DE69631690T2

DE69631690T2 - Verfahren zur aktivierung einer kinase

Info

Publication number: DE69631690T2
Application number: DE1996631690
Authority: DE
Inventors: Arthur Brian HEMMINGS; Mirjana Andjelkovic; Peter Cron-Hofmann
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2016-11-06
Also published as: ES2293941T3; EP1111056B1; DE69631690D1; ES2216071T3; ATE380244T1; DK0877818T3; AU7564496A; EP1111056A2; ATE260345T1; EP1111056A3; PT877818E; DE69637357D1; WO1997022716A1; PT1111056E; DE69637357T2; GB9525702D0; JP2001500722A; JP3745379B2; EP0877818A1; EP0877818B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven Form einer Kinase, die in einen Insulin-abhängigen Signalweg involviert ist, und auf die Verwendung der aktiven Kinase bei Screening-Techniken.
Hintergrund der Erfindung
Proteinphosphorylierung und -dephosphorylierung sind fundamentale Prozesse für die Regulierung zellulärer Funktionen. Die Proteinphosphorylierung ist überwiegend in die Signaltransduktion involviert, bei der extrazelluläre Signale durch eine Kaskade von Proteinphosphorylierung und -dephosphorylierung verbreitet und verstärkt werden. In zwei der am besten charakterisierten Signaltransduktionswege ist die c-AMP-abhängige Proteinkinase (PKA) und Proteinkinase C (PKC) involviert. Jeder Weg verwendet ein unterschiedliches Molekül eines sekundären Botenstoffes, um die Proteinkinase zu aktivieren, die wiederum spezifische Zielmoleküle phosphoryliert.
Eine neue Unterfamilie von Serin/Threoninkinasen wurde kürzlich identifiziert und geklont, hier bezeichnet als die RAC-Kinasen (RAC-PK; Jones et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171–4175; Jones et al. (1991), Cell Regulation 2, 1001–1009), ist aber auch als PKB oder Akt. bekannt. RAC-Kinasen wurden als zwei nahe verwandten Isoformen RACα und RACβ identifiziert, die 90% Homologie an der Gensequenz teilen. Die Maus-RACα (c-akt) ist das zelluläre Homolog für das virale Onkogen v-akt, hergestellt durch Fusion des Gag-Proteins aus dem AKT8-Retrovirus an den N-Terminus des Murin-c-akt. Es wird gefunden, dass menschliches RACβ in annähernd 10% der Ovarkarzinome involviert ist, was auf ein Involviertsein der RAC-Kinasen in der Zellwachstumsregulation hinweist.
Andere Kinasen, die in die Zellwachstumssteuerung verwickelt sind, ist die S6-Kinase, die als p70^S6K bekannt ist. Die S6-Kinase phosphoryliert das 40S-ribosomale Protein S6, ein Ereignis, das die Proteinsynthese hochreguliert und von dem geglaubt wird, dass es für die Progression durch die G₁-Phase des Zellzyklus erforderlich ist. Die Aktivität des p70^S6K wird durch die zugehörige Serin/Threoninphosphorylierung reguliert und es ist selbst eine Serin/Threoninkinase. Es wird geglaubt, dass der p70^S6K-Signalweg aus einer Reihe von Serin/Threoninkinasen besteht, die wiederum einander aktivieren und zu einer Vielzahl von Effekten führt, die mit der Zellproliferation und -wachstum im Zusammenhang stehen. Es wird geglaubt, dass RAC-PK auf demselben Signalweg wie p70^S6K liegt, jedoch stromaufwärts davon.
RAC-PK spielt eine Hauptrolle in der Insulin-abhängigen Signaltransduktion, die bei einer Anzahl von Funktionen einschließlich der Regulierung des Zeltwachstums und des Glycogenmetabolismus wichtig ist. Z.B. ist die Glycogensynthasekinase-3 (GSK3), die für die Aktivierung der Glycogensynthase verantwortlich ist, ein Ziel für RAC-PK.
Wenn sie aus natürlichen Quellen isoliert werden, insbesondere aus herkömmlichen Quellen, wie Gewebekulturzellen, befinden sich RAC-PK und andere Signalkinasen normalerweise im inaktiven Zustand. Um aktive Kinaseproteine zu isolieren, ist es nötig, Zellen zu stimulieren, um den Signalweg einzuschalten, um eine aktive Kinase zu erhalten. Außerdem ist es nötig, wenn Zellen, die Kinaseenzyme exprimieren, bei Kinaseaktivitätsassays verwendet werden, Aktivierungsmittel vor dem Ausführen des Assays einzusetzen. Daher werden Zellen normalerweise mit Mitogenen und/oder aktivierenden Mitteln stimuliert, wie beispielsweise IL-2, Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Insulin, Epidermal Growth Factor (EGF) und basischer Fibroblast Growth Factor (bFGF). Derartige Mittel sind teuer und, wenn es erwünscht ist, die aktiven Kinasen oder aktiven Zellen in größeren Mengen zu erzeugen, ist die Verwendung derartiger Mittel nachteilig.
Das Screenen von möglichen Verbindungen auf eine Aktivität als Inhibitoren des RAC-PK oder anderer Signalkinasen, um mögliche immunosuppressive oder antiproliferative Mittel zu identifizieren, erfordert eine reich liche Versorgung mit Kinaseprotein. Unter Verwenden einer modernen Technologie ist es möglich, große Mengen so gut wie jedes erwünschten Proteins in Expressionssystemen mit rekombinanter DNA zu erzeugen. Im Falle von Kinasen, wie jene, die vorliegend betroffen sind, sind jedoch derartige Systeme nicht zufrieden stellend, weil die erzeugten Proteine unphosphoryliert und deshalb inaktiv sein würden. Es ist deshalb ein Erfordernis, einen kostengünstigen Weg zur Herstellung phosphorylierter Kinaseproteine zu identifizieren, die bei Screeningprozeduren eingesetzt werden können.
Es wurde gefunden, dass Okadaic Acid, Vanadat und Phenylarsinoxid den 2-Deoxyglukosetransport im Insulin-resistenten menschlichen Skelettmuskel stimulieren (Carey et al. (1995), Diabetes 44, 682–688).
Es ist bekannt (Janö et al. (1988), Biochemistry 85, 406–410), dass Vanadat p70^S6K selbst aktivieren kann. Der Mechanismus dieser Aktivierung ist jedoch unbekannt. Wir haben nun gefunden, das Vanadat generell auf Signalkinasen wirkt, sie aktiviert und die Deaktivierung durch Phosphatasen verhindert. Außerdem haben wir gefunden, dass Okadaic Acid, eine von Vanadat verschiedene Verbindungsklasse, die mit unterschiedlichen Proteinen wechselwirkt, für eine ähnliche Wirkung verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Aktivieren einer Kinase eines Signalweges, der die Behandlung davon mit einem Phosphataseinhibitor umfasst. Außerdem gibt die Erfindung Verfahren an zum Screenen von möglichen immunosuppressiven und antiproliferativen Mitteln unter Verwenden derartiger aktivierter Kinasen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wir haben beobachtet, dass die Modulation der RAC-PK-Aktivität durch reversible Phosphorylierung bewirkt zu werden scheint, bei der das Gleichgewicht der Phosphorylierungs/Dephosphorylierungsreaktion verschoben wird, um die Gehalte des aktiven RAC-PK in Bezug auf seine inaktive Form zu ändern. Der Aufbau der aktiven Form kann deshalb durch Inhibierung der Dephosphorylierungsreaktion gefördert werden, erreicht durch eine Behandlung mit einem Phosphataseinhibitor.
Ein überraschender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass Tyrosinphosphataseinhibitoren, wie Vanadat, fähig sind, RAC-PK zu aktivieren, ungeachtet der Tatsache, dass, wie hier offenbart ist, diese Kinase durch Phosphorylierung an Threonin- und Serinresten aktiviert wird.
Es ist bekannt, dass Vanadat p70^S6K aktiviert. Die Erfindung erstreckt sich demgemäß nicht auf die Verwendung von Vanadat, um p70^S6K zu aktivieren. Jedoch ist die Verwendung von Phosphataseinhibitoren, wie Okadaic Acid, das durch einen ziemlich unterschiedlichen Mechanismus wirkt, Teil der vorliegenden Erfindung.
Wie hier erwähnt sind die Signalwege die Aktivierungskaskaden, die die Signaltransduktion schließlich regulieren, und die Kinasen dieser Wege sind Kinasen, deren in vivo Ziele mindestens eine Einheit umfassen, die zu einer derartigen Signaltransduktion beiträgt. Bevorzugt sind die Signalwege der Erfindung Insulin-abhängige Signalwege, die für die Transduktion von Signalen von Insulin und anderer Wachstumsfaktoren verantwortlich sind. Ohne auf irgendeine Weise irgendeine Beschränkung der vorliegenden Erfindung auferlegen zu wollen, wird geglaubt, dass ein derartiger Weg in vivo durch Binden von Wachstumsfaktoren, wie Insulin und dergleichen, an ihre Rezeptoren getriggert wird, was inter alia die Phospatidylinositol-3-OH-kinase (PI-3K) stimuliert. PI-3K phosphoryliert wiederum direkt oder indirekt RAC-PK, was indirekt zu der schließlichen Phosphorylierung von p70^S6K führt.
Die Behandlung von Kinasen gemäß der Erfindung, um sie zu aktivieren, erfordert, dass die Kinase einem Phosphorylierungsmittel, wie beispielsweise einer anderen Kinase des Signalweges, und dem Phosphataseinhibitor ausgesetzt wird. Dies kann ausgeführt werden, z.B. in vitro durch

(a) zusammen Inkubieren einer Kinase eines Signalweges, eines Mittels, das fähig ist, die Kinase zu phosphorylieren, um sie zu aktivieren, und eines Phosphataseinhibitors, und
(b) Reinigen der Kinase aus der Inkubationsmischung.

Das Phosphorylierungsmittel sollte wirksam sein, um die Kinase an Resten zu phosphorylieren, die zu deren Aktivierung führen. Im Falle des RAC-PK zielt das Phosphorylierungsmittel vorteilhafterweise auf Serin- und Threoninreste ab.
Bevorzugt ist das Phosphorylierungsmittel ein oder mehrere Kinasen des Signalweges, der in Anwesenheit geeigneter Aktivierungsfaktoren so wirkt, dass er die Kinase von Interesse phosphoryliert und dadurch aktiviert. Bevorzugt wird dies ausgeführt durch Wiedergewinnen des aktiven Kinaseenzyms von mit Phosphataseinhibitor behandelten Zellen, die die erforderlichen Signalwegkinasen enthalten.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet in vitro, dass das Experiment außerhalb eines lebenden Organismus oder einer Zelle ausgeführt wird. In vivo schließt eine Zellkultur ein. Die Behandlung von Zellen in vivo mit Phospataseinhibitoren ist insbesondere zur Herstellung des aktiven RAC-PK effektiv. Jedoch führt, da RAC-PK und andere Signalkinasen, z.B. p70^S6K, sich auf demselben Weg befinden, die Aktivierung des RAC-PK zur Aktivierung anderer Kinasen auf demselben Signalweg, z.B. p70^S6K selbst. Die Erfindung umfasst deshalb ein Verfahren zum Aktivieren von Kinasen auf Signalwegen im Allgemeinen, mit Ausnahme von p70^S6K, insbesondere wo sich derartige Kinasen stromabwärts des RAC-PK im Weg befinden.
Zellen, die Kinasen herstellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen allgemein jede beliebige Zelllinie eines Säugerursprungs, insbesondere Fibroblastzelllinien, wie RAT-1, COS oder NIH 3T3. Swiss-3T3-Zellen sind besonders bevorzugt. Wo menschliche Zelllinien verwendet werden, sind menschliche embryonische Nieren-293-Zellen bevorzugt.
Die Phospataseinhibitoren sind Mittel, die die Proteindephosphorylierung inhibieren, durch Inhibieren der Aktivität der Phospataseenzyme. Eine Phosphatase hat im Wesentlichen die inverse Wirksamkeit einer Kinase und entfernt Phosphatgruppen.
Beispiele von Phospataseinhibitoren sind Vanadat und Okadaic Acid, wobei Vanadat das wirksamere Mittel im Falle von RAC-PK ist. Jedoch wird geglaubt, dass die Wirkung von Vanadat indirekt ist, da es ein spezifischer Tyrosinphosphataseinhibitor ist und RAC-PK nicht durch Tyrosinphosphorylierung stimuliert zu werden scheint. Okadaic Acid, von dem bekannt ist, dass es direkt auf Phosphatase PP2A wirkt, scheint andererseits die Dephosphorylierung von RAC-PK direkt zu inhibieren.
Es wird an die Verwendung anderer Phospataseinhibitoren gedacht und sie ist nur durch die Eignung derartiger Inhibitoren zur Verabreichung an die spezielle verwendete Zelllinie beschränkt. Es wird geglaubt, dass Vanadat und Okadaic Acid generell anwendbar sind, aber der Fachmann wird erkennen, dass andere Phosphataseinhibitoren verfügbar sind und dass ihre Aktivität und Eignung leicht durch empirische Routinetests bestimmt werden können. Z.B. umfassen Phospataseinhibitoren, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, Calyculin A, Cantharidic Acid, Cantharidin, DTX-1, Mikrocystin, Nodularin und Tautomycin. Diese und andere Phospataseinhibitoren sind kommerziell beispielsweise von Calbiochem erhältlich.
Der Phospataseinhibitor wird an Zellen in ihrem normalen Wachstumsmedium, das serumfrei sein kann, verabreicht. Es wird beobachtet, dass das Serum selbst die Kinaseaktivität stimuliert, aber es ist teuer und seine Funktion kann durch einen Phospataseinhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung ersetzt werden. Geeignete Konzentrationen von Phospataseinhibitoren umfassen Gehalte von 0,01 mM bis 10 mM, bevorzugt 0,1 mM bis 1 mM. Die am meisten bevorzugte Konzentration für Vanadat ist 0,1 mM.
Das Verfahren der Erfindung kann zusätzliche Schritte umfassen, mit denen beabsichtigt wird, dass die erwünschte aktive Kinase von den Zellen, in denen sie hergestellt wird, isoliert wird. Derartige Schritte sind herkömmliche Prozeduren, mit denen die Fachleute vertraut sind, und können durch äquivalente Prozesse innerhalb des Umfangs der Erfindung substituiert werden. Der bevorzugte Prozess umfasst jedoch die Schritte des Homogenisierens der Zellen, des Entfernens von Zelltrümmern (z.B. durch Zentrifugieren) und des Trennens der erwünschten Kinase durch Affinitätsreinigung.
Die Homogenisierung kann in standardisotonischem Lysepuffer ausgeführt werden, der vorteilhafterweise einen Proteinaseinibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), und einen Phospataseinhibitor enthält, um die Deaktivierung der Kinase während der Reinigungsprozedur zu inhibieren. Die Zellen werden gespalten, wodurch deren cytoplasmischen und nuklearen Gehalte in den Lysepuffer freigesetzt werden.
Die Zelltrümmer werden dann vorteilhafterweise aus der lysierten zellulären Präparation entfernt, bevorzugt durch Zentrifugieren der Mischung, um alle teilchenförmige Materie zu pelletisieren. Nur die lösliche Fraktion verbleibt im Überstand.
Der Überstand kann dann Standardproteinreinigungstechniken unterzogen werden, um die Kinase von Interesse, falls erwünscht, zu isolieren. Bevorzugte Verfahren, insbesondere für Präparationen eines relativ geringen Volumens, umfassen eine Affinitätschromatographie. Derartige Techniken können einen Antikinaseantikörper oder -antiserum immobilisiert an einer geeigneten Matrix einsetzen. Andere immobilisierte Bindungsmittel, wie Substratanaloga, können eingesetzt werden.
Antikörper, die für eine Immunotrennung aktivierter Kinasen gemäß der Erfindung nützlich sind, können gemäß in der Technik bekannten Techniken hergestellt werden. Um ein polyklonales Serum herzustellen, wird z.B. ein Antigenteil der erwünschten Kinase, die aus einem davon abgeleiteten Peptid, wie einem C-terminalen Peptid, besteht, oder sogar die ganze Kinase, optional in Anwesenheit eines Hilfsstoffs oder konjugiert an ein Immunostimulatormittel, wie Keyhole Limpet Haemocyanin, in einen Säuger, wie eine Maus oder ein Kaninchen, injiziert und Antikörper werden durch Affmitätsreinigung unter Verwenden einer an eine Festphase gebundenen Kinase oder eines Antigenteils davon wieder gewonnen. Monoklonale Antikörper können gemäß etablierter Prozeduren erzeugt werden.
Alternativ und insbesondere für Präparationen im größeren Umfang können Trennprozeduren verwendet werden, die keine Affinitätschromatographie umfassen.
Z.B. sind zahlreiche Verfahren in der Technik verfügbar zum Trennen von Polypeptiden auf der Basis der Größe, wie Chromatographie und Gelelektrophorese. Bevorzugt sind Verfahren, die eine Reinigungsfunktion wie auch eine Größentrennungsfunktion ausführen, während sie keine inakzeptablen Verunreinigungen einbringen. Daher werden Verfahren, wie Schritt- oder kontinuierliche Gradientenzentrifugation, insbesondere unter Verwenden von Sucrosegradienten, Dialysetechniken unter Verwenden von Membranen mit kontrollierten Poren und Membran(Amicon)-Zentrifugation bevorzugt. Insbesondere bevorzugt ist jedoch die Size Exclusion Chromatography, typischerweise unter Verwenden von porösen Perlen als den chromatographischen Träger ausgeführt. Size Exclusion Chromatography ist, z.B. durch Stellwagen in Deutscher (1990), Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA, 317–328, beschrieben.
Alternative Reinigungsverfahren, die allgemein in Deutscher (1990) beschrieben sind, umfassen eine Chromatographie basierend auf der Trennung durch Ladungsunterschiede, wie Ionenaustauscherchromatographie unter Verwenden einer Austauschgruppe, wie DEAE oder CM, gebunden auf einem Festphasenpackungsmaterial, wie Cellulose, Dextran, Agarose oder Polystyrol. Andere Verfahren umfassen Hydroxyapatitsäulenchromatographie (siehe z.B. Gorbunoff (1985), Methods in Enzymology, 117, 370–380) und eine allgemeine Affinitätschromatographie unter Verwenden von Glasperlen oder reaktiven Farbstoffen als Affmitätsmittel.
Vorteilhafterweise kann Kationenaustauschchromatographie eingesetzt werden, sodass eine Proteinelution maßgeschneidert werden kann, um den bekannten oder eingeschätzten kleinen pI der in Frage stehenden Kinase zu berücksichtigen. Der pI für eine beliebige Kinase kann experimentell bestimmt werden durch isoelektrische Focussierung. Auf diese Weise ist es möglich, aus dem Kationenaustauschharz jene Proteine selektiv zu eluieren, die ein pI auf oder um jenem der Kinase besitzen, was zu einem hohen Grad der Reinigung führt.
Die Erfindung gibt ferner die Verwendung einer aktiven Kinase an, die gemäß der Erfindung in einem Verfahren zum Screenen potentieller Modulatoren von Signalwegen hergestellt ist. Daher kann das beanspruchte Verfahren den zusätzlichen Schritt des einem potentiellen Modulator Aussetzen der Kinase und dem nachfolgenden Bewerten der Wirksamkeit der Kinase umfassen, um die Effektivität des Modulators zu bestimmen.
Die Erfindung gibt demgemäß ein Verfahren zum Screenen möglicher Modulatoren von Signalwegen an mit:

(a) zusammen Inkubieren einer Kinase eines Signalwegs und eines Phospataseinhibitors,
(b) Zugeben eines möglichen Modulators des Signalweges, und
(c) Bestimmen der Aktivität der Signale.

Das dem Modulator Aussetzen kann bei der aktivierten oder inaktivierten Kinase entweder in einer zellfreien Umgebung, optional nach der Reinigung der Kinase aus der rohen zellulären Präparation, oder in situ in den Zellen, die die Kinase herstellen, nach der Phospataseinhibitoraktivierung ausgeführt werden. Die Schritte (a) und (b) können daher umgekehrt oder gleichzeitig ausgeführt werden.
Im Schritt (a), insbesondere falls der Assay in vitro ausgeführt werden soll, kann ein Mittel zu der Inkubationsmischung gegeben werden, das fähig ist die Kinase zu phosphorylieren. Phospataseinhibitoren aktivieren Kinasen durch Verhindern der Dephosphorylierung, sodass ein Phosphorylierungsmittel erforderlich sein wird. Vorteilhafterweise ist das Phosphorylierungsmittel eine Kinase eines Insulin-abhängigen Signalweges oder eines Analogons davon. Außerdem können Faktoren erforderlich sein, um die Signaltransduktion im Signalweg zu initiieren oder zu unterstützen. Z.B. wird FKBP, falls die getestete Verbindung ein Rapamycinanalogon ist, das FKBP bindet, in der Inkubationsmischung erforderlich sein.
Bevorzugt wird die Prozedur jedoch in vivo in Zellen ausgeführt, die Kinasen des Signalweges enthalten. In einem derartigen Assay ersetzt der Phospataseinhibitor das Serum oder andere zuvor eingesetzte Mittel als externe Stimulierungsmittel, um die Kinasen des Signalweges zu aktivieren.
Die Aktivität der Kinase kann mittels eines Kinaseaktivitätsassays bewertet werden, unter Einsatz eines Substrats für die Kinase. Z.B. kann ein Myelin Basic Protein verwendet werden, gemäß etablierter Assayprozedurchen. Physiologische Substrate, wie die 40S-ribosomale Untereinheit oder S6, können auch verwendet werden. Alternativ kann die Kinaseaktivität durch Bestimmen des Grads der Phoshorylierung der Kinase bewertet werden. Vorteilhafterweise wird die Phosphorylierung an Resten, die normalerweise in die Kinaseaktivierung verwickelt sind, bewertet. Die Identifizierung derartiger Reste, die Teil der Erfindung ist, wird unten dargelegt.
Der Assay der Erfindung kann verwendet werden, um die direkte Wirkung der möglichen Verbindung auf die mit dem Assay untersuchte Kinase zu messen, oder er kann verwendet werden, um die Wirkung der Verbindung auf eine Kinase zu bestimmen, die stromaufwärts davon im Signalweg wirkt. In der letzteren Situation wirkt die mit dem Assay untersuchte Kinase als ein Substrat für die Stromaufwärtskinase und die Aktivität der Stromaufwärtskinase wird durch Bestimmen des Phosphorylierungszustands oder der Aktivität der mit dem Assay untersuchten Kinase bewertet.
Um ein bedeutsames Ergebnis zu erhalten, sollte die Aktivität der mit dem Assay untersuchten Kinase, die dem möglichen Modulator des Signalweges ausgesetzt wird, mit der Aktivität der nicht dem Mittel ausgesetzten Kinase verglichen werden, wobei eine Inhibierung der Kinaseaktivität auf ein Potential als ein immunosuppressives oder antiproliferatives Mittel hinweist.
Verbindungen, die gehobene Niveaus der Kinaseinhibierung zeigen, können dann weiter durch Bestimmen der immunosuppressiven oder antiproliferativen Eigenschaften davon direkt, besipielsweise mittels eines Zellproliferationsinhibitionsassays bewertet werden. Ein derartiger Assay umfasst bevorzugt eine physikalische Bestimmung der T-Zellenproliferation in Zellen, die einer Kinaseaktivierung durch einen Phospataseinhibitor unterzogen, dem möglichen Kinaseinhibitor ausgesetzt und optional nachfolgend mit einem Mitogen, wie beispielsweise einen Wachstumsfaktor, IL-2 oder PMA, stimuliert wurden. Einfacher kann der Assay das dem möglichen Inhibitor Aussetzen von unstimulierten Zellen umfassen, gefolgt von einer Stimulation mit einem Phosphataseinhibitor.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung waren wir in der Lage zu Bestimmen, welche Stellen für die Phosphorylierung von Kinasen, insbesondere jene der p70^S6K/RAC-PK-Familie wichtig sind. Übenaschenderweise scheint die aktivierende Phosphorylierung überwiegend an Serin- und Threoninresten stattzufinden.
Z.B. ist ein wichtiger Aktivierungsrest T308, der in der so genannten T-Loop zwischen den Subdomänen 7 und 8 der Kinase vorhanden ist. Ein allgemeines Handbuch zur Kinasestruktur ist in Woodgett (1994), Protein Kinases, IRL Press, UK, gegeben. Ein anderer wichtiger Aktivierungsrest ist S473. Die Phosphorylierung dieses Rests ist für die volle Aktivierung des RAC-PK in vivo erforderlich.
Die Erfindung wird weiter nur für die Zwecke der Veranschaulichung in den folgenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Mitogene Stimulierung und Phosphorylierung von RAC-PK.
Die Swiss-3T3-Zelllinie (M. Šuša & G. Thomas (1990), Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87, 7040–7044) wird genutzt, um die mögliche Involvierung von RAC-PK in die Wachstumsfaktorsignalübertragung zu untersuchen. Untätige Swiss-3T3-Zellen werden 24 h lang Serum-mangelernährt, gefolgt von einer Stimulierung mit 10% FCS.
(a) Die Kinaseaktivität wird durch Immunopräzipitieren von RAC-PK und einem Assay-Unterziehen der Kinase unter Verwenden von Myelin Basic Protein als ein Substrat bewertet. Kurz erläutert werden die zellfreien Extrakte durch Kratzen von präkonfluenten Zellen in eiskaltes TBS, Lysieren der Zellen in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, ein mM EDTA, 1,0% Triton X-100, 2 mM EGTA, 1 mM PMSF, 20 μM Leupeptin, 20 μM Aprotenin und 10 μM Molybdat enthalten. Die Lysate werden 15 min lang bei 12.000 × g bei 4°C zentrifugiert. RAC-PKα wird aus Pasorbin-gereinigten Extrakten immunopräzipitiert unter Verwenden eines polyklonalen Kaninchenantikörpers, der für den konservierten C-Terminus (Anti-RAC^469–480 Jones et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171–4175) spezifisch ist und durch subkutanes Injizieren des Peptids FPQFSYSASSTA, das an Keyhole Limpet Haemocyanin gekoppelt ist, in Kaninchen gezogen wurde, und durch Präzipitation unter Verwendung von 50% (NH₄)₂SO₄, gefolgt von einer Affinitätschromatographie auf einer RAC-PK-gekoppelten Affigel^®-10-Säule (Bio-Rad) gereinigt wurde. Diese Antisera erkennen auch die b/AKT2-Isoform, weil deren C-Terminus von demjenigen des RAC-PKα in den letzten drei Aminosäuren verschieden ist. Die RAC-PK-Aktivität wird, wie zuvor beschrieben, unter Verwenden von Myelin Basic Protein als Substrat einem Assay unterzogen (Jones et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171–4175). Die Extrakte werden 2 h lang bei 4°C mit dem Antiserum (2 μg/100 μl Extrakt) inkubiert, die Immunipräzipitate werden unter Verwenden von Protein-A-Sepharose gesammelt und mit einem Ly sepuffer gewaschen. Die Proteinsepharoseperlen werden in 100 μl von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 10 μm Molybdat resuspendiert und 35 μl werden für den Kinaseassay wie folgt verwendet:
Reaktionsmischungen mit einem Endvolumen von 50 μl enthalten 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM Proteinkinaseinhibitor, PKI-Peptid, 25 μg Myelin Basic Protein (MBP-Sigma), 50 μM (γ-³²P) ATP (3500 cpm/pmol und 35 μl eines Immunopräzipitats aus zellfreien Extrakten oder gereinigte Fraktionen von RAC-Proteinkinase. Nach der Inkubation bei 30°C für 10, 30 oder 60 min werden die Proben durch 12% SDS/PAGE analysiert, gefolgt von Autoradiographie, und durch Scintillationszählen der phosphorylierten MBP-Bänder quantifiziert.
Es wird gefunden, dass die Aktivität des immunopräzipitierten RAC-PK zwei bis viermal höher in Serumstimulierten Zellen gegenüber untätigen Zellen ist. Die Aktivierung tritt innerhalb von 5 min auf und die Kinaseaktivität bleibt mindestens 120 min lang angehoben.
(b) Die Aktivierung fällt mit der verringerten Mobilität des RAC-PK auf SDS-PAGE zusammen. Um zu bestimmen, welche Formen auf SDS-PAGE-Gelen vorhanden sind, wird ein Immunoblotten unter Verwenden von Anti-RAC-PK-Antisera, die wie oben hergestellt sind, ausgeführt. Zellextrakte und Immunopräzipitate werden mit 7,5% SDS-PAGE aufgelöst, in Immobilon-P-Membrane (Millipore) transferiert und mit dem Anti-RAC^469–490– Antikörper inkubiert. Der Nachweis wird unter Verwenden eines alkalischen Phospatase-konjugierten Anti-Kaninchenantikörper ausgeführt.
Mindestens drei verschiedene Formen können mit Immunoblotanalysen nachgewiesen werden, genannt a, b und c. Die Kinase von untätigen Zellen. wandert als ein Dublett der a- und b-Formen, und während der Stimulierung taucht eine langsamer wandernde Form c auf, gefolgt von einem Verschwinden der Form a. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die RAC-PK-Aktivität durch reversible Phosphorylierung moduliert wird.
(c) Um diese Möglichkeit zu testen, werden die in vivo-Wirkungen der Phospataseinhibitoren Okadaic Acid und Vanadat auf RAC-PK von Swiss-3T3-Zellen untersucht. Die Zellen werden 24 h lang Serum-mangelernährt, gefolgt von einer Stimulierung mit 1 μM Okadaic Acid oder 0,1 mM Vanadat hergestellt mit 0,1 mM H₂O₂ (Posner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 4596–4604) optional zusammen mit 10% FCS. Die Behandlung von Zellen mit Ocadaic Acid, einem spezifischen Inhibitor von PP2A und PP1 induziert einen dreifachen Anstieg in der RAC-PK-Aktivität und verringert die elektrophoretische Mobilität. Die gleichzeitige Behandlung mit 1 μM Okadaic Acid und 10% Serum verursacht eine fünffache Aktivierung und eine größere Änderung der elektrophoretischen Mobilität. Eine elffache Aktivierung wird nach der Behandlung mit 0,1 mM Vanadat beobachtet, was den Hauptteil des Proteins in die am langsamsten wandernde Form c umwandelt.
Um zu bestätigen, dass Formen mehrfacher elektrophoretischer Mobilität verschiedene Phosphorylierungszustände der Kinase wiedergeben, wird RAC-PK aus ³²P-markierten untätigen und Vanadat-stimulierten Swiss-373-Zellen immunopräzipitiert. Swiss-373-Zellen werden in phosphatfreiem DMEM/FCS wie beschrieben arretiert (M. Šuša & G. Thomas (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7040–7044) und 16 h lang vor dem 6 bis 10 h langen Markieren mit [³²P]Orthophosphat (2 mCi pro 15 cm Schale) Serum-mangelernährt. Die Stimulation wird mit 0,1 mM Vanadat ausgeführt. Die Quantifizierung der Phosphorylierung wird unter Verwenden der ImageQuant-Software ausgeführt. Die Vanadatbehandlung führt zu einem drei- bis vierfachen Anstieg in der Phosphorylierung, was zeigt, dass die Mobilitätsformen b und c phosphoryliertes RAC-PK repräsentieren.
(d) Um zu bestimmen, welche Reste im aktivierten RAC-PK phosphoryliert werden, wird eine Phosphoaminosäureanalyse mit Zellen ausgeführt, die wie oben gemäß Boyle et al. (1991), Methods Enzymol. 201, 110–149, markiert sind. Die Kinase von arretierten Zellen scheint hauptsächlich an Serinresten und in einem geringen Ausmaß an Threonin mit einem Verhältnis von 12:1 phosphoryliert zu sein. Die Vanadatstimulierung führt zu einem Anstieg im Phosposerin- und insbesondere im Phosphothreoningehalt, was das Verhältnis auf 4:1 verringert. Phosphotyrosin wird nach der Vanadatstimulierung weder durch Phosphoaminosäureanalyse noch durch Immunoblotanalyse unter Verwenden eines Anti-Phosphotyrosinantikörpers nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass RAC-PK durch einen Phosphorylierungsmechanismus aktiviert wird. Außerdem schließen wir daraus, dass die RAC-PK-Aktivierung, die durch Vanadat vermittelt wird, wahrscheinlich indirekt ist, da Vanadat dafür bekannt ist, ein Inhibitor von Tyrosinphosphatasen zu sein.
Beispiel 2
Inaktivierung von RAC-PK durch Proteinphosphatase 2A in vitro.
Um zu bestätigen, dass RAC-PK durch Phosphorylierung reguliert wird, werden die Wirkungen der Proteinphosphatase-2A-(PP2A)-Behandlung auf die Kinase, die von untätigen und Vanadat-stimulierten Swiss-3T3-Zellen immunopräzipitiert sind, untersucht. Da die Behandlung von Zellen mit 1mM Okadaic Acid 2 h lang bevorzugt PP2A vor PP1 inaktiviert, wird RAC-PK entweder mit der gereinigten katalytischen PP2A-Untereinheit (PP2Ac) oder mit einem PP2A-Dimer bestehend aus der katalytischen und der regulatorischen PR65-Untereinheit (PP2A₂) inkubiert.
Immunopräzipitiertes RAC-PK wird mit 0,3 U/ml eines Schweinemuskel-PP2Ac oder 1,7 U/ml eines Kaninchenmuskel-PP2A₂ in 30 ml Puffer, der 50 mM Tris-HCl 7,5, 1% b-Mercaptoethanol, 1 mM MuCl₂, 1 mM Bezamidin und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid bei 30°C 60 min lang inkubiert (eine Einheit (U) ist definiert als ein nmol von Pi freigesetzt aus Phosphorylase a pro min definiert). Die Reaktionen werden durch Zugabe von 50 nmol Calyculin A gestoppt. Die gebildeten Immunkomplexe werden mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Benzamidin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 50 nM Calyculin A gewaschen und RAC-PK wird, wie oben beschrieben, einem Assay unterzogen.
Die Dephosphorylierung des aktivierten RAC-PK in vitro durch PP2Ac führt zu einer 84%igen Verringerung der Kinaseaktivität und einer gleichzeitigen Änderung der elektrophoretischen Mobilität, was es von der Form c zu b umwandelt. Die PP2A₂-Behandlung führt zu einer 92%igen Verringerung der Aktivität und stellt die Proteinmobilität auf SDS-PAGE zu dem a/b-Doublett wieder her. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die beobachteten Aktivitätsänderungen durch einen reversiblen Phosphorylierungsmechanismus erreicht werden. Außerdem wird auf PP2A als einen potentiellen Regulator der RAC-PK-Aktivität in vivo hingewiesen.
Beispiel 3
RAC-PKa stimuliert die p70^s6k-Aktivität
In Swiss-3T3-Zellen wird RAC-PK durch Insulin (4,5-fach) aktiviert, vergleichbar zu Niveaus, die für p70^s6k nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu hat Insulin einen geringen oder keinen Effekt auf p42^mapk und p44^mapk in diesen Zellen, was daran denken lässt, das RAC-PK und p70^s6k sich auf demselben Signalweg befinden können, was ein von dem MAPK-Weg unterschiedlicher Weg ist.
Um diese Möglichkeit zu untersuchen, werden die Wirkungen von Wortmannin und Rapamycin auf die Serum-induzierte Aktivierung der zwei Kinasen untersucht. Wortmannin, ein Inhibitor der Phosphoinositid-(PI)-3-Kinase und immunosuppressives Rapamycin blockieren die Aktivierung von p70^s6k durch Beeinflussen desselben Satzes von Phosphorylierungsstellen.
Die Stimulierung untätiger Swiss-3T3-Fibroblasten führt zu einer ∼4fachen Induktion der RAC-PK-Aktivität, wohingegen die Wortmanninbehandlung, die der Serumstimulation vorangeht, die Aktivierung fast vollständig blockiert. Andererseits übt die Rapamycin-Vorbehandlung keinen signifikanten Effekt auf die RAC-PK- Aktivierung aus. Wortmannin blockiert auch das Auftreten der RAC-PK-Form mit der niedrigsten Mobilität, die nach der Serumbehandlung beobachtet wird, während Rapamycin die RAC-PK-Mobilität nicht beeinflusst. In demselben Experiment schaltet die Wortmannin- und Rapamycin-Vorbehandlung die p70^s6k-Aktivierung aus.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass RAC-PK stromaufwärts des p70^S6K auf dem p70^S6K-Signalweg liegen kann, welches stromaufwärts von RAC-PK durch Wortmannin und stromabwärts davon durch Rapamycin inhibiert wird. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wird die Regulierung von p70^s6k in einem transienten Cotransfektionsassay unter Verwenden menschlicher 293-Zellen untersucht. RAC-PKα-Konstrukte werden durch Ligieren der RAC-PKa-c-DNA (Jones et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 4171–4175) inframe des Initiators Methionin im Säuger-Expressionsvektor pECE hergestellt. Das Konstrukt wird auch in einen CMV-Promoter-getriebenen Expressionsvektor subkloniert. Das Konstrukt wird durch Restriktionsanalyse und Sequenzieren bestätigt. Konstrukte, die Myc-markiertes p70^s6k exprimieren, werden von Dr. G. Thomas (Friederich Miescher Institut, Basel, Schweiz) erhalten. Die Konstrukte werden in COS-Zellen unter Verwenden von Standardprozeduren transfiziert. Die Coexpression von RAC-PKa mit p70^s6k-Myc führt zu einem 3,5- und 3fachen Anstieg der basalen bzw. Insulinstimulierten p70^s6k-Myc-Aktivität.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines aktiven RAC-PK durch spezifisches Verschieben des Gleichgewichts einer Phosphorylierungs/Dephosphorylierungsreaktion, die auf mindestens einen Serin- und/oder Threoninrest der Kinase gerichtet ist, in Richtung der Phosphorylierung, mit einer Behandlung des RAC-PK mit Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das aktive RAC-PK isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das in Zellkultur ausgeführt wird, die mindestens eine Kinase stromaufwärts vom RAC-PK in seinem Signalweg enthält, die fähig ist, RAC-PK an mindestens einem Serin- und/oder Threoninrest zu phosphorylieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das in vitro ausgeführt wird, mit (a) zusammen Inkubieren von RAC-PK, einem Mittel, das fähig ist, RAC-PK an mindestens einem Serin- und/oder Threoninrest zu phosphorylieren, einem Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A, und (b) Reinigen des aktiven RAC-PK aus der Inkubationsmischung.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Phosphorylierungsmittel mindestens eine Kinase stromaufwärts des RAC-PK in seinem Signalweg ist, die fähig ist, RAC-PK an mindestens einem Serin- und/oder Threoninrest zu phosphorylieren, wodurch es aktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem der Serinrest S473 ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem der Threoninrest T308 ist.
Verfahren zum Screenen möglicher Verbindungen auf eine Aktivität als Inhibitoren von RAC-PK in Zellkultur, mit: (a) zusammen Inkubieren von Zellen, die RAC-PK enthalten, einem Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A, (b) Zugeben der möglichen Verbindung, und (c) Bestimmen der Aktivität von RAC-PK.
Verfahren zum Screenen möglicher Verbindungen auf eine Aktivität als Inhibitoren von RAC-PK in vitro, mit: (a) zusammen Inkubieren von RAC-PK, einem Mittel, das fähig ist, RAC-PK an mindestens einem Serin- und/oder Threoninrest zu phosphorylieren, einem Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A, (b) Zugeben der möglichen Verbindung, und (c) Bestimmen der Aktivität von RAC-PK.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Phosphorylierungsmittel eine oder mehrere Kinasen stromaufwärts vom RAC-PK ist.
Verfahren zum Screenen möglicher Verbindungen auf eine Aktivität als Inhibitoren von RAC-PK, mit: (a) Inkubieren des aktiven RAC-PK's, das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhältlich ist, zusammen mit Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A, (b) Zugeben der möglichen Verbindung, und (c) Bestimmen der Wirksamkeit von RAC-PK.
Verfahren zum Screenen potentieller Modulatoren von RAC-PK, die direkt oder indirekt die Aktivierung von RAC-PK bewirken, mit: (a) Inkubieren von RAC-PK gemäß Anspruch 9(a) oder gemäß Anspruch 11(a) mit einem Mittel, das fähig ist, RAC-PK an mindestens einem Serin- und/oder Threoninrest zu phosphorylieren, und Vanadat oder einem Inhibitor der Phosphatase PP2A, (b) Zugeben des potentiellen Modulators von RAK-PK, und (c) Bewerten der Aktivität des Modulators.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der potentielle Modulator des RAC-PK eine Kinase stromaufwärts vom RAC-PK ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 12, bei dem der Serinrest S473 ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 12, bei dem der Threoninrest T308 ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 8, 9, 11 oder 12, bei dem die Schritte (a) und (b) gleichzeitig ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Inhibitor der Phosphatase PP2A aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Okadaic Acid und Calyculin A besteht.