ES2288330B1 - Procedimiento de identificacion de potenciales compuestos moduladores de la actividad de nor-1, nueva diana diagnostica y terapeutica de enfermedades cardiovasculares. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de potenciales compuestos moduladores de la actividad de nor-1, nueva diana diagnostica y terapeutica de enfermedades cardiovasculares. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de la actividad de NOR-1,
nueva diana diagnóstica y terapéutica de enfermedades
cardiovasculares.
NOR-1 es un factor de
transcripción potencial modulador de la función de células
vasculares (células musculares lisas vasculares y células
endoteliales) y monocitos/macrófagos y por tanto una nueva diana
diagnóstica en humanos, para el diagnóstico, seguimiento de
enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de
NOR-1 o para la monitorización, seguimiento o
evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas
enfermedades cardiovasculares; así como una diana terapéutica que
permite la identificación de nuevos compuestos terapéuticos para el
tratamiento de estas enfermedades y el diseño de nuevos protocolos
de terapia génica.
Description
Procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de la actividad de NOR-1,
nueva diana diagnóstica y terapéutica de enfermedades
cardiovasculares.
Biomedicina. Nuevas dianas terapéuticas y
diagnóstico de enfermedades e identificación de nuevos compuestos
farmacéuticos que regulan la actividad de dichas dianas
terapéuticas. Enfermedades cardiovasculares como la
arteriosclerosis.
Para entender los mecanismos moleculares
involucrados en la activación y desdiferenciación de las células
musculares lisas vasculares (CMLV), se necesita un detallado mapaje
de las cascadas de factores de transcripción inducidos por los
estímulos aterogénicos. Estos genes maestros podrían ser dianas
para nuevas estrategias, tanto terapéuticas como de diagnostico.
Recientemente, distintos receptores nucleares, entre los cuales
cabe destacar, los receptores activados por proliferadores
peroxisomicos (Peroxisome Proliferator-Activated
Receptors, PPARs) (Marx N, Schonbeck V, Lazar MA, Libby P,
Plutzky J. Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma activators inhibit gene expression and migration in
human vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1998; 83:
1097-1103; Staels B, Koening W, Habib A, Merval R,
Lebret M, Torra IP, Delerive P, Faadel A, Chinetti G, Fruchart JC,
Najib J, Maclouf J, Tedgui A. Activation of human aortic
smooth-muscle cells is inhibited by PPARalpha but
not by PPARgamma activator. Nature 1998; 393:
790-793), receptores de retinoicos, tanto el
receptor del retinoide X (Retinoid X Receptor, RXR), como el
receptor del ácido retinoico (Retinoic Acid Receptor, RAR) y
el receptor huérfano relacionado con el de retinoico
(Retinoid-related Orphan Receptor, ROR) han
sido identificados en la activación/proliferación de CMLV y
consecuentemente implicados en el proceso aterogénico (Miano JM,
Topouzis S, Majesky MW, Olson EN. Retinoid expression and
all-trans retinoic acid-mediated
growth inhibition in vasculat smooth muscle cells.
Circulation. 1996; 93: 1886-1895; Neuville P,
Yan Z, Gidlof A, Pepper MS, Hansson GK, Gabbiani G, Sirsjo A.
Retinoic acid regulates arterial smooth muscle cell proliferation
and phenotypic features in vivo and in vitro through
an RARalpha-dependent signalling pathway.
Arterioscler Thronb Vasc Biol. 1999; 19:
1430-1436; Haxsen V, Adam-Stitah S,
Ritz E, Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin II on
vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001; 88:
637-644). Los receptores nucleares son una gran
familia de factores de transcripción activados por ligandos, los
cuales regulan complejos programas génicos que tienen una gran
importancia en prácticamente todos los procesos del desarrollo y la
fisiología en la edad adulta (Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M,
Herrlich P, Schütz, Umesono K, Blumberg B, Kastner P, Mark M,
Chambon P, Evans RM. The nuclear receptor superfamily: the second
decade. Cell. 1995; 83: 835-839; Giguére V.
Orphan nuclear receptors: from gene to function. Endocr Rev
1999; 20: 689-725). Además, en la actualidad se
conocen ligandos sólo para la mitad de los receptores nucleares
conocidos, los restantes receptores son conocidos como receptores
huérfanos y constituyen una área especialmente para la
investigación y desarrollo (I+D).
NOR-1, junto con Nur77 y Nurr1,
forman la subfamilia del NGFI-B dentro de la
superfamilia de los receptores nucleares (Mangelsdorf DJ, Thummel C,
Beato M, Herrlich P, Schütz, Umesono K, Blumberg B, Kastner P, Mark
M, Chambon P, Evans RM. The nuclear receptor superfamily: the
second decade. Cell. 1995; 83: 835-839;
Giguére V. Orphan nuclear receptors: from g ene to function.
Endocr Rev 1999; 20: 689-725). Estos genes
han sido involucrados en regulación neuroendocrina, diferenciación
neuronal, regeneración hepática, apoptosis celular y de respuesta a
estímulos mitogénicos en distintos tipos celulares (Maruyama K,
Tsukada t, Ohkura N, Bandoh S, Hosono T, Yamaguchi K. The
NGFI-B subfamily of the nuclear receptor
superfamily. Int J Oncol. 1998; 12:
1237-1243). Finalmente, es de esperar que nuevos
conocimientos sobre la actividad funcional completas de estos
factores de transcripción pueden permitir el desarrollo de nuevas
estrategias de diagnóstico y tratamiento de enfermedades causadas
por la alteración de dichas potenciales dianas.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación de NOR-1 y/o
Nu77 y/o Nurr1 en muestras biológicas de mamíferos, preferentemente
humanos, para el diagnóstico, seguimiento de enfermedades
cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1
o para la monitorización, seguimiento o evaluación de la eficacia
de tratamientos farmacológicos de dichas enfermedades
cardiovasculares, caracterizado porque comprende las siguientes
partes:
- a)
- Obtención de la muestra biológica mediante extracción sanguínea o intervención intravascular (aterectomía o similar), y
- b)
- identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 en dicha muestra biológica, donde un resultado positivo o incrementado respecto a un nivel basal considerado fisiológico indicará existencia de una enfermedad cardiovascular que cursa con activación de NOR-1, o donde la comparación de los niveles de NOR-1 determinados a I o largo del tiempo indicarían la evolución de la enfermedad cardiovascular o si, por ejemplo, el tratamiento administrado para dicha enfermedad presenta algún efecto terapéutico.
Un objeto adicional de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1, y por
tanto, potenciales compuestos terapéuticos de enfermedades
cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1
y/o Nur77 y/o Nur1, caracterizado por las siguientes etapas:
- a)
- puesta en contacto del mencionado compuesto en un entorno biológico donde exista la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 funcionalmente activa,
- b)
- determinación de los niveles de expresión o de los niveles de actividad de la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, y
- c)
- la selección de dicho compuesto como compuesto modulador de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 si se constata la inhibición o la potenciación de los efectos de NOR-1 en presencia del compuesto.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o
Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un
cultivo de CMLV de mamíferos, preferentemente humanas o porcinas,
donde en presencia o no de mitógenos inductores de
NOR-1 - suero, trombina, PDGF y EGF, entre otros, -
se añade el potencial compuesto a valorar y posteriormente se
determinan: los niveles de mRNA de NOR-1 y/o Nur77
y/o Nur1 (mediante RT-PCR, Northern blot, in
situ RT-PCR o hibridación in situ, entre
otros métodos) o la actividad NOR-1 y/o Nur77 y/o
Nur1 [mediante la capacidad de estos factores de transcripción de
unirse a secuencias específicas de ADN en Ensayos de Retardación en
la Movilidad Electroforética (EMSA)], como se ha real ido en la
presente invención, o determinando la capacidad de
NOR-1 de formar heterodímeros con otros miembros de
la familia NGFI-B (Nur77 y Nurr1) modulando así la
transactivación de genes d lana; o mediante determinación de los
niveles de proteína (mediante las técnicas mencionadas
anteriormente).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o
Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un
modelo animal, preferentemente porcino, al que se somete a una
intervención de angioplastia coronaria transluminal percutanea
(PTCA), al que se administra el potencial compuesto a valorar y
posteriormente se determina los niveles de NOR-1 de
las lesiones provocadas mediante técnicas como
RT-PCR, Northern blot, in situ
RT-PCR o Western blot (ver ejemplo 2.3 de la
presente invención) entre otras.
Así, un objeto adicional de la presente
invención lo constituye un compuesto inhibidor o potenciador de
NOR-1 (que modifique su expresión o su actividad
como factor de transcripción individual o cooperativamente con los
otros miembros de la familia NGFI-B) identificados
según un procedimiento descrito anteriormente. Igualmente, otro
objeto adicional lo constituye una composición farmacéutica
caracterizada porque comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz
de un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1
identificado por el procedimiento de la presente invención.
Otro objeto adicional de la presente invención
lo constituye el empleo de una composición farmacéutica descrita
anteriormente en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares que cursen con
activación de NOR-1 en mamíferos, preferentemente
humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención
es un procedimiento de terapia génica para el tratamiento y
prevención en mamíferos, preferentemente humanos, de enfermedades
cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1
que permitiera la modificación de la expresión de
NOR-1 en la células implicadas en la etiopatogenia
de dichas enfermedades, por ejemplo mediante la expresión de
oligonucleótidos antisense de NOR-1 (ODNs)
utilizando vectores o vehiculizantes que permitan la entrada de
dichos ODNs en dichas células. Un objeto particular de la presente
invención lo constituye los ODNs antisentido/contra
NOR-1 descritos en la presente invención:
AS1-NOR-1 (SEQ ID N06) y
AS2-NOR-1 (SEQ ID NO 7), así como
cualquier otro que se pueda desarrollar con los conocimientos
existentes en el estado del arte, y que bloqueen la expresión de N
OR-1 (Nabel E .G., Nabel G.J. G ene Transfer. In:
Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. edited by V.
Fuster, R. Ross and E.J. Topol. Lippincott-Raven
Publisher, Philadelphia, 1996). Dichas estrategias comprenderían
tambien aquellas encaminadas a modificar la función de la proteína
NOR-1 mediante la sobre-expresión de
una proteína NOR-1 (o de otro miembro de la familia
NGFI-B) defectiva (dominantes negativos) que compite
con las proteínas nativas y reduce su actividad.
En este estudio se utilizó el sistema de
análisis mRNA-DD en una búsqueda de genes inducidos
por mitógenos en CMLV en el modelo porcino, un modelo que por su
gran similitud al ser humano es comúnmente aceptado en el estudio
de diferenciación de CMLV y en arteriosclerosis (Badimon, L.
Atherosclerosis and thrombosis: lessons from animal models.
Thromb Haemost. 2001; 86, 356-365). Hemos
identificado NOR-1 como un gen de inducción rápida
en CMLV. NOR-1 fue inducido transitoriamente
mediante angioplastia en arterias coronarias de cerdo y fue
sobre-expresado en lesiones ateroscleróticas
primarias en humanos. También se detectó inducción de los otros
miembros de la familia NGFI-B en lesiones
ateroscleróticas humanas (Nur77) y en arterias coronarias porcinas
sometidas a angioplastia con balón (Nurr1). ODNs antisentido contra
NOR-1 inhibieron la proliferación de CMLV y la
reparación tisular inducida mediante daño mecánico.
A partir de CML porcinas se clonaron dos
isoformas de NOR-1. NOR-1 es un gen
de inducción rápida que fue intensamente inducido en CMLV por
estímulos mitogénicos que señalizan a través de vías dependientes de
receptores proteína quinasa (PDGF y EGF) y de receptores acoplados
a proteínas G (trombina). Por el contrario, otros agentes como
citocinas, que inducen NOR-1 en fibroblastos
gingibales (Borghaei RC, Sinai ES, Mochan E, Pease EA. Induction of
mitogen-inducible nuclear orphan receptor by
interleukin 1 in human synovial and gingival fibroblasts. Biochem
Biophys Res Common. 1998; 251: 334-338), o
angiotensina-II, que induce NOR-1 en
células fasciculata (Fernández PM, Brunel F, Jimenez MA, Saez JM,
Cereghini S, Zakin MM. Nuclear receptors Norl and
NGFI-B/Nur77 play similar, albeit distinct, roles
in hypothalamo-pituitary-adrenal
axis. Endocrinology. 2000; 141: 2392-2400),
no indujeron NOR-1 en CMLV. Aumento de la
concentración intracelular de calcio así como la activación de la
PKC y la vía de las MAPK, vías activadas en procesos de migración y
proliferación celular, están involucradas en la inducción de
NOR-1 en CMLV. En este sentido, mitógenos que
utilizan más de una vía (por ejemplo, el suero) indujeron
NOR-1 en mayor medida, y la asociación de PDGF o
trombina con IGF-I incrementó el efecto producido
individualmente por cada uno de ellos. Por tanto,
NOR-1 podría jugar un papel clave integrando
diferentes vías de señalización en CMLV, en procesos tales como la
trombosis que produce la activación/degranulación de las plaquetas
(que liberan PDGF y EGF) y generación de trombina. De hecho
NOR-1 fue también inducido por estos agentes en
otras células involucradas en el proceso aterosclerótico, como
células endoteliales y monocitos/macrófagos [Fuster V, Badimon L,
Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery
disease and the acute coronary syndromes. New Engl J Med 326. Part
I (242-250) and Part II (310-318)].
Además, concentraciones crecientes de Iipoproteínas de baja
densidad (LDL) indujeron NOR-1 tanto en CMLV como
en células endoteliales, mientras que concentraciones crecientes de
HDL sólo indujeron NOR-1 en CMLV. La modulación de
NOR-1 por lipoproteínas sugiere que este gen puede
ser un potencial indicador de procesos que cursen con un incremento
de los niveles circulantes de LDL, que de hecho constituye uno de
los factores de riesgo aterosclerótico mejor caracterizado que
repercute tanto en la fisiología de las células vasculares (CMLV y
células endoteliales) como circulantes (en particular monocitos)
(Navad M, fogelman AM, Berliner JA, Terroto MC, Demer LL, Franks
JS, Watson AD, Edwards PA, Lusis AJ. Pthogenesis of
atherosclerosis. Am J Cardiol 1995;76:18C-23C; Lusis
AJ. Atherosclerosis Nature 2000; 407: 233-241).
Los experimentos de transfección indican un
papel clave de los elementos CRE presentes en el promotor de
NOR-1 en su inducción por estímulos mitogénicos. De
hecho, la activación de CREB es un punto de convergencia tanto de
las vías dependientes de PKC como de movilización de calcio (Mayr
B, Montminy M. Transcriptional regulation by the
phosphorylation-dependent factor CREB. Nat Rev
Mol Cell Bio 2001, 2: 599-609), los dos
principales vías implicadas en la inducción de
NOR-1. El suero indujo la fosforilación de CREB,
aunque no se observaron cambios en la unión de CREB, de acuerdo con
la capacidad de CREB de unirse constitutivamente a su elemento de
respuesta (Mayr B, Montminy M. Transcriptional regulation by the
phosphorylation-dependent factor CREB. Nat Rev
Mol Cell Bio 2001, 2: 599-609).
Aunque NOR-1 es inducido
transitoriamente por mitógenos e n células en cultivo, se detectó
expresión significativa de NOR-1 en varios tejidos
adultos, en particular en miocardio y en músculo esquelético tanto
de cerdo como de humanos (datos no mostrados), lo que sugiere que
en dichos tejidos NOR-1 podría regular genes
involucrados en funciones clave en estos tejidos. La expresión
simultánea de los genes de la familia NGFI-B en
ciertos tejidos y células, la gran homología de sus secuencias de
aminoácidos y la capacidad de los tres receptores de unirse a un
elemento de respuesta específico (NBRE) (Wilson TE, Fahrner TJ,
Johnston M, Milbrandt J. Identification of the cDNA binding site
for NGFI-B by genetic selection in yeast.
Science. 1991; 256: 1296-1299) puede
explicar la redundancia funcional observada en ciertos sistemas
(Cheng LEC, Chan FKM, Cado D, Winoto A. Functional redundancy of the
Nur77 and Nor-1 orphan steroid receptors in
T-cell apoptosis. EMBO J. 1997; 16:
1865-1875). Sin embargo, nosotros observamos
patrones de expresión diferentes en tejidos adultos y en la pared
vascular en condiciones patológicas. De hecho, aunque tanto la
expresión de NOR-1 como la de Nur77 está aumentada
en lesiones ateroscleróticas primarias humanas de pacientes con
enfermedad arterial coronaria (CAD) o aneurisma aórtico, los
procedimientos de revascularización que dañan la pared vascular e
inducen la proliferación de las CMLV activaron la expresión de
NOR-1 y Nurr1 pero no la de Nur77 (datos no
mostrados). Actualmente se desconoce el significado de la expresión
incrementada de Nur77 y Nurr1 en estas muestras. Sin embargo, Nur77
y Nurr1 se inducen de forma concomitante con NOR-1
(en las situaciones mencionadas), se unen a un mismo elemento de
respuesta, y pueden formar heterodímeros entre sí (Maira M, Martens
C, Philips A, Drouin J. Heterodimerization between members of the
Nur subfamily of orphan nuclear receptors as a novel mechanism for
gene activation. Mol Cell Biol 1999;19:7549-7557) o
con RXR (Mangelsdorf DJ, Evans RM. The RXR heterodimers and orphan
receptors. Cell. 1995; 83: 841-850), factor
nuclear que modula el fenotipo de CMLV (como se comenta más
extensamente en el párrafo siguiente), por ello podrían modular
positiva o negativamente la actividad de NOR-1 en
las células vasculares o en las células sanguíneas. Por tanto,
tanto Nur77 como Nurr1 estarían directa o indirectamente implicados
en las patologías en las que se detecta inducción de
NOR-1.
Los genes de la familia NGBI-B
han sido involucrados en diferentes funciones celulares, entre
ellas proliferación y diferenciación celular y apoptosis (Maruyama
K, Tsukada t, Ohkura N, Bandoh S, Hosono T, Yamaguchi K. The
NGFI-B subfamily of the nuclear receptor
superfamily. Int J Oncol. 1998; 12:
1237-1243). Debe tenerse en cuenta que de igual modo
estos papeles "inespecíficos" han sido atribuidos a otros
genes de respuesta temprana como c-fos y c-myc
(Rothman A, Wolner B, Button D, Taylor P.
Immediate-early gene expression in response to
hypertrophic and proliferative stimuli in pulmonary arterial smooth
muscle cells. J Biol Chem. 1994;269:639-6404;
Macdonald K, Bennet MR. Cdc25A is necessary but not sufficient for
optimal c-myc induced apoptosis and cell
proliferation of vascular smooth muscle cells. Circ Res.
1999; 84: 820-830). En este sentido, parece
plausible que en un contexto fisiológico concreto la función
específica de NOR-1 dependa de cambios
concomitantes en los niveles de expresión de otros genes. De hecho,
la relación entre factores de transcripción eucariotas, en
particular la paradigmática heterodimerización entre receptores
nucleares (Maira M, Martens C, Philips A, Drouin J.
Heterodimerization between members of the Nur subfamily of orphan
nuclear receptors as a novel mechanism for gene activation. Mol
Cell Biol. 1999; 19: 7549-7557), incrementa la
complejidad de las "redes" moleculares que operan en las
células vasculares. Nur77 y Nurr1 (pero no NOR-1)
pueden formar heterodímeros con RXR (Mangelsdorf DJ, Evans RM. The
RXR heterodimers and orphan receptors. Cell. 1995; 83:
841-850), permitiendo a éstos la activación de
genes vasculares de una forma dependiente de ligando a través de
elementos de respuesta a ácido retinoico. Dado que RXR ha sido
involucrado directamente en la modulación del fenotipo de las CMLV
y en aterogénesis (Haxsen V, Adam-Stitah S, Ritz E,
Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin II on
vascular smooth muscle cells. Circ Res.
2001;88:637-644; Claudel T, Leibowitz MD, Fievet C,
Tailleux A, Wagner B, Repa JJ, Torpier G, Lobaccaro JM, Paterniti
JR, Mangelsdorf DJ, Heyman RA, Auwerx J. Reduction of
atherosclerorisis in apolipoprotein E knockout mice by activation
on the retinoid X receptor. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;
27: 2610-2615), y es la pareja común de otros
receptores nucleares activados en células vasculares como PPARs o
RAR (Marx N, Schonbeck V, Lazar MA, Libby P, Plutzky J. Peroxisome
proliferator-activated receptor gamma activators
inhibit gene expression and migration in human vascular smooth
muscle cells. Circ Res. 1998;
83:1097-1103;Haxsen V, Adam-Stitah
S, Ritz E, Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin
II on vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001; 88:
637-644; Benson S, Padmanabhan S, Kurtz TW,
Pershadsingh HA. Ligands for the peroxisome
proliferator-activated
receptor-gamma and the retinoid X
receptor-alpha exert synergistic antiproliferative
effects on human coronary artery smooth muscle cells. Mol Cell
Biol Res Commun. 2000, 3: 159-164), no debe
descartarse una potencial "competición" de estos parejas
heterodiméricas por RXR. Esta relación de interferencia/sinergia
entre los receptores nucleares entre si o con otros factores de
transcripción puede ser importante en la regulación de la función
de las células vasculares (Benson S, Padmanabhan S, Kurtz TW,
Pershadsingh HA. Ligands for the peroxisome
proliferator-activated
receptor-gamma and the retinoid X
receptor-alpha exert synergistic antiproliferative
effects on human coronary artery smooth muscle cells. Mol Cell
Biol Res Commun. 2000, 3: 159-164).
El patrón de expresión de NOR-1
está de acuerdo con la participación de este factor de
transcripción en los mecanismos moleculares subyacentes tanto en la
arteriosclerosis espontánea como la "acelerada". La naturaleza
de los estímulos que conducen a un aumento de la expresión de
NOR-1, tanto in vitro como in vivo, y
las vías intracelulares implicadas en tal inducción avalan
firmemente un papel de NOR-1 en la proliferación de
las CMLV. Para apoyar esta hipótesis analizamos el efecto de dos
ODNs antisentido dirigidos contra NOR-1. Estos ODNs
inhibieron significativamente la proliferación de CML de coronaria
humana (redujeron la síntesis de novo de ADN, la progresión
del ciclo celular y la reparación de lesión por las CMLV). La
eficacia de los ODNs antisentido bloqueando estos procesos fue
similar a la producida por ODNs dirigidos contra el bien
caracterizado proto-oncogen c-fos, que como
NOR-1 se induce transitoriamente en CMLV y en
arterias coronarias porcinas tras PTCA
(Martínez-González J, Viñals M, Vidal F,
Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate
deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human
vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135:
213-223; Rothman A, Wolner B, Button D, Taylor P.
Immediate-early gene expression in response to
hypertrophic and proliferative stimuli in pulmonary arterial smooth
muscle cells. J Biol Chem.
1994;269:639-6404; Badimon L, Alfon J, Royo T,
Berrozpe M, Martínez-González J, Vidal F, Chesebro
JH, Fuster V, Badimon JJ. Cell biology of restenosis
post-angioplasty. Z Kardiol. 1995; 84:
145-149). Nosotros seleccionamos c-fos como
patrón de comparación porque se ha establecido una relación de
proporcionalidad entre el grado de expresión de c-fos y la
proliferación de CMLV tanto in vivo (Indolfi C, Esposito G,
Di Lorenzo E, Rapacciuolo A, Feliciello A, Porcellini A,
Avvedimento VE, Condorelli M, Chiariello M. Smooth muscle cell
prolifertaion is proportional to the degree of balloon injury in a
rat model of angioplasty. Circulation. 1995; 92:
1230-1235) como in vitro
(Martínez-González J, Viñals M, Vidal F,
Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate
deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human
vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135:
213-223), y ODNs contra c-fos se han
utilizado con éxito para boquear proliferación celular en
diferentes sistemas incluyendo CMLV (Leon Y, Vazquez E, Sanz C, Vega
JA, Mato JM, Giraldez F, Represa J, Varela-Nieto I.
Insulin-like growth factor-I
regulates cell proliferation in the developing inner ear, activating
glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos
expression. Endocrinology. 1995; 136:
3494-3503; Suggs W, Olson SC, Mandani D, Patel S,
Eith FJ. Antisense oligonucleotides to c-fos and
c-jun inhibit intimal thickenn i a rat vein graft model.
Surgery. 1999; 126: 443-449). Nuestros
resultados sugieren firmemente que NOR-1 juega un
papel en la proliferación de las CMLV, lo que está de acuerdo con
las evidencias obtenidas por otros autores que atribuyen un papel a
este receptor nuclear huérfano en proliferación celular en
diferentes sistemas. De hecho, entre los genes de la familia
NGFI-B sólo se ha descrito la conversión oncogénica
de NOR-1 (Labelle Y, Zucman J, Stenman G, Kindblom
LG, Knight J, Turc-Carel C,
Dockhorn-Dworniczak B, Mandahl N, Desmaze C, Peter
M, Aurias A, Delattre O, Thomas G. Oncogenic conversion of a novel
orphan nuclear receptor by chromosome translocation. Hum Mol
Genet. 1995; 4: 2219-2226).
En resumen, la presente invención se basa en que
los inventores han observado que el factor de transcripción
NOR-1 es un potencial factor modulador de la
función de las células vasculares (CMLV y células endoteliales) y
monocitos/macrófagos, y por tanto una nueva diana de diagnóstico de
patologías cardiovasculares y una nueva diana en futuras
estrategias terapéuticas (farmacológicas o basadas en terapia
génica).
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de
NOR-1 y/o Nu77 y/o Nurr1 en muestras biológicas de
mamíferos, preferentemente humanos, para el diagnóstico, seguimiento
de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de
NOR-1 o para la monitorización, seguimiento o
evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas
enfermedades cardiovasculares, caracterizado porque comprende las
siguientes partes:
- c)
- Obtención de la muestra biológica mediante extracción sanguínea o intervención intravascular (aterectomía o similar), y
- d)
- identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 en dicha muestra biológica, donde un resultado positivo o incrementado respecto a un nivel basal considerado fisiológico indicará existencia de una enfermedad cardiovascular que cursa con activación de NOR-1, o donde la comparación de los niveles de NOR-1 determinados a I o largo del tiempo indicarían la evolución de la enfermedad cardiovascular o si, por ejemplo, el tratamiento administrado para dicha enfermedad presenta algún efecto terapéutico.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "identificación de NOR-1" se refiere a
la determinación de los niveles de expresión de
NOR-1 humano, en cualquiera de sus dos isoformas
alfa y beta, y/o Nur77 y/o Nurr1, ya sea de su ARN mensajero o de
las proteínas correspondientes -mediante cualquier método
cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo - en una muestra
biológica de un potencial paciente de dicha enfermedad
cardiovascular.
El término "muestra biológica" tal como se
utiliza en la presente invención se refiere a fluidos corporales
como sangre (en especial a sus constituyentes celulares), a células
vasculares así como a muestras de tejidos periféricos afectos por
enfermedades cardiovasculares o por procesos que puedan actuar como
coadyuvantes del desarrollo de lesiones ateroscleróticas y
eventualmente como marcadores del proceso (por ejemplo, biopsias de
encías), obtenidas mediante extracción sanguínea, intervención
intravascular (aterectomía o similar) entre otras.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo"
se refiere a métodos utilizados en el campo de la biología
molecular para la determinación de niveles de RNAm como, entre
otras, RT-PCR, Northern blot (Sambroock J., Fritsch
E.F., Maniatis T. Extraction purifation analysis o f m essenger R
NA f rom eukaryotic cells. In: Molecular Cloning (book 1). Could
Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 7.39), "DNA arrays" o
biochips de DNA o oligonucleótidos (Hiltunen MO, Niemi M,
Ylä-Herttuala S. Functional genomics and DNA array techniques in
atherosclerosis research. Curr Opin Lipidol. 1999; 10:
515-519); hibridación in situ o in
situ RT-PCR (Herrington GS., McGee JO.
Princeples and basic methodology of DNA/RNA detection by In
situ hibridation. In: Herrington GS., McGee JO. Eds Diagnostic
molecular pathology: A practical approach. IRL press, 1992; 1:
69-102); o de niveles de proteínas mediante
anticuerpos policlonales o monoclonales que reconozcan a
NOR-1 como, entre otros, Western blot (Sambroock
J., Fritsch E.F., Maniatis T. Detection and analysis of proteins
espressed from cloned genes. In: Molecular Cloning (book 3). Could
Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 18.60), inmunocitoquímica e
inmunohistoquímica (Robinson G., Ellis I.O., MacLennan A.
Immunocitochemistry. In: Bandcroft J. D., Stevens A. ed. Theory and
practice of histological techniques . Churchill Livingstone, 1990:
413-436.), técnicas de EIA o ELISA (Pradellas P
et al. Enzyme immunoassays of eicosanoids using
acetylcholinesterase as label: an alternative to radiommunoassays.
Anal Chem 1985; 57: 1170-1173), biochips de
proteínas (Huang, RP Detection of multiple proteins in an
antibody-based protein microarray system. Journal of
Immunological Methods 225 (2001): 1-13;
http://www.functionalgenomics.orq.uk/sections/resources/protein
arrays.htm; Kodadek T. Protein microarrays: prospects and
problems. Chemistry and Biology 8/2 (2001):
105-115). Actualmente se encuentra en fase de
desarrollo, por los inventores de la presente invención, la
obtención de anticuerpos contra un fragmento de la secuencia
proteína de NOR-1 generado mediante expresión en un
vector plasmídico procarionte, mediante técnicas ampliamente
conocidas por cualquier experto del sector de la técnica de la
presente invención (Sambroock J., Fritsch E.F., Maniatis T.
Expression of cloned genes in Escherichia coli. In:
Molecular Cloning (book 3). Could Spring Harbor Laboratory Press,
1989).
Un objeto adicional de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1, y por
tanto, potenciales compuestos terapéuticos de enfermedades
cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1
y/o Nur77 y/o Nur1, caracterizado por las siguientes etapas:
- d)
- puesta en contacto del mencionado compuesto en un entorno biológico donde exista la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 funcionalmente activa,
- e)
- determinación de los niveles de expresión o de los niveles de actividad de la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, y
- f)
- la selección de dicho compuesto como compuesto modulador de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 si se constata la inhibición o la potenciación de los efectos de NOR-1 en presencia del compuesto.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o
Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un
cultivo de CMLV de mamíferos, preferentemente humanas o porcinas,
donde en presencia o no de mitógenos inductores de
NOR-1 - suero, trombina, PDGF y EGF, entre otros, -
se añade el potencial compuesto a valorar y posteriormente se
determinan: los niveles de mRNA de NOR-1 y/o Nur77
y/o Nur1 (mediante RT-PCR, Northern blot, in
situ RT-PCR o hibridación in situ, entre
otros métodos) o la actividad NOR-1 y/o Nur77 y/o
Nur1 [mediante la capacidad de estos factores de transcripción de
unirse a secuencias específicas de ADN en Ensayos de Retardación en
la Movilidad Electroforética (EMSA)], como se ha realizado en la
presente invención, o determinando la capacidad de
NOR-1 de formar heterodímeros con otros miembros de
la familia NGFI-B (Nur77 y Nurr1) modulando así la
transactivación de genes diana; o mediante determinación de los
niveles de proteína (mediante las técnicas mencionadas
anteriormente).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o
Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un
modelo animal, preferentemente porcino, al que se somete a una
intervención de angioplastia coronaria transluminal percutanea
(PTCA), al que se administra el potencial compuesto a valorar y
posteriormente se determina los niveles de NOR-1 de
las lesiones provocadas mediante técnicas como
RT-PCR, Northern blot, in situ
RT-PCR o Western blot (ver ejemplo 2.3 de la
presente invención) entre otras.
Así, un objeto adicional de la presente
invención lo constituye un compuesto inhibidor o potenciador de
NOR-1 (que modifique su expresión o su actividad
como factor de transcripción individual o coperativamente con los
otros miembros de la familia NGFI-B) identificados
según un procedimiento descrito anteriormente. Igualmente, otro
objeto adicional lo constituye una composición farmacéutica
caracterizada porque comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz
de un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1
identificado por el procedimiento de la presente invención.
Otro objeto adicional de la presente invención
lo constituye el empleo de una composición farmacéutica descrita
anteriormente en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares que cursen con
activación de NOR-1 en mamíferos, preferentemente
humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención
es un procedimiento de terapia génica para el tratamiento y
prevención en mamíferos, preferentemente humanos, de enfermedades
cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1
que permitiera la modificación de la expresión de
NOR-1 en la células implicadas en la etiopatogenia
de dichas enfermedades, por ejemplo mediante la expresión de
oligonucleótidos antisense de NOR-1 (ODNs)
utilizando vectores o vehiculizantes que permitan la entrada de
dichos ODNs en dichas células. Un objeto particular de la presente
invención lo constituye los ODNs antisentido/contra
NOR-1 descritos en la presente invención:
AS_{1}-NOR-1 (SEQ ID NO6) y
AS_{2}-NOR-1 (SEQ ID NO 7), así
como cualquier otro que se pueda desarrollar con los conocimientos
existentes en el estado del arte, y que bloqueen la expresión de
NOR-1 (Nabel E.G., Nabel G .J. Gene Transfer. In:
Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. edited by V.
Fuster, R. Ross and E.J. Topol. Lippincott-Raven
Publisher, Philadelphia, 1996). Dichas estrategias comprenderían
tambien aquellas encaminadas a modificar la función de la proteína
NOR-1 mediante la sobre-expresión de
una proteína NOR-1 (o de otro miembro de la familia
NGFI-B) defectiva (dominantes negativos) que compite
con las proteínas nativas y reduce su actividad.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "enfermedades cardiovasculares que cursan con activación
de NOR-1" se refiere a enfermedades
cardiovasculares que cursan con niveles incrementados de
NOR-1, por una relación causal inductora o
simplemente por una asociación, que pertenece, entre otras, al
siguiente grupo: aterotrombosis (Woof N, Davies MJ.
Interrelationship between atherosclerosis and thrombosis. In:
Thrombosis in Cardiovascular Disorders. Edited by V. Fuster
and M. Verstraete. WB Sanders Company. Harcourt Brace Jovanovich,
Inc. Philadelphis 1992), arteriosclerosis "acelerada"
(restenosis post-revascularización) (Nikol S.,
Huehns T.Y., Höfling B. Molecular biology and
post-angioplasty restenosis. Atherosclerosis
1996;123:17-23), arteriosclerosis espontánea en sus
diferentes manifestaciones [enfermedad arterial coronaria (CAD),
enfermedad aortica, enfermedad cerebrovascular y arteriopatías
periféricas] (Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis. Nature
1993;362:801-809; Lusis AJ. Atherosclerosis Nature
2000;407:233-241), aneurismas y
remodelado/degeneración vascular (Ouriel K. Endovascular therapies:
an update on aortic aneurysm repair and carotid endarterectomy. J
Am Coll Surg. 2002; 195: 549-552) y en general en
enfermedades cardiovasculares que cursan con
des-diferenciación (Owens GK. Role of alterations in
the differentiated state of vascular smooth muscle cells in
atherogenesis. In: Atherosclerosis and Coronary Artery
Disease. edited by V. Fuster, R. Ross and E.J. Topol.
Lippincott-Raven Publisher, Philadelphia, 1996),
migración y proliferación (Libby P. Molecular bases of the acute
coronary syndromes. Circulation 1995; 91:
2844-2850) o apoptosis de células vasculares (Best
P.J.M. et al. Apoptosis: basic concepts and implications in
coronary artery disease. Arterioscler Throm Vasc Biol 1999; 19:
14-22) o que causan disfunción endotelial como la
hipercolesterolemia (John S, Schmieder RE. Impaired endothelial
dysfunction in arterial hypertension and hyperchoelsterolemia:
potential mechanisms and
differences.
differences.
Figura 1.- Identificación de
NOR-1 mediante mRNA-DD. A,
Análisis mRNA-DD representativo mostrando la
inducción de la banda 2 producía por 10% de suero humano, 10 U/mL de
trombina y 5 nmol/L de PDGF (después de 1 h de estimulación). B,
Análisis mediante Northern blot de CML de arteria coronaria
porcina quiescentes versus estimuladas utilizando como sondas
el ADNc regulado diferencialmente (banda 2) o c-fos. rRNA,
ARN ribosomal. C, Northen blot de CML de arteria coronaria
porcina quiescentes versus estimuladas (1 h con suero)
utilizando como sondas el ADNc de la banda 2 (izquierda) o
pNOR-1\alpha (derecha). D, cinéticas de
inducción de NOR-1 por suero en CML de coronaria
humana. E, Niveles de RNAm de NOR-1 en CML de
coronaria humana estimuladas con suero en presencia o ausencia de
cicloheximida (CHX) durante diferentes tiempos. NI, células no
inducidas.
Figura 2.- Expresión de NOR-1
en CMLV humanas. Niveles de R NAm en CMLV de coronarias humanas
estimuladas con factores de crecimiento y citocinas durante 1 h. A,
Se muestra un Northen blot representativo (n=3). [rRNA, ARN
ribosomal; bFGF, factor de crecimiento básico de fibroblastos;
TGF\beta, factor de crecimiento transformante beta;
IL-1\beta, interleucina-1 beta;
TNF-\alpha, factor necrosante de
tumores-alfa]. NI, células no inducidas.
Figura 3.- Vías de señalización involucradas
en la inducción de NOR-1. A, Northern
blot mostrando la expresión de NOR-1 en CML de
coronaria humana estimuladas con PMA o con el ionóforo de calcio
A23187 durante 1 h, y el efecto de inhibidores de diferentes vías
de señalización. Se muestra un experimento representativo (n=3).
[GF,GF-109203X]. B, EMSA mostrando el incremento de
la unión de extractos nucleares de células tratadas con suero a una
sonda que contiene un elemento NBRE consenso y el efecto de
GF-109203X y BAPTA (un quelante de calcio). Se
muestra la competición de la unión por un exceso (5 y 50 veces) de
sonda fría. Las flechas indican las bandas de retardación.
[Probe(-NE), sonda NBRE sin extractos nucleares]. NI, células no
inducidas.
Figura 4.- Mecanismos involucrados en la
inducción de NOR-1. A, Western blot mostrando
el efecto del suero (después de 10 min) sobre la fosforilación de
CREB en la serina^{133} (CREB-P) y el efecto de
los inhibitorios GF-109203X y BAPTA. En el panel
inferior se muestran los niveles totales de CREB. B, EMSA mostrando
la capacidad de unión de extractos nucleares de CMLV humanas a la
sonda Nor/3CRE. Se muestra el efecto de cantidades crecientes de
sonda fría (5 y 50 veces). Se muestra la banda de
super-retardación producida por anticuerpos
anti-CREB pero no por anticuerpos
anti-c-Fos o
anti-c-Jun. [Probe(-NE), sonda
Nor/CRE sin extractos nucleares]. C, Efecto de 10% de suero,
GF-109203X y BAPTA sobre los niveles de
NOR-1 en células NIH-3T3. D, El
suero incrementa la actividad del promotor de NOR-1
en células transfectadas con el promotor nativo
(pNOR\alpha/-1703) pero no en aquellas transfectadas con el
promotor en el que se mutaron los tres elementos CRE
[pNOR\alpha/-1703-(M)]. Se muestra el efecto producido por la
inhibición de la PKC y la movilización de calcio. La actividad
luciferasa fue normalizada por la actividad
\beta-galactosidasa y fue calculada como
porcentaje de la actividad de pNOR\alpha/-1703 en células
tratadas con suero. NI, células no inducidas.
Figura 5.- Expresión de NOR-1
en tejidos porcinos. Northen blot mostrando los niveles
de RNAm de NOR-1 y Nur77 en tejidos porcinos. Se
muestra un experimento representativo (n=3). [rRNA, ARN
ribosomal].
Figura 6.- Expresión de miembros de la familia
NGFI-B en arterias humanas y porcinas. A, Expresión
de NOR-1 y Nur77 en arterias humanas de pacientes
con aneurisma aórtico, cardiopatía dilatada idiopática (DIC) y
enfermedad arterial coronaria (CAD). [A, íntima/media de aorta; C,
intima/media de arterias coronarias no ateroscleróticas; C_{AT},
íntima/media de arterias coronarias ateroscleróticas]. B,
Regulación de NOR-1 y Nurr1 por angioplastia con
balón. Expresión de NOR-1 y Nurr1 en arterias
porcinas dilatadas con balón. Experimento representativo mostrando
dos arterias dilatadas en cada tiempo. [PTCA, angioplastia
coronaria percutánea transcutánea]. C, in situ
RT-PCR mostrando la inducción de
NOR-1 en CML de la media después de PTCA. Cortes
seriados de arterias dilatadas (a-c) y no dilatadas
(d-f); b y e corresponden a controles negativos de
RT-PCR; c y f corresponden a tinciones de
hematoxilina-eosina. Barra=50 \mum.
Figura 7.- Oligonucleótidos antisentido
contra NOR-1 inhiben la síntesis de A DN y l a
reparación tisular en CML de coronaria humana. A, CMLV
quiescentes fueron estimuladas con 10% de suero humano durante 24 h
y se determinó la incorporación de [^{3}H]timidina en
ausencia (barras blancas) o presencia de concentraciones crecientes
(\mumol/l) de ODNs antisentido (AS_{1}-NOR,
barras negras).
Se muestra el efecto del correspondiente
secuencia "sentido" (SE_{1}-NOR, 10
\mumol/L) (barras rayadas); (n=4 experimentos realizados en
triplicado). B, Efecto de los oligonucleótidos sobre los niveles de
RNAm de NOR-1 analizados mediante
RT-PCR 3 h después de la estimulación con suero.
[AS-FOS, ODNs antisentido contra c-fos]. C,
Perfiles representativos del análisis mediante citometría de flujo
de CMLV humanas quiescentes (línea negra), estimuladas con suero
(línea roja) y tratadas con AS_{1}-NOR (línea
azul). D, Oligonucleótidos antisentido contra NOR-1
inhiben la reparación tisular después de daño mecánico de CML de
coronaria humana. CML confluentes/quiescentes fueron raspadas y
después incubadas durante 72 h en ausencia (Control) o presencia de
oligonucleótidos (10 \mumol/L). El histograma muestra el número de
células en la zona denudada (n=3 experimentos realizados en
triplicado). En E se muestran los datos representativos
correspondientes a las células tratadas con
AS_{1}-NOR y controles. Las flechas indican el
margen de la "herida". [ODNs, oligonucleótidos; AS-,
antisentido; SE-, sentido]; (*, p<0.05 versus controles o
células tratadas con la correspondiente secuencia sentido). NI,
células no inducidas.
Figura 8. Inducción de NOR-1
por lipoproteínas y mitógenos en células endoteliales humanas y por
lipoproteínas en CMLV. A y B, niveles de ARNm de
NOR-1 en células endoteliales humanas (HUVEC) (A) y
en CMLV de coronaria humana (B) en respuesta a concentraciones
crecientes de LDL o HDL (\mug/mL). Se muestran los niveles de
GAPDH sutilizados para normalizar el resultado. Como control se
muestra el efecto de 10% suero humano. C, Niveles de mRNA de
NOR-1 de HUVEC y células endoteliales porcinas
(PAEC) en cultivo activadas con 10% suero humano o trombina (10
U/mL). Se muestra un experimento representativo (n=3) de los
niveles de ARNm determinados mediante RT-PCR. NI,
células no inducidas.
Figura 9. Inducción de NOR-1
en monocitos/macrófagos. Niveles de mRNA de
NOR-1 en monocitos/macrófagos humanos en cultivo
activados con 10% suero humano, PDGF-BB (5 nmol/L),
trombina (10 U/mL) y un inductor de la PKC (PMA 5 \mumol/L). Se
muestran los niveles de GAPDH sutilizados para normalizar el
resultado. Se muestra un experimento representativo
(n=3).
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance
de la misma.
Para identificar nuevos genes involucrados en la
activación de las CMLV se estimuló CMLs de arteria coronaria
porcina con mitógenos como el suero, PDGF o trombina y se analizó
la expresión génica diferencial mediante análisis
mRNA-DD. El modelo porcino es un modelo, que por su
gran similitud con el ser humano, es comúnmente aceptado en el
estudio de diferenciación de CMLV y en arteriosclerosis (Badimon,
L. Atherosclerosis and thrombosis: lessons from animal models.
Thromb Haemost. 2001; 86, 356-365). Se aisló
un total de 23 bandas reguladas diferencialmente al menos por uno
de los inductores utilizados. El análisis de la secuencia de dichas
bandas reveló que sólo una de ellas presentaba identidad
significativa con genes descritos previamente. La
banda-23, inducida por suero y PDGF, correspondía a
la trombospondina-1. La banda-2
(1010 bp) (Figura 1A), reconoció un transcrito de 5,7 kb inducido
tempranamente por suero, PDGF y trombina (Figura 1B y IC, panel de
la izquierda). La secuencia de nucleótidos de la banda 2 compartía
un alto nivel de homología con la región
3'-no-traducida de los miembros de
la familia NGFI-B de receptores nucleares huérfanos:
NOR-1 (Ohkura N, Hijikuro M, Yamamoto A, Miki K.
Molecular cloning of a novel thyroid/steroid receptor superfamily
gene from cultured rat neuronal cells. Biochem Biophys Res
Common. 1994; 205: 1959-1965; Hedvat CV, Irving
SG. The isolation and characterization of MINOR, a novel
mitogen-inducible nuclear orphan receptor. Mol
Endocrinol. 1995; 9: 1692-1700), Nur77 (Hazel
TG, Nathans D, Lau LF. A gene inducible by serum growth factors
encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor
superfamily. Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85:
8444-8448; Milbrandt J. Nerve growth factor induces
a gene homologous to the glucocorticoid receptor gene.
Neuron. 1988;1:183-188) y Nurr1 (Law SW,
Conneely OM, DeMayo FJ, O'Malley BW. Identification of a new
brain-specific transcription factor, Nurr1. Mol
Endocrinol. 1992; 6: 2129-2135).
El marco abierto de lectura (ORF) del clon
\lambdasNor32 (sometido al GenBanK/EMBL Nº. de acceso AJ011767)
codifica para un polipéptido de 643 residuos aminoacídicos, que
entre los receptores mencionados anteriormente, exhibió el mayor
nivel de homología con secuencias de NOR-1\alpha.
La larga región 3'-non-traducida
(3072 bp) de este ADNc (pNOR-1\alpha) contiene 9
copias de la secuencia ATTTA, típica de ARNm de vida corta. El clon
\lambdaSsNor83 (sometido al GenBank/EMBL Nº de acceso AJ011768)
exhibe un ORF codificante para un polipéptido de 446 residuos
aminoacídicos (pNOR-1\beta) que no contiene la
región C-terminal correspondiente al dominio de
unión a ligando. Alineamientos de la secuencia de aminoácidos de
pNOR-1\alpha y pNOR-1\beta con
sus homólogas en humanos, rata y ratón reveló una gran identidad,
entre el 89% y el 94% para NOR-1\alpha y el 87%
para NOR-1\beta. La mayor identidad (100%) fue
encontrada en el dominio de unión al ADN. La cremallera de leucinas
de la región C-terminal se conserva en los tres
miembros de la familia NGFI-B.
En experimentos de Northern blot el ADNc
pNOR-1\alpha reconoció dos transcritos (5,7 kb y
4,0 kb) inducidos transitoriamente por suero en CML de arteria
coronaria porcina (Figura 1C, panel de la derecha) y humana (Figura
1D). La inducción del RNAm de NOR-1 no requirió la
síntesis de novo de proteína y fue
sobre-inducido por cicloheximida (Figura 1E), como
se ha descrito previamente en células no vasculares.
Los inductores más potentes de
NOR-1 fueron el suero, el PDGF y la trombina
(Figura 2). El EGF y el IGF-I (sólo detectable en
placas sobre-expuestas) también indujeron
NOR-1. El IGF-I sinergiza tanto con
el PDGF como con la trombina en la inducción de
NOR-1, aunque en menor grado que en la inducción de
c-fos. El efecto de otros mitógenos, incluyendo
lipopolisacárido y la angiotensina-II (datos no
mostrados) sobre NOR-1 fue mínimo.
CMLV quiescentes fueron expuestas a
concentraciones crecientes de lipoproteínas de baja (LDL) y alta
densidad (HDL) obtenidas mediante centrifugación diferencial como
hemos descrito previamente (Vidal F, Colomé C,
Martínez-González J, Badimon L. Atherogenic
concentrations of native low density lipoproteins downregulate
nitric oxide synthasemRNA and protein levels in endothelial cells.
Eur J Biochem 1998; 252: 378-384) y los niveles de
ARNm de NOR-1 se determinaron mediante Northern
blot. Las lipoproteínas indujeron NOR-1 con un
patrón temporal similar al obtenido con el suero (no se muestran
datos).
La inducción de NOR-1 es
dependiente de la activación de la proteína quinasa C (PKC): fue
inducido por PMA (un activador de la PKC), mientras que
GF-109203X (un inhibidor de la PKC) inhibió la
inducción de NOR-1 producida por el suero (Figura
2A). El aumento de la expresión de NOR-1 es
dependiente también de la movilización de Ca^{2+}: el A23187 (un
ionóforo de calcio) indujo NOR-1, mientras que el
quelante de calcio EGTA inhibió su expresión. La inducción de
NOR-1 producida por el suero también fue inhibida
por un inhibidor especifico de los receptores acoplados a proteínas
G (toxina pertussis) y de la quinasa de la proteína activada por
mitógenos (MAPK) (PD98059) (Figura 2A). La toxina pertussis abolió
completamente la inducción producida por trombina (datos no
mostrados).
\newpage
Mediante EMSA (Ensayo de Retardación en la
Movilidad Electroforética) observamos un incremento de la unión de
extractos nucleares procedentes de CMLV estimuladas con suero a una
sonda que contiene una secuencia consenso NBRE (un elemento de
respuesta a NOR-1), dicho incremento no tuvo lugar
cuando se inhibió la activación de la PKC (por GF10920X) o la
movilización de Ca^{2+} (por BAPTA) (Figura 3B).
CREB fue activada por fosforilación en la
Ser^{133} en CMLV inducidas con suero (Figura 4A) y extractos
nucleares de CMLV humanas se unen a una sonda (Nor/3CRE) que
contiene los tres elementos putativos CRE presentes en el promotor
de NOR-1 (de -84 a -41) (Ohkura N, Ito M, Tsukada T,
Sasaki K, Yamaguchi K, Miki K. Alternative splicing generates
isoforms of human neuron-derived orphan
receptor-1 (NOR-1) mRNA.
Gene. 1998; 211: 79-85) (Figura 4B). El
efecto fue específico (competido por un exceso de sonda fría) y fue
super-retardado por anticuerpos contra CREB pero no
por anticuerpos contra c-Fos o
c-Jun.
El papel de los elementos CRE en la inducción de
NOR-1 por suero fue analizado en células
NIH-3T3. Como en las CMLV humanas la inducción de
NOR-1 producida por el suero en las células
NIH-3T3 fue inhibida cuando se bloqueó la
activación de la PKC o la movilización de calcio (Figura 4C). En
experimentos de transfección la actividad del promotor de
NOR-1 fue reducida por BAPTA (un quelante de
calcio) y por GF-109203X, y fue inhibida
completamente cuando los tres elementos CRE fueron mutados (Figura
4D).
Corazón y músculo esquelético expresan niveles
elevados de NOR-1, por el contrario se detectaron
bajos niveles en aorta torácica, pulmón y glándulas adrenales, y
expresión marginal (sólo detectada en placas
sobre-expuestas) en el resto de tejidos porcinos
analizados (Figura 5). El patrón de expresión de Nur77, el
principal miembro de la familia NGFI-B, fue similar
al de NOR-1. Sin embargo, los niveles de expresión
de Nur77 fueron menores que los de NOR-1 en el
miocardio (en relación a los niveles en músculo esquelético) y
superiores en diafragma, aorta torácica, pulmón y glándulas
adrenales.
Los niveles de RNAm de NOR-1 en
arterias no-ateroscleróticas (arterias coronarias y
aorta) tanto en pacientes con DIC (cardiopatía dilatada idiopática)
como CAD (enfermedad arterial coronaria) fueron bajos o no
detectables (Figura 6A). NOR-1 se
sobre-expresó en lesiones ateroscleróticas primarias
de pacientes con CAD. La expresión de Nur77, detectada en aorta
pero no en arterias coronarias de pacientes con DIC, fue inducida
en lesiones ateroscleróticas primarias de pacientes con CAD pero en
menor grado que NOR-1. En arterias aorta humanas con
aneurisma la expresión tanto NOR-1 como Nur77 fue
muy elevada.
Angioplastia coronaria transluminal percutanea
(PTCA) induce transitoriamente el RNAm de NOR-1 en
arterias coronarias porcinas con un patrón similar al observado en
CMLV en cultivo (Figura 6B). Nurr1 también fue inducido
transitoriamente después de PTCA (Figura 6B), pero en cambio no se
detectó expresión de Nur77 (datos no mostrados). Mediante in
situ RT-PCR se determinó que la expresión de
NOR-1 se localizaba en CML de la media de las
arterias dilatadas (Figura 6C).
Secuencias antisentido (AS-NOR)
fueron dirigidas contra los dos putativos codones ATG de inicio de
la traducción de NOR-1 humano (Ohkura N, Hijikuro
M, Yamamoto A, Miki K. Molecular cloning of a novel thyroid/steroid
receptor superfamily gene from cultured rat neuronal cells.
Biochem Biophys Res Common. 1994; 205:
1959-1965; Hedvat CV, Irving SG. The isolation and
characterization of MINOR, a novel mitogen-inducible
nuclear orphan receptor. Mol Endocrinol. 1995; 9:
1692-1700). Ambos ODNs antisentido inhibieron
eficazmente la incorporación de [^{3}H]timidina en CMLV
humanas de forma dosis dependiente. La Figura 7A muestra el efecto
de la secuencia AS_{1}-NOR. Los ODNs de
NOR-1 sentido no produjeron efecto. Un efecto
inhibitorio similar fue producido por concentraciones crecientes de
un ODNs antisentido contra c-fos (datos no mostrados),
utilizado previamente para analizar el papel de este
proto-oncogen en proliferación celular (Leen Y,
Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM, Giraldez F, Represa J,
Varela-Nieto I. Insulin-like growth
factor-I regulates cell proliferation in the
developing inner ear, activating
glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos
expression. Endocrinology. 1995; 136:
3494-3503). Los niveles de RNAm de
NOR-1 en las células tratadas con los ODNs
antisentido fueron significativamente inferiores que en las células
control o en las tratadas con las secuencias NOR-1
sentido o con ODNs anti-c-fos (Figura
7B).
El análisis mediante citometría de flujo de la
distribución de las fases del ciclo celular reveló una reducción
significativa del ingreso en la fase S después de la estimulación
con suero (40% y 42% con AS_{1}- y AS_{2}-NOR
respectivamente) y un aumento paralelo en las células en fase G1. La
figura 7C muestra perfiles de FACS representativos correspondientes
a CMLV humanas con y sin AS_{1}-NOR. ODNs
NOR-1 sentido no produjeron ningún efecto en la
distribución del ciclo celular. Un efecto similar fue producido por
ODNs antisentido contra c-fos (41% de reducción en la entrada
de células en la fase S y un incremento similar en el número de
células en fase G1).
En un sistema in vitro de reparación de
lesión validado previamente (Lowe HC, Fahmy RG, Kavurna MM, Baker
A, Chesterman CN, Khachigian LM. Catalytic oligodeoxynucleotides
define a key regulatory role for early growth response
factor-1 in the porcine model of coronary
in-stent restenosis. Cir Res. 2001; 89:
670-677) AS_{1}- o AS_{2}-NOR
inhibieron significativamente la invasión de la zona denudada en un
45% y 46% respectivamente (Figura 7D). Por el contrario,
concentraciones equivalentes de ODNs NOR-1 sentido
no modularon este proceso. El efecto producido por los ODNs contra
NOR-1 fue similar al producido por los ODNs contra
c-fos. La Figura 7E muestra una imagen representativa de
CMLV humanas sometidas a este proceso en presencia de
AS_{1}-NOR-1.
Monocitos humanos aislados mediante elutriación
(Sanderson RJ et al. Isolation and enumeration of peripheral
blood monocytes. J Immunol 1977;118:1409-1414)
fueron incubados 24 horas en placas multipocillo y posteriormente
se expusieron durante 1 h a diferentes inductores [suero humano,
PDGF-BB, trombina, y un inductor de la PKC (PMA)] y
se determinó los niveles de ARNm de NOR-1 mediante
RT-PCR como se ha indicado previamente
(Figura 8).
(Figura 8).
Concentraciones crecientes de lipoproteínas de
baja (LDL), pero no de lipoproteínas de alta densidad (HDL),
indujeron los niveles de ARNm de NOR-1 en células
endoteliales humanas de cordón umbilical (HUVEC) (Figura 8A). En
CMLV tanto las LDL como las HDL indujeron la expresión de
NOR-1 (Figura 8B). El 10% suero y la trombina (10
U/mL) tambien indujeron la expresión de NOR-1 tanto
en HUVEC como en células endoteliales de arteria aorta porcina
(PAEC) (Figura 8C). En estos experimentos las células endoteliales
en estado de semiconfluencia, cultivadas en medio de bajo contenido
en suero, fueron inducidas con concentraciones crecientes de
lipoproteínas o el resto de inductores durante 1 h.
Monocitos humanos fueron incubados 24 horas en
placas multipocillo y posteriormente se expusieron durante 1 h a
diferentes inductores [10% suero humano, 5 nmol/L
PDGF-BB, 10 U/mL de trombina, y un inductor de la
PKC (PMA, 5 \mumol/L)] y se determinó los niveles de ARNm de
NOR-1 mediante RT-PCR. En la figura
9 se muestran los niveles de expresión de NOR-1
alcanzados en estas células expuestas a los distintos
inductores.
En la siguiente sección de Materiales y Métodos
se identifican las células, plásmidos, secuencias antisentido,
oligonucleótidos y animales utilizados en dichos Ejemplos así como
los métodos para evaluar la expresión de las proteínas de interés
de la presente invención NOR-1 y Nur77 (Northern
blot, in situ RT-PCR, EMSA), western blot,
la técnica de angioplastia, técnica de lesión de CMLV y el análisis
estadístico.
Las CMLV fueron obtenidas por la técnica de
explantes a partir de arterias coronarias de humanas y porcinas
(Martínez-González J, Viñals M, Vidal F,
Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation
impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular
smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135:
213-223). Las células fueron cultivadas como se ha
descrito previamente y en los experimentos se usaron células
comprendidas entre el 2º y el 5º pasaje. Las células se sembraron
en placas multi-pocillo y cuando llegaron a
confluencia se indujo quiescencia incubándolas 48 horas en medio
con un 0,4% de suero fetal de ternera (SFT). Las células quiescentes
fueron estimuladas con 10% de suero humano o con 5 nmol/L del
factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB
(Platelet-Derived Growth
Factor-BB, PDGF-BB)
(Amersham-Pharmacia), 10 U/mL de
\alpha-trombina
(Diagnostica-Stago), 10 nmol/L del factor de
crecimiento semejante a la insulina-1
(Insulin-like Growth Factor-1,
IGF-1) (Sigma), 1 \mumol/L de insulina
(Novo-Nordisk), 10 nmol/L del factor de crecimiento
epidérmico (Epidermal growth factor, EGF)
(Amersham-Pharmacia), 25 nmol/L del factor de
crecimiento básico de fibroblastos (basic Fibroblast Growth
Factor, bFGF) (Amersham-Pharmacia), 5 nmol/L
del factor de necrosis tumural-\alpha (Tumor
Necrosis Factor-\alpha,
TNF-\alpha)
(Amersham-Pharmacia), 5000 U/mL de
interleucina-1\beta (IL-1\beta)
(Amersham-Pharmacia), 0,1 nmol/L del factor de
crecimiento transformante beta (Transforming Growth Factor,
TGF\beta) (Amersham-Pharmacia) o por
concentraciones crecientes de A23187 (Alexis) y
4-\beta-forbol-12-miristato-13-acetato
(PMA) (Sigma) en distintos experimentos. Cuando se utilizaron
inhibidores, las CMLV fueron preincubadas 30 minutos antes del
estimulo. Los inhibidores usados fueron: 1 \mug/mL de toxina
pertussis (Sigma), 50 \mumol/L de PD98059 (Sigma), 15 \mumol/L
del éster acetoximetil del ácido
1,2-bis(2aminofenoxy)etano-N,N,
N',N'-tetrakis tetraacetico (BAPTA-AM) (Sigma) o concentraciones crecientes de GF-109203X (Sigma) o EDTA.
N',N'-tetrakis tetraacetico (BAPTA-AM) (Sigma) o concentraciones crecientes de GF-109203X (Sigma) o EDTA.
Las células endoteliales humans de cordón
umbilical (HUVEC) y de arteria aorta porcina (PAEC) fueron
obtenidas mediante el método de digestión con colagenasa y
cultivadas según hemos describimos previamente
(Martínez-González J, Raposo B, Rodriguez C,
Badimon L.
3-hydroxy-3-methylglutaryl
coenzyme A reductase inhibition prevents endothelial NO synthase
downregulation by atherogenic levels of native LDLs. Arterioscler
Thromb Vasc Biol 2001;21:804-809).
Los monocitos humanos fueron obtenidos mediante
elutriación a partir de concentrados de células blancas de acuerdo
con metodologías descritas previamente (Sanderson RJ et al.
Isolation and enumeration of peripheral blood monocytes. J Immunol
1977; 118: 1409-1414).
Los inhibidores no produjeron ningún efecto en
la morfología celular, apoptosis celular (analizada por tinción con
el colorante Hoesch 33258) o en la viabilidad celular analizada con
un kit comercial la actividad deshidrogenasa mitocondrial (XTT
based assay for cell viability, Roche).
Se aisló el RNA total de la CMLV procedentes de
la túnica media de arterias coronarias porcinas, quiescentes o
estimuladas 1 hora con 10% de suero humano, 10 U/mL de
\alpha-trombina o 5 nmol/L de
PDGF-BB utilizando QuickPrep^{TM}
(Amersham-Pharmacia). El análisis
mRNA-DD fue realizado con el Delta^{TM}
RNA fingerprinting Kit (Clontech) tal como esta descrito (Rodríguez
C, Martínez-González J,
Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51
in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a
SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001;
88: 268-274). Las bandas diferenciales fueron
clonadas en el vector pGEM-T^{TM} (Promega) y
secuenciadas con el ABIPrism dRhodamine Terminator Sequencing kit
(Perkin Elmer).
La banda número 2 identificada por
mRNA-DD fue utilizada como sonda para el
análisis en una librería de ADNc en \lambdaZAPII (Stratagene)
preparada a partir de ARNm de CML de arterias coronarias porcinas
(estimuladas con suero humano durante 1 hora). En un análisis de
1\times10^{6} colonias se identificaron 101 clones positivos,
los cuales fueron caracterizados por mapeo con enzimas de
restricción. Los clones \lambdaSsNor32 y \lambdaSsnor83 se
subclonaron para los posteriores análisis. La secuencia de
nucleotidos se obtuvo por secuenciación automática de ambas hebras
del ADNc. Los alineamientos múltiples de proteína se obtuvieron
usando el servicio ClustalW del Instituto Europeo de
Bioinformática.
El RNA total se obtuvo como se ha explicado
anteriormente y se analizó mediante Northern blot como esta
descrito previamente (Martínez-González J, Viñals
M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate
deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in
human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997;
135: 213-223). Como sondas se utilizaron el ADNc de
NOR-1\alpha, un ADNc de rata de c-fos y un
ribosomal ADNc (para normalizar las membranas).
Se utilizaron extractos nucleares (3 \mug) de
CMLV humanas y las sondas de doble cadena correspondientes a la
secuencia del promotor humano de NOR-1 (de -84
hasta -41; Nor/3CRE), la cual contiene los tres sitios CRE o una
sonda que contiene una secuencia consenso NBRE, tal como esta
descrito (Rodríguez C, Martínez-González J,
Sánchez-Gómez S, B adimon L. LDL downregulate CYP51
in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a
SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001;
88: 268-274). Los experimentos de
super-retardación se realizados usando anticuerpos
contra CREB, c-Fos y c-Jun (Santa
Cruz Biotechnology).
Se analizaron por Western blot los
niveles de CREB (de las formas fosforilada y desfosforilada) en
extractos celulares provenientes de CMLV (Rodríguez C,
Martínez-González J, Sánchez-Gómez
S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells
and in the arterial wall through a SREBP-2
dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88:
268-274) usando anticuerpos específicos (Santa Cruz
Biotechnology).
El plásmido pNOR\alpha-1703
que contiene el promotor humano de NOR-1 (de -1703
a +264) nos fue gentilmente cedido por el Dr. N. Ohkura. La
mutagenesis dirigida sobre los tres posibles sitios CRE presentes en
el promotor de NOR-1 fueron realizada con el
QuickChange^{TM} Site-Directed Mutagenesis Kit
(Stratagene). Los cambios introducidos en la secuencia de la
construcción mutante [pNOR\alpha/-1703-(M)] fueron (-79)
TGcatcAGCGTCCCATGcatgCACATTGcgta
CT(-46) (SEQ ID NO1) (los cambios se indican por las letras en minúsculas). La nueva secuencia se analizó mediante programas de análisis de promotores para confirmar que no se habían creado nuevos elementos de respuesta.
CT(-46) (SEQ ID NO1) (los cambios se indican por las letras en minúsculas). La nueva secuencia se analizó mediante programas de análisis de promotores para confirmar que no se habían creado nuevos elementos de respuesta.
Las células NIH-3T3 fueron
transfectadas con vectores de expresión de luciferasa utilizando el
sistema
Nucleofactor^{TM} (Amaxa Biosystems) siguiendo las especificaciones del fabricante. Se indujo quiescencia en las células transfectadas incubándolas 36 horas en un medio con un 0,4% de SFT y posteriormente se estimularon con suero durante 4 horas. La actividad luciferasa se determinó en los lisados celulares con un luminometro. Se utilizó el pSV\beta-gal (Promega) como control interno.
Nucleofactor^{TM} (Amaxa Biosystems) siguiendo las especificaciones del fabricante. Se indujo quiescencia en las células transfectadas incubándolas 36 horas en un medio con un 0,4% de SFT y posteriormente se estimularon con suero durante 4 horas. La actividad luciferasa se determinó en los lisados celulares con un luminometro. Se utilizó el pSV\beta-gal (Promega) como control interno.
Se obtuvieron muestras de aortas y arterias
coronarias de corazones transplantados provenientes de pacientes
humanos con cardiomiopatia idiopática (DIC) o de CAD. Las arterias
coronarias fueron examinadas a bajo aumento y clasificadas en dos
categorías: áreas con lesiones ateroscleroticas y áreas sin lesión
ateroscierotica. El estudio y todas las muestras humanas siguieron
las directrices internas y fue aprobado por el Comité de Ética del
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.
Se seleccionaron cerdos
Yorkshire-Albino (peso corporal de
30-35 Kg) para realizar las angioplastias. El
manejo, mantenimiento y cuidado de los animales, así como los
procedimientos realizados en este estudio fueron realizados
siguieron las directrices institucionales así como las directrices
de la Asociación Americana del Corazón (American Heart
Assciation) para la investigación con animales. La metodología
para la angioplastia con balón coronaria ha sido ampliamente
descrita.^{13} Las lesiones coronarias fueron realizadas inflando
tres veces a 8 atmósferas un catéter balón (Cordis) de 4,0x20,0 mm.
Una vez finalizada la angioplastia los animales fueron sacrificados
a 1, 2, 4 y 6 horas (n=20). Este procedimiento de angioplastia
produce una sobre extensión de la arteria causando un severo
daño.
La expresión de NOR-1, Nur77 y
Nurr1 fue analizada por RT-PCR. Los
oligonucleotidos específicos utilizados fueron NOR-1
5'-AGGGCTGCAAGGGCTTTTTCAAGAGA-3'
(SEQ ID NO2) y
5'-TGCTTTCTACAGGAGCTGC
T-3' (SEQ ID NO3); Nur77, 5'-CCACAGCCTCCAGCCTTTT-3' (SEQ ID NO4) y 5'-TTTCGCCGCCTCTTGTCCA
C-3' (SEQ ID NO5); Nurr1, 5'-CTCCCGCCTCTCCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO10) y 5'-TTGGTCGGCTTTGGG
CAGGT-3' (SEQ ID NO11). Los niveles de la gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH) se utilizaron para normalizar I os resultados (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274). La amplificación se realizó a 24 (NOR-1, Nur77 y Nurr1) o 22 (GAPDH) ciclos: desnaturalización, 94ºC durante 30 s: anillamiento a 61ºC (NOR-1, Nurr1 y GAPDH) o 55ºC (Nur77) durante 1 minuto y polimerización, 72ºC durante 1 min. 30 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se resolvieron en geles de agarosa, se transfirieron a membranas de nylon (Schleicher & Schuell) y se detectaron tal como esta descrito (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274).
T-3' (SEQ ID NO3); Nur77, 5'-CCACAGCCTCCAGCCTTTT-3' (SEQ ID NO4) y 5'-TTTCGCCGCCTCTTGTCCA
C-3' (SEQ ID NO5); Nurr1, 5'-CTCCCGCCTCTCCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO10) y 5'-TTGGTCGGCTTTGGG
CAGGT-3' (SEQ ID NO11). Los niveles de la gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH) se utilizaron para normalizar I os resultados (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274). La amplificación se realizó a 24 (NOR-1, Nur77 y Nurr1) o 22 (GAPDH) ciclos: desnaturalización, 94ºC durante 30 s: anillamiento a 61ºC (NOR-1, Nurr1 y GAPDH) o 55ºC (Nur77) durante 1 minuto y polimerización, 72ºC durante 1 min. 30 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se resolvieron en geles de agarosa, se transfirieron a membranas de nylon (Schleicher & Schuell) y se detectaron tal como esta descrito (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274).
La in situ RT-PCR se
realizó en especímenes sometidos a PTCA usando el EZ rTth RNA PCR
Kit^{TM} (Perkin Elmer) según el protocolo del fabricante. Los
cebadores usados para amplificar el ARNm fueron:
5'-GATGCTATCC
CAGCAGGAAA-3' (SEQ ID NO 8) y 5'-CATCAAGAACGGCCAAAAT-3' (SEQ ID NO9). La amplificación se realizó durante 25 ciclos y las condiciones de anillamiento especificas fueron 55ºC durante 90 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se detectaron usando un sistema acoplado a la fosofatasa alcalina y NBT/BCP.
CAGCAGGAAA-3' (SEQ ID NO 8) y 5'-CATCAAGAACGGCCAAAAT-3' (SEQ ID NO9). La amplificación se realizó durante 25 ciclos y las condiciones de anillamiento especificas fueron 55ºC durante 90 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se detectaron usando un sistema acoplado a la fosofatasa alcalina y NBT/BCP.
CML de arteria coronaria humanas quiescentes se
indujeron con 10% de suero humano en medio de cultivo con 0,5
\muCi/mL de [^{3}H]timidina en presencia o ausencia de
concentraciones crecientes de oligodeoxinucleótidos fosforotioados
(ODNs) y se determinó la incorporación de [^{3}H]timidina
cómo se ha descrito (Martínez-González J, Viñals M,
Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate
deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human
vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135:
213-223). El efecto de los ODNs sobre el ciclo
celular se analizó mediante citometría de flujo como se ha descrito
(Darzinkiewic Z, Juan G. Nucleic acid analysis. In: Robinson JP.
ed. Current Protocols in Cytometry. New York, John Wiley and
Sons, Inc. 1997: 1-24). Los ODNs antisentido
utilizados fueron: NOR-1
antisentido-1 (AS_{1}-NOR;
5'-TTGGACGCAGGGCAT-3') (SEQ ID NO 6)
y antisentido-2 (AS_{2}-NOR;
5'-GCTGCCAAGGTCCAT-3') (SEQ ID NO
7), complementarios de los nucleótidos 732 a 746 y 849 a 863 del
RNAm de NOR-1 humano (Nº de acceso
NM-006981) respectivamente. Como controles se
utilizaron las correspondientes secuencias sentido y ODNs
antisentido contra c-fos, utilizados previamente para
analizar el papel de este proto-oncogen en
proliferación celular (Leon Y, Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM,
Giraldez F, Represa J, Varela-Nieto I.
Insulin-like growth factor-I
regulates cell proliferation in the developing inner ear,
activating glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis
and Fos expression. Endocrinology. 1995; 136:
3494-3503).
La capacidad de los ODNs antisentido de inhibir
la reparación tisular de las CMLV después de lesión mecánica fue
analizada en CML de arteria coronaria humana en cultivo como se ha
descrito previamente (Lowe HC, Fahmy RG, Kavurna MM, Baker A,
Chesterman CN, Khachigian LM. Catalytic oligodeoxynucleotides
define a key regulatory role for early growth response
factor-1 in the porcine model of coronary
in-stent restenosis. Cir Res. 2001; 89:
670-677). Brevemente, CML de arteria coronaria
humana en estado de confluencia y quiescentes fueron raspadas y
después se incubaron durante 72 h a 37ºC en presencia y ausencia de
los ODNs indicados previamente. Las células se fijaron y tiñeron
con azul de metileno. Las imágenes fueron digitalizadas mediante una
cámara Sony 3CCD y se determinó en número de células en la zona
denudada.
Los resultados se expresaron como la media±EEM.
Para los análisis se utilizó el programa Stat Viev^{TM} II
(Abacus Concepts) para ordenador Macintosh. Se compararon múltiples
grupos mediante un factor ANOVA, seguido del test de Fisher PLSD
para determinar diferencias especificas entre grupos.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de identificación de
potenciales compuestos moduladores de la actividad de
NOR-1, nueva diana diagnóstica y terapéutica de
enfermedades cardiovasculares
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NOR-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo NOR-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggctgcaa gggctttttc aagaga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo NOR-1b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctttctac aggagctgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo Nur77 a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacagcctc cagcctttt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo Nur77 b
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttcgccgcc tcttgtccac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia pNORa/-1703-(M)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcatcagcg tcccatgcat gcacattgcg tact
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo NOR-1
antisentido-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggacgcag ggcat
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NOR-1
antisentido-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgccaagg tccat
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo NOR-1 in
situ RT-PCR a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgctatcc cagcaggaaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo NOR-1 in
situ RT-PCR b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcaagaac ggccaaaat
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo Nurr1 a
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcccgcctc tccctcttct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo Nurr1 b
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggtcggct ttgggcaggt
\hfill20
Claims (6)
1. Procedimiento de identificación de
potenciales compuestos moduladores de actividad de
NOR-1 caracterizado por las siguientes
etapas:
- a)
- puesta en contacto del mencionado compuesto en un entorno biológico donde exista la proteína NOR-1 funcionalmente activa,
- b)
- determinación de los niveles de expresión o de actividad de la proteína NOR-1, y
- c)
- la selección de dicho compuesto como compuesto modulador de NOR-1 (o de los otros miembros de la familia NGFI-B) si se constata la inhibición o la potenciación de los efectos de NOR-1 en presencia del compuesto.
2. Procedimiento de identificación de
potenciales compuestos moduladores de actividad de
NOR-1 según la reivindicación 1 caracterizado
porque el entorno biológico es un cultivo de CMLV, células
endoteliales y monocitos/macrófagos donde en presencia o no de
mitógenos inductores de NOR-1 - suero, trombina,
PDGF y EGF, entre otros, - se añade el potencial compuesto a
valorar y posteriormente se determinan los niveles de expresión o de
actividad de NOR-1.
3. Procedimiento de identificación de
potenciales compuestos moduladores de actividad de
NOR-1 según la reivindicación 1 caracterizado
porque el entorno biológico es un modelo animal, preferentemente
porcino, al que se somete a una intervención de angioplastia
coronaria transluminal percutanea (PTCA), al que se administra el
potencial compuesto a valorar.
4. Uso de oligonucleótidos antisentido de
NOR-1 (ODNs), o secuencias nucleotídicas dirigidas
a bloquear la expresión de NOR-1, mediante vectores
o vehiculizantes que permitan la entrada de dichas secuencias en
células implicadas en la etiopatogenia de enfermedades
cardiovasculares para preparar un medicamento destinado al
tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares que
cursan con activación de NOR-1.
5. Uso de oligonucleótidos antisentido de
NOR-1 según la reivindicación 4
caracterizado porque los oligonucleótidos antisentido son el
oligonucleótido AS_{1}-NOR-1 (SEQ
ID NO6) y AS_{2}-NOR-1 (SEQ ID
NO7).
6. Oligonucleótido antisentido contra
NOR-1 útil como compuesto modulador de la actividad
de NOR-1 caracterizado porque está
constituido por una secuencia de nucleótidos perteneciente al
siguiente grupo: SEQ ID NO6 y SEQ ID NO7.
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OHKURA N. et al. Structure, mapping ad expression of a human NOR-1 gene, the third member of theNur77/NGFI-B. Biochim Biophys Acta. Sep 1996, Vol 1308, Nº 3, paginas 205-214. * |
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