ES2293941T3 - Procedimiento para activar una quinasa. - Google Patents
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Abstract
Un método para rastrear compuestos que inhiben la señalización por RAC-PK, que comprende exponer a los compuestos células que contienen RAC-PK recombinante constitutivamente activa, en el que la RAC-PK recombinante constitutivamente activa es una proteína de RAC-PK en la que al menos un residuo de treonina o serina implicado en la activación de la quinasa a través de la fosforilación in vivo se reemplaza por un residuo de aminoácido ácido.
Description
Procedimiento para activar una quinasa.
La presente invención se refiere a un método
para producir una forma activa de una quinasa implicada en una ruta
de señalización dependiente de insulina, y al uso de la quinasa
activada en técnicas de rastreo.
La fosforilación y la desfosforilación de
proteínas son procesos fundamentales para la regulación de las
funciones celulares. La fosforilación de proteínas está
notablemente implicada en la transducción de señales, donde señales
extracelulares se propagan y se amplifican mediante una cascada de
fosforilación y desfosforilación de proteínas. Dos de las rutas de
transducción de señales mejor caracterizadas implican la proteína
quinasa dependiente de c-AMP (PKA) y la proteína
quinasa C (PKC). Cada ruta usa una molécula de segundo mensajero
diferente para activar la proteína quinasa, que, a su vez, fosforila
moléculas diana específicas.
Una nueva subfamilia de serina/treonina quinasas
se ha identificado y clonado recientemente, denominada en la
presente memoria RAC quinasas (RAC-PK; Jones y otros
(1991) Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 4171-4175;
Jones y otros (1991) Cell Regulation 2, 1001-1009),
pero también conocida como PKB o Akt. Las RAC quinasas se han
identificado en dosis o formas estrechamente relacionadas,
RAC\alpha y RAC\beta, que comparten 90% de homología en la
secuencia génica. La RAC\alpha de ratón (c-akt) es
el homólogo celular del oncogén viral v-akt,
generado mediante la fusión de la proteína Gag del retrovirus AKT8
con el extremo N de c-akt múrida. Se encuentra que
la RAC\beta humana está implicada en aproximadamente 10% de los
carcinomas ováricos, sugiriendo una implicación de las RAC quinasas
en la regulación del crecimiento celular.
Otra quinasa implicada en el control del
crecimiento celular es la S6 quinasa, conocida como p70^{S6K}. La
S6 quinasa fosforila la proteína ribosómica 40S, S6, un episodio que
regula al alza la síntesis de proteínas y se cree que se requiere
para la progresión a través de la fase G_{1} del ciclo celular. La
actividad de p70^{S6K} es regulada por la fosforilación por
serina/treonina de la misma, y es ella misma una serina/treonina
quinasa. Se cree que la ruta de señalización de p70^{S6K} consiste
en una serie de serina/treonina quinasas que activan cada una a la
otra por turnos y que conducen a una variedad de efectos asociados
con la proliferación y el crecimiento celular. Se cree que la
RAC-PK está en la misma ruta de señalización que
p70^{S6K}, pero aguas arriba de la misma.
Según se indica en la solicitud de Patente del
Reino Unido 9523379.9 (Ciba-Geigy AG),
presentada el 16 de noviembre de 1995, RAC-PK
representa un papel principal en la transducción de señales
dependiente de insulina, que es importante en un número de
funciones incluyendo la regulación del crecimiento celular y el
metabolismo del glicógeno. Por ejemplo, la glicógeno sintasa
quinasa-3 (GSK3), que es responsable de la
activación de glicógeno sintasa, es una diana para
RAC-PK.
Cuando se aíslan de fuentes naturales,
especialmente fuentes convenientes tales como células de cultivo
tisular, RAC-PK y otras quinasas de señalización
están normalmente en estado inactivo. Para aislar proteínas de
quinasa activas, es necesario estimular las células para encender
la ruta de señalización para dar quinasa activa. Por otra parte,
cuando se usan células que expresan enzimas quinasa en ensayos de
activación de quinasas, es necesario emplear agentes activantes
antes de efectuar el ensayo. Así, las células normalmente se
estimulan con mitógenos y/o agentes activantes, tales como
IL-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor
de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Tales agentes son
costosos y, cuando se desea producir quinasas activas o activar
células en grandes cantidades, el uso de tales agentes es poco
ventajoso.
El rastreo de posibles compuestos para la
actividad como inhibidores de RAC-PK u otras
quinasas de señalización para identificar posibles agentes
inmunosupresores o antiproliferativos requiere un suministro
abundante de proteína de quinasa. Usando la tecnología actual, es
posible producir grandes cantidades virtualmente de cualquier
proteína deseada en sistemas de expresión de DNA recombinante. En el
caso de quinasas tales como aquellas con las que tratamos
actualmente, sin embargo, tales sistemas son insatisfactorios debido
a que las proteínas producidas estarían desfosforiladas y por lo
tanto serían inactivas. Por lo tanto, existe un requerimiento de
identificar un modo económico de producir proteínas de quinasa
desfosforiladas que puedan emplearse en procedimientos de
rastreo.
Se sabe (Janö y otros, (1988) Biochemistry, 85,
406-410) que el vanadato puede activar la propia
p70^{S6K}. Sin embargo, el mecanismo de esta activación se
desconoce. Se ha encontrado ahora que el vanadato actúa generalmente
sobre quinasas de señalización, activándolas y evitando la
desactivación por fosfatasas. Por otra parte, se ha encontrado que
el ácido okadaico, una clase diferente de compuesto con respecto al
vanadato que interactúa con proteínas diferentes, puede usarse para
un efecto similar.
La invención proporciona métodos para rastrear
posibles agentes inmunosupresores y antiproliferativos usando
quinasas así activadas.
Se ha observado que la modulación de la
actividad de RAC-PK parece estar afectada por la
fosforilación reversible, en la que el equilibrio de la reacción de
fosforilación/desfosforilación se desplaza para cambiar los niveles
de RAC-PK activa con respecto a su forma inactiva.
La acumulación de la forma activa puede promoverse por lo tanto
mediante la inhibición de la reacción de fosforilación, alcanzada
mediante el tratamiento con un inhibidor de fosfatasa.
Un aspecto sorprendente de la presente invención
es que inhibidores de tirosina fosfatasa, tales como vanadato, son
capaces de activar RAC-PK a pesar del hecho de que,
según se describe en la presente memoria, esta quinasa es activada
por fosforilación en residuos de treonina y serina.
Se sabe que el vanadato activa p70^{S6K}. De
acuerdo con esto, la invención no se extiende al uso de vanadato
para activa p70^{S6K}. Sin embargo, se describe el uso de
inhibidores de fosfatasa tales como ácido okadaico, que actúa a
través de un mecanismo totalmente diferente.
Según se menciona en la presente memoria, las
rutas de señalización son las cascadas de activación que finalmente
regulan la transducción de señales y las quinasas de estas rutas son
quinasas cuyas dianas in vivo incluyen al menos una entidad
que contribuye a tal transducción de señales. Preferiblemente, las
rutas de señalización de la invención son rutas de señalización
dependientes de insulina, que son responsables de la transducción
de señales a partir de insulina y otros factores de crecimiento. Sin
querer de ningún modo ninguna limitación a la presente invención,
se cree que una de tales rutas es promovida in vivo por
la unión de factores de crecimiento tales como insulina y similares
a sus receptores, lo que estimula entre otras cosas la
fosfatidilinositol-3-OH quinasa
(PI-3K). PI-3K a su vez fosforila
directamente o indirectamente RAC-PK, lo que conduce
indirectamente a la fosforilación final de p70^{S6K}.
El tratamiento de quinasas para activarlas
requiere la exposición de la quinasa a un agente fosforilante, tal
como otra quinasa de la ruta de señalización, y al inhibidor de
fosfatasa. Esto puede efectuarse, por ejemplo, in vitro
- (a)
- incubando conjuntamente una quinasa de una ruta de señalización, un agente capaz de fosforilar la quinasa para activarla y un inhibidor de fosfatasa; y
- (b)
- purificando la quinasa de la mezcla de incubación.
El agente fosforilante debe ser eficaz para
fosforilar la quinasa en residuos que conducen a la activación de
la misma. En el caso de RAC-PK, el agente
fosforilante elige como diana ventajosamente residuos de serina y
treonina.
Preferiblemente, el agente fosforilante es una o
más quinasas de la ruta de señalización que actúa, en presencia de
factores activantes adecuados, para fosforilar y de ese modo activar
la quinasa de interés. Preferiblemente, esto se efectúa recuperando
enzima quinasa activa de células tratadas con inhibidor de
fosfatasa, que contienen las quinasas de la ruta de señalización
requeridas.
En el contexto de la presente memoria
descriptiva, in vitro significa que el experimento se efectúa
fuera de un organismo o célula vivos. In vivo incluye
cultivo celular. El tratamiento de células in vivo con
inhibidores de fosfatasa es especialmente eficaz para la
preparación de RAC-PK activa. Sin embargo, puesto
que RAC-PK y otras quinasas de señalización, por
ejemplo p70^{S6K}, están en la misma ruta, la activación de
RAC-PK da como resultado la activación de otras
quinasas en la misma ruta de señalización, por ejemplo la propia
p70^{S6K}. Por lo tanto, se describe un método para activar
quinasas en rutas de señalización en general, excepto para
p70^{S6K}, especialmente cuando tales quinasas están aguas abajo
de RAC-PK en la ruta.
Células que producen quinasas que pueden usarse
en la presente invención incluyen generalmente cualquier línea
celular de origen mamífero, especialmente líneas celulares de
fibroblastos tales como RAT-1, COS o NIH 3T3. Las
células Swiss 3T3 son particularmente preferidas. Cuando se usan
líneas celulares humanas, se prefieren células 293 de riñón
embrionario humano.
Los inhibidores de fosfatasa son agentes que
inhiben la desfosforilación de proteínas inhibiendo la actividad de
enzimas fosfatasa. Una fosfatasa tiene esencialmente la actividad
inversa que una quinasa, y retira grupos fosfato.
Ejemplos de inhibidores de fosfatasa son
vanadato y ácido okadaico, siendo el vanadato el agente más eficaz
en el caso de RAC-PK. Sin embargo, se cree que la
acción del vanadato es indirecta, ya que es un inhibidor de
tirosina fosfatasa específico y la RAC-PK no parece
ser estimulada por la fosforilación de tirosina. El ácido okadaico,
por otra parte, que se sabe que actúa directamente sobre fosfatasa
PP2A, parece inhibir directamente la desfosforilación de
RAC-PK.
El inhibidor de fosfatasa se administra a
células en su medio de crecimiento normal, que puede estar libre de
suero. Se observa que el suero por sí mismo estimula la actividad de
quinasas, pero es costoso y su función puede sustituirse por un
inhibidor de fosfatasa de acuerdo con la presente invención.
Concentraciones adecuadas de inhibidores de fosfatasa incluyen
niveles de 0,01 mM a 10 mM, preferiblemente de 0,1 mM a 1 mM. La
concentración más preferida para el vanadato es 0,1 mM.
El método de la invención puede comprender
etapas adicionales destinadas a aislar la quinasa activa deseada de
las células en las que se produce. Tales etapas son procedimientos
convencionales familiares para los expertos en la técnica y pueden
sustituir a procedimientos equivalentes dentro del alcance de la
invención. Sin embargo, el procedimiento preferido comprende las
etapas de homogeneizar las células, retirar residuo celular (por
ejemplo, mediante centrifugación) y separar la quinasa deseada
mediante purificación por afinidad.
La homogeneización puede llevarse a cabo en un
tampón de lisis isotónico estándar, que contiene ventajosamente un
inhibidor de proteinasa tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo
(PMSF) y un inhibidor de fosfatasa para inhibir la desactivación de
la quinasa durante el procedimiento de purificación. Las células se
rompen, liberando de ese modo los contenidos citoplásmico y nuclear
de las mismas en el tampón de lisis.
El residuo celular se retira a continuación
ventajosamente de la preparación celular sometida a lisis,
preferiblemente centrifugando la mezcla para formar pellas de toda
la materia en partículas. Solo la fracción soluble permanece en el
sobrenadante.
El sobrenadante puede someterse a continuación a
técnicas de purificación de proteínas estándar para aislar la
quinasa de interés, si se desea. Métodos preferidos, especialmente
para preparaciones de volumen relativamente bajo, implican
cromatografía por afinidad. Tales técnicas pueden emplear un
anticuerpo antiquinasa o un antisuero inmovilizado en una matriz
adecuada. Pueden emplearse otros agentes de unión inmovilizados,
tales como análogos de sustrato.
Anticuerpos útiles para la inmunoseparación de
quinasas activadas de acuerdo con la invención pueden prepararse de
acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad. Para preparar un
suero policlonal, por ejemplo, una porción antigénica de la quinasa
deseada, que consiste en un péptido derivado de la misma, tal como
un péptido C-terminal, o incluso la quinasa entera,
opcionalmente en presencia de un adyuvante o conjugada a un agente
inmunoestimulante tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura,
se inyecta en un mamífero, tal como un ratón o un conejo, y los
anticuerpos se recuperan del mismo mediante purificación por
afinidad usando una quinasa o una porción antigénica de la misma
unida a la fase sólida. Los anticuerpos monoclonales pueden
prepararse de acuerdo con procedimientos establecidos.
Alternativamente, y especialmente para
preparaciones a mayor escala, pueden usarse procedimientos de
separación que no implican cromatografía de afinidad.
Por ejemplo, están disponibles en la técnica
numerosos métodos para separar polipéptidos basándose en el tamaño,
tales como cromatografía y electroforesis en gel. Se prefieren
métodos que realizan una función de purificación así como una
función de separación por tamaños, mientras que no introducen
contaminantes inaceptables. Así, se prefieren métodos tales como
centrifugación en gradiente por etapas o continua, particularmente
usando gradientes de sacarosa, técnicas de diálisis usando
membranas de poro controlado y centrifugación con membrana
(Amicon). Sin embargo, se prefiere especialmente la cromatografía de
exclusión por tamaño, típicamente realizada usando cuentas porosas
como soporte cromatográfico. La cromatografía de exclusión por
tamaño es descrita, por ejemplo, por Stellwagen, en Deutscher
(1990) Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., San
Diego, CA, USA, 317-328.
Métodos de purificación alternativos, descritos
en general en Deutscher (1990), incluyen cromatografía basada en la
separación por diferencia de carga, tal como cromatografía de
intercambio iónico usando un grupo de intercambio tal como DEAE o
CM unido a un material de relleno en fase sólida tal como celulosa,
dextrano, agarosa o poliestireno. Otros métodos incluyen
cromatografía en columna de hidroxiapatito (véase, por ejemplo,
Gorbunoff, (1985) Methods in Enzymology, 117,
370-380) y cromatografía de afinidad general usando
cuentas de vidrio o colorantes reactivos como agentes de
afinidad.
Ventajosamente, puede emplearse cromatografía de
intercambio catiónico, de modo que la elución de la proteína puede
adaptarse para tener en cuenta el pI conocido o estimado de la
quinasa en cuestión. El pI para cualquier quinasa puede
determinarse experimentalmente, mediante enfoque isoeléctrico. De
esta manera, es posible eluir selectivamente de la resina de
intercambio catiónico aquellas proteínas que tienen un pI en o
alrededor del de la quinasa, lo que da como resultado un alto grado
de purificación.
La invención proporciona además el uso de una
quinasa activa preparada de acuerdo con la invención en un método
para rastrear moduladores potenciales de rutas de señalización. Así,
el método reivindicado puede comprender la etapa adicional de
exponer la quinasa a un inhibidor potencial y subsiguientemente
evaluar la actividad de la quinasa para determinar la eficacia del
modulador.
Se describe en la presente memoria un método
para rastrear posibles moduladores de rutas de señalización, que
comprende:
- (a)
- incubar conjuntamente una quinasa de una ruta de señalización y un inhibidor de fosfatasa;
- (b)
- añadir un posible modulador de la ruta de señalización; y
- (c)
- determinar la actividad de la quinasa.
La exposición al modulador puede realizarse
sobre la quinasa activada o inactivada bien en un ambiente libre de
células, opcionalmente después de la purificación de la quinasa de
la preparación celular en bruto, o bien in situ en las
células que producen la quinasa, después de la activación con
inhibidor de fosfatasa. Por lo tanto, las etapas (a) y (b) pueden
invertirse o efectuarse contemporáneamente.
En la etapa (a), especialmente si el ensayo ha
de realizarse in vitro, un agente capaz de fosforilar la
quinasa puede añadirse a la mezcla de incubación. Los inhibidores
de fosfatasa activan las quinasas evitando la desfosforilación, de
modo que se requerirá un agente fosforilante. Ventajosamente, el
agente fosforilante es una quinasa de una ruta de señalización
dependiente de insulina o un análogo de la misma. Por otra parte,
pueden requerirse factores para iniciar o ayudar a la transducción
de señales en la ruta de señalización. Por ejemplo, si el compuesto
que se prueba es un análogo de rapamicina que se une a FKBP, se
requerirá FKBP en la mezcla de incubación.
Preferiblemente, sin embargo, el procedimiento
se lleva a cabo in vivo en células que contienen quinasas de
la ruta de señalización. En tal ensayo, el inhibidor de fosfatasa
reemplaza al suero u otros agentes previamente empleados como
agentes estimulantes externos para activar fosfatasa de la ruta de
señalización.
La actividad de la quinasa puede evaluarse por
medio de un ensayo de actividad de quinasa, empleando un sustrato
para la quinasa. Por ejemplo, puede usarse proteína básica de
mielina, de acuerdo con procedimientos de ensayo establecidos.
También pueden usarse sustratos fisiológicos, tales como la
subunidad ribosómica 40S, o S6. Alternativamente, la actividad de
la quinasa puede evaluarse determinando el grado de fosforilación de
la quinasa. Ventajosamente, se evalúa la fosforilación sobre
residuos normalmente implicados en la activación de la quinasa. La
activación de tales residuos, que es parte de la presente invención,
se indica posteriormente.
El ensayo de la invención puede usarse para
medir el efecto directo del posible compuesto sobre la quinasa
ensayada, o puede usarse para determinar el efecto del compuesto
sobre una quinasa que actúa aguas arriba de la misma en la ruta de
señalización. En la última situación, la quinasa ensayada actúa como
un sustrato para la quinasa aguas arriba y la actividad de la
quinasa aguas arriba se evalúa determinando el estado de
fosforilación o la actividad de la quinasa ensayada.
Para obtener un resultado significativo, la
actividad de la quinasa ensayada expuesta al posible modulador de
la ruta de señalización debe compararse con la actividad de la
quinasa no expuesta al agente, siendo una inhibición de la
actividad de quinasa indicativa de potencial como un inmunosupresor
o antiproliferativo.
Los compuestos que demuestran niveles elevados
de inhibición de quinasa pueden ensayarse a continuación
adicionalmente determinando las propiedades inmunosupresoras o
antiproliferativas de los mismos directamente, por ejemplo por
medio de un ensayo de inhibición de la proliferación celular. Tal
ensayo implica preferiblemente la determinación física de la
proliferación de células T en células que se han sometido a
actividad de quinasa mediante un inhibidor de fosfatasa, se han
expuesto al posible inhibidor de quinasa y opcionalmente se han
estimulado subsiguientemente con un mitógeno, tal como un factor de
crecimiento, IL-2 o PMA. Más simplemente, el ensayo
puede implicar la exposición de células no estimuladas al posible
inhibidor, seguido por estimulación con un inhibidor de
fosfatasa.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se ha
podido determinar qué sitios son importantes para la fosforilación
de quinasas, particularmente las de la familia
p70^{S6K}/RAC-PK. Sorprendentemente, la mayoría de
la fosforilación activante parece tener lugar sobre residuos de
serina y treonina. Se sabe que la fosforilación puede en ciertos
casos ser imitada por la sustitución del amino fosforilado por un
aminoácido ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico.
La invención proporciona de acuerdo con esto una
proteína de RAC-PK recombinante en la que al menos
un residuo de treonina implicado en la activación de la quinasa a
través de fosforilación in vivo se reemplaza por un residuo
de aminoácido ácido. Por otra parte, la invención proporciona un
método para rastrear compuestos que inhiben la señalización por
RAC-PK, que comprende exponer células que contienen
la RAC-PK recombinante constitutivamente activa a
los compuestos.
Por ejemplo, un residuo activador importante es
T308, presente en el llamado bucle T entre los subdominios 7 y 8 de
la quinasa. Una guía general para la estructura de quinasas se da en
Woodgett (1994), Protein Kinases, IRL Press, Reino Unido. La
sustitución de T308 por ácido aspártico da como resultado un
incremento claro en la actividad basal de la quinasa, que sin
embargo retiene un potencial para una activación adicional. Por lo
tanto, la invención proporciona una proteína de RAC quinasa en la
que Thr308 se ha mutado por Asp.
Preferiblemente, Ser473 se muta adicionalmente
por Asp. La fosforilación de este residuo se requiere para la
activación total de RAC-PK in vivo, y el
doble mutante T308/S473 (ambos residuos convertidos en Asp) muestra
una actividad constitutiva 18 veces superior que
RAC-PK natural. El mutante doble no retiene la
capacidad para una activación adicional.
Las mutaciones pueden llevarse a cabo por medio
de cualquier técnica adecuada. Sin embargo, se prefiere la
mutagénesis dirigida al sitio in vitro de una secuencia de
nucleótidos que codifica RAC y la expresión subsiguiente de RAC en
un sistema de expresión de DNA recombinante. Este método es un
procedimiento de mutagénesis in vitro por el que puede
alterarse un sitio definido dentro de una región de DNA clonal (cfr.
los artículos de revisión de M.J. Zoller y M. Smith, Methods
Enzymol. (1983), 100, 468; D. Botstein y D. Shortle, Science (1985),
229, 1193). Los métodos para la mutagénesis dirigida al sitio son
bien conocidos por los expertos en la técnica, según se ejemplifica
por Sambrook (1989): Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, NY, EE.UU. de A., y el número de estuches de
mutagénesis in vitro disponibles comercialmente.
Las quinasas constitutivamente activas de
acuerdo con la invención se emplean en lugar de la quinasa activada
por inhibidor de fosfatasa en técnicas de rastreo como las descritas
en la presente memoria. Ventajosamente, tales quinasas activadas
constitutivamente no requieren agentes estimulantes externos.
La invención se describe adicionalmente, solo
con propósitos de ilustración, en los siguientes ejemplos.
La línea celular Swiss 3T3
(\check{S}u\check{s}a, M. y Thomas, G. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 7040-7044) se utiliza para investigar
la posible implicación de RAC-PK en la señalización
de factores de crecimiento. Células Swiss 3T3 quiescentes se privan
de suero durante 24 horas, seguido por estimulación con FCS al
10%.
- (a)
- La actividad de quinasa se evalúa inmunoprecipitando RAC-PK y ensayando la quinasa usando proteína básica de mielina como sustrato. Brevemente, se preparan extractos libres de células rascando células preconfluentes en TBS enfriada con hielo, sometiendo a lisis las células en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1,0%, EGTA 2 mM, PMSF 1 mM, leupeptina 20 \muM, aprotinina 20 \muM y molibdato 10 \muM. Los lisados se centrifugan durante 15 min a 12.000 x g a 4ºC. La RAC-PKa se inmunoprecipita de extractos clarificados con pasorbina usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para el extremo C conservado (anti-RAC^{469-480}; Jones y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175) producido inyectando a los ratones subcutáneamente el péptido FPQFSYSASSTA acoplado a hemocianina de lapa de ojo de cerradura y se purifica mediante precipitación usando (NH_{4})_{2}SO_{4} al 50% seguido por cromatografía de afinidad sobre una columna Affigel® 10 (Bio-Rad) acoplada a RAC-PK. Estos antisueros también reconocen la isoforma b/AKT2, debido a que su extremo C difiere del de RAC-PKa en los tres últimos aminoácidos. La actividad de RAC-PK se ensaya como se describe previamente usando proteína básica de mielina como sustrato (Jones y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175). Los extractos se incuban durante 2 h a 4ºC con el antisuero (2 \mug/100 \mul de extracto), los inmunoprecipitados se recogen usando proteína A-Sepharose y se lavan con tampón de lisis. Las cuentas de proteína-Sepharose se resuspenden en 100 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, molibdato 10 \muM y 35 \mul se usan para el ensayo de quinasa, como sigue:
- Las mezclas de reacción en un volumen final de 50 \mul contienen Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, inhibidor de proteína quinasa 1 mM, péptido PKI, 25 \mug de proteína básica de mielina (MBP-Sigma) (\gamma-^{32}P) ATP 50 \muM (3500 cpm/pmol) y 35 \mul de inmunoprecipitado procedente de extractos libres de células o fracciones purificadas de RAC proteína quinasa. Después de la incubación a 30ºC durante 10, 30 ó 60 minutos, las muestras se analizan mediante SDS al 12%/PAGE seguido por autorradiografía y se cuantifican mediante conteo por centelleo de las bandas de MBP fosforilada.
- Se encuentra que la actividad de RAC-PK inmunoprecipitada es de 2 a 4 veces superior en células estimuladas con suero frente a células quiescentes. La activación se produce en menos de 5 min y la actividad de quinasa permanece elevada durante al menos 120 min.
- (b)
- La activación coincide con la movilidad disminuida de RAC-PK en SDS-PAGE. Para determinar qué formas están presentes en geles de SDS-PAGE, se realiza inmunotransferencia usando antisueros anti-RAC-PK preparados como anteriormente. Los extractos celulares y los inmunoprecipitados se resuelven mediante SDS al 7,5%-PAGE, se transfieren a membranas Immobilon-P (Millipore) y se incuban con el anticuerpo anti-RAC^{469-480}. La detección se realiza usando anticuerpo anticonejo conjugado a fosfatasa alcalina.
- Al menos tres formas diferentes pueden detectarse mediante análisis de inmunotransferencia, denominadas a, b y c. La quinasa procedente de células quiescentes migra como un doblete de las formas a y b y durante la estimulación aparece una forma c que migra más lentamente, seguido por desaparición de la forma a. Estos resultados sugieren que la actividad de RAC-PK está modulada por fosforilación reversible.
- (c)
- Para probar esta posibilidad, se examinan los efectos in vivo de los inhibidores de fosfatasa ácido okadaico y vanadato sobre RAC-PK procedente de células Swiss 3T3. Las células se privan de suero durante 24 h, seguido por estimulación con ácido okadaico 1 \muM o vanadato 0,1 mM preparado con H_{2}O_{2} 0,1 mM (Posner y otros (1994) J. Biol. Chem. 269, 4596-4604), opcionalmente junto con FCS al 10%. El tratamiento de las células con ácido okadaico, un inhibidor específico de PP2A y PP1, induce un incremento de 3 veces en la actividad de RAC-PK y disminuye la movilidad electroforética. El tratamiento simultáneo con ácido okadaico 1 \muM y suero al 10% provoca una activación de 5 veces y una alteración mayor de la movilidad electroforética. Se observa una activación de 11 veces después del tratamiento con vanadato 0,1 mM, que convierte la mayor parte de la proteína en la forma que migra más lentamente c.
Para confirmar que las múltiples formas de
movilidad electroforética reflejan diferentes estados de la
fosforilación de la quinasa, RAC-PK se
inmunoprecipita a partir de células Swiss 3T3 quiescentes y
estimuladas con vanadato marcadas con ^{32}P. Las células Swiss
3T3 se capturan en DMEM libre de fosfato/FCS según se describe
(\check{S}u\check{s}a, M. y Thomas, G. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 7040-7044) y se privan de suero durante
16 h antes de marcar con [^{32}P]ortofosfato durante
6-10 h (2 mCi por plato de 15 cm). La estimulación
se realiza con vanadato 0,1 mM. La cuantificación de la
fosforilación se realiza usando el software ImageQuant. El
tratamiento con vanadato conduce a un incremento de 3 a 4 veces en
la fosforilación, demostrando que las formas de movilidad b y c
representan RAC-PK fosforilada.
- (d)
- Para determinar qué residuos están fosforilados en RAC-PK activada, el análisis de fosforaminoácidos se lleva a cabo sobre células marcadas como anteriormente de acuerdo con Boyle y otros (1991) Methods Enzymol. 201, 110-149. La quinasa procedente de células capturadas aparece fosforilada principalmente sobre residuos de serina y en bajos niveles sobre treonina, con una relación de 12:1. La estimulación con vanadato conduce a un incremento en fosfoserina y en particular en el contenido de fosfotreonina, reduciendo la relación hasta 4:1. No se detecta fosfotirosina después de la estimulación con vanadato, ni mediante análisis de fosfoaminoácidos ni mediante análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-fosfotirosina. Estos resultados muestran que la RAC-PK es activada por un mecanismo de fosforilación. Por otra parte, se concluye que la actividad de RAC-PK mediada por vanadato es probablemente indirecta, ya que se sabe que el vanadato es un inhibidor de tirosina fosfatasa.
Para confirmar que la RAC-PK es
regulada por la fosforilación, se investigan los efectos del
tratamiento con proteína fosfatasa 2A (PP2A) sobre la quinasa
inmunoprecipitada a partir de células Swiss 3T3 quiescentes y
estimuladas con vanadato. Como el tratamiento de las células con
ácido okadaico 1 mM durante 2 h inactiva preferentemente PP2A en
vez de PP1, la RAC-PK se incuba bien con la
subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac) purificada o bien con el
dímero de PP2A que consiste en la subunidad PR65 catalítica y
reguladora (PP2A_{2}).
La RAC-PK inmunoprecipitada se
incuba con 0,3 U/ml de PP2Ac de músculo porcino o 1,7 U/ml de
PPA_{2} de músculo de conejo en 30 ml de tampón que contiene
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5,
b-mercaptoetanol al 1%, MnCl_{2} 1 mM,
benzamidina 1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM a 30ºC
durante 60 min (una unidad (U) se define como un nmol de Pi
liberado de la fosforilasa a por minuto). Las reacciones se detienen
mediante la adición de caliculina A 50 nM. Los complejos
inmunitarios formados se lavan con Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, benzamidina 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM y
caliculina A 50 nM y la RAC-PK se ensaya como se
describe anteriormente.
La desfosforilación de la RAC-PK
activada in vitro mediante PP2Ac da como resultado una
reducción de 84% de actividad de quinasa y un cambio concomitante
en la movilidad electroforética, convirtiendo la forma c en la b.
El tratamiento con PP2A_{2} conduce a una reducción de 92% de
actividad y restaura la movilidad de la proteína en
SDS-PAGE hasta el doblete a/b. Estos resultados
confirman que los cambios de actividad observados se alcanzan
mediante un mecanismo de fosforilación reversible. Por otra parte,
PP2A está indicada como un regulador potencial de la actividad de
RAC-PK in vivo.
En células Swiss 3T3, la RAC-PK
se activa mediante insulina (4,5 veces), de forma comparable a los
niveles detectados para p70^{s6k}. En contraste, la insulina
tiene poco o ningún efecto sobre p42^{mapk} y p44^{mapk} en
estas células, sugiriendo que RAC-PK y p70^{s6k}
pueden residir en la misma ruta de señalización, que es una ruta
diferente a la ruta de MAPK.
Para investigar esta posibilidad, se examinan
los efectos de wortmanina y rapamicina sobre la activación inducida
por suero de las dos quinasas. La wortmanina, un inhibidor de
fosfoinosítido (PI) 3-quinasa, y el inmunosupresor
rapamicina bloquean la activación de p70^{s6k} afectando al mismo
grupo de sitios de fosforilación.
La estimulación de fibroblastos Swiss 3T3
quiescentes conduce a una inducción de \sim4 veces de la actividad
de RAC-PK, mientras que el tratamiento con
wortmanina que precede a la estimulación con suero casi bloquea
completamente la activación. Por otra parte, el pretratamiento con
rapamicina no ejerce ningún efecto significativo sobre la
activación de RAC-PK. La wortmanina también bloquea
la aparición de la forma de movilidad más lenta de
RAC-PK que se observa después del tratamiento con
suero, mientras que la rapamicina no afecta a la movilidad de
RAC-PK. En el mismo experimento, el pretratamiento
con wortmanina y rapamicina abortan la activación de
p70^{s6k}.
Estos resultados sugieren que
RAC-PK puede estar aguas arriba de p70^{S6K} en la
ruta de señalización de p70^{S6K}, que es inhibida aguas arriba
de RAC-PK por wortmanina y aguas abajo de la misma
por rapamicina. Para examinar esta posibilidad, se investiga la
regulación de p70^{s6k} en un ensayo de contransfección
transitorio usando células 293 humanas. Se preparan constructos de
RAC-PK\alpha ligando el cDNA de
RAC-PKa (Jones y otros (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 4171-4175) en el marco a la metionina
iniciadora, en el vector de expresión mamífero pECE. El constructo
también se subclona en un vector de expresión conducido por el
promotor de CMV. El constructo se confirma mediante análisis de
restricción y secuenciación. Se obtienen constructos que expresan
p70^{s6k} etiquetados con Myc del Dr. G. Thomas (Friederich
Miescher Institut, Basel, Suiza). Los constructos se transfieren en
células COS usando procedimientos estándar. La coexpresión de
RAC-PKa con p70^{s6k}-Myc da como
resultado un incremento de 3,5 y 3 veces de la actividad de
p70^{s6k}-Myc basal y estimulada con insulina,
respectivamente.
Claims (7)
1. Un método para rastrear compuestos que
inhiben la señalización por RAC-PK, que comprende
exponer a los compuestos células que contienen
RAC-PK recombinante constitutivamente activa, en el
que la RAC-PK recombinante constitutivamente activa
es una proteína de RAC-PK en la que al menos un
residuo de treonina o serina implicado en la activación de la
quinasa a través de la fosforilación in vivo se reemplaza por
un residuo de aminoácido ácido.
2. Un método para rastrear posibles moduladores
de rutas de señalización que comprende:
- a.
- usar una quinasa constitutivamente activa;
- b.
- añadir un posible modulador de la ruta de señalización a (a); y
- c.
- determinar la actividad de la quinasa; en donde la quinasa constitutivamente activa comprende proteína de RAC-PK recombinante en la que al menos un residuo de treonina o serina implicado en la activación de la quinasa a través de fosforilación in vivo se reemplaza por un residuo de aminoácido ácido.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la actividad de la quinasa se evalúa por medio de un
ensayo de actividad de quinasa que emplea un sustrato para la
quinasa.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el sustrato para la quinasa comprende proteína básica de
mielina, subunidad ribosómica 40S, o S6.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2-4, en el que la exposición al
modulador de (b) sobre la quinasa activa de (a) se realiza in
situ o en células que producen la quinasa.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2-4, en el que la exposición al
modulador de (b) sobre la quinasa activa de (a) se realiza en un
ambiente libre de células, opcionalmente después de la purificación
de la quinasa de una preparación celular en bruto.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que el residuo de aminoácido
ácido es ácido aspártico o ácido glutámico.
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