ES2288475T3 - Un motor de polinucleotido, un sistema motor, su preparacion y usos. - Google Patents
Un motor de polinucleotido, un sistema motor, su preparacion y usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un sistema motor molecular que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene unido a ella: (1) en una primera región proximal del ácido nucleico, una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación; y (2) en una segunda región distal del ácido nucleico, una sustancia de unión que puede permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico en dicha región distal durante la translocación; caracterizado porque la enzima comprende una enzima de restricción-modificación de tipo I que tiene las subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica HsdR1M2S1.
Description
Un motor de polinucleótido, un sistema motor, su
preparación y usos.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ácido nucleico que tiene unido a ella un complejo particular que
implica una subunidad de una endonucleasa de restricción, complejo
que puede translocar el polinucleótido sin producir la ruptura del
mismo; y su uso, entre otros, en un sistema de máquina
molecular.
Las máquinas moleculares se han descrito como
moléculas (en una escala nanométrica) que tienen partes que se
mueven y hacen un trabajo útil. Un sistema de máquina molecular
puede ser por tanto una máquina molecular multicomponente. Para que
una máquina o sistema de máquina de este tipo funcione
satisfactoriamente, debe estar basado en una estructura molecular
estable, compacta. Por consiguiente, los estudios teóricos de
sistemas de máquina molecular se han centrado en estructuras
covalentes, inflexibles, tales como materiales de tipo grafito y
diamante, que operan a vacío. Sin embargo, es poco probable que
tales sistemas teóricos puedan construirse, en la práctica, en el
futuro próximo.
Por otro lado, la técnica para preparar
estructuras poliméricas está comparativamente muy avanzada. Sin
embargo, el inconveniente de éstas es que deben plegarse
apropiadamente con el fin de proporcionar una estructura utilizable.
Los plegamientos de las proteínas, por ejemplo, son difíciles de
diseñar en vista de la falta de complementariedad fuerte, natural
de aminoácidos individuales. De manera contrastante, se ha realizado
trabajo que muestra que es posible diseñar estructuras basadas en
ADN, de manera que los ácidos nucleicos pueden modificarse mediante
ingeniería genética para servir como adaptadores para sistemas
motores moleculares complejos - y otros. El problema entonces es
proporcionar un sistema motor o de máquina adecuado que pueda
interactuar apropiadamente con una estructura basada en ADN.
El estudio de motores moleculares ha girado
principalmente alrededor de proteínas de músculo y sistemas
macromoleculares similares. Sin embargo, los motores biológicos
también existen a nivel molecular, y pueden proporcionar modelos
adecuados para la industria de la nanotecnología en desarrollo. De
éstos, quizás los más interesantes desde un punto de vista
biotecnológico (por ejemplo debido al posible uso del contenido de
información de ADN al nivel nanotecnológico) son aquellas enzimas
que manipulan ácidos nucleicos. Éstas incluyen ARN polimerasas;
algunas enzimas implicadas en la recombinación (por ejemplo RecBCD);
topoisomerasas; y enzimas de restricción de tipo I y III. Sin
embargo, a pesar del potencial de la translocación, el mecanismo
mediante el que se mueve el ADN a través del complejo proteico no
se entiende bien. Además, se sabe que estos sistemas enzimáticos no
sólo provocan movimiento o seguimiento de ADN, sino que también
tienen otros efectos, tales como síntesis (en el caso de
polimerasas); desenrollar o romper cadenas de ADN (tales como por
helicasas); y escindir (en el caso de las enzimas de restricción).
Tales efectos pueden hacer claramente que estos sistemas sean
indeseables o imposibles de usar como parte de un sistema de
máquina o máquina molecular.
No obstante, la presente invención se refiere
sorprendentemente a un sistema motor o de máquina que está basado
en el movimiento o seguimiento de una enzima, particularmente una
enzima de restricción de tipo I, por el ADN.
Los sistemas de enzima de restricción y
modificación (R-M) de tipo I protegen la célula
bacteriana frente a la invasión de ADN foráneo (tal como virus)
escindiendo ADN que carece de una metilación de adenina en N6
específica de diana. El segundo papel fisiológico de estos sistemas
es restaurar la metilación completa de los sitios diana en el ADN
huésped tras la replicación de ADN. Se distinguen las enzimas
R-M de tipo I (endonucleasas de restricción) por el
hecho de que la unión de un sitio de reconocimiento no metilado
provoca la escisión de ADN en un sitio no específico, localizado en
la distancia en el ADN. El ATP, que se requiere para la restricción
de ADN, alimenta la translocación mediante la enzima del ADN desde
el sitio de reconocimiento hasta el sitio de escisión.
Las endonucleasas de restricción de tipo I
reconocen específicamente una secuencia de ADN no palindrómica (por
ejemplo GAAnnnnnnRTCG para EcoR124I, en la que n es
cualquier base y R es una purina). La unión de la endonucleasa a un
sitio de reconocimiento no modificado activa una actividad ATPasa
potente, que alimenta la translocación de ADN pasado el complejo
ADN-enzima, mientras que la enzima permanece unida
al sitio de reconocimiento. Se escinde el ADN en posiciones en las
que se detiene la translocación de ADN - debido a una colisión de
dos moléculas enzimáticas que translocan en dos sitios, sustratos de
ADN lineales o bien debido a la acumulación de tensión topológica
en moléculas circulares. La endonucleasa no se gira en la reacción
de escisión; sin embargo, la actividad ATPasa continúa durante un
largo periodo de tiempo después de que la escisión se completa. La
actividad de metilación de ADN de los sistemas R-M
de tipo I da como resultado una transferencia de un grupo metilo
desde un cofactor (S-adenosilmetionina o "SAM")
hasta la posición N-6 de una adenina específica en
cada cadena de la secuencia de reconocimiento. Claramente, la
escisión que está asociada con tal translocación sería sumamente
probable para negar la utilidad de tal enzima como un posible
motor.
Las enzimas de
restricción-modificación de tipo I están compuestas
por tres subunidades diferentes (HsdR, HsdM y HsdS) codificadas por
tres genes hsd. Se requieren absolutamente las tres
subunidades para la actividad de restricción, mientras que las
subunidades HsdM y HsdS son suficientes para la actividad de
modificación y también pueden formar una MTasa independiente. Los
sistemas R-M de tipo I están agrupados en cuatro
familias, basándose en la complementación alélica, homologías
proteicas y propiedades bioquímicas de las enzimas. Los sistemas
R-M de tipo IA, IB y ID están codificados
cromosómicamente, mientras que la mayoría de los sistemas
R-M de tipo IC se portan en grandes plásmidos
conjugativos. La familia de tipo IA está tipificada por las enzimas
EcoKI y EcoBI, de tipo IB por EcoAI y de tipo
IC por EcoR124I. EcoKI forma un complejo
R_{2}M_{2}S_{1} estable; sin embargo, la MTasa de EcoKI
independiente (M_{2}S_{1}) es un complejo relativamente débil,
que se disocia en una especie M_{1}S_{1} inactiva y una
subunidad HsdM libre. La endonucleasa de restricción EcoBI
purificada existe en una variedad de formas estequiométricas
diferentes incluyendo R_{2}M_{2}S_{1}, R_{1}M_{2}S_{1} y
R_{1}M_{1}S_{1}. La endonucleasa de tipo IB EcoAI es
un complejo débil que se disocia en MTasa y subunidad HsdR cuando se
purifica.
Ya se ha mostrado (Janscak in Nucleic Acids
Research 26 (19) 4439-4445 (1998)) que la
enonucleasa de restricción EcoR124I es una mezcla de dos
especies, que tienen una estequeometría de subunidad de
R_{2}M_{2}S_{1} y R_{1}M_{2}S_{1}, respectivamente.
Sólo se ha encontrado que tiene actividad endonucleasa la primera
especie. Sin embargo, el complejo R_{2}M_{2}S_{1} es
relativamente débil, disociándose en subunidad HsdR libre y el
producto intermedio del conjunto R_{1}M_{2}S_{1} deficiente
para la restricción, que parece ser un complejo muy fuerte. Aunque
el complejo R_{1}M_{2}S_{1} no puede escindir ADN, puede hacer
una muesca en una cadena del ADN. Sin embargo, hasta la presente
invención, no ha habido ninguna indicación de que el complejo
R_{1}M_{2}S_{1} puede por si mismo translocar el ADN a pesar
del hecho de que no provoca la escisión del mismo.
En primer lugar, todavía no se ha encontrado un
procedimiento satisfactorio para producir el complejo
R_{1}M_{2}S_{1} deficiente para la restricción ("el
complejo R_{1}") preferentemente sobre la endonucleasa
R_{2}M_{2}S_{1}, para permitir - en la práctica- la síntesis
de un complejo polinucleótido-enzima
R_{1}M_{2}S_{1} en una escala útil. Se ha encontrado ahora,
tal como se describe más adelante en el ejemplo 1, que el
polipéptido de tipo Stp sintético, Stp_{2-26},
desplaza el equilibrio entre los complejos de subunidad
HsdR_{2}M_{2}S_{1} y HsdR_{1}M_{2}S_{1} hacia la última
forma. El polipéptido Stp es el determinante
anti-restricción del bacteriófago T4 que tiene 26
aminoácidos, cuya presencia da como resultado principalmente el
complejo deficiente para la restricción R_{1}M_{2}S_{1}.
Además, se ha producido una subunidad HsdR
híbrida que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la prevista
para la subunidad HsdR de EcoprrI. Los estudios con una
endonucleasa híbrida que comprende la MTasa de EcoR124I y la
subunidad HsdR(prrI) han mostrado que esta enzima híbrida
sólo puede escindir ADN en presencia de concentraciones
extremadamente altas de HsdR(prrI), lo que indica que este
conjunto tiene un complejo R_{2} incluso más débil que el de
EcoR124I y también sería adecuado para la producción del
complejo R_{1}. Además, se ha demostrado que una mutación puntual
de EcoAI transloca sin escindir (Janscak et al in
Nucleic Acids Research 27(13), 2638-2643;
(1999)); las sustituciones de aminoácidos sencillas en la subunidad
HsdR de la enzima de restricción de tipo IB de EcoAI
desacoplan las actividades de translocación de ADN y escisión de ADN
de la enzima y también pueden ser un motor de este tipo.
Con la capacidad preferente para producir el
complejo R_{1}, se ha logrado la producción de un polinucleótido,
tal como ADN, que tiene una enzima complejada al mismo, tal como una
que comprende el complejo R_{1}, y sorprendentemente se ha
encontrado que es capaz de translocar el polinucleótido, a pesar del
hecho de que no puede provocar la escisión del mismo.
Por tanto, los inventores han identificado ahora
un complejo entre una secuencia de polinucleótido, tal como ADN, y
una enzima, tal como R_{1}M_{2}S_{1}, que puede translocar la
secuencia de ácido nucleico sin provocar la escisión del mismo u
otros efectos aparentes que podrían restarle utilidad, tales como
actividad polimerasa. Además, también se ha encontrado que un
complejo polinucleótido-enzima (de translocación
pero no de restricción) de este tipo puede proporcionar el motor
para su uso en la maquinaria según la presente invención, motor que
puede funcionar, por ejemplo, mediante la presencia de ATP e iones
magnesio (Mg++).
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un sistema motor molecular que comprende una secuencia
de ácido nucleico que tiene unido a ella:
- (1)
- en una primera región proximal del ácido nucleico, una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación; y
- (2)
- en una segunda región distal del ácido nucleico, una sustancia de unión que puede permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico en dicha región distal durante la translocación;
caracterizado porque la enzima
comprende una enzima de restricción-modificación de
tipo I que tiene las subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la
forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
La memoria descriptiva también describe una
enzima que puede unirse a una secuencia de ácido nucleico, enzima
que no puede restringir la secuencia, caracterizada porque la enzima
puede translocarse con respecto a la secuencia. Preferiblemente, la
enzima también puede hacer una muesca en la secuencia; es decir, en
el caso de una secuencia de ADN, de romper una de las cadenas
dobles de la secuencia de ADN sin romper la otra cadena de la
misma.
\newpage
Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
es un polinucleótido, tal como ADN. El ADN puede comprender ADN
lineal o circular; mas preferiblemente, ADN lineal.
Preferiblemente, la enzima se deriva de una
enzima de restricción, tal como una derivada de la subunidad HsdR,
tal como una derivada a partir de una enzima de
restricción-modificación de tipo I; más
preferiblemente se deriva de una enzima R-M de tipo
IC, tal como EcoR124I o EcoprrI. La importancia de
HsdR como la subunidad responsable de la escisión de ADN y unión a
ATP sugiere otros enfoques que deben producir una enzima de
restricción, que puede translocar ADN sin escisión. Un
procedimiento sería producir una mutación en el gen hsdR que
inactiva el acontecimiento de escisión de ADN sin perder la
actividad ATPasa. Una enzima de restricción que comprende una
subunidad HsdR mutante de este tipo también sería un motor
molecular, equivalente en muchos aspectos al complejo R_{1};
aunque producirá una translocación bidireccional. Un motivo corto de
aminoácidos, común a muchas endonucleasas, sería el sitio más
probable para tales mutaciones. Pueden existir otras mutaciones que
alteran el conjunto de subunidad del complejo R_{2} y estabilizan
el complejo R_{1} de una manera similar a la observada con
HsdR(prr); por tanto, tales mutantes producirán también un
motor molecular útil. Se prefiere especialmente cuando la enzima se
deriva de una endonucleasa de tipo I y muestra la forma
estequiométrica R_{1}M_{2}S_{1}, especialmente la
R_{1}M_{2}S_{1} derivada de EcoR124I.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona además el uso del complejo R_{1} para la preparación
de un motor de polinucleótido en el que una secuencia de ácido
nucleico (por ejemplo un polinucleótido (por ejemplo ADN)) al que
está unido o complejado se transloca pero no se escinde. Por tanto,
un aspecto particularmente preferido de la presente invención
comprende un complejo R_{1}M_{2}S_{1}-ADN que
tiene unido a ello una sustancia que puede permanecer unida al ADN
durante la translocación del ADN, mediante lo cual se transloca la
sustancia de unión por si misma durante la translocación del
ADN.
Más adelante en el presente documento, la
secuencia de ácido nucleico que tiene la enzima (de translocación
pero no de restricción) unida a ella puede denominarse como "el
complejo polinucleótido-enzima". En este
contexto, las referencias a un polinucleótido pueden incluir
referencias a otras secuencias de ácido nucleico, a no ser que se
establezca específicamente lo contrario.
Por tanto, con el complejo
polinucleótido-enzima que puede translocar la
sustancia de unión, se proporciona además un procedimiento para
translocar una sustancia unida a una secuencia de ácido nucleico
desde una región distal de la secuencia de ácido nucleico hacia una
región proximal, procedimiento que comprende:
- (a) {}\hskip1mm (i)
- proporcionar en la región distal de la secuencia de ácido nucleico una sustancia de unión, o
- (ii)
- unir una sustancia a la región distal de la secuencia de ácido nucleico; y
- (b) {}\hskip1mm (i)
- proporcionar en la región proximal un complejo de la secuencia de ácido nucleico con una enzima, o
- (ii)
- complejar una enzima a la región proximal de la secuencia de ácido nucleico, y
(c) activar la enzima, mediante lo
cual la enzima transloca la secuencia de ácido nucleico, incluyendo
la sustancia de unión, desde la región distal hacia la región
proximal;
caracterizado porque la enzima
comprende una enzima de restricción-modificación de
tipo I que tiene las subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la
forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
La activación de la enzima dependerá de la
enzima particular elegida y, en el caso del complejo
R_{1}M_{2}S_{1}, comprenderá convenientemente la presencia de
ATP, tal como se demuestra en el ejemplo 2 más adelante, mostrando
la capacidad de un complejo
R_{1}M_{2}S_{1}-ADN para translocar, en
presencia de ATP, una sustancia de unión que comprende un sitio de
restricción XhoI unido a una enzima quimioluminiscente. En el
ejemplo 2, el ATP está presente con Mg^{++} en un tampón de
escisión o restricción de composición particular. Sin embargo, el
experto en la técnica entenderá que un intervalo de tampones o
condiciones de tampón, que pueden determinarse mediante ensayo y
error rutinario, serán adecuados para activar la enzima según la
etapa (c) del procedimiento de esta invención. Sin embargo, los
tampones preferidos incluyen ditiotreitol recién preparado, y se
añade ATP a una concentración preferiblemente superior a 0,5 mM,
siendo aproximadamente 2 mM suficiente para dar como resultado la
actividad de enzima completa.
La sustancia unida dependerá del uso particular
al cual va a ponerse el sistema motor de polinucleótido según la
presente invención, que se describe adicionalmente más adelante. La
sustancia de unión puede comprender por sí misma uno o más
componentes o ligandos; por tanto, la sustancia de unión puede
comprender:
- (a)
- una sustancia que se requiere que se transloque; o
- (b)
- medios para unir la sustancia (que se requiere que se transloque) al complejo polinucleótido-enzima; o
- (c)
- tanto (a) como (b) juntos.
Por ejemplo, la sustancia de unión puede
comprender inicialmente un ligando de unión que puede unirse a una
sustancia en disolución, tal como un compuesto de prueba u otro
material requerido para fijarse al complejo
polinucleótido-enzima (tales como enzimas
quimioluminiscentes, perlas magnéticas o "engranajes" basados
en carbono) los cuales, una vez fijados, junto con los propios
ligandos, forman la sustancia de unión; o la sustancia de unión
puede comprender una secuencia de ADN específica a la que pueden
unirse proteína(s) de unión a ADN. Como alternativa, la
sustancia de unión puede no implicar un ligando de unión, pero
puede unirse directamente al polinucleótido, tales como fluoróforos
o similares. Por tanto, la sustancia de unión puede interactuar con
el medio externo al complejo polinucleótido-enzima
para producir un efecto que puede detectarse y/o medirse, tal como
una reacción química, biológica o física, por ejemplo, la emisión de
luz, corriente eléctrica o movimiento.
Muchos de los usos a los que puede someterse el
sistema motor de polinucleótido de la presente invención requieren,
en la práctica, que el complejo
polinucleótido-enzima de translocación se ancle, tal
como unido a una superficie sólida, más que móvil libremente en una
disolución. Por consiguiente, la presente invención proporciona
además una secuencia de ácido nucleico que tiene unido a ella una
enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico sin
provocar la escisión de la misma (el complejo
"polinucleótido-enzima"), complejo
polinucleótido-enzima que está fijado a un soporte
sólido.
Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
también tiene unida a ella una sustancia (la "sustancia de
unión") que puede permanecer unida a la secuencia de ácido
nucleico durante la translocación, mediante lo cual se transloca la
sustancia de unión por sí misma, con respecto a la región de unión
de la enzima de la secuencia de ácido nucleico, durante la
translocación. Más preferiblemente, el complejo
polinucleótido-enzima es sustancialmente lineal,
antes de la translocación; y se prefiere especialmente cuando sólo
un extremo del mismo está fijado al soporte, permitiendo que su
extremo libre esté disponible para la unión a ello de la sustancia
de unión y por tanto puede moverse con respecto al soporte.
Una forma de anclar el complejo
polinucleótido-enzima es uniéndolo a un ligando de
unión que puede unirse por sí mismo a un sustrato revestido sobre
el soporte sólido. Por tanto, los medios de fijación entre el
complejo polinucleótido-enzima y el soporte sólido
pueden ser directos o indirectos. Un ejemplo de fijación indirecta
es en el que el ligando de unión es biotina y el sustrato es una
proteína de unión a biotina tal como avidina, estreptavidina o
neutravidina (disponible de Pierce & Warriner (RU) Ltd, Upper
Northgate Street, Chester, RU), cualquiera de las cuales puede
revestirse convenientemente sobre un soporte sólido, tal como se
describe por Bayer et al en A Sensitive Enzyme Assay for
Biotin, Avidin, and Streptavidin in Analytical Biochemistry
154(1), 367-70 (1986). Por ejemplo, puede
copiarse ADN de plásmido (usando PCR) para producir un fragmento de
ADN lineal, que tiene fijada biotina en su extremo cerca del sitio
de reconocimiento para la enzima EcoR124I y después puede
fijarse el ADN, a través de la biotina, a un soporte revestido con
estreptavidina, seguido por la formación del conjunto del complejo
R_{1} en el sitio de reconocimiento en el ADN, tal como se
describe en el ejemplo 3.
De manera conveniente, el soporte sólido
comprende un componente, tal como un chip de una máquina de
resonancia de plasmón superficial (SPR), que puede usarse para
controlar no sólo la unión del complejo
polinucleótido-enzima al soporte sino también las
reacciones del complejo y el uso del sistema de motor.
Como alternativa, el soporte o ligando de unión
pueden comprender una micropartícula que contiene una sustancia de
centelleo, tales como las usadas en ensayos de proximidad
convencionales.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona además un sistema motor molecular que comprende una
secuencia de ácido nucleico que tiene unido a ella:
- (1)
- una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a un región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación; y
- (2)
- un soporte sólido;
caracterizado porque la enzima
comprende una enzima de restricción-modificación de
tipo I que tiene subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma
estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
Opcionalmente, una sustancia que puede
permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico durante la
translocación puede unirse a ella. Durante la translocación, puede
translocarse la sustancia de unión por sí misma, con respecto a la
región de unión de la enzima a la secuencia de ácido nucleico.
Un ligando de unión, tal como la biotina, puede
unirse a la secuencia de ácido nucleico. Puede proporcionarse un
sustrato, tal como avidina o estreptavidina, para unir el ligando de
unión a ella y para anclar la secuencia de ácido nucleico a ello
cuando la secuencia de ácido nucleico está en disolución, tal como
revistiéndose sobre la superficie del soporte sólido.
Preferiblemente, el sustrato es por sí mismo o
está asociado con medios sólidos para controlar la actividad del
complejo polinucleótido-enzima, tal como un chip
revestido con estreptavidina de un aparato SPR.
Dependiendo del uso al que va a someterse el
motor de polinucleótido de la presente invención, la sustancia de
unión puede hacer uso por sí misma de una interacción ligando de
unión/sustrato (por ejemplo biotina/estreptavidina o avidina). Por
ejemplo, la sustancia de unión puede comprender por sí misma
biotina, o estreptavidina o avidina. Las sustancias disponibles
comercialmente adecuadas para la unión al complejo
polinucleótido-enzima incluyen perlas magnéticas
revestidas con estreptavidina o biotina, o enzimas
quimioluminiscentes unidas a estreptavidina o biotina. Claramente,
para muchos usos del complejo polinucleótido-enzima
de la presente invención, pueden intercambiarse la biotina y
estreptavidina o avidina, y deben interpretarse de acuerdo con esto
la descripción y los ejemplos en el presente documento. Otras
sustancias adecuadas para unirse al complejo
polinucleótido-enzima y hacer uso de las
interacciones biotina-estreptavidina o avidina, u
otras interacciones ligando de unión-sustrato están
disponibles por los expertos en la técnica, tales como enzimas o
proteínas de unión a ADN, que unen secuencias específicas en el
ADN.
Un ejemplo particular del uso mediante un
sistema motor de polinucleótido según la presente invención de una
interacción sustancia de unión/estreptavidina de este tipo es una
denominada "polea molecular" o "línea y anzuelo
molecular". Usando el sistema motor de polinucleótido
inmovilizado sobre chip de SPR revestido con estreptavidina
descrito en el ejemplo 2, a cuyo extremo libre se ha ligado una
biotina fijada a oligonucleótido, puede "sacarse" de la
disolución una molécula quimioluminiscente fijada a estreptavidina
mediante la biotina y, en presencia de ATP alimentar la
translocación, arrastrada hacia el chip revestido con
estreptavidina, pudiéndose controlar su presencia mediante la
detección de la emisión de luz, tal como se describe en el ejemplo
3. Este modelo de una polea molecular demuestra el posible uso del
sistema de polea-motor de polinucleótido según la
presente invención para arrastrar moléculas, tales como un ligando o
sustancia de prueba, fuera de la disolución hacia una superficie
sólida, pudiéndose éstas detectar y/o aislar y/o medir su actividad
y/o por otra parte someterse a prueba.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para capturar una sustancia de prueba
en disolución, suspensión o dispersión y ponerla en asociación con
una superficie sólida, procedimiento que comprende:
(a) proporcionar un sistema motor molecular que
comprende un ácido nucleico que tiene:
- (i)
- una región proximal del ácido nucleico a la cual está unida una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación;
- (ii)
- una región distal del ácido nucleico que permite que la sustancia de prueba se capture, adaptándose la región distal y/o la sustancia de prueba para ese fin, y
- (iii)
- una superficie sólida fijada al ácido nucleico;
(b) poner en contacto la región distal del
complejo polinucleótido-enzima con la sustancia de
prueba, mediante lo cual se captura la sustancia de prueba, y
(c) activar la enzima, mediante lo cual la
enzima transloca el polinucleótido, incluyendo la sustancia de
prueba, desde la región distal hacia la superficie sólida;
caracterizado porque la enzima comprende una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
Este procedimiento tiene una aplicación
particular en la industria farmacéutica, basándose los
procedimientos de selección actuales usados para pruebas, por
ejemplo interacciones proteína-fármaco, en sistemas
de dos componentes. En muchos de estos sistemas, se detecta la
interacción entre los dos componentes mediante un mecanismo que
implica emisión de luz producida por una proteína o fármaco
radiomarcado que interactúa con una sustancia de centelleo, o de
fluorescencia que resulta de la interacción proximal de los
productos químicos fluorescentes de dos componentes (el intercambio
cuántico entre estos dos productos químicos da como resultado una
emisión de luz que puede detectarse). Tales sistemas implican, por
ejemplo, un fármaco que está anclado a la sustancia de centelleo,
que puede existir como una perla, o a uno de los productos químicos
fluorescentes, y un complejo que se identifica por la emisión de
luz cuando una proteína de control conocida, que es radiactiva o
bien porta el otro producto químico fluorescente, se une al fármaco.
Las proteínas u otros compuestos de prueba que van a examinarse
para determinar su capacidad para unirse al fármaco se someten a
prueba para determinar su capacidad para desplazar la proteína de
control unida al complejo fármaco/perla.
Sin embargo, estos sistemas de detección son
difíciles de montar y es difícil aislar los complejos de dos
componentes resultantes. También, aunque la detección de estos
complejos parece sencilla, en la práctica, esto también se ha
encontrado que es poco fiable. Además, el uso de muestras
radiactivas es un problema por razones tanto de seguridad como de
residuos.
Por otro lado, el "anzuelo" basado en motor
molecular según la presente invención no sólo permitirá una
detección relativamente fácil de la interacción entre muchos
fármacos y muchas proteínas empleando un procedimiento en serie con
detección directa de la interacción fármaco-proteína
usando un ensayo de proximidad, sino que también permitirá el
aislamiento del complejo resultante. Puede lograrse la fijación del
fármaco al extremo del ADN a través del ligamiento de un
oligodúplex adecuado sintetizado con fármaco de unión (o a través de
un complejo
biotina-estreptavidina-fármaco).
Además, este sistema se diseña para que funcione a nivel molecular y
por tanto puede detectar moléculas sencillas que interaccionan entre
sí.
\newpage
Esta tecnología es una versión de los ensayos de
proximidad por centelleo (SPA, "Scintillation Proximity
Assay"). El motor se fijaría a una perla (véase anteriormente) y
las proteínas que van a examinarse para determinar la interacción
con los fármacos se radiomarcarían. Dado que el ADN translocado por
el motor puede producirse con una amplia variedad de fármacos
fijados, este sistema permitiría un examen a muy gran escala de
bibliotecas de expresión frente a grandes números de fármacos.
Además, debido a que existe tanto un retraso temporal como un
movimiento físico del complejo fármaco-enzima, el
sistema no sólo permitirá la detección directa de tales
interacciones, sino que también detectaría sólo complejos de unión
fuertes (ya que es más probable que otros se disocien antes de la
detección). Este sistema debe avanzar enormemente la miniaturización
actual de SPA y conducir al uso de tales ensayos en una escala
nanométrica.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona además un procedimiento para examinar una sustancia de
prueba para obtener una actividad biológica, química o física
predeterminada, procedimiento que comprende:
(a) proporcionar una disolución, suspensión o
dispersión de la sustancia de prueba, (i) por sí misma o bien (ii)
en asociación con una primera sustancia interactiva que puede
proporcionar o inducir una reacción que puede detectarse en una
segunda sustancia interactiva;
(b) proporcionar un sistema motor de
polinucleótido que comprende un ácido nucleico que tiene unido a
ello:
- (1)
- en una primera región proximal del ácido nucleico, una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo dicha enzima unida a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación, y
- (2)
- en una segunda región distal del ácido nucleico, una sustancia de unión que puede permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico en dicha región distal durante la translocación;
fijándose el ácido nucleico a un soporte sólido
y:
- (i)
- pudiéndose unir además la sustancia de unión a una sustancia de prueba que muestra la actividad predeterminada, y
- (ii)
- siendo la sustancia de unión por sí misma o comprendiendo el soporte sólido la segunda sustancia interactiva;
(c) activar el sistema motor de polinucleótido
para efectuar la translocación, y
(d) controlar la presencia o ausencia de la
reacción que puede detectarse durante o después de la
translocación;
caracterizado porque la enzima
comprende una enzima de restricción-modificación de
tipo I que tiene las subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la
forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
Por tanto, la presente invención proporciona
además una sustancia (tal como un compuesto químico) para su uso en
industria, medicina o agricultura, siempre que se identifique o que
pueda identificarse mediante el procedimiento de examen de esta
invención.
Según este procedimiento de examen, por ejemplo,
en presencia de ATP, el sistema motor de polinucleótido de la
presente invención dará como resultado la translocación del
polinucleótido, junto con la sustancia de unión a la cual puede
unirse una sustancia de prueba que muestra la actividad
predeterminada. La translocación del complejo sustancia de
unión-sustancia de prueba dará como resultado la
sustancia de prueba, opcionalmente junto con su primera sustancia
interactiva asociada, arrastrándose hacia el soporte sólido y por
tanto la segunda sustancia interactiva, dando como resultado la
reacción que puede detectarse. Como alternativa, el complejo
sustancia de unión-sustancia de prueba dará como
resultado por sí mismo la reacción que puede detectarse, que se
detectará a medida que este complejo se aproxima al soporte
sólido.
Ejemplos de reacciones que pueden detectarse y,
preferiblemente también medirse, incluyen quimioluminiscencia, tal
como se menciona con respecto al sistema modelo anteriormente;
magnetismo; corriente eléctrica; reacción química; radiactividad;
centelleo; o similares.
Por consiguiente, otros usos para el motor de
polinucleótido según esta invención incluyen su uso como un
interruptor inteligente, tal como mediante el uso de un marcador
fluorescente en ADN, que está activado por un intercambio cuántico
que sigue el movimiento del ADN que porta un primer fluoróforo hacia
un segundo fluoróforo. Puede detectarse el fotón emitido por el/los
intercambio(s) cuántico(s) y usarse para hacer
funcionar otro equipo. Por tanto, la activación del equipo puede
estar gobernada por la secuencia de ADN, haciendo así
"inteligente" al "interruptor". Esto tiene aplicabilidad
para la detección de secuencia de ADN en una escala nanotecnológica
o para el control programado de instrumentación.
Otro uso surge del hecho de que la translocación
de ADN con una perla magnética fijada rotaría la perla en un
movimiento en espiral alrededor de la cadena de ADN debido a la
naturaleza helicoidal del ADN. Tal movimiento de un imán alrededor
de un conductor produciría una corriente eléctrica. Dado que existen
pruebas de que el ADN puede conducir la electricidad; un sistema de
este tipo puede proporcionar una dinamo molecular, y la electricidad
generada puede derivarse para encender transistores.
La invención proporciona además el uso de:
una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdM y HsdS en la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1} en un sistema motor molecular tal como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
La presente invención se ilustrará ahora
mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo
1A
El plásmido pCFD30 es un plásmido recombinante
producido insertando un oligodúplex de fórmula
que contiene un sitio de
reconocimiento único (identificado en negrita) para EcoR124I
(el motor molecular) (Taylor et al., Substrate Recognition
and Selectivity in the Type IC DNA Modification Methylase M.
EcoR124I in Nucleic Acids Research 21 (21) (1993)) en el
sitio SmaI único de pTZ19R (Mead et al.,
Single-Stranded DNA "Blue" T7 Promoter
Plasmids: A Versatile Tandem Promoter Systemfor Cloning and Protein
Engineering in Protein Engineering 1 67-74 (1986))
usando procedimientos convencionales descritos por Maniatis et
al en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Harbor
Laboratory, Nueva York (1982). Se encontró que la secuencia de ADN
en el sitio de SmaI (a continuación, identificado en cursiva)
de pCFD30 era
CCCCCGTGCAGAATTCGAGGTCGACGGATCCGGGGGG, que
muestra la orientación de la secuencia de reconocimiento de
EcoR124I en el
plásmido.
Ejemplo
1B
Se incubó ADN de plásmido pCFD30 10 nM,
preparado tal como se describió anteriormente, a 37ºC en 25 \mul
de tampón de escisión (Tris-HCl 50 mM pH 8,0;
ditiotreitol (DTT) 1 mM; MgCl_{2} 10 mM; NaCl 50 mM). A esto se
añadieron MTasa(R124) 50 nM y HsdR(R124) 40 nM (estas
concentraciones garantizan principalmente la formación de complejos
R_{1}).
Para garantizar la formación del complejo
R_{1}, se usó el polipéptido de tipo Stp (descrito por Penner
et al en PhageT4-coded Stp:
Double-edged Effector of Coupled
DNAandtRNA-Restriction Systems en Journal of
Molecular Biology 249 (5), 857-68 (1995)),
Stp_{2-26} para promover la disociación de
cualquier complejo R_{2}. Por consiguiente, se llevaron a cabo las
mismas reacciones que anteriormente en presencia del polipéptido
Stp_{2-26} 100 nM.
Como alternativa, puede seguirse el
procedimiento anterior, pero usando HsdR(prrI) 40 nM en lugar
de HsdR(R124).
Ejemplo
1C
Para confirmar la producción del complejo
R_{1} y para garantizar que no está presente el complejo R_{2},
se realiza una prueba de escisión. Si sólo está presente el complejo
R_{1} no debe existir producto de escisión.
Se añadió ATP 2 mM al producto del ejemplo 1B
para iniciar la reacción, y se incubaron las muestras durante 30
minutos. También se realizó un control positivo para escisión en el
que se añadió un exceso de HsdR(R124) (250 nM) con el fin de
promover la formación del complejo R_{2}. Se hicieron pasar
muestras de 10 \mul sobre geles de agarosa al 1%.
Se encontró que el complejo R_{2} escindía el
ADN de plásmido, tal como se esperaba. No se observó escisión para
el complejo R_{1}, confirmando la producción del complejo R_{1}.
Puede usarse cualquier mezcla para todos los experimentos de motor
posteriores.
Este ejemplo proporciona la primera confirmación
de translocación de ADN por el complejo R_{1}: se translocó ADN de
plásmido circular que portaba una enzima quimioluminiscente y se
mostró la translocación mediante escisión con XhoI. El
modelo usado depende del hecho de que puede "enterrarse" un
único sitio de escisión de enzima de restricción (para XhoI)
en el complejo de translocación evitando la escisión por
XhoI. En este ejemplo, se investigó la escisión de ADN
circular que portaba una molécula de biotina a la que puede fijarse
una enzima quimioluminiscente unida a estreptavidina. La presencia
de enzimas quimioluminiscentes debe detener la translocación
mediante la colisión con el complejo R_{1} que se transloca y
"enterrando" el sitio de XhoI dentro del complejo de
translocación. Cuando se entierra el sitio de XhoI en el
complejo de translocación (se detendrá la translocación por la
presencia de la enzima quimioluminiscente), no existe linealización
del plásmido por XhoI. Este acontecimiento es independiente
de la dirección de la translocación.
Ejemplo
2A
Se linealizó el plásmido pCFD30 (tal como se
definió en el ejemplo 1A) con XmnI y se ligó a un exceso de
oligodúplex (CAGATGCACGTGAG*TCGC) que contenía un sitio de
XhoI (identificado en negrita) y una única molécula de
biotina (obtenida de Cruachem Ltd, Glasgow) unida a timina (*T)
para producir pCFD30-biotina. Se identificaron los
recombinantes mediante la escisión de XhoI. Se produjo la
presencia de una única copia del oligodúplex mediante la escisión de
XhoI seguido del ligamiento de nuevo y se confirmó mediante
análisis de secuencia de ADN de los recombinantes resultantes.
Se añadió un exceso de enzima quimioluminiscente
unida a estreptavidina (peroxidasa de rábano unida a estreptavidina
(S-HRP), disponible de Pierce & Warriner (RU)
Ltd, Upper Northgate Street, Chester, RU) al plásmido y se purificó
el complejo de la enzima excedente usando precipitación en etanol
(Maniatis, en el mismo lugar, ejemplo 1A).
Se confirmó la presencia de enzima unida a ADN
mediante una medición quimioluminiscente sencilla. Se formaron
manchas con 100 ng del plásmido
pCFD30-biotina/S-HRP sobre una
membrana de nailon empapada con sustrato quimioluminiscente
(Sustrato SuperSignal (marca comercial registrada) de Pierce &
Warriner (RU) Ltd, Upper Northgate Street, Chester, RU). Se incubó
la membrana a 37ºC para activar la enzima y se visualizó la mancha
usando película de rayos X. Se formaron manchas con los controles de
pCFD30 y pCFD30-biotina sobre la misma membrana.
Se obtuvo una emisión de luz positiva para el
plásmido pCFD30-biotina/S-HRP sólo,
indicando una enzima quimioluminiscente unida a ADN.
Ejemplo
2B
Se produjo un complejo R_{1} y se confirmó
como pCFD30 que no escinde tal como se describió en el ejemplo 1. Se
incubó este complejo R_{1} con una concentración equimolar de
pCFD30-biotina unida con enzima quimioluminiscente
preparada tal como anteriormente. Se añadió ATP, usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 1. Después de 15 min. a 37ºC,
se sometió el plásmido a escisión con 10 unidades de XhoI.
Además, también se sometieron a escisión con XhoI, pCFD30,
pCFD30-biotina,
pCFD30-biotina/S-HRP y
pCFD30-biotina/S-HRP con complejo
R_{1}, pero sin ATP.
Se escindieron todos los plásmidos excepto el
pCFD30-biotina/S-HRP con ATP por la
XhoI, produciendo ADN lineal (detectado tras la
electroforesis en gel). La adición de
\gamma-S-ATP (un análogo no
hidrolizable de ATP, que no puede soportar translocación) en lugar
de ATP también produjo ADN lineal. Por tanto, se "enterró" el
sitio de XhoI en el complejo de translocación bloqueado
producido por la acción de ATP, evitando la escisión. La
translocación en cualquiera de las direcciones logra este
procedimiento.
Por tanto, el complejo R_{1} puede
translocarse dirigido por ATP y puede usarse como un motor
molecular. Esta es la primera confirmación de translocación (en
oposición a la actividad ATPasa) por el complejo R_{1}.
Se copió el ADN del plásmido pCFD30 usando PCR
(usando cebador universal con biotina fijada en el extremo 5'
(disponible de Cruachem Ltd., Todd Campus, West of Scotland Science
Park, Acre Road, Glasgow G20 0UA) y un cebador que solapaba el
sitio de XmnI único: GCCCCGAAGAACGTTTTCC) para dar un
fragmento de ADN lineal con biotina fijada en un extremo específico
(cerca del sitio de reconocimiento para la enzima R_{1}). Se fijó
el producto de PCR al chip revestido con estreptavidina de una
máquina de SPR (resonancia de plasmón superficial) (Biacore X
disponible de Biacore AB, Meadway Technology Park, Stevenage,
Herts., RU). Se controló la fijación usando SPR para confirmar que
no pudo unirse más producto de PCR al chip. Se fijó la biotina a
otro oligodúplex (como en el ejemplo 2A), que se ligó al otro
extremo del producto de PCR unido al chip; de nuevo, se controló la
fijación usando la SPR.
Este otro oligodúplex tenía un sitio diana de
enzima de restricción cerca de un extremo, accesible para la
escisión mediante la enzima de restricción (XhoI).
Se fijó el complejo R_{1}, preparado según el
ejemplo 1 (el motor molecular), al producto de PCR (el sitio diana
estaba cerca del chip) y se controló la fijación mediante SPR. La
adición de ATP dio como resultado la translocación del ADN. Tras la
translocación, el sitio diana de XhoI es inaccesible debido a
que está enterrado en el complejo de translocación, tal como se
observó en el ejemplo 2.
Para controlar el proceso de translocación y
para confirmar el modelo de "anzuelo", se "sacó" una
enzima unida a estreptavidina que puede producir
quimioluminiscencia (S-HRP, tal como se describió en
el ejemplo 2), de la disolución por la biotina unida en el extremo
de la molécula de ADN. Se controló la presencia de la enzima
mediante emisión de luz desde el chip. La escisión mediante
XhoI libera de nuevo a la disolución toda la enzima
quimioluminiscente no translocada. Se retiró la enzima
quimioluminiscente presente en la disolución mediante lavado
repetido.
repetido.
Se realizaron los experimentos descritos a
continuación usando un chip revestido con estreptavidina (Biacore
SA5 disponible de Biacore AB, Meadway Technology Park, Stevenage,
Herts., RU) desde una máquina de resonancia de plasmón superfical
(BIAlite 2000), dado que esta máquina permite un control en tiempo
real de la fijación de moléculas a la superficie del chip. También
permite el control en tiempo real de la liberación de moléculas
desde la superficie del chip.
Para investigar adicionalmente la función del
motor cuando está fijado a una superficie sólida a través de un
extremo de una molécula de ADN, se llevaron a cabo los siguientes
experimentos:
Ejemplo
4A
Se sintetizó un oligonucleótido
(CTACGGTACCGAAACGCGTGTCGGGCCCGCGAAGCTTGC_{x}) que portaba una
molécula de biotina (x) en un extremo por Cruachem. Se controló la
fijación del oligo a la superficie mediante SPR. Se apareó este
oligo a un oligo complementario
(CATGGATGCCATGGCTTTGCGCACAGCCCGGGCGCTTCGA
ACG) para dar un oligodúplex con una biotina fijada y con un "extremo pegajoso" de 6 pares de bases adecuado en el extremo 3' (extremo de biotina) para permitir el ligamiento de otra molécula de ADN. También se controló el apareamiento de este segundo oligo mediante SPR. El tampón de elución (tampón 1) usado fue Tris-HCl 10 mM (pH 8), MgCl_{2} 10 mM, NaCl 100 mM, DTT 1 mM.
ACG) para dar un oligodúplex con una biotina fijada y con un "extremo pegajoso" de 6 pares de bases adecuado en el extremo 3' (extremo de biotina) para permitir el ligamiento de otra molécula de ADN. También se controló el apareamiento de este segundo oligo mediante SPR. El tampón de elución (tampón 1) usado fue Tris-HCl 10 mM (pH 8), MgCl_{2} 10 mM, NaCl 100 mM, DTT 1 mM.
Ejemplo
4B
Se realizaron varios experimentos para
determinar la densidad máxima a la que un oligodúplex de este tipo
puede unirse a un chip revestido con estreptavidina de una máquina
de resonancia de plasmón superficial. Esto se logró mediante el paso
repetido de disoluciones diluidas (<1 nM, pero concentración
conocida) de oligonucleótido sobre el chip. Cuando no se observó
unión adicional esta concentración total era la capacidad del chip.
Se confirmó que, a bajas densidades, los sitios de estreptavidina
restantes en el chip pudieron bloquearse usando biotina libre y
entonces no pudo unirse más oligodúplex al chip.
Sin embargo, se encontró que había una variación
considerable en la capacidad de cada lote de chips, supuestamente
debido a las pequeñas variaciones en el área de superficie. Por
tanto, se calculó el número de moléculas presentes en cada chip
sometido a prueba. Usando estos datos, fue posible determinar que
chips portaban aproximadamente una molécula cada aproximadamente 100
nm^{2} sobre el chip. Se encontró que esta era la mejor densidad
para el experimento descrito a continuación; a densidades
inferiores, cualquier cambio en los datos de SPR fue difícil de
medir, mientras que densidades superiores dieron resultados más
aleatorios lo que sugiere interferencia entre motores
adyacentes/moléculas de ADN.
\newpage
Ejemplo
4C
Se copió el ADN del plásmido pCFD30 usando PCR
(usando cebador Universal disponible de Cruachem Ltd., Todd Campus,
West of Scotland Science Park, AcreRod, Glasgow G20 0UA) y un
cebador que solapaba el sitio de XmnI único:
(GCCCCGAAGAACGTTTTCC) para dar un fragmento de ADN lineal. Se
escindió este ADN lineal con KpnI para producir un
"extremo pegajoso" complementario adecuado. Se fijó el producto
de PCR al chip revestido con estreptavidina de una SPR mediante
ligamiento a los oligodúplex fijados a la superficie del chip usando
procedimientos convencionales descritos en Maniatis (en el mismo
lugar, ejemplo 1). Se lavó el chip libre de ligasa y se eliminó
cualquier ADN lineal no ligado usando SDS al 1% en el tampón
detallado anteriormente (este también puede usarse para eliminar
enzima EcoR124I del ADN en el chip). Los datos de la SPR
mostraron que la ligación fue satisfactoria.
Se dejó que EcoR124I purificada en la
forma del complejo R_{1} (MTasa 100 nM + HsdR (R124 con y sin Stp
100 nM, o prr [que no requiere Stp]) 100 nM o el complejo R_{2}
(MTasa 100 nM + HsdR 500 nM) en tampón de escisión (ejemplo 1B),
se uniese al ADN (controlado por SPR). Tras la adición de ATP 2 mM
se observó una gran liberación de material desde el chip para ambos
complejos. Se determinó la confirmación de que el motor estaba
presente como complejo R_{1} mediante el procedimiento descrito en
el ejemplo 1B.
De manera interesante, durante cualquier periodo
de tiempo, hubo una mayor liberación de material para el complejo
R_{2} que para el complejo R_{1} y la tasa de liberación también
fue mayor para el complejo R_{2}. El lavado del chip con tampón 1
(ejemplo 4A), después de los ensayos de translocación, seguido por
la adición adicional de ATP mostró que el complejo R_{1} podía
dar otros cambios pero el complejo R_{2} no.
Esto se debe a la translocación, por el motor,
del ADN seguido por el desplazamiento de la unión
biotina-estreptavidina a la superficie, liberando
así el motor. El complejo R_{2} puede experimentar translocación
bidireccional y puede desplazar todos los motores unidos, mientras
que el complejo R_{1} es unidireccional y sólo algunos
(\sim50%) de los motores se desplazan de la superficie. La adición
de más ATP al complejo R_{1} permite la translocación adicional y
por tanto desplazamiento adicional del motor. Por tanto, el complejo
R_{1} también puede reordenarse tras la translocación.
La translocación de ADN por el motor conduce al
desplazamiento del ADN de la superficie del chip. Por tanto, tanto
el complejo R_{1} como el complejo R_{2} pueden translocarse.
Los datos del complejo R_{1} también muestran que no se desplazan
todos los motores lo que sugiere que algunos motores se translocan
alejándose de la superficie sin desplazamiento.
El ejemplo 2 anteriormente en el presente
documento confirmó la translocación mediante el complejo R_{1}.
Sin embargo, aunque el concepto de que el complejo
biotina-estreptavidina-HRP
"bloquea" la translocación parece ser la explicación más
lógica de estos resultados, otra explicación podría ser que la
translocación está bloqueada simplemente por la falta de ADN para
la translocación y por casualidad el sitio de XhoI se
"entierra" en el complejo bloqueado. Por tanto, era necesario
investigar cualquier desplazamiento del enlace
biotina-estreptavidina.
Se realizó el siguiente experimento para mostrar
que el desplazamiento del motor (R_{1}-) desde la superficie del
chip de SPR no era simplemente el resultado de la colisión del motor
con la superficie sino un resultado de un desplazamiento del enlace
biotina-estreptavidina mediante translocación.
Ejemplo
5A
Se usó el plásmido
pCFD30-biotina, producido tal como se describió
anteriormente, para producir tres plásmidos lineales mediante
escisión con AflIII, BsgI o DraIII, respectivamente, (mostrado en la
figura 1). La escisión de 200 ng de pCFD30-biotina
con las enzimas de restricción respectivas (siguiendo las
instrucciones del fabricante - New England BioLabs) produjo los
plásmidos requeridos, teniendo cada uno la molécula de biotina a
distancias diferentes (y orientaciones) desde el sitio s_{R124}.
El oligodúplex contiene una sitio de XhoI único, que debe
ser inaccesible si está "enterrado" bajo el motor de
translocación/biotina-estreptavidina-HRP
(tal como se describió previamente). Sin embargo, si se rompe el
enlace biotina-estreptavidina mediante el motor de
translocación, entonces la adición de estreptavidina en exceso, tras
la adición de ATP, debe evitar que HRP se vuelva a unir a la biotina
en el ADN.
Se añadió estreptavidina-HRP
(Pierce & Warriner Nº de catálogo 21126) al plásmido (exceso
sobre la concentración de plásmido) y se eliminó el exceso mediante
precipitación con etanol del ADN usando técnicas convencionales
(Maniatis en el mismo lugar, ejemplo 1). Se sometió a ensayo la
presencia de HRP unido en una muestra (5-10 ng) de
ADN usando el sustrato quimioluminscente Supersignal de Pierce (nº
de catálogo 34080) tal como se describe por el fabricante siguiendo
"la formación de manchas" de muestras diluidas sobre la
membrana de nailon.
Se incubó el plásmido unido a HRP (100 nM) con
una concentración equimolar de MTasa + motor de HsdR (R124 o prr)
(complejo R_{1}), tal como se describió en el ejemplo 2B. Comenzó
la translocación mediante la adición de ATP 2 mM.
Para el bloqueo del ensayo de translocación (tal
como se describió en el ejemplo 2 para ADN circular), se sometió a
ensayo la escisión del plásmido usando la enzima XhoI seguido
por electroforesis en gel de agarosa (Maniatis en el mismo lugar,
ejemplo 1).
Para el ensayo de desplazamiento se añadió
estreptavidina 300 nM para extinguir cualquier S-HRP
desplazado y se controló la presencia de S-HRP en
el ADN mediante precipitación con etanol del ADN seguido por la
formación de manchas sobre la membrana de nailon y se sometió a
ensayo para determinar la quimioluminiscencia como
anteriormente.
Todas las digestiones de XhoI produjeron
escisión del ADN lineal en fragmentos del tamaño previsto, lo que
indica que la translocación no "enterró" el sitio de
XhoI. Esto sugiere que los resultados previos eran una
consecuencia de usar ADN circular de plásmido.
Los ensayos de desplazamiento mostraron una
falta de, o cantidades significativamente reducidas de,
quimioluminiscencia lo que indica la pérdida de HRP desde el ADN.
Los controles sin añadir ATP, ni EcoR124I (motor) y el uso de
\gamma-S ATP (un análogo no hidrolizable de ATP
que evita la translocación) indicaron que la estreptavidina en
exceso no desplazó la unión estreptavidina-HRP salvo
cuando se producía la translocación.
Ejemplo
5B
Se repitieron los experimentos anteriores pero
con la biotina fijada al extremo final del ADN lineal. Se empleó
una versión modificada del oligodúplex descrito en el ejemplo 4A
para estos experimentos. Se alteraron las primeras pocas bases de
cada cadena superior para producir un "extremo pegajoso" de
PstI.
Los experimentos fueron tal como se describió en
el ejemplo 2 salvo que el oligodúplex estaba ligado al sitio PstI
de ADN de pCFD30 y, para garantizar la disposición correcta del
sitio de reconocimiento s_{R124} y biotina, se escindió
adicionalmente el plásmido con SalI. La purificación del fragmento
grande usando técnicas convencionales de extracción con fenol de
geles de agarosa de bajo punto de fusión dio como resultado una
molécula de ADN lineal con biotina fijada a un extremo y el sitio
s_{R124} en el otro extremo. En este caso no se observó
desplazamiento de HRP en ninguna de las condiciones descritas
anteriormente. Por tanto, cuando la biotina está "libre" en el
extremo final de una molécula de ADN no se desplaza por el complejo
de translocación.
La observación en el ejemplo 2 de que el sitio
de XhoI, presente en el ADN de plásmido circular, estaba
"enterrado" por el complejo de translocación bloqueado no era
debido a la presencia de la
biotina-S-HRP que bloqueaba la
translocación, sino debido al bloqueo del complejo tras la
translocación de todo el ADN disponible. No obstante, el ejemplo 2
todavía demuestra que se produce la translocación, mediante el
complejo R_{1}.
Por tanto, aunque se ha confirmado que el
complejo R_{1} puede provocar la translocación, de manera
inesperada también puede desplazar la unión
biotina-estreptavidina muy fuerte. Sin embargo,
cuando la biotina se fija a cualquiera de los pocos nucleótidos
terminales del ADN, no se altera la unión
biotina-estreptavidina.
Se produjo el complejo R_{1} de EcoR124
usado, usando Stp en exceso para garantizar que no se formaba nada,
o poco, complejo R_{2}. Sin embargo, se obtuvieron los mismos
resultados cuando, en lugar de HsdR(R124), se usó
HsdR(prr) en ausencia de Stp. El ejemplo 3 muestra que el
complejo R_{2} es bidireccional; se desplazaron todos los motores
desde la superficie del chip. También se ha encontrado (Firman et
al en Eur Mol Biol Org J 19(9) 2094-2102
(2000)) que el complejo R_{1} avanza menos (dando como resultado
una tasa de translocación inferior) que el
complejo R_{2}.
complejo R_{2}.
Se usó el plásmido usado en el ejemplo 2A para
fijar una perla paramagnética revestida con estreptavidina
(disponible de Pierce & Warriner). Se purificó el ADN que
llevaba la perla fijada a partir de la disolución usando un imán
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usó este ADN,
linealizado mediante escisión con PstI y con la perla
paramagnética fijada, para determinar si el motor molecular giraría
la perla paramagnética en disolución.
Se prepararon el ADN y el motor tal como se
describió en el ejemplo 1 y se cargó la muestra en el tubo capilar
de una máquina de resonancia paramagnética. Se añadió ATP 2 mM a uno
de los tubos y se dejó que difundiera en la muestra. A medida que
el ATP entraba en la célula de medida, se midió un momento
paramagnético, que se debilitaba gradualmente a medida que el ATP
se difundía a través de la muestra. La adición de
_{\chi}-S-ATP no produjo tal
señal, lo que indica que se necesita la hidrólisis de ATP para este
efecto.
La perla "que gira" en el campo magnético
aplicado produce un momento paramagnético. Esto refleja la
translocación del ADN (el extremo libre del ADN rota a medida que
el motor sigue la doble hélice) y puede usarse para medir la
translocación. Además, indica la posibilidad de sustituir la perla
magnética con una perla magnética permanente y usar este sistema
como una dinamo molecular (si el ADN está fijado a la superficie la
perla magnética que gira debe generar electricidad dentro del
"conductor" de ADN).
Para un experto en la técnica será evidente que
el sistema descrito anteriormente tiene aplicaciones para examinar
o someter a prueba una actividad biológica, química o física
predeterminada; por ejemplo, para examinar nuevos ligandos
farmacológicamente eficaces.
<110> Universidad de Portsmouth
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un motor de polinucleótido, un
sistema motor, su preparación y usos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT/GB00/02034
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB00/02034
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
25-05-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccccgtgca gaattcgagg tcgacggatc cgggggg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El extremo de la secuencia No. 2
está unido al principio de la secuencia No. 3 mediante una única
molécula de biotina.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatgcacg tgag
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgc
\hfill4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccccgaaga actgttttcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Salmonella typhimurium
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El extremo de la secuencia No. 5
lleva una molécula de biotina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctacggtacc gaaacgcgtg tcgggcccgc gaagcttgc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatggatgcc atggctttgc gcacagcccg ggcgcttcga acg
\hfill43
Claims (22)
1. Un sistema motor molecular que comprende una
secuencia de ácido nucleico que tiene unido a ella:
- (1)
- en una primera región proximal del ácido nucleico, una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación; y
- (2)
- en una segunda región distal del ácido nucleico, una sustancia de unión que puede permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico en dicha región distal durante la translocación;
caracterizado porque la
enzima comprende una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
2. El sistema según la reivindicación 1, en el
que la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ADN
lineal o circular.
3. El sistema según la reivindicación 1, en el
que la sustancia de unión comprende un ligando de unión que puede
unirse a una sustancia en disolución.
4. El sistema según la reivindicación 1, en el
que el ácido nucleico se fija a un soporte sólido.
5. El sistema según la reivindicación 3, en el
que es lineal el ácido nucleico, teniendo así dos extremos, estando
unida la sustancia de unión a un extremo y estando unido un soporte
sólido al otro extremo.
6. El sistema según la reivindicación 3, en el
que la sustancia de unión comprende uno o más de:
- (a)
- una sustancia que se requiere que se transloque; o
- (b)
- medios para unir al complejo ácido nucleico-enzima la sustancia que se requiere que se transloque; o
- (c)
- tanto (a) como (b) juntos.
7. El sistema según la reivindicación 3, en el
que la sustancia de unión comprende uno o más de:
- (a)
- un ligando de unión para unir una sustancia en disolución, suspensión o dispersión;
- (b)
- una enzima que produce quimioluminiscencia;
- (c)
- una sustancia magnética;
- (d)
- una secuencia de ADN;
- (e)
- una sustancia de centelleo;
- (f)
- una sustancia radiactiva;
- (g)
- una sustancia que puede producir una corriente eléctrica;
- (h)
- una sustancia que puede moverse o dar como resultado un movimiento;
- (i)
- una sustancia que puede interactuar con el medio del sistema para producir un efecto que puede detectarse y/o medirse; y/o
- (j)
- biotina, estreptavidina o avidina.
8. Un sistema motor molecular que comprende una
secuencia de ácido nucleico que tiene unido a ella:
- (1)
- una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a un región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación; y
- (2)
- un soporte sólido;
caracterizado porque la
enzima comprende una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene
subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
\newpage
9. El sistema motor según la reivindicación 1 o
la reivindicación 8, en el que la subunidad HsdR es la de la enzima
de restricción-modificación de tipo IC de
EcoprrI o un mutante de dicha subunidad HsdR que confiere a
la enzima la propiedad de translocar una secuencia de ácido nucleico
sin provocar la escisión de la misma y sin pérdida de actividad
ATPasa.
10. Un procedimiento para translocar una
sustancia unida a una secuencia de ácido nucleico desde una región
distal de la secuencia de ácido nucleico hacia una región proximal,
procedimiento que comprende:
- (a) {}\hskip1mm (i)
- proporcionar en la región distal de la secuencia de ácido nucleico una sustancia de unión, o
- (ii)
- unir una sustancia a la región distal de la secuencia de ácido nucleico; y
- (b) {}\hskip1mm (i)
- proporcionar en la región proximal un complejo de la secuencia de ácido nucleico con una enzima, o
- (ii)
- complejar una enzima a la región proximal de la secuencia de ácido nucleico, y
(c) activar la enzima, mediante lo
cual la enzima transloca la secuencia de ácido nucleico, incluyendo
la sustancia de unión, desde la región distal hacia la región
proximal;
caracterizado porque la
enzima comprende una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de ATP e iones
Mg^{++}.
12. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de un tampón de
restricción.
13. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de
ditiotrei-
tol.
tol.
14. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que el complejo polinucleótido-enzima se fija
a un soporte sólido.
15. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de
ADN circular o lineal.
16. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el que la subunidad HsdR es la de la enzima de
restricción-modificación del tipo IC de
EcoprrI o un mutante de dicha subunidad HsdR que estabiliza
el complejo R_{1}.
17. Un procedimiento para capturar una sustancia
de prueba en disolución, suspensión o dispersión y ponerla en
asociación con una superficie sólida, procedimiento que
comprende:
(a) proporcionar un sistema motor molecular que
comprende un ácido nucleico que tiene:
- (i)
- una región proximal del ácido nucleico a la cual está unida una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación;
- (ii)
- una región distal del ácido nucleico que permite que la sustancia de prueba se capture, adaptándose la región distal y/o la sustancia de prueba para ese fin, y
- (iii)
- una superficie sólida fijada al ácido nucleico;
(b) poner en contacto la región distal del
complejo polinucleótido-enzima con la sustancia de
prueba, mediante lo cual se captura la sustancia de prueba, y
(c) activar la enzima, mediante lo cual la
enzima transloca el polinucleótido, incluyendo la sustancia de
prueba, desde la región distal hacia la superficie sólida;
caracterizado porque la enzima comprende
una enzima de restricción-modificación de tipo I
que tiene las subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma
estequiométrica HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
18. Un procedimiento para examinar una sustancia
de prueba para obtener una actividad biológica, química o física
predeterminada, procedimiento que comprende:
\newpage
(a) proporcionar una disolución, suspensión o
dispersión de la sustancia de prueba, (i) por sí misma o bien (ii)
en asociación con una primera sustancia interactiva que puede
proporcionar o inducir una reacción que puede detectarse en una
segunda sustancia interactiva;
(b) proporcionar un sistema motor de
polinucleótido que comprende un ácido nucleico que tiene unido a
ello:
- (1)
- en una primera región proximal del ácido nucleico, una enzima que puede translocar la secuencia de ácido nucleico, permaneciendo unida dicha enzima a dicha región proximal del ácido nucleico, como un complejo con eso, durante la translocación, y
- (2)
- en una segunda región distal del ácido nucleico, una sustancia de unión que puede permanecer unida a la secuencia de ácido nucleico en dicha región distal durante la translocación;
fijándose el ácido nucleico a un soporte sólido
y:
- (i)
- pudiéndose unir además la sustancia de unión a una sustancia de prueba que muestra la actividad predeterminada, y
- (ii)
- siendo la sustancia de unión por sí misma o comprendiendo el soporte sólido la segunda sustancia interactiva;
(c) activar el sistema motor de polinucleótido
para efectuar la translocación, y
(d) controlar la presencia o ausencia de la
reacción que puede detectarse durante o después de la
translocación;
caracterizado porque la
enzima comprende una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdS y HsdM mostrando la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}.
19. El uso de:
una enzima de
restricción-modificación de tipo I que tiene las
subunidades HsdR, HsdM y HsdS en la forma estequiométrica
HsdR_{1}M_{2}S_{1}
en un sistema motor molecular según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9.
20. El uso de una enzima según la reivindicación
19, en el que la enzima está unida a una secuencia de ácido
nucleico.
21. El uso de una enzima según la reivindicación
20, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de ADN
circular o lineal.
22. El uso de una enzima según una cualquiera de
las reivindicaciones 19 a 21, en el que la subunidad HsdR es la
enzima de restricción-modificación de tipo IC de
EcoprrI o es un mutante de dicha subunidad HsdR de
EcoprrI que estabiliza el complejo R_{1}.
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|---|---|---|---|
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