plantas.

Breve descripción de las formas de realización preferidas Ejemplo I Síntesis de una SPCL

Los procedimientos de construcción de péptidos de secuencias definidas o por lo menos parcialmente definidas, péptidos que después pueden seleccionarse para actividad biológica son conocidos (patentes US nº 4.833.092, nº 5.182.366, nº 5.010.175, y Geysen, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002). Estos procedimientos se incorporan específicamente a la presente invención en el grado en que proporcionan procedimientos alternativos adecuados para sintetizar dichos péptidos. Las técnicas que se ha descubierto en la presente invención que resultan adecuadas para sintetizar las composiciones péptidos de la invención son generalmente las de Houghten et al., Biotechniques 4:522-524, 1986, y Houghten, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135, 1985; ambas referencias se incorporan a la presente invención en el grado en que proporcionan materiales y métodos suplementarios.

Se utilizó química de Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) en la producción de las bibliotecas de péptidos. Este enfoque se utilizó con la totalidad de los péptidos de la invención, comprendiesen análogos D o L. A menos que se indique lo contrario, los péptidos específicos que se describen adicionalmente en la presente memoria comprenden secuencias de D-análogo. El grupo Fmoc protege los grupos N-alfa-amino de los derivados aminoácidos y pueden eliminarse con una base, tal como piperidina, mientras que los grupos funcionales de cadena lateral se encuentran protegidos con grupos protectores sensibles a ácidos. El primer aminoácido se añade a un línker sensible a ácidos unido a una resina de poliestireno. Se añaden sucesivamente aminoácidos a través de un ciclo de eliminación de Fmoc con piperidina al 20-25% en DMF:NMP (9:1; el NMP se añade para ayudar a solvatar la resina, que mejora la eliminación del Fmoc), lavado de la resina 6X con DMF, y adición del próximo aminoácido protegido con Fmoc junto con un agente de acoplamiento apropiado, tal como PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-trix-pirrolidino-fosfonio, el análogo no carcinogénico de BOP), HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetra-metiluronio), DCCI (N,N'-diciclohexilcarbodiimida) junto con una base, tal como N-metilmorfolina o diisopropiletilamina y HOBT (N-hidroxilbenzotriazol), que reduce la racemización durante el acoplamiento. Para péptidos pequeños (<10 aminoácidos), habitualmente resulta suficiente una sola etapa de acoplamiento, con un exceso de 3 a 8 aminoácidos, dependiente de los equipos de síntesis de péptidos utilizados, junto con un exceso similar de cada uno de los compuestos químicos indicados anteriormente.

Para péptidos largos o complicados, los reactivos indicados anteriormente pueden eliminarse tras dejar transcurrir el acoplamiento 20 a 45 minutos, momento en el que, en lugar de lavar la resina con DMF y eliminar el Fmoc para el siguiente ciclo de aminoácidos, se añade una cantidad adicional de aminoácidos, agente de acoplamiento, base y HOBT con el fin de mejorar la eficiencia de acoplamiento por etapas. Típicamente se observa una eficiencia de acoplamiento de 99% o más durante las primeras pocas etapas de un péptido medio, mientras que las eficiencias de acoplamiento pueden ser mucho menores a medida que las cadenas de péptidos se alargan y adquieren una estructura terciaria significativa. El acoplamiento doble puede mejorar significativamente el rendimiento y pureza globales del producto crudo. Se observa una mejora todavía mayor si las cadenas de péptidos que no consiguen añadir el aminoácido apropiado reciben una "caperuza" mediante acetilación, que termina estas cadenas. Este último procedimiento evita la síntesis de péptidos prácticamente perfectos, que pueden no haber incorporado un solo aminoácido, y de péptidos largos, que presentan problemas de purificación debido a la similitud de secuencia con el péptido de longitud completa deseado (se utilizó el acoplamiento doble para garantizar un nivel elevado de eficiencia de acoplamiento; se utilizó un exceso 5X de aminoácido, PyBOP y HOBT con un exceso 10X de NMM).

La purificación de bibliotecas de péptidos puede llevarse a cabo de dos maneras; para la identificación en una etapa (iteraciones únicas), la purificación puede llevarse a cabo mediante HPLC, en la que se carga la mezcla de péptidos en agua/TFA al 0,1% y tras un ciclo de lavado corto en agua/TFA al 0,1%, se eluye con un gradiente escalonado de acetonitrilo (ACN al 60%/TFA al 0,1%) en agua/TFA al 0,1%. Alternativamente, para el descubrimiento inicial de fármacos, en la que puede haber 400 muestras, puede utilizarse un robot de extracción en fase sólida para eluir los péptidos, utilizando una estrategia similar a la descrita anteriormente (se realizó una purificación en HPLC en una columna C-18 de Vydac, 5 \mum de tamaño de poro, 10 x 250 mm).

Ejemplo II Ensayo de protocolos en general

Existen procedimientos para determinar la toxicidad de nuevos compuestos para potenciales microorganismos diana. Por ejemplo, puede realizarse el seguimiento del crecimiento de cultivos puros de un microorganismo de ensayo en un lector de microplacas. También pueden determinarse las tasas de crecimiento de cultivos tras la adición de compuestos de ensayo a los medios de crecimiento. En el caso de que una tasa de crecimiento sea más lenta tras la adición de un compuesto de ensayo al medio de crecimiento, se afirma que el compuesto es un agente antimicrobiano (W.F. Broekaert et al., FEMS Microbiology Letters 69:55, 1990).

La clave para la identificación exitosa de péptidos ha sido el ensayo cuantitativo para la medición del crecimiento microbiano. La identificación de secuencias de péptido a partir de SPCL, que inhiban el crecimiento de patógenos vegetales presentes en el suelo se llevó a cabo utilizando un ensayo de crecimiento en microplacas. Los volúmenes de cultivo y las densidades de inóculo de esporas o de fragmentos de micelios se optimizó para el crecimiento en microplacas de Fusarium oxysporum f. lycopersici, Pythium ultimum, Ceratocystis fagacerum, Rhizoctonia solani y Mycosphaerella fijiensis. El peso seco de estos organismos es directamente proporcional a la densidad óptica del cultivo. De esta manera, pueden determinarse las tasas de crecimiento mediante la medición de incrementos de densidad óptica de un cultivo líquido en diferentes tiempos. Se determinaron las tasas de crecimiento en presencia y en ausencia de composiciones añadidas, tales como SPCL. En el caso de que se inhiba el crecimiento en la presencia de estos compuestos, los compuestos se considera que presentan propiedades antimicrobianas. De manera similar, se han llevado a cabo ensayos de microplaca con los microorganismos Erwinia carotovora subsp. carotovors y con Pseudomonas solanacearum.

Puede someterse a ensayo virtualmente cualquier compuesto soluble para su capacidad de inhibir el crecimiento microbiano en dicho ensayo, preferentemente se criban SPCL o péptidos de esta manera. Puede cribarse con este ensayo cualquier microorganismo que pueda cultivarse en cultivo líquido. Aunque los microorganismos específicamente indicados anteriormente resultan preferidos en la presente invención, también pueden estudiarse patógenos vegetales, tales como Aspergillus flavus, A. higer, A. terreus, Chaetomium globosum, Monilinia fructicola, Penicilium oxalicum u otras especies de Mycosphaerella. Durante el cribado inicial de la biblioteca de aminoácidos, y tal como se describe en los ejemplos adicionales posteriormente, se identificaron varias mezclas de péptidos que presentaban fuerte actividad de inhibición del crecimiento contra los patógenos diana.

Cuando una mezcla, tal como una SPCL, presentaba actividad antimicrobiana, se identificaron las especies péptidos responsable de dicha actividad mediante síntesis de componentes de la mezcla seguido de un nuevo ensayo. Tras el cribado inicial de mezclas de péptidos que definían las dos primeras posiciones en la SPCL, las mezclas que mostraban la actividad de inhibición del crecimiento más elevada se sometieron a series sucesivas de evaluaciones. En la siguiente ronda de evaluación, se sintetizaron las primeras tres posiciones de la secuencia hexamérica. A continuación, la resina XXX se dividió en 19 partes iguales, seguido de la adición de un aminoácido, O_{3}. A este procedimiento siguió el acoplamiento de O_{1} y O_{2} definidos anteriormente. De esta manera, se prepararon 20 mezclas de péptidos. En cada grupo, se definieron los primeros tres residuos y los últimos tres residuos eran aleatorios. A continuación, se sometió a ensayo cada grupo en el ensayo de bioactividad tal como se ha descrito anteriormente. Tras este procedimiento, se definió un aminoácido adicional en cada nivel de evaluación hasta determinar cada secuencia con fuertes propiedades de inhibición del crecimiento. Este procedimiento permite la definición completa de secuencias útiles como inhibidores de crecimiento de microorganismos diana procedentes de bibliotecas SPCL.

Debido a que las posiciones se encuentran definidas, la mezcla de péptidos puede mostrar una potencia más elevada o IC_{50} (concentración inicial de inhibidor para la inhibición del 50% del crecimiento) más baja para la batería completa de microorganismos sometidos a ensayo que la mezcla menos definida anterior. Sin embargo, éste no es un requisito estricto en la presente invención debido a que dos péptidos pueden presentar efectos sinérgicos de inhibición del crecimiento y la separación de los mismos puede dejar péptidos purificados con menor actividad antimicrobiana. Alternativamente, un péptido puede presentar un efecto sinérgico de inhibición del crecimiento con otro compuesto. Debido a que existen estos motivos, así como otros motivos en la actualidad desconocidos, el inventor decidió no limitar la selección de péptidos a únicamente los que mostraban valores de IC_{50} crecientemente más bajos para cada organismo de ensayo en cada ronda de síntesis.

Por el contrario, se realizaron selecciones que proporcionaban generalmente la IC_{50} más baja para el mayor número de organismos de ensayo. De esta manera, este enfoque es diferente de los diseños experimentales específicos para un microorganismo, que maximizan la actividad antimicrobiana de una mezcla de péptidos frente a una sola especie de microorganismo. Por este motivo, tal como se observará en los Ejemplos posteriormente, cuando se añade un residuo aminoácido invariante adicional y la mezcla de péptidos resultante se somete a ensayo nuevamente frente a la misma batería de organismos de ensayo, la IC_{50} puede haberse reducido o no, debido a que se refiere a una sola especie de microorganismo, debido a que es la actividad inhibidora más amplia que resulta inicialmente preferida. Evidentemente, tras seleccionar una colección de péptidos basándose en el espectro más amplio de organismos de ensayo, pueden llevarse a cabo mejoras de los organismos diana específicos.

También puede utilizarse un ensayo de protección de plantas para evaluar el control biológico frente a hongos que causan peste de los semilleros y podredumbre de las raíces. Las composiciones de la invención se estabilizan tal como se describe en la presente memoria (microencapsulación, sustitución de D-aminoácidos o adición de caperuza terminal) y después se aplican en el suelo en contacto con la planta o se utilizan para recubrir la planta, semilla, producto o similar. Se introduce un reto para la planta, semilla o producto constituido por un inóculo del microorganismo causante de enfermedad. El inóculo puede ponerse en contacto con la planta o añadirse al suelo residente de la planta. Alternativamente, el inóculo puede inyectarse en el sistema vascular de la planta, particularmente cuando se están tratando enfermedades vasculares tales como las causadas por Ceratocystis. A continuación, se realiza un seguimiento del crecimiento de la planta con el fin de determinar si se produce una reducción estadísticamente significativa de los síntomas, tales como los observados cuando se produce peste de los semilleros o podredumbre de las raíces. Una cantidad efectiva de la composición es la cantidad que resulta en una reducción significativa en los síntomas visibles de la enfermedad de la planta.

Ejemplo III Ensayo de inhibición del crecimiento fúngico de Fusarium, Rhizoctonia, Pythium y Ceratocystis

Crecimiento de cultivos. Se mantuvieron rutinariamente en cuñas de ágar de patata-dextrosa (PDA), cultivos de Fusarium oxysporum f.sp. lycoperici raza 1 (RM-1) [FOLRM-1]; Rhizoctonia solani (cepa TM-101, anastomosis grupo -1) [RS-101]; Pythium ultimum (cepa LB1, algodón) [PULB1]; y Ceratocystis fagacearum (cepa BAN 102) [CFBAN102]. Con el fin de obtener microconidios del aislado de Fusarium oxysporum f.sp. lycoperici, se transfirió una parte reducida de un cultivo en crecimiento activo de una placa PDA a 50 ml de medio de sales minerales, tal como describen Esposito y Fletcher (Esposito, R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 93:369-376, 1961). El cultivo se incubó bajo agitación (125 rpm) a 25ºC. Tras 96 horas, la suspensión fúngica constituida por micelios y microconidios se filtraron dos veces a través de ocho capas de estopilla estéril para obtener una suspensión microconidial. A continuación, se calibró la suspensión microconidial con un hemocitómetro. Se obtuvieron esporas de C. fagacearum haciendo crecer el cultivo en placas PDA a 25ºC durante siete días. Las placas se lavaron a continuación con caldo de patata-dextrosa (PDB), se filtraron dos veces a través de ocho capas de estopilla estéril, y la suspensión se calibró con un hemocitómetro. Se ajustaron microconidios de Fusarium y esporas de Ceratocystis a 1-5 x 10^{7}/ml y se almacenaron en una solución al 50% de glicerol a -80ºC hasta la utilización. Para obtener fragmentos miceliares de Rhizoctonia, se inoculó un solo esclerotio en 50 ml de PDB y se incubó a 25ºC bajo agitación (125 rpm) durante 5 días. El cultivo miceliar se fragmentó utilizando un homogeneizador de tejidos con un paso de 0,15 mm entre el tubo y el pistón. El procedimiento se llevó a cabo en hielo para evitar el calentamiento de la muestra. La suspensión de fragmentos miceliares se calibró con un hemocitómetro. Con el fin de obtener oosporas de Pythium, se utilizó un tapón de PDA del hongo para inocular 25 ml de caldo V-8-colesterol (Ayers, W.A. et al., Phytopathology 65:1094-1100, 1975) dispensado en una placa Petri y se incubó estáticamente. Tras 10 días, se retiró la malla miceliar, se lavó dos veces en agua estéril, y se maceró en agua estéril utilizando un homogeneizador de tejidos tal como se ha descrito anteriormente. El homogenado se filtró dos veces a través de ocho capas de estopilla y las suspensiones de oosporas se calibraron con un hemocitómetro. Se sometieron a ensayo inóculos fúngicos para la ausencia de bacteria contaminantes antes de su utilización.

Ensayo de microplacas para la inhibición del crecimiento. Con el fin de determinar los efectos de inhibición de las mezclas de péptidos de ensayo, se determinó el crecimiento de los aislados fúngicos en presencia de las mismas. Se identificaron los efectos de inhibición de los aislados fúngicos preparando series de dilución seriada de dos veces de una suspensión acuosa de las mezclas de péptidos en PDB en un volumen final de 50 ml en una microplaca de 96 pocillos estériles de fondo plano. A continuación, se añadió el inóculo fúngico en PDB a cada uno de los pocillos. Se añadieron cincuenta microlitros de una suspensión que contenía 6-8 X 10^{4} microconidios de Fusarium/ml a la mezcla de péptidos o péptidos individuales para obtener una concentración final de 3-4 X 10^{3} microconidios/pocillo. Se ajustaron los fragmentos de Rhizoctonia a 6 X 10^{4}/ml y se añadieron 50 ml de la suspensión a la serie de dilución de los péptidos. Las oosporas de Pythium se ajustaron a 1 X 10^{5}/ml y se añadieron 50 ml de la suspensión a la serie de dilución de los péptidos. Se añadieron cincuenta microlitros de una suspensión que contenía 6-8 X 10^{4} esporas de Ceratocystis/ml a la mezcla de péptidos o péptidos individuales para obtener un volumen final de 100 ml/pocillo y 3-4 X 10^{3} esporas/pocillo. Se cultivaron esporas de Mycosphaerella fijiensis en peptona de harina de soja-dextrosa a pH 6,7. Sin embargo, se consiguió un crecimiento mejor en el intervalo de pH de entre 5,0 y 5,5.

La concentración final de la mezcla de péptidos por pocillo en la serie de dilución seriada de dos veces era de 2.500-1.25 mg/ml o 1.250-0.625 mg/ml, dependiendo de la concentración inicial de la mezcla que se somete a ensayo. Todas las placas se incubaron estáticamente a 25ºC. Cada placa incluía tres pocillos que se asignaron a los blancos, y 9 pocillos que realizaban el seguimiento del crecimiento de los aislados fúngicos en ausencia de ningún péptido. Previamente a la lectura, las placas se agitaron suavemente para suspender cualquier parte sedimentada del cultivo. Se realizaron lecturas a las 0, 24, 48 y 70 horas posteriores a la incoulación. Se realizó el seguimiento del crecimiento mediante la obtención de lecturas de densidad óptica (DO) a 595 nm utilizando un lector de precisión de microplacas Emax (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) unido a la impresora de inyección Think-Jet de Hewlett-Packard. Se calcularon las IC_{50} (concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento) para los péptidos basándose en el análisis de regresión lineal de los datos de crecimiento. Los datos utilizados para calcular la IC_{50} de cada mezcla es una sola lectura a cada concentración de cada mezcla de péptidos debido a la reducida cantidad de muestra disponible para el ensayo. Los análisis se llevaron a cabo por duplicado o por triplicado.

Ejemplo IV Inhibición del crecimiento inducida por péptidos de Ceratocystis, Rhizoctonia, Fusarium y Phythium

Se llevaron a cabo tres rondas de ensayo utilizando mezclas de péptidos definidas sucesivamente derivadas de la SPCL indicada anteriormente (una biblioteca D). Mediante la utilización de las técnicas de cultivo indicadas de manera general anteriormente, se sometieron a ensayo células de los hongos patogénicos Ceratocystis fagacerum, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum y Pythium ultimum frente a baterías de péptidos, tal como se ha descrito anteriormente.

La IC_{50} (mg/ml) calculada en cada caso es la concentración de la composición de péptido de ensayo que inhibe el crecimiento hasta el 50% del obtenido sin adición de péptido al medio de cultivo. Los cálculos de IC_{50} se basaron en el análisis de regresión lineal de los datos. En determinados casos, los valores de IC_{50} se recogieron y se informaron como tres valores independientes de tres determinaciones separadas.

Los datos para cada uno de los cuatro patógenos fúngicos se proporcionan en tablas posteriormente. En cada tabla, se someten a ensayo alícuotas definidas sucesivamente de la SPCL. En algunos casos, la batería de péptidos sometida a ensayo en primer lugar era la definida de manera general como O_{1}O_{2}XXXX. En otros casos, la primera batería ensayada era O_{1}O_{2}O_{3}XXX (Ceratocystis). En cualquiera de los casos, la siguiente ronda de péptidos sometidos a ensayo se encuentra definido por un residuo fijo adicional. Se muestra para cada composición de péptidos sometida a ensayo el nº de ID de secuencia.

La composición de péptidos sombreada en cada caso es la composición de péptidos utilizada para definir la fracción de la SPCL de la ronda siguiente que se sometió a ensayo. A continuación, haciendo referencia a la Tabla IV, puede observarse que FRXXXX (sec ID nº 1) proporcionó una concentración significativamente inhibidora a 557 mg/ml al someterla a ensayo contra Rhizoctonia solani. De esta manera, se sometieron a ensayo péptidos con FRXXXX en la segunda ronda. En la segunda ronda puede observarse que los péptidos de fórmula general FRLXXX (sec ID nº 9) demostraron una actividad de inhibición significativa en tres experimentos separados de 42, 119 y 94 mg/ml. Posteriormente, basándose en las indicaciones relativas al interés particular que muestran los péptidos FRLXXX (sec ID nº 9), se sometió a ensayo una diversidad de dichos péptidos y se demostró en tres rondas separadas que una de dichas composiciones de péptido, FRLKXX (sec ID nº 14), presentaba actividad preferida contra Rhizoctonia. Se aplicaron análisis en cada uno de los cuatro grupos fúngicos separados sometidos a ensayo.

También puede apreciarse mediante comparación de las Tablas (III-VI) que resumen los cuatro hongos sometidos a ensayo, que resultó posible utilizar los procedimientos de la invención para seleccionar composiciones de péptidos con una amplia gama de características antifúngicas. En cada Tabla y para cada ronda sucesiva de ensayo, las composiciones de péptidos se disponen de arriba abajo en orden creciente de valores de IC_{50}. Las composiciones de péptidos situadas en primer lugar en cada columna se descubrió que eran las más inhibidoras (IC_{50} más baja) para cada hongo seleccionado. También puede apreciarse que, en baterías sucesivas de péptidos ensayados, las composiciones alternativas de péptidos proporcionaron resultados adecuadamente inhibidores. Éstos se indican en cajas sombreadas en cada tabla. Debe recordarse que no todas las composiciones de péptidos sometidas a ensayo se encuentran representadas en las tablas, posteriormente. Únicamente se tabulan las que mostraron valores significativos de IC_{50}. Se llevaron a cabo ensayos adicionales para elucidar la secuencia completa de cada composición antibiótica de péptidos. Estos péptidos se muestran en las Tablas VII-XII, posteriormente.

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TABLA COMPARATIVA III Ceratocystis fagacerum

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TABLA COMPARATIVA IV Rhizoctonia solani

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TABLA COMPARATIVA V Fusarium oxysporum

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TABLA COMPARATIVA VI Pythium ultimum

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Ejemplo V Inhibición del crecimiento inducida por péptido de hongos utilizando péptidos completamente definidos

También se sometieron a ensayo composiciones de péptidos completamente definidas frente a la batería de hongos. Se adoptó un enfoque similar al descrito en el Ejemplo IV anteriormente. Las composiciones de péptidos era tripéptidos, tetrapéptidos o pentapéptidos seleccionados basándose en los cribados iniciales llevados a cabo en el Ejemplo IV anteriormente y sometidos a ensayo a título comparativo.

Nuevamente, se utilizó el análisis de regresión lineal para generar los datos tabulados. Para el ensayo de tripéptidos, los datos representados se basan en lecturas realizadas a las 72 horas para cada hongo, excepto para Pythium. Para Pythium, los datos se recogieron a las 48 horas. Para los datos de tetrapéptidos, la totalidad de los datos se recogieron a las 94 horas, excepto para los datos de Ceratocystis. Para los datos de pentapéptidos, la totalidad de los datos se recogieron a las 72 horas. En cada unas de las Tablas VII-IX, "cc" es el coeficiente de correlación y "n" es el número de datos utilizado en el cálculo. En el caso de que se someta a ensayo un análogo D frente a un análogo L, la designación "D-" o "L-" precede a la secuencia del péptido.

En el caso del ensayo de los pentapéptidos, haciendo referencia a la Tabla IX puede observarse que se sometieron a ensayo tanto el isómero D como el isómero L. En la mayoría de los hongos sometidos a ensayo, las composiciones de péptidos que estaban compuestas de D-aminoácidos eran inhibidoras a concentraciones sustancialmente inferiores que el análogo de L-aminoácido. Sin embargo, inesperadamente se ha descubierto que en determinados casos (Ceratocystis), los análogos D y L eran de actividad inhibidora sustancialmente similar.

TABLA COMPARATIVA VII Tripéptidos

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TABLA COMPARATIVA VIII Tetrapéptidos

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TABLA COMPARATIVA IX Pentapéptidos

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TABLA X Hexapéptidos

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Ejemplo VI Cultivo y ensayo de Mycosphaerella

Se mantuvo rutinariamente un cultivo de Mycosphaerella fijiensis var difformis ATCC 36054 en cuñas de ágar peptona de harina de soja-dextrosa. Con el fin de obtener fragmentos miceliares de Mycosphaerella, se inoculó una parte del cultivo miceliar de una cuña en 50 ml de caldo de peptona de harina de soja-dextrona (SDB) (ajustada a pH 5,0 con ácido acético) y se incubó a 28ºC bajo agitación (125 rpm) durante 6 días.

El cultivo miceliar se fragmentó utilizando un homogeneizador de tejidos con un paso de 0,15 mm entre el tubo y el pistón. El procedimiento se llevó a cabo en hielo para evitar el calentamiento de la muestra. La suspensión de fragmentos miceliares se calibró con un hemocitómetro. Los fragmentos miceliares de Mycosphaerella se ajustaron a 1 X 10^{6} mg/ml en 1X SDB.

Todas las placas se incubaron estáticamente a 28ºC. Cada placa incluía tres pocillos que se asignaron a blancos y 9 pocillos que realizaron el seguimiento del crecimiento del hongo en ausencia de cualquier péptido. Antes de las lecturas, las placas se agitaron suavemente para suspender la parte sedimentada del cultivo. Se realizaron lecturas en las 0, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas posteriores a la inoculación. Se realizó el seguimiento del crecimiento mediante la obtención de lecturas de densidad óptica (DO) a 595 nm utilizando un lector de precisión de microplacas Emax (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) acoplado a una impresora de inyección Think-Jet de Hewlett-Packard. Los cálculos de IC_{50} se basan en el análisis de regresión lineal de los datos de crecimiento. Los datos utilizados para calcular la IC_{50} de cada mezcla son de tres lecturas a cada concentración para cada mezcla de péptidos.

Se cultivaron cultivos de Mycosphaerella fijiensis var. difformis ATCC 36054 en presencia o en ausencia del análogo péptido de D-aminoácidos de FRLHF (sec. ID nº 31) en peptona de harina de soja-dextrosa a pH 6,7 (los intervalos de pH de entre 5,0 y 5,5 promueven mejor el crecimiento). Se obtuvo una IC_{50} (mg/ml) calculada del péptido D-FRLHF (sec ID nº 31) de 10,5 \pm 2,60 como la media de tres evaluaciones réplicas. Los valores se basan en lecturas a las 141 horas del crecimiento en comparación con controles sin adición de péptido. Se obtuvo un valor calculado de IC_{50} de 57 \pm 0,0 como la media de tres evaluaciones réplicas para el péptido L-FRLHF (sec ID nº 31).

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Ejemplo VII Cultivo y ensayo de Candida

Se cultivó Candida albicans cepa BG1 en ágar de soja tríptica (Difco) a 25ºC para obtener clamidosporas. Se preparó una suspensión del cultivo en caldo de soja tríptica (TSB) y se ajustó a una densidad óptica de 0,10 a 600 nm. Se determinó el recuento de clamidosporas utilizando un hemocitómetro. El péptido o mezcla de péptidos se diluyó seriadamente tal como se ha descrito anteriormente con la excepción de que se utilizó TSB en lugar de PDB. Se añadieron cincuenta microlitros de la suspensión de clamidosporas a la suspensión de péptidos para obtener una concentración final de clamidosporas de 1 X 10^{6} por pocillo. La concentración final del péptido o mezcla de péptidos por pocillo en la serie de dilución seriada de dos veces en un volumen final de 50 ml, en una microplaca de 96 pocillos estériles de fondo plano, era de 2.500-1.255 mg/ml o de 1.250/0,625 mg/ml, dependiendo de la concentración inicial del péptido o mezcla de péptidos sometido a ensayo.

Las placas de microtitulación se incubaron a 37ºC en un agitador de plataforma giratoria a 200 rpm. Cada placa incluía tres pocillos que se asignaron a blancos y 9 pocillos que realizaron el seguimiento del crecimiento del aislado fúngico en ausencia de ningún péptido.

Antes de las lecturas, las placas se agitaron suavemente para suspender cualquier parte sedimentada del cultivo. Se realizaron las lecturas a las 0 h y cada hora durante las 8 horas posteriores. Se realizó el seguimiento mediante la obtención de lecturas de densidad óptica (DO) a 595 nm utilizando un lector de precisión de microplacas Emax (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) acoplado a una impresora de inyección Think-Jet de Hewlett Packard. Se calculó la IC_{50} de los péptidos utilizando análisis de regresión lineal para los datos de crecimiento.

Correlación de peso seco de los micelos y densidad óptica. Los aislados fúngicos se inocularon tal como se ha descrito anteriormente en ausencia de cualquier compuesto inhibidor. Las lecturas de DO se realizaron a lo largo de un periodo de 96 horas con treinta pocillos muestreados en cada uno de los periodos de tiempo. Las muestras se recogieron por filtración (10/filtro) a través de filtros de vidrio pesados previamente (0,45 micras) Los filtros se secaron en un horno de vacío a 70ºC hasta peso constante y se restó el peso de la tara del peso del filtro con muestra para determinar el peso seco de la masa de micelios.

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Ejemplo VIII Inhibición del crecimiento de levaduras inducida por péptidos

Se llevaron a cabo estudios similares en levaduras. Los datos informados en la Tabla XII se basan en el análisis de regresión logarítmica de los datos. Los datos se basan en lecturas a las 6 horas de cultivos incubados a 37ºC.

A continuación, haciendo referencia a la Tabla XII, puede apreciarse que determinadas composiciones de péptido variable de la invención se sometieron a ensayo contra la levadura Candida albicans. Además, se sometieron a ensayo determinados péptidos completamente definidos de la invención que comprendían tres y cuatro residuos. En el caso de que se someta a ensayo un análogo L en lugar de un análogo D, la designación "L-" precede a la secuencia del péptido.

TABLA COMPARATIVA XII Candida albicans

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Ejemplo IX Organismos parasíticos obligados

En determinados casos, puede resultar más deseable llevar a cabo los ensayos de inhibición directamente en determinados organismos huésped susceptibles, de manera que dichos microorganismos no puedan crecer independientemente del organismo huésped, o de manera que el crecimiento independiente del microorganismo respecto al huésped resulte problemático de otra manera. Por ejemplo, el mildiú pulverulento de las rosas está causado por el parásito obligado Sphaerothecia pannosa f.sp. rosae. En estos casos, resultará necesario someter a ensayo la inhibición por el péptido o mezcla de péptidos en las plantas huésped infectadas.

Ejemplo X Estudios de daños en frutos posteriormente a la cosecha

En otros casos, puede resultar deseable someter a ensayo la efectividad de las composiciones de péptidos de la invención directamente en el producto cosechado, tal como fruta. Janisiewicz et al., 1991, describen un ensayo posterior a la cosecha para el control del moho azul y el moho gris de manzanas y peras mediante tratamiento por inmersión con pirrolnitrina, que es ejemplificativo (ver el artículo por los mismos autores en Plant Disease 75:490-494, 1991). Los patógenos de interés se aíslan y se conservan tal como se ha descrito anteriormente.

Se recolectan manzanas Golden Delicious y se mantienen con un régimen de pulverización mínimo. La fruta puede almacenarse a 1º \pm 1ºC y 95 \pm 2% de humedad relativa (HR) durante por lo menos 2 meses antes de la utilización. La fruta utilizada en los ensayos se selecciona para uniformidad de tamaño y de madurez. De manera similar, se recolectan peras Bosc y se almacenan bajo las mismas condiciones y se utilizan dentro de los 2 meses posteriores a la recolección. Se somete a ensayo la firmeza de las manzanas y peras antes de inocularlas con hongos, y deben presentar una firmeza de aproximadamente 11 (manzanas) y 14 (peras) libras de fuerza según se determina mediante ensayos de presión de Effegi.

Se daña la fruta mediante tres procedimientos. Se infringen daños de corte cortando una incisión de 3 mm cuadrados y 3 mm de profundidad con un instrumento afilado y retirando el tejido. Se realizan dos de estos daños separados aproximadamente 2 cm en cada fruta. Se infringen daños por punción con dos clavos de 6,1 mm de diámetro separados 2 cm y sobresalientes 4 mm de un bloque de madera. Se infringen daños de "amoratamiento" apretando dos cabezas de tornillo (de 1 cm de diámetro) contra la superficie de la fruta hasta una profundidad de 2 a 3 mm, rompiendo la piel de la fruta. Las cabezas de tornillo se montan en un bloque de madera separadas 2 cm. Se infringen todos los daños aproximadamente a mitad de la línea entre el cáliz y el final del tallo.

Las frutas se sumergen en suspensiones que contienen el organismo de ensayo solo o mezclado con diversas concentraciones de la composición de péptidos que deben someterse a ensayo. Las manzanas o peras dañadas (dos daños por fruto) se sumergen en las suspensiones durante 2 minutos con agitación ocasional. A continuación, la fruta se coloca en paquetes-bandeja de poliestireno para fruta con la cara dañada orientada hacia arriba en cajas de fruta de 1 bushel con revestimiento de polietileno. Se coloca la fruta de cada tratamiento en bandejas separadas en cajas separadas. Se utilizan cinco frutos por tratamiento, y cada tratamiento se repite tres veces. Las cajas se almacenan en bloques aleatorizados.

Se almacena un grupo de frutas tratado de la manera indicada anteriormente, a 24ºC y 95 \pm 2% de HR durante 7 días, y el otro grupo se almacena a 2ºC durante 30 días. El almacenamiento a 24ºC se ha diseñado para mantener o para establecer condiciones óptimas para el desarrollo de las enfermedades fúngicas, y se seleccionan las duraciones de los periodos de almacenamiento para que resulte posible medir los daños antes de que se pudran por completo los frutos. Al final del periodo de almacenamiento, se miden los diámetros de los daños en dirección perpendicular al eje que conecta los dos daños.

Ejemplo XI Determinación de fitotoxicidad/mutagenicidad

Se llevaron a cabo estudios de fitotoxicidad mediante el seguimiento del crecimiento de la lenteja de agua (Lemna minor) y la germinación de la semilla del arroz (Oryzae sativa). Los ensayos de fitotoxicidad con lenteja de agua común son simples, sensibles y eficientes para el coste. Se cultivó L. minor axénico en matraces utilizando medio de Bowker, tal como describe Caux (Caux, P.Y. et al., Environmental Toxicology and Chemistry 7:671-676, 1988). Se obtuvo una población clonal mediante multiplicación vegetativa de un inóculo que era una sola fronda. Se añadieron los péptidos individuales al medio de ensayo, y se realizó el seguimiento de las plantas para el incremento de biomasa y de disfunción fotosintética (Caux, P.Y. et al., Environmental Toxicology and Chemistry 7:671-676, 1988) durante un periodo de 14 días. El arroz es un cultivo económicamente importante y es una especie recomendada para el ensayo de toxicidad (Wang, W., Environmental Toxicology and Chemistry 10:1173-1177, 1991). Las condiciones para el ensayo son las descritas por Wang (Wang, W., Environmental Toxicology and Chemistry 10:1173-1177, 1991). Para evaluar la potencial genotoxicidad, los péptidos de interés se evaluaron utilizando el ensayo de Salmonella/microsomas (Maron, D.M. y B.N. Ames, Mutat. Res.:173-215, 1983) y el ensayo microscreen de inducción de profago (Rossman, T.G. et al., Environ. Mutagen. 6:59-69, 1984). La actividad hemolítica se evaluó mediante el procedimiento de Zasloff (Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5449-5453, 1987).

Ejemplo XII Péptidos estabilizantes

Puede llevarse a cabo una diversidad de modificaciones a los péptidos con la condición de que se conserve la actividad antimicrobiana. Algunas modificaciones pueden utilizarse para incrementar la potencia antimicrobiana intrínseca del péptido. Otras modificaciones pueden facilitar la manipulación del péptido. Entre los grupos funcionales del péptido que típicamente pueden modificarse se incluyen hidroxilo, amino, guanidinio, carboxilo, amida, fenol, anillos imidazol o sulfhidrilo. Entre las reacciones típicas de estos grupos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la acetilación de grupos hidroxilo por haluros de alquilo. Los grupos carboxilo pueden esterificarse, amidarse o reducirse a alcoholes. Las carbodiimidas u otros catalizadores pueden utilizarse para catalizar la amidación de los grupos carboxilo. Los grupos amida de la asparagina o de la glutamina pueden desaminarse bajo condiciones ácidas o básicas. Las reacciones de acilación, alquilación, arilación o amidación se producen con facilidad con grupos amino, tal como el grupo amino primario del péptido o el grupo amino de los residuos lisina. El grupo fenólico de la tirosina puede halogenarse o nitratarse. Entre los ejemplos en los que podría reducirse la solubilidad de un péptido se incluyen acilar residuos de lisina cargados o acetilar los grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico. Los péptidos pueden conjugarse con moléculas portadores solubles o insolubles para modificar sus propiedades de solubilidad según resulte necesario, y para incrementar las concentraciones locales de los péptidos en las áreas diana de los mismos. Las composiciones de péptidos de la invención también pueden inyectarse en el sistema vascular de una planta. Entre los ejemplos de moléculas portadores solubles se incluyen polímeros de polietilenglicol y polivinilpirrolidona. Entre los ejemplos de polímeros insolubles se incluyen arena u otros silicatos o poliestireno, celulosa o similares. Los péptidos también pueden microencapsularse para incrementar su estabilidad durante la aplicación en semillas, suelo o plantas. Típicamente se utilizan microesferas de poliéster para encapsular y estabilizar los péptidos.

Ejemplo XIII Síntesis a gran escala de péptidos

Se lleva a cabo la síntesis a gran escala (hasta 60 kg) de péptidos en solución o en fase sólida tras la selección de composiciones particulares de péptidos para la utilización masiva. Esta síntesis requiere una selección cuidadosa de grupos protectores y procedimientos de condensación. Todos los materiales de partida y reactivos pueden obtenerse con buena pureza a partir de suministradores químicos, tales como Sigma Chemical Co. O Aldrich Chemical Co. La racemización de los bloques de construcción aminoácidos bajo condiciones de acoplamiento puede suprimirse en gran medida o eliminarse mediante la utilización de reactivos de nueva generación, es decir HOBt, HOAt, HBTU o HATU. Incluso la metodología en fase sólida en la actualidad se encuentra convenientemente desarrollada para preparar péptidos farmacéuticos en múltiples de 1 a 10 kg/año.

Síntesis a gran escala de péptidos en solución. La síntesis en fase sólida permite la fácil planificación con respecto a la estrategia de protección de grupos, selección de fragmentos y procedimientos de acoplamiento de fragmentos para minimizar la racemización. Los intermediarios en ocasiones pueden aislarse simplemente mediante técnicas de cristalización, que pueden eliminar la necesidad de purificación mediante cromatografía de columna y por lo tanto mejorar el potencial de escalado. La calidad de los fragmentos producidos simultáneamente puede controlarse con facilidad en cada etapa.

Síntesis de péptidos en fase sólida a gran escala. El coste de los polímeros más avanzados de la síntesis en fase sólida habitualmente es elevado. Algunos de los soportes no se encuentran disponible en masa. Sin embargo, las propiedades de los mismos desempeñan un papel importante en la accesibilidad del péptido anclado y en la liberación del péptido de la resina en una forma completamente protegida, desprotegida o modificada. La transición de la escala de laboratorio a la de fabricación de la síntesis de péptidos en fase sólida (SPSS) resulta claramente ventajosa debido al hecho de que el procedimiento sintético entero podría automatizarse con facilidad, y podría realizarse el seguimiento y la optimización de la eficiencia de las etapas sintéticas. Los procesos activadores a escala productiva son bien conocidos y ambientalmente inocuos. Además, SPSS permite la recuperación directa y el reciclado del exceso de bloques de construcción aminoácidos a partir de los filtrados de los residuos a escala productiva.

Las referencias siguientes se incorporan específicamente como referencia a la presente invención:

Boris Group, "Production of large-scale peptides in solution", Biochem. Soc. Trans. 18(6):1299-306; Christian Birr, "The transition to solid-phase production of pharmaceutical peptides", Biochem. Soc. Trans. 18(6):1313-16, y Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio y Ernest Giralt, "Convergent solid-phase peptide synthesis", Tetrahedron 49(48):11065-11133. En el caso de que deban intentarse síntesis a gran escala de las composiciones de péptidos de la invención, deben seguirse los procedimientos y materiales citados en dichas referencias.

Evidentemente, en el caso de que se haya determinado que un péptido de L-aminoácidos resulta suficientemente inhibidor (con o sin estabilización), puede resultar posible utilizar expresión de ADN recombinante siguiendo técnicas bien conocidas por los expertos en la materia para producir dichos péptidos en cantidades de gran escala. En el caso de que se produzcan péptidos recombinantes y se desee la estabilidad de dichos péptidos, el péptido puede protegerse del ataque en ambos extremos uniendo covalentemente D-aminoácidos a uno o a ambos extremos utilizando técnicas conocidos por los expertos en la materia de la química de los péptidos.

Ejemplo XVI Tratamiento de las semillas

También se da a conocer un procedimiento para proteger las semillas. El procedimiento de recubrimiento de semillas con un compuesto antimicrobiano es bien conocido por los expertos en la materia. Cualquier procedimiento convencional que no destruye el ingrediente activo resulta adecuado para los fines de la presente invención. Un procedimiento fácil y preferido consiste en suspender o disolver el ingrediente activo en metilcelulosa acuosa al 1,0-1,5%. Se añaden las semillas que deben protegerse a la suspensión y se mezclan vigorosamente con la misma para recubrir la superficie de las semillas con la suspensión. A continuación se secan las semillas. Las semillas se encuentran protegidas de las infecciones fúngicas tras la germinación debido a que el material de recubrimiento sitúa el ingrediente activo en posición inmediatamente contigua a las semillas.

Se determinan las concentraciones efectivas del ingrediente activo mediante la mezcla de cantidades diversas del ingrediente activo en la mezcla de recubrimiento líquida y recubriendo lotes de semillas. A continuación, se plantan las semillas en el suelo y se retan con microorganismos causantes de enfermedad. Se determina la tasa de germinación de las semillas y se determina una concentración mínima de ingrediente activo cuando rinde tasas de germinación estadísticamente mejoradas. También pueden determinarse tasas de supervivencia de las plántulas y de la planta en general. Pueden utilizarse concentraciones más elevadas del agente antimicrobiano si se demuestra que incrementan la supervivencia de las plántulas o plantas o si incrementan los rendimientos de plantas.

Pueden utilizarse otros procedimientos para controlar las infecciones fúngicas agrícolas. Los microorganismos pueden ponerse en contacto directamente con una cantidad efectiva de una composición de ingrediente activo de la presente invención, típicamente disuelta en el portador apropiado. Son conocidos de la técnica ejemplos de portadores apropiados y pueden comprender tampón fosfato o solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico.

El tratamiento de las semillas por medio de la aplicación de materiales químicos, biológicos o una combinación de los mismos, sobre las semillas con el fin de protegerlas frente al ataque por patógenos e insectos presentes en el suelo, típicamente puede llevarse a cabo utilizando dos procedimientos de aplicación comunes:

(1) Recubrimiento comercial por las compañías de semillas. Los tratadores comerciales normalmente crean una suspensión del material de péptidos en agua y aplican la suspensión en forma de pulverización sobre las semillas. A continuación, secan las semillas y las embolsan para su comercialización.

(2) También puede utilizarse un procedimiento de caja de tolva. El cultivador aplica el material de péptidos antes del plantado. El material se rocía en forma de polvos secos sobre la parte superior de la caja de tolva. Típicamente se introduce la mitad de las semillas en la caja de tolva, la mitad del fungicida, después el resto de las semillas y finalmente el resto de fungicida.

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Referencias citadas

Las siguientes referencias proporcionan detalles de procedimientos adicionales a los establecidos en la presente memoria, y por ello están incorporados específicamente a continuación:

Caux, P. Y., P. Weinberger, y D. B. Carlisle. 1988. A physiological study of the effects of triton surfactants on Lemna minor L. Environmental Toxicology and Chemistry 7:671-676.

Cull, MV. G., J. F. Miller, y P. J. Schatz. 1992. Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869.

Fiedler, H. P., R. Kurth, J. Langharig, J. Delzer, y H. Zahner. 1982. Nikomycins: microbial inhibitors of chitin synthase. J. Chem. Technol. Biotechnol. 32:271-280.

Furka, A., F. Sebastyen, M. Asgedom, y G. Dibo. 1991. General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Pept. Protein Res. 37:487-493.

Gramsch, C., T. Meo, G. Riethmuller, y A. Herz. 1983. Binding characteristics of a monoclonal b-endorphin antibody recognizing the N-terminus of opioid peptides. J. Neurochem. 40:1220-1226.

Houghten, R. A., C. Pinilla, S. E. Blondelle, J. R. Appel, C. T. Dooley, y J. H. Cuervo. 1991. Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery. Nature 354:84-86.

Houghten, R. A., J. R. Appel, S. E. Blondelle, J. H. Cuervo, C. T. Dooley, y C. Pinilla. 1992. The use of synthetic peptide combination libraries for the identification of bioactive peptides. BioTechniques 13:412-421.

Houghten, R.A., Blondelle, S.E., Cuervo, J.H., en Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis. Canterbury; Epton, R., Ed., Solid Phase Conference Coordination, Ltd.: Canterbury, 1992.

Isono, K. and S. Suzuki. 1979. The polyoxins: pyrimidine nucleoside peptide antibiotics inhibiting fungal cell wall biosynthesis. Heterocycles 13:333-351.

Lerner, R. A. 1982. tapping the immunological repertoire to produce antibodies of predetermined specificity. Nature 299:592-596.

Maron, D. M., y B. N. Ames. 1983. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat. Res.: 173-215.

Pinilla, C., J.R. Appel, and R. A. Houghten. 1992. Synthetic peptide combinatorial libraries: the screening of tens of millions of peptides for basic research and drug discovery. in Vaccines 92; Brown, F., Chanock, R.M., Ginsberg,

H.S., Lerner, R.A., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992 página 25 y siguientes.

Rossman, T. G., M. Molina, y L. W. Meyer. 1984. the genetic toxicology of metal compounds. I. Induction of lambda prophage in E. coli WP2, Environ. Mutagen. 6:59-69.

Wang, W. 1991. Ammonia toxicity to macrophytes (common duckweeds and rice) using static and renewal methods. Environmental Toxicology and Chemistry 10:1173-1177.

Zasloff, M. 1987. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: Isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5449-5453.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: David L. Edwards

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 7 Inwood Oaks

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Antonio

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(D)

ESTADO: Texas

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78248

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (210) 691-2868

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: (210) 697-9942

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Antibióticos sintéticos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 47

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn emisión nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Phe His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa His Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Ile Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Phe Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Trp Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Met Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Arg Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa His Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Thr Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Phe Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Ser Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Ile Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Leu Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Ala Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Trp Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Met Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe His Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 36

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 37

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 38

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 39

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe His Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 40

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile His Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 41

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Leu Lys Phe His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 43

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 44

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 45

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 46

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Phe Lys Leu Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 47

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Phe Lys Leu Arg Phe}

Claims (10)

1. Antibiótico que comprende por lo menos uno de los péptidos de las SEC. ID nº 32 a 47.

2. Antibiótico según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de los aminoácidos que comprende dicho péptido es un estereoisómero D.

3. Antibiótico según la reivindicación 1, que comprende además un portador.

4. Antibiótico según la reivindicación 3, en el que dicho portador comprende además una microesfera.

5. Antibiótico según la reivindicación 1, capaz de inhibir el crecimiento de un hongo.

6. Antibiótico según la reivindicación 5, en el que dicho hongo se selecciona de entre Fusarium, Rhizoctonia, Ceratocystis, Pythium, Mycosphaerella y Candida.

7. Procedimiento para inhibir el crecimiento de una célula fúngica en una planta, que comprende poner en contacto dicha célula con por lo menos uno de los péptidos de las SEC. ID nº 32 a 47, en el que dicha célula fúngica es un patógeno de una planta.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha célula fúngica se selecciona de entre Fusarium, Rhizoctonia, Ceratocystis, Pythium, Mycosphaerella y Candida.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha planta es una semilla.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha planta es un cuerpo fructífero.