ES2228235B1 - Procedimiento de identificacion de nor-1 y/o nur77 y/o nurr1 para el diagnostico y seguimiento de enfermedades cardiovasculares. - Google Patents

Procedimiento de identificacion de nor-1 y/o nur77 y/o nurr1 para el diagnostico y seguimiento de enfermedades cardiovasculares.

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Abstract

Procedimiento de identificación de NOR-1 y/o NUR77 y/o NURR1 para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades cardiovasculares. NOR-1 es un factor de transcripción potencial modulador de la función de células vasculares (células musculares lisas vasculares y células endoteliales) y monocitos/macrófagos y por tanto una nueva diana diagnóstica en humanos, para el diagnóstico, seguimiento de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 ó para la monitorización, seguimiento o evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas enfermedades cardiovasculares; así como una diana terapéutica que permite la identificación de nuevos compuestos terapéuticos para el tratamiento de estas enfermedades y el diseño de nuevos protocolos de terapia génica.

Description

Procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nurr1 para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades cardiovasculares.
Sector de la técnica
Biomedicina. Nuevas dianas terapéuticas y diagnóstico de enfermedades e identificación de nuevos compuestos farmacéuticos que regulan la actividad de dichas dianas terapéuticas. Enfermedades cardiovasculares como la arteriosclerosis.
Estado de la técnica
Para entender los mecanismos moleculares involucrados en la activación y desdiferenciación de las células musculares lisas vasculares (CMLV), se necesita un detallado mapaje de las cascadas de factores de transcripción inducidos por los estímulos aterogénicos. Estos genes maestros podrían ser dianas para nuevas estrategias, tanto terapéuticas como de diagnostico. Recientemente, distintos receptores nucleares, entre los cuales cabe destacar, los receptores activados por proliferadores peroxisomicos (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors, PPARs) (Marx N, Schonbeck V, Lazar MA, Libby P, Plutzky J. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activators inhibit gene expression and migration in human vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1998; 83: 1097-1103; Staels B, Koening W, Habib A, Merval R, Lebret M, Torra IP, Delerive P, Faadel A, Chinetti G, Fruchart JC, Najib J, Maclouf J, Tedgui A. Activation of human aortic smooth-muscle cells is inhibited by PPARaIpha but not by PPARgamma activator. Nature 1998; 393: 790-793), receptores de retinoicos, tanto el receptor del retinoide X (Retinoid X Receptor, RXR), como el receptor del ácido retinoico (Retinoic Acid Receptor, RAR) y el receptor huérfano relacionado con el de retinoico (Retinoid-related Orphan Receptor, ROR) han sido identificados en la activación/proliferación de CMLV y consecuentemente implicados en el proceso aterogénico (Miano JM, Topouzis S, Majesky MW, Olson EN. Retinoid expression and all-trans retinoic acid-mediated growth inhibition in vasculat smooth muscle cells. Circulation. 1996; 93: 1886-1895; Neuville P, Yan Z, Gidlof A, Pepper MS, Hansson GK, Gabbiani G, Sirsjo A. Retinoic acid regulates arterial smooth muscle cell proliferation and phenotypic features in vivo and in vitro through an RARalpha-dependent signalling pathway. Arterioscler Thronb Vasc Biol. 1999; 19: 1430-1436; Haxsen V, Adam-Stitah S, Ritz E, Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin II on vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001; 88: 637-644). Los receptores nucleares son una gran familia de factores de transcripción activados por ligandos, los cuales regulan complejos programas génicos que tienen una gran importancia en prácticamente todos los procesos del desarrollo y la fisiología en la edad adulta (Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M, Herrlich P, Schutz, Umesono K, Blumberg B, Kastner P, Mark M, Chambon P, Evans RM. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 1995; 83: 835-839; Giguére V. Orphan nuclear receptors: from gene to function. Endocr Rev 1999; 20: 689-725). Además, en la actualidad se conocen ligandos sólo para la mitad de los receptores nucleares conocidos, los restantes receptores son conocidos como receptores huérfanos y constituyen una área especialmente para la investigación y desarrollo (I+D).
NOR-1, junto con Nur77 y Nurr1, forman la subfamilia del NGFI-B dentro de la superfamilia de los receptores nucleares (Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M, Herrlich P, Schütz, Umesono K, Blumberg B, Kastner P, Mark M, Chambon P, Evans RM. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 1995; 83: 835-839; Giguére V. Orphan nuclear receptors: from g ene to function. Endocr Rev 1999; 20: 689-725). Estos genes han sido involucrados en regulación neuroendocrina, diferenciación neuronal, regeneración hepática, apoptosis celular y de respuesta a estímulos mitogénicos en distintos tipos celulares (Maruyama K, Tsukada t, Ohkura N, Bandoh S, Hosono T, Yamaguchi K. The NGFI-B subfamily of the nuclear receptor superfamily. Int J Oncol. 1998; 12: 1237-1243). Finalmente, es de esperar que nuevos conocimientos sobre la actividad funcional completas de estos factores de transcripción pueden permitir el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico y tratamiento de enfermedades causadas por la alteración de dichas potenciales dianas.
Descripción Descripción breve
Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nu77 y/o Nurr1 en muestras biológicas de mamíferos, preferentemente humanos, para el diagnóstico, seguimiento de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 o para la monitorización, seguimiento o evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas enfermedades cardiovasculares, caracterizado porque comprende las siguientes partes:
a)
Obtención de la muestra biológica mediante extracción sanguínea o intervención intravascular (aterectomía o similar), y
b)
identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 en dicha muestra biológica, donde un resultado positivo o incrementado respecto a un nivel basal considerado fisiológico indicará existencia de una enfermedad cardiovascular que cursa con activación de NOR-1, o donde la comparación de los niveles de NOR-1 determinados a I o largo del tiempo indicarían la evolución de la enfermedad cardiovascular o si, por ejemplo, el tratamiento administrado para dicha enfermedad presenta algún efecto terapéutico.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1, y por tanto, potenciales compuestos terapéuticos de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, caracterizado por las siguientes etapas:
a)
puesta en contacto del mencionado compuesto en un entorno biológico donde exista la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 funcionalmente activa,
b)
determinación de los niveles de expresión o de los niveles de actividad de la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, y
c)
la selección de dicho compuesto como compuesto modulador de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 si se constata la inhibición o la potenciación de los efectos de NOR-1 en presencia del compuesto.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un cultivo de CMLV de mamíferos, preferentemente humanas o porcinas, donde en presencia o no de mitógenos inductores de NOR-1 - suero, trombina, PDGF y EGF, entre otros, - se añade el potencial compuesto a valorar y posteriormente se determinan: los niveles de mRNA de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 (mediante RT-PCR, Northern blot, in situ RT-PCR o hibridación in situ, entre otros métodos) o la actividad NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 [mediante la capacidad de estos factores de transcripción de unirse a secuencias específicas de ADN en Ensayos de Retardación en la Movilidad Electroforética (EMSA)], como se ha realizado en la presente invención, o determinando la capacidad de NOR-1 de formar heterodímeros con otros miembros de la familia NGFI-B (Nur77 y Nurr1) modulando así la transactivación de genes diana; o mediante determinación de los niveles de proteína (mediante las técnicas mencionadas anteriormente).
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un modelo animal, preferentemente porcino, al que se somete a una intervención de angioplastia coronaria transluminal percutanea (PTCA), al que se administra el potencial compuesto a valorar y posteriormente se determina los niveles de NOR-1 de las lesiones provocadas mediante técnicas como RT-PCR, Northern blot, in situ RT-PCR o Western blot (ver ejemplo 2.3 de la presente invención) entre otras.
Así, un objeto adicional de la presente invención lo constituye un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1 (que modifique su expresión o su actividad como factor de transcripción individual o cooperativamente con los otros miembros de la familia NGFI-B) identificados según un procedimiento descrito anteriormente. Igualmente, otro objeto adicional lo constituye una composición farmacéutica caracterizada porque comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1 identificado por el procedimiento de la presente invención.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo de una composición farmacéutica descrita anteriormente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares que cursen con activación de NOR-1 en mamíferos, preferentemente humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención es un procedimiento de terapia génica para el tratamiento y prevención en mamíferos, preferentemente humanos, de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 que permitiera la modificación de la expresión de NOR-1 en la células implicadas en la etiopatogenia de dichas enfermedades, por ejemplo mediante la expresión de oligonucleótidos antisense de NOR-1 (ODNs) utilizando vectores o vehiculizantes que permitan la entrada de dichos ODNs en dichas células. Un objeto particular de la presente invención lo constituye los ODNs antisentido/contra NOR-1 descritos en la presente invención: AS1-NOR-1 (SEQ ID NO 6) y AS2-NOR-1 (SEQ ID NO 7), así como cualquier otro que se pueda desarrollar con los conocimientos existentes en el estado del arte, y que bloqueen la expresión de NOR-1 (Nabel E.G., Nabel G.J. Gene Transfer. In: Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. edited by V. Fuster, R. Ross and E.J. Topol. Lippincott-Raven Publisher, Philadelphia, 1996). Dichas estrategias comprenderían también aquellas encaminadas a modificar la función de la proteína NOR-1 mediante la sobre-expresión de una proteína NOR-1 (o de otro miembro de la familia NGFI-B) defectiva (dominantes negativos) que compite con las proteínas nativas y reduce su actividad.
Descripción detallada
En este estudio se utilizó el sistema de análisis mRNA-DD en una búsqueda de genes inducidos por mitógenos en CMLV en el modelo porcino, un modelo que por su gran similitud al ser humano es comúnmente aceptado en el estudio de diferenciación de CMLV y en arteriosclerosis (Badimon, L. Atherosclerosis and thrombosis: lessons from animal models. Thromb Haemost. 2001; 86, 356-365). Hemos identificado NOR-1 como un gen de inducción rápida en CMLV. NOR-1 fue inducido transitoriamente mediante angioplastia en arterias coronarias de cerdo y fue sobre-expresado en lesiones ateroscleróticas primarias en humanos. También se detectó inducción de los otros miembros de la familia NGFI-B en lesiones ateroscleróticas humanas (Nur77) y en arterias coronarias porcinas sometidas a angioplastia con balón (Nurr1). ODNs antisentido contra NOR-1 inhibieron la proliferación de CMLV y la reparación tisular inducida mediante daño mecánico.
A partir de CML porcinas se clonaron dos isoformas de NOR-1. NOR-1 es un gen de inducción rápida que fue intensamente inducido en CMLV por estímulos mitogénicos que señalizan a través de vías dependientes de receptores proteína quinasa (PDGF y EGF) y de receptores acoplados a proteínas G (trombina). Por el contrario, otros agentes como citocinas, que inducen NOR-1 en fibroblastos gingibales (Borghaei RC, Sinai ES, Mochan E, Pease EA. Induction of mitogen-inducible nuclear orphan receptor by interleukin 1 in human synovial and gingival fibroblasts. Biochem Biophys Res Common. 1998; 251: 334-338), o angiotensina-II, que induce NOR-1 en células fasciculata (Fernández PM, Brunel F, Jimenez MA, Saez JM, Cereghini S, Zakin MM. Nuclear receptors Nor1 and NGFI-B/Nur77 play similar, albeit distinct, roles in hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Endocrinology. 2000; 141: 2392-2400), no indujeron NOR-1 en CMLV. Aumento de la concentración intracelular de calcio así como la activación de la PKC y la vía de las MAPK, vías activadas en procesos de migración y proliferación celular, están involucradas en la inducción de NOR-1 en CMLV. En este sentido, mitógenos que utilizan más de una vía (por ejemplo, el suero) indujeron NOR-1 en mayor medida, y la asociación de PDGF o trombina con IGF-I incrementó el efecto producido individualmente por cada uno de ellos. Por tanto, NOR-1 podría jugar un papel clave integrando diferentes vías de señalización en CMLV, en procesos tales como la trombosis que produce la activación/degranulación de las plaquetas (que liberan PDGF y EGF) y generación de trombina. De hecho NOR-1 fue también inducido por estos agentes en otras células involucradas en el proceso aterosclerótico, como células endoteliales y monocitos/macrófagos [Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes. New Engl J Med 326. Part I (242-250) and Part II (310-318)]. Además, concentraciones crecientes de lipoproteínas de baja densidad (LDL) indujeron NOR-1 tanto en CMLV como en células endoteliales, mientras que concentraciones crecientes de HDL sólo indujeron NOR-1 en CMLV. La modulación de NOR-1 por lipoproteínas sugiere que este gen puede ser un potencial indicador de procesos que cursen con un incremento de los niveles circulantes de LDL, que de hecho constituye uno de los factores de riesgo aterosclerótico mejor caracterizado que repercute tanto en la fisiología de las células vasculares (CMLV y células endoteliales) como circulantes (en particular monocitos) (Navad M, fogelman AM, Berliner JA, Terroto MC, Demer LL, Franks JS, Watson AD, Edwards PA, Lusis AJ. Pthogenesis of atherosclerosis. Am J Cardiol 1995;76:18C-23C; Lusis AJ. Atherosclerosis Nature 2000; 407: 233-241).
Los experimentos de transfección indican un papel clave de los elementos CRE presentes en el promotor de NOR-1 en su inducción por estímulos mitogénicos. De hecho, la activación de CREB es un punto de convergencia tanto de las vías dependientes de PKC como de movilización de calcio (Mayr B, Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB. Nat Rev Mol Cell Bio 2001, 2: 599-609), los dos principales vías implicadas en la inducción de NOR-1. El suero indujo la fosforilación de CREB, aunque no se observaron cambios en la unión de CREB, de acuerdo con la capacidad de CREB de unirse constitutivamente a su elemento de respuesta (Mayr B, Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB. Nat Rev Mol Cell Bio 2001, 2: 599-609).
Aunque NOR-1 es inducido transitoriamente por mitógenos en células en cultivo, se detectó expresión significativa de NOR-1 en varios tejidos adultos, en particular en miocardio y en músculo esquelético tanto de cerdo como de humanos (datos no mostrados), lo que sugiere que en dichos tejidos NOR-1 podría regular genes involucrados en funciones clave en estos tejidos. La expresión simultánea de los genes de la familia NGFI-B en ciertos tejidos y células, la gran homología de sus secuencias de aminoácidos y la capacidad de los tres receptores de unirse a un elemento de respuesta específico (NBRE) (Wilson TE, Fahrner TJ, Johnston M, Milbrandt J. Identification of the cDNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. Science. 1991; 256: 1296-1299) puede explicar la redundancia funcional observada en ciertos sistemas (Chong LEC, Chan FKM, Cado D, Winoto A. Functional redundancy of the Nur77 and Nor-1 orphan steroid receptors in T-cell apoptosis. EMBO J. 1997; 16: 1865-1875). Sin embargo, nosotros observamos patrones de expresión diferentes en tejidos adultos y en la pared vascular en condiciones patológicas. De hecho, aunque tanto la expresión de NOR-1 como la de Nur77 está aumentada en lesiones ateroscleróticas primarias humanas de pacientes con enfermedad arterial coronaria (CAD) o aneurisma aórtico, los procedimientos de revascularización que dañan la pared vascular e inducen la proliferación de las CMLV activaron la expresión de NOR-1 y Nurr1 pero no la de Nur77 (datos no mostrados). Actualmente se desconoce el significado de la expresión incrementada de Nur77 y Nurr1 en estas muestras. Sin embargo, Nur77 y Nurr1 se inducen de forma concomitante con NOR-1 (en las situaciones mencionadas), se unen a un mismo elemento de respuesta, y pueden formar heterodímeros entre sí (Maira M, Martens C, Philips A, Drouin J. Heterodimerization between members of the Nur subfamily of orphan nuclear receptors as a novel mechanism for gene activation. Mol Cell Biol 1999;19:7549-7557) o con RXR (Mangelsdorf DJ, Evans RM. The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell. 1995; 83: 841-850), factor nuclear que modula el fenotipo de CMLV (como se comenta más extensamente en el párrafo siguiente), por ello podrían modular positiva o negativamente la actividad de NOR-1 en las células vasculares o en las células sanguíneas. Por tanto, tanto Nur77 como Nurr1 estarían directa o indirectamente implicados en las patologías en las que se detecta inducción de NOR-1.
Los genes de la familia NGBI-B han sido involucrados en diferentes funciones celulares, entre ellas proliferación y diferenciación celular y apoptosis (Maruyama K, Tsukada t, Ohkura N, Bandoh S, Hosono T, Yamaguchi K. The NGFI-B subfamily of the nuclear receptor superfamily. Int J Oncol. 1998; 12: 1237-1243). Debe tenerse en cuenta que de igual modo estos papeles "inespecíficos" han sido atribuidos a otros genes de respuesta temprana como c-fos y c-myc (Rothman A, Wolner B, Button D, Taylor P. Immediate-early gene expression in response to hypertrophic and proliferative stimuli in pulmonary arterial smooth muscle cells. J Biol Chem. 1994;269:639-6404; Macdonald K, Bennet MR. Cdc25A is necessary but not sufficient for optimal c-myc induced apoptosis and cell proliferation of vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1999; 84: 820-830). En este sentido, parece plausible que en un contexto fisiológico concreto la función específica de NOR-1 dependa de cambios concomitantes en los niveles de expresión de otros genes. De hecho, la relación entre factores de transcripción eucariotas, en particular la paradigmática heterodimerización entre receptores nucleares (Maira M, Martens C, Philips A, Drouin J. Heterodimerization between members of the Nur subfamily of orphan nuclear receptors as a novel mechanism for gene activation. Mol Cell Biol. 1999; 19: 7549-7557), incrementa la complejidad de las "redes" moleculares que operan en las células vasculares. Nur77 y Nurr1 (pero no NOR-1) pueden formar heterodímeros con RXR (Mangelsdorf DJ, Evans RM. The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell. 1995; 83: 841-850), permitiendo a éstos la activación de genes vasculares de una forma dependiente de ligando a través de elementos de respuesta a ácido retinoico. Dado que RXR ha sido involucrado directamente en la modulación del fenotipo de las CMLV y en aterogénesis (Haxsen V, Adam-Stitah S, Ritz E, Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin II on vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001;88:637-644; Claudel T, Leibowitz MD, Fievet C, Tailleux A, Wagner B, Repa JJ, Torpier G, Lobaccaro JM, Paterniti JR, Mangelsdorf DJ, Heyman RA, Auwerx J. Reduction of atherosclerorisis in apolipoprotein E knockout mice by activation on the retinoid X receptor. Proc Nat/ Acad Sci USA. 2001; 27: 2610-2615), y es la pareja común de otros receptores nucleares activados en células vasculares como PPARs o RAR (Marx N, Schonbeck V, Lazar MA, Libby P, Plutzky J. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activators inhibit gene expression and migration in human vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1998; 83:1097-1103;Haxsen V, Adam-Stitah S, Ritz E, Wagner J. Retinoids inhibit the actions of angiotensin II on vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001; 88: 637-644; Benson S, Padmanabhan S, Kurtz TW, Pershadsingh HA. Ligands for the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and the retinoid X receptor-alpha exert synergistic antiproliferative effects on human coronary artery smooth muscle cells. Mol Cell Biol Res Commun. 2000, 3: 159-164), no debe descartarse una potencial "competición" de estos parejas heterodiméricas por RXR. Esta relación de interferencia/sinergia entre los receptores nucleares entre si o con otros factores de transcripción puede ser importante en la regulación de la función de las células vasculares (Benson S, Padmanabhan S, Kurtz TW, Pershadsingh HA. Ligands for the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and the retinoid X receptor-alpha exert synergistic antiproliferative effects on human coronary artery smooth muscle cells. Mol Cell Biol Res Commun. 2000, 3: 159-164).
El patrón de expresión de NOR-1 está de acuerdo con la participación de este factor de transcripción en los mecanismos moleculares subyacentes tanto en la arteriosclerosis espontánea como la "acelerada". La naturaleza de los estímulos que conducen a un aumento de la expresión de NOR-1, tanto in vitro como in vivo, y las vías intracelulares implicadas en tal inducción avalan firmemente un papel de NOR-1 en la proliferación de las CMLV. Para apoyar esta hipótesis analizamos el efecto de dos ODNs antisentido dirigidos contra NOR-1. Estos ODNs inhibieron significativamente la proliferación de CML de coronaria humana (redujeron la síntesis de novo de ADN, la progresión del ciclo celular y la reparación de lesión por las CMLV). La eficacia de los ODNs antisentido bloqueando estos procesos fue similar a la producida por ODNs dirigidos contra el bien caracterizado proto-oncogen c-fos, que como NOR-1 se induce transitoriamente en CMLV y en arterias coronarias porcinas tras PTCA (Martínez-González J, Viñals M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135: 213-223; Rothman A, Wolner B, Button D, Taylor P. Immediate-early gene expression in response to hypertrophic and proliferative stimuli in pulmonary arterial smooth muscle cells. J Biol Chem. 1994;269:639-6404; Badimon L, Alfon J, Royo T, Berrozpe M, Martínez-González J, Vidal F, Chesebro JH, Fuster V, Badimon JJ. Cell biology of restenosis post-angioplasty. Z Kardiol. 1995; 84: 145-149). Nosotros seleccionamos c-fos como patrón de comparación porque se ha establecido una relación de proporcionalidad entre el grado de expresión de c-fos y la proliferación de CMLV tanto in vivo (Indolfi C, Esposito G, Di Lorenzo E, Rapacciuolo A, Feliciello A, Porcellini A, Avvedimento VE, Condorelli M, Chiariello M. Smooth muscle cell prolifertaion is proportional to the degree of balloon injury in a rat model of angioplasty. Circulation. 1995; 92: 1230-1235) como in vitro (Martínez-González J, Viñals M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135: 213-223), y ODNs contra c-fos se han utilizado con éxito para boquear proliferación celular en diferentes sistemas incluyendo CMLV (Leon Y, Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM, Giraldez F, Represa J, Varela-Nieto I. Insulin-like growth factor-I regulates cell proliferation in the developing inner ear, activating glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos expression. Endocrinology. 1995; 136: 3494-3503; Suggs W, Olson SC, Mandani D, Patel S, Eith FJ. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickenn i a rat vein graft model. Surgery. 1999; 126: 443-449). Nuestros resultados sugieren firmemente que NOR-1 juega un papel en la proliferación de las CMLV, lo que está de acuerdo con las evidencias obtenidas por otros autores que atribuyen un papel a este receptor nuclear huérfano en proliferación celular en diferentes sistemas. De hecho, entre los genes de la familia NGFI-B sólo se ha descrito la conversión oncogénica de NOR-1 (Labelle Y, Zucman J, Stenman G, Kindblom LG, Knight J, Turc-Carel C, Dockhorn-Dworniczak B, Mandahl N, Desmaze C, Peter M, Aurias A, Delattre O, Thomas G. Oncogenic conversion of a novel orphan nuclear receptor by chromosome translocation. Hum Mol Genet. 1995; 4: 2219-2226).
En resumen, la presente invención se basa en que los inventores han observado que el factor de transcripción NOR-1 es un potencial factor modulador de la función de las células vasculares (CMLV y células endoteliales) y monocitos/macrófagos, y por tanto una nueva diana de diagnóstico de patologías cardiovasculares y una nueva diana en futuras estrategias terapéuticas (farmacológicas o basadas en terapia génica).
Así, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nu77 y/o Nurr1 en muestras biológicas de mamíferos, preferentemente humanos, para el diagnóstico, seguimiento de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 o para la monitorización, seguimiento o evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas enfermedades cardiovasculares, caracterizado porque comprende las siguientes partes:
c)
Obtención de la muestra biológica mediante extracción sanguínea o intervención intravascular (aterectomía o similar), y
d)
identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 en dicha muestra biológica, donde un resultado positivo o incrementado respecto a un nivel basal considerado fisiológico indicará existencia de una enfermedad cardiovascular que cursa con activación de NOR-1, o donde la comparación de los niveles de NOR-1 determinados a I o largo del tiempo indicarían la evolución de la enfermedad cardiovascular o si, por ejemplo, el tratamiento administrado para dicha enfermedad presenta algún efecto terapéutico.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "identificación de NOR-1" se refiere a la determinación de los niveles de expresión de NOR-1 humano, en cualquiera de sus dos isoformas alfa y beta, y/o Nur77 y/o Nurr1, ya sea de su ARN mensajero o de las proteínas correspondientes -mediante cualquier método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo - en una muestra biológica de un potencial paciente de dicha enfermedad cardiovascular.
El término "muestra biológica" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a fluidos corporales como sangre (en especial a sus constituyentes celulares), a células vasculares así como a muestras de tejidos periféricos afectos por enfermedades cardiovasculares o por procesos que puedan actuar como coadyuvantes del desarrollo de lesiones ateroscleróticas y eventualmente como marcadores del proceso (por ejemplo, biopsias de encías), obtenidas mediante extracción sanguínea, intervención intravascular (aterectomía o similar) entre otras.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo" se refiere a métodos utilizados en el campo de la biología molecular para la determinación de niveles de RNAm como, entre otras, RT-PCR, Northern blot (Sambroock J., Fritsch E.F., Maniatis T. Extraction purifation analysis of messenger RNA from e ukaryotic cells. In: Molecular Cloning (book 1). Could Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 7.39), "DNA arrays" o biochips de DNA o oligonucleótidos (Hiltunen MO, Niemi M, YIä-Herttuala S. Functional genomics and DNA array techniques in atherosclerosis research. Curr Opin Lipidol. 1999; 10: 515-519); hibridación in situ o in situ RT-PCR (Herrington GS., McGee JO. Princeples and basic methodology of DNA/RNA detection by In situ hibridation. In: Herrington GS., McGee JO. Eds Diagnostic molecular pathology: A practical approach. IRL press, 1992; 1: 69-102); o de niveles de proteínas mediante anticuerpos policlonales o monoclonales que reconozcan a NOR-1 como, entre otros, Western blot (Sambroock J., Fritsch E.F., Maniatis T. Detection and analysis of proteins espressed from cloned genes. In: Molecular Cloning (book 3). Could Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 18.60), inmunocitoquímica e inmunohistoquímica (Robinson G., Ellis I.O., MacLennan A. Immunocitochemistry. In: Bandcroft J. D., Stevens A. ed. Theory and practice of histological techniques. Churchill Livingstone, 1990: 413-436.), técnicas de EIA o ELISA (Pradellas P et al. Enzyme immunoassays of eicosanoids using acetylcholinesterase as label: an alternative to radiommunoassays. Anal Chem 1985; 57: 1170-1173), biochips de proteínas (Huang, RP Detection of múltiple proteins in an antibody-based protein microarray system. Journal of Immunological Methods 225 (2001): 1-13; http://www.functionalgenomics.org.uk/sections/resources/protein arrays.htm; Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems. Chemistry and Biology 8/2 (2001): 105-115). Actualmente se encuentra en fase de desarrollo, por los inventores de la presente invención, la obtención de anticuerpos contra un fragmento de la secuencia proteína de NOR-1 generado mediante expresión en un vector plasmídico procarionte, mediante técnicas ampliamente conocidas por cualquier experto del sector de la técnica de la presente invención (Sambroock J., Fritsch E.F., Maniatis T. Expression of cloned genes in Escherichia coli. In: Molecular Cloning (book 3). Could Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1, y por tanto, potenciales compuestos terapéuticos de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, caracterizado por las siguientes etapas:
d)
puesta en contacto del mencionado compuesto en un entorno biológico donde exista la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 funcionalmente activa,
e)
determinación de los niveles de expresión o de los niveles de actividad de la proteína NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1, y
f)
la selección de dicho compuesto como compuesto modulador de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 si se constata la inhibición o la potenciación de los efectos de NOR-1 en presencia del compuesto.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un cultivo de CMLV de mamíferos, preferentemente humanas o porcinas, donde en presencia o no de mitógenos inductores de NOR-1 - suero, trombina, PDGF y EGF, entre otros, - se añade el potencial compuesto a valorar y posteriormente se determinan: los niveles de mRNA de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 (mediante RT-PCR, Northern blot, in situ RT-PCR o hibridación in situ, entre otros métodos) o la actividad NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 [mediante la capacidad de estos factores de transcripción de unirse a secuencias específicas de ADN en Ensayos de Retardación en la Movilidad Electroforética (EMSA)], como se ha realizado en la presente invención, o determinando la capacidad de NOR-1 de formar heterodímeros con otros miembros de la familia NGFI-B (Nur77 y Nurr1) modulando así la transactivación de genes d lana; o mediante determinación de los niveles de proteína (mediante las técnicas mencionadas anteriormente).
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de potenciales compuestos moduladores de actividad de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nur1 donde el "entorno biológico" es por ejemplo un modelo animal, preferentemente porcino, al que se somete a una intervención de angioplastia coronaria transluminal percutanea (PTCA), al que se administra el potencial compuesto a valorar y posteriormente se determina los niveles de NOR-1 de las lesiones provocadas mediante técnicas como RT-PCR, Northern blot, in situ RT-PCR o Western blot (ver ejemplo 2.3 de la presente invención) entre otras.
Así, un objeto adicional de la presente invención lo constituye un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1 (que modifique su expresión o su actividad como factor de transcripción individual o cooperativamente con los otros miembros de la familia NGFI-B) identificados según un procedimiento descrito anteriormente. Igualmente, otro objeto adicional lo constituye una composición farmacéutica caracterizada porque comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor o potenciador de NOR-1 identificado por el procedimiento de la presente invención.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo de una composición farmacéutica descrita anteriormente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares que cursen con activación de NOR-1 en mamíferos, preferentemente humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención es un procedimiento de terapia génica para el tratamiento y prevención en mamíferos, preferentemente humanos, de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 que permitiera la modificación de la expresión de NOR-1 en la células implicadas en la etiopatogenia de dichas enfermedades, por ejemplo mediante la expresión de oligonucleótidos antisense de NOR-1 (ODNs) utilizando vectores o vehiculizantes que permitan la entrada de dichos ODNs en dichas células. Un objeto particular de la presente invención lo constituye los ODNs antisentido/contra NOR-1 descritos en la presente invención: ASI-NOR-1 (SEQ ID N06) y AS2-NOR-1 (SEQ ID NO 7), así como cualquier otro que se pueda desarrollar con los conocimientos existentes en el estado del arte, y que bloqueen la expresión de NOR-1 (Nabel E.G., Nabel G.J. Gene Transfer. In: Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. edited by V. Fuster, R. Ross and E.J. Topol. Lippincott-Raven Publisher, Philadelphia, 1996). Dichas estrategias comprenderían también aquellas encaminadas a modificar la función de la proteína NOR-1 mediante la sobre-expresión de una proteína NOR-1 (o de otro miembro de la familia NGFI-B) defectiva (dominantes negativos) que compite con las proteínas nativas y reduce su actividad.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1" se refiere a enfermedades cardiovasculares que cursan con niveles incrementados de NOR-1, por una relación causal inductora o simplemente por una asociación, que pertenece, entre otras, al siguiente grupo: aterotrombosis (Woof N, Davies MJ. Interrelationship between atherosclerosis and thrombosis. In: Thrombosis in Cardiovascular Disorders. Edited by V. Fuster and M. Verstraete. WB Sanders Company. Harcourt Brace Jovanovich, Inc. Philadelphis 1992), arteriosclerosis "acelerada" (restenosis post-revascularización) (Nikol S., Huehns T.Y., Höfling B. Molecular biology and post-angioplasty restenosis. Atherosclerosis 1996;123:17-23), arteriosclerosis espontánea en sus diferentes manifestaciones [enfermedad arterial coronaria (CAD), enfermedad aortica, enfermedad cerebrovascular y arteriopatías periféricas] (Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis. Nature 1993;362:801-809; Lusis AJ. Atherosclerosis Nature 2000;407:233-241), aneurismas y remodelado/degeneración vascular (Ouriel K. Endovascular therapies: an update on aortic aneurysm repair and carotid endarterectomy. J Am Coll Surg. 2002; 195: 549-552) y en general en enfermedades cardiovasculares que cursan con des-diferenciación (Owens GK. Role of alterations in the differentiated state of vascular smooth muscle cells in atherogenesis. In: Atherosclerosis and Coronary Artery Disease.edited by V. Fuster, R. Ross and E.J. Topol. Lippincott-Raven Publisher, Philadelphia, 1996), migración y proliferación (Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91: 2844-2850) o apoptosis de células vasculares (Best P.J.M. et al. Apoptosis: basic concepts and implications in coronary artery disease. Arterioscler Throm Vasc Biol 1999; 19: 14-22) o que causan disfunción endotelial como la hipercolesterolemia (John S, Schmieder RE. Impaired endothelial dysfunction in arterial hypertension and hyperchoelsterolemia: potential mechanisms and
differences.
Descripción de las figuras Figura 1 Identificación de NOR-1 mediante mRNA-DD
A, Análisis mRNA-DD representativo mostrando la inducción de la banda 2 producía por 10% de suero humano, 10 U/mL de trombina y 5 nmol/L de PDGF (después de 1 h de estimulación). B, Análisis mediante Northern blot de CML de arteria coronaria porcina quiescentes versus estimuladas utilizando como sondas el ADNc regulado diferencialmente (banda 2) o c-fos. rRNA, ARN ribosomal. C, Northen blot de CML de arteria coronaria porcina quiescentes versus estimuladas (1 h con suero) utilizando como sondas el ADNc de la banda 2 (izquierda) o pNOR- 1\alpha (derecha). D, cinéticas de inducción de NOR-1 por suero en CML de coronaria humana. E, Niveles de RNAm de NOR-1 en CML de coronaria humana estimuladas con suero en presencia o ausencia de cicloheximida (CHX) durante diferentes tiempos. NI, células no inducidas.
Figura 2 Expresión de NOR-1 en CMLV humanas
Niveles de RNAm en CMLV de coronarias humanas estimuladas con factores de crecimiento y citocinas durante 1 h. A, Se muestra un Northen blot representativo (n=3). [rRNA, ARN ribosomal; bFGF, factor de crecimiento básico de fibroblastos; TGF\beta, factor de crecimiento transformante beta; IL-1\beta, interleucina-1 beta; TNF-\alpha, factor necrosante de tumores-alfa]. NI, células no inducidas.
Figura 3 Vías de señalización involucradas en la inducción de NOR-1
A, Northern blot mostrando la expresión de NOR-1 en CML de coronaria humana estimuladas con PMA o con el ionóforo de calcio A23187 durante 1 h, y el efecto de inhibidores de diferentes vías de señalización. Se muestra un experimento representativo (n=3). [GF, GF-109203X]. B, EMSA mostrando el incremento de la unión de extractos nucleares de células tratadas con suero a una sonda que contiene un elemento NBRE consenso y el efecto de GF-109203X y BAPTA (un quelante de calcio). Se muestra la competición de la unión por un exceso (5 y 50 veces) de sonda fría. Las flechas indican las bandas de retardación. [Probe(-NE), sonda NBRE sin extractos nucleares]. NI, células no inducidas.
Figura 4 Mecanismos involucrados en la inducción de NOR-1
A, Western blot mostrando el efecto del suero (después de 10 min) sobre la fosforilación de CREB en la serina^{133} (CREB-P) y el efecto de los inhibitorios GF-109203X y BAPTA. En el panel inferior se muestran los niveles totales de CREB. B, EMSA mostrando la capacidad de unión de extractos nucleares de CMLV humanas a la sonda Nor/3CRE. Se muestra el efecto de cantidades crecientes de sonda fría (5 y 50 veces). Se muestra la banda de super-retardación producida por anticuerpos anti-CREB pero no por anticuerpos anti-c-Fos o anti-c-Jun. [Probe(-NE), sonda Nor/CRE sin extractos nucleares]. C, Efecto de 10% de suero, GF-109203X y BAPTA sobre los niveles de NOR-1 en células NIH-3T3. D, El suero incrementa la actividad del promotor de NOR-1 en células transfectadas con el promotor nativo (pNOR\alpha/-1703) pero no en aquellas transfectadas con el promotor en el que se mutaron los tres elementos CRE [pNOR\alpha/-1703-(M)]. Se muestra el efecto producido por la inhibición de la PKC y la movilización de calcio. La actividad luciferasa fue normalizada por la actividad \beta-galactosidasa y fue calculada como porcentaje de la actividad de pNOR\alpha/-1703 en células tratadas con suero. NI, células no inducidas.
Figura 5 Expresión de NOR-1 en tejidos porcinos
Northen blot mostrando los niveles de RNAm de NOR-1 y Nur77 en tejidos porcinos. Se muestra un experimento representativo (n=3). [rRNA, ARN ribosomal].
Figura 6 Expresión de miembros de la familia NGFI-B en arterias humanas y porcinas
A, Expresión de NOR-1 y Nur77 en arterias humanas de pacientes con aneurisma aórtico, cardiopatía dilatada idiopática (DIC) y enfermedad arterial coronaria (CAD). [A, íntima/media de aorta; C, intima/media de arterias coronarias no ateroscleróticas; C_{AT}, íntima/media de arterias coronarias ateroscleróticas]. B, Regulación de NOR-1 y Nurr1 por angioplastia con balón. Expresión de NOR-1 y Nurr1 en arterias porcinas dilatadas con balón. Experimento representativo mostrando dos arterias dilatadas en cada tiempo. [PTCA, angioplastia coronaria percutánea transcutánea]. C, in situ RT-PCR mostrando la inducción de NOR-1 en CML de la media después de PTCA. Cortes seriados de arterias dilatadas (a-c) y no dilatadas (d-f); b y e corresponden a controles negativos de RT-PCR; c y f corresponden a tinciones de hematoxilina-eosina. Barra=50 \mum.
Figura 7 Oligonucleótidos antisentido contra NOR-1 inhiben la síntesis de ADN y la reparación tisular en CML de coronaria humana
A, CMLV quiescentes fueron estimuladas con 10% de suero humano durante 24 h y se determinó la incorporación de [^{3}H]timidina en ausencia (barras blancas) o presencia de concentraciones crecientes (\mumol/I) de ODNs antisentido (AS_{1}-NOR, barras negras).
Se muestra el efecto del correspondiente secuencia "sentido" (SE_{1}-NOR, 10 \mumol/L) (barras rayadas); (n=4 experimentos realizados en triplicado). B, Efecto de los oligonucleótidos sobre los niveles de RNAm de NOR-1 analizados mediante RT-PCR 3 h después de la estimulación con suero. [AS-FOS, ODNs antisentido contra c-fos]. C, Perfiles representativos del análisis mediante citometría de flujo de CMLV humanas quiescentes (línea negra), estimuladas con suero (línea roja) y tratadas con AS_{1}-NOR (línea azul). D, Oligonucleótidos antisentido contra NOR-1 inhiben la reparación tisular después de daño mecánico de CML de coronaria humana. CML confluentes/quiescentes fueron raspadas y después incubadas durante 72 h en ausencia (Control) o presencia de oligonucleótidos (10 \mumol/L). El histograma muestra el número de células en la zona denudada (n=3 experimentos realizados en triplicado). En E se muestran los datos representativos correspondientes a las células tratadas con AS_{1}-NOR y controles. Las flechas indican el margen de la "herida". [ODNs, oligonucleótidos; AS-, antisentido; SE-, sentido]; (*, p<0.05 versus controles o células tratadas con la correspondiente secuencia sentido). NI, células no inducidas.
Figura 8 Inducción de NOR-1 por lipoproteínas y mitógenos en células endoteliales humanas y por lipoproteínas en CMLV
A y B, niveles de ARNm de NOR-1 en células endoteliales humanas (HUVEC) (A) y en CMLV de coronaria humana (B) en respuesta a concentraciones crecientes de LDL o HDL (\mug/mL). Se muestran los niveles de GAPDH sutilizados para normalizar el resultado. Como control se muestra el efecto de 10% suero humano. C, Niveles de mRNA de NOR-1 de HUVEC y células endoteliales porcinas (PAEC) en cultivo activadas con 10% suero humano o trombina (10 U/mL). Se muestra un experimento representativo (n=3) de los niveles de ARNm determinados mediante RT-PCR. NI, células no inducidas.
Figura 9 Inducción de NOR-1 en monocitos/macrófagos
Niveles de mRNA de NOR-1 en monocitos/macrófagos humanos en cultivo activados con 10% suero humano, PDGF-BB (5 nmol/L), trombina (10 U/mL) y un inductor de la PKC (PMA 5 \mumol/L). Se muestran los niveles de GAPDH sutilizados para normalizar el resultado. Se muestra un experimento representativo (n=3).
Ejemplos de realización
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
Ejemplo 1 El factor de transcripción NOR-1 es inducido en CMLV por mitógenos mediante mecanismos dependientes de CREB 1.1. Análisis mediante DD/RT-PCR de CMLV
Para identificar nuevos genes involucrados en la activación de las CMLV se estimuló CMLs de arteria coronaria porcina con mitógenos como el suero, PDGF o trombina y se analizó la expresión génica diferencial mediante análisis mRNA-DD. El modelo porcino es un modelo, que por su gran similitud con el ser humano, es comúnmente aceptado en el estudio de diferenciación de CMLV y en arteriosclerosis (Badimon, L. Atherosclerosis and thrombosis: lessons from animal models. Thromb Haemost. 2001; 86, 356-365). Se aisló un total de 23 bandas reguladas diferencialmente al menos por uno de los inductores utilizados. El análisis de la secuencia de dichas bandas reveló que sólo una de ellas presentaba identidad significativa con genes descritos previamente. La banda-23, inducida por suero y PDGF, correspondía a la trombospondina-1. La banda-2 (1010 bp) (Figura 1A), reconoció un transcrito de 5,7 kb inducido tempranamente por suero, PDGF y trombina (Figura 1B y 1C, panel de la izquierda). La secuencia de nucleótidos de la banda 2 compartía un alto nivel de homología con la región 3'-no-traducida de los miembros de la familia NGFI-B de receptores nucleares huérfanos: NOR-1 (Ohkura N, Hijikuro M, Yamamoto A, Miki K. Molecular cloning of a novel thyroid/steroid receptor superfamily gene from cultured rat neuronal cells. Biochem Biophys Res Common. 1994; 205: 1959-1965; Hedvat CV, Irving SG. The isolation and characterization of MINOR, a novel mitogen-inducible nuclear orphan receptor. Mol Endocrinol. 1995; 9: 1692-1700), Nur77 (Hazel TG, Nathans D, Lau LF. A gene inducible by serum growth factors encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Proc Nat Acad Sci USA. 1988; 85: 8444-8448; Milbrandt J. Nerve growth factor induces a gene homologous to the glucocorticoid receptor gene. Neuron. 1988;1:183-188) y Nurr1 (Law SW, Conneely OM, DeMayo FJ, O'Malley BW. Identification of a new brain-specific transcription factor, Nurr1. Mol Endocrinol. 1992; 6: 2129-2135).
1.2. Aislamiento de clones de DNAc de secuencia completa
El marco abierto de lectura (ORF) del clon \lambdaSsNor32 (sometido al GenBanK/EMBL Nº. de acceso AJ011767) codifica para un polipéptido de 643 residuos aminoacídicos, que entre los receptores mencionados anteriormente, exhibió el mayor nivel de homología con secuencias de NOR-1\alpha. La larga región 3'-non-traducida (3072 bp) de este ADNc (pNOR-1 \alpha) contiene 9 copias de la secuencia ATTTA, típica de ARNm de vida corta. El clon \lambdaSsNor83 (sometido al GenBank/EMBL Nº de acceso AJ011768) exhibe un ORF codificante para un polipéptido de 446 residuos aminoacídicos (pNOR-1 \beta) que no contiene la región C-terminal correspondiente al dominio de unión a ligando. Alineamientos de la secuencia de aminoácidos de pNOR-1\alpha y pNOR-1 \beta con sus homólogas en humanos, rata y ratón reveló una gran identidad, entre el 89% y el 94% para NOR-1\alpha y el 87% para NOR-1\beta. La mayor identidad (100%) fue encontrada en el dominio de unión al ADN. La cremallera de leucinas de la región C-terminal se conserva en los tres miembros de la familia NGFI-B.
En experimentos de Northern blot el ADNc pNOR-1\alpha reconoció dos transcritos (5,7 kb y 4,0 kb) inducidos transitoriamente por suero en CML de arteria coronaria porcina (Figura 1 C, panel d e la derecha) y humana (Figura ID). La inducción del RNAm de NOR-1 no requirió la síntesis de novo de proteína y fue sobre-inducido por cicloheximida (Figura 1E), como se ha descrito previamente en células no vasculares.
1.3. Efecto de factores de crecimiento, citocinas y lipoproteínas sobre la expresión de NOR-1
Los inductores más potentes de NOR-1 fueron el suero, el PDGF y la trombina (Figura 2). El EGF y el IGF-I (sólo detectable en placas sobre-expuestas) también indujeron NOR-1. El IGF-I sinergiza tanto con el PDGF como con la trombina en la inducción de NOR-1, aunque en menor grado que en la inducción de c-fos. El efecto de otros mitógenos, incluyendo lipopolisacárido y la angiotensina–II (datos no mostrados) sobre NOR-1 fue mínimo.
CMLV quiescentes fueron expuestas a concentraciones crecientes de lipoproteínas de baja (LDL) y alta densidad (HDL) obtenidas mediante centrifugación diferencial como hemos descrito previamente (Vidal F, Colomé C, Martínez-González J, Badimon L. Atherogenic concentrations of native low density lipoproteins downregulate nitric oxide synthasemRNA and protein levels in endothelial cells. Eur J Biochem 1998; 252: 378-384) y los niveles de ARNm de NOR-1 se determinaron mediante Northern blot. Las lipoproteínas indujeron NOR-1 con un patrón temporal similar al obtenido con el suero (no se muestran datos).
1.4. Vías de señalización involucradas en la inducción de NOR-1
La inducción de NOR-1 es dependiente de la activación de la proteína quinasa C (PKC): fue inducido por PMA (un activador de la PKC), mientras que GF-109203X (un inhibidor de la PKC) inhibió la inducción de NOR-1 producida por el suero (Figura 2A). El aumento de la expresión de NOR-1 es dependiente también de la movilización de Ca^{2+}: el A23187 (un ionóforo de calcio) indujo NOR-1, mientras que el quelante de calcio EGTA inhibió su expresión. La inducción de NOR-1 producida por el suero también fue inhibida por un inhibidor específico de los receptores acoplados a proteínas G (toxina pertussis) y de la quinasa de la proteína activada por mitógenos (MAPK) (PD98059) (Figura 2A). La toxina pertussis abolió completamente la inducción producida por trombina (datos no mostrados).
Mediante EMSA (Ensayo de Retardación en la Movilidad Electroforética) observamos un incremento de la unión de extractos nucleares procedentes de CMLV estimuladas con suero a una sonda que contiene una secuencia consenso NBRE (un elemento de respuesta a NOR-1), dicho incremento no tuvo lugar cuando se inhibió la activación de la PKC (por GF10920X) o la movilización de Ca^{2+} (por BAPTA) (Figura 3B).
1.5. Participación de CREB en la inducción de NOR-1
CREB fue activada por fosforilación en la Ser^{133} en CMLV inducidas con suero (Figura 4A) y extractos nucleares de CMLV humanas se unen a una sonda (Nor/3CRE) que contiene los tres elementos putativos CRE presentes en el promotor de NOR-1 (de -84 a -41) (Ohkura N, Ito M, Tsukada T, Sasaki K, Yamaguchi K, Miki K. Alternative splicing generates isoforms of human neuron-derived orphan receptor-1 (NOR-1) mRNA. Gene. 1998; 211: 79-85) (Figura 4B). El efecto fue específico (competido por un exceso de sonda fría) y fue super-retardado por anticuerpos contra CREB pero no por anticuerpos contra c-Fos o c-Jun.
El papel de los elementos CRE en la inducción de NOR-1 por suero fue analizado en células NIH-3T3. Como en las CMLV humanas la inducción de NOR-1 producida por el suero en las células NIH-3T3 fue inhibida cuando se bloqueó la activación de la PKC o la movilización de calcio (Figura 4C). En experimentos de transfección la actividad del promotor de NOR-1 fue reducida por BAPTA (un quelante de calcio) y por GF-109203X, y fue inhibida completamente cuando los tres elementos CRE fueron mutados (Figura 4D).
Ejemplo 2 NOR-1 marcador de lesiones patológicas ateroescleróticos 2.1. Expresión de NOR-1 en tejidos adultos
Corazón y músculo esquelético expresan niveles elevados de NOR-1, por el contrario se detectaron bajos niveles en aorta torácica, pulmón y glándulas adrenales, y expresión marginal (sólo detectada en placas sobre-expuestas) en el resto de tejidos porcinos analizados (Figura 5). El patrón de expresión de Nur77, el principal miembro de la familia NGFI-B, fue similar al de NOR-1. Sin embargo, los niveles de expresión de Nur77 fueron menores que los de NOR-1 en el miocardio (en relación a los niveles en músculo esquelético) y superiores en diafragma, aorta torácica, pulmón y glándulas adrenales.
2.2. Expresión de NOR-1 en arterias humanas
Los niveles de RNAm de NOR-1 en arterias no-ateroscleróticas (arterias coronarias y aorta) tanto en pacientes con DIC (cardiopatía dilatada idiopática) como CAD (enfermedad arterial coronaria) fueron bajos o no detectables (Figura 6A). NOR-1 se sobre-expresó en lesiones ateroscleróticas primarias de pacientes con CAD. La expresión de Nur77, detectada en aorta pero no en arterias coronarias de pacientes con DIC, fue inducida en lesiones ateroscleróticas primarias de pacientes con CAD pero en menor grado que NOR-1. En arterias aorta humanas con aneurisma la expresión tanto NOR-1 como Nur77 fue muy elevada.
2.3. Expresión de NOR-1 arterias porcinas dilatadas con balón
Angioplastia coronaria transluminal percutanea (PTCA) induce transitoriamente el RNAm de NOR-1 en arterias coronarias porcinas con un patrón similar al observado en CMLV en cultivo (Figura 6B). Nurr1 también fue inducido transitoriamente después de PTCA (Figura 6B), pero en cambio no se detectó expresión de Nur77 (datos no mostrados). Mediante in situ RT-PCR se determinó que la expresión de NOR-1 se localizaba en CML de la media de las arterias dilatadas (Figura 6C).
Ejemplo 3 Participación de NOR-1 en la proliferación de CMLV 3.1. ODNs antisentido contra NOR-1 inhiben la síntesis de ADN y la progresión del ciclo celular
Secuencias antisentido (AS-NOR) fueron dirigidas contra los dos putativos codones ATG de inicio de la traducción de NOR-1 humano (Ohkura N, Hijikuro M, Yamamoto A, Miki K. Molecular cloning of a novel thyroid/steroid receptor superfamily gene from cultured rat neuronal cells. Biochem Biophys Res Common. 1994; 205: 1959-1965; Hedvat CV, Irving SG. The isolation and characterization of MINOR, a novel mitogen-inducible nuclear orphan receptor. Mol Endocrinol. 1995; 9: 1692-1700). Ambos ODNs antisentido inhibieron eficazmente la incorporación de [^{3}H]timidina en CMLV humanas de forma dosis dependiente. La Figura 7A muestra el efecto de la secuencia AS_{1}-NOR. Los ODNs de NOR-1 sentido no produjeron efecto. Un efecto inhibitorio similar fue producido por concentraciones crecientes de un ODNs antisentido contra c-fos (datos no mostrados), utilizado previamente para analizar el papel de este proto-oncogen en proliferación celular (Leon Y, Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM, Giraldez F, Represa J, Varela-Nieto I. Insulin-like growth factor-I regulates cell proliferation in the developing inner ear, activating glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos expression. Endocrinology. 1995; 136: 3494-3503). Los niveles de RNAm de NOR-1 en las células tratadas con los ODNs antisentido fueron significativamente inferiores que en las células control o en las tratadas con las secuencias NOR-1 sentido o con ODNs anti-c-fos (Figura 7B).
El análisis mediante citometría de flujo de la distribución de las fases del ciclo celular reveló una reducción significativa del ingreso en la fase S después de la estimulación con suero (40% y 42% con AS_{1}- y AS_{2}-NOR respectivamente) y un aumento paralelo en las células en fase G1. La figura 7C muestra perfiles de FACS representativos correspondientes a CMLV humanas con y sin AS_{1}-NOR. ODNs NOR-1 sentido no produjeron ningún efecto en la distribución del ciclo celular. Un efecto similar fue producido por ODNs antisentido contra c-fos (41% de reducción en la entrada de células en la fase S y un incremento similar en el número de células en fase G1).
3.2. ODNs antisentido contra NOR-1 inhiben el crecimiento de las CMLV humanas inducido por lesión
En un sistema in vitro de reparación de lesión validado previamente (Lowe HC, Fahmy RG, Kavurna MM, Baker A, Chesterman CN, Khachigian LM. Catalytic oligodeoxynucleotides define a key regulatory role for early growth response factor-1 in the porcine model of coronary in-stent restenosis. Cir Res. 2001; 89: 670-677) AS_{1}- o AS_{2}-NOR inhibieron significativamente la invasión de la zona denudada en un 45% y 46% respectivamente (Figura 7D). Por el contrario, concentraciones equivalentes de ODNs NOR-1 sentido no modularon este proceso. El efecto producido por los ODNs contra NOR-1 fue similar al producido por los ODNs contra c-fos. La Figura 7E muestra una imagen representativa de CMLV humanas sometidas a este proceso en presencia de AS_{1}-NOR-1.
Ejemplo 3 El factor de transcripción NOR-1 es inducido en monocitos/macrófagos activados por factores mitogénicos
Monocitos humanos aislados mediante elutriación (Sanderson RJ et al. Isolation and enumeration of peripheral blood monocytes. J Immunol 1977;118:1409-1414) fueron incubados 24 horas en placas multipocillo y posteriormente se expusieron durante 1 h a diferentes inductores [suero humano, PDGF-BB, trombina, y un inductor de la PKC (PMA)] y se determinó los niveles de ARNm de NOR-1 mediante RT-PCR como se ha indicado previamente (Figura 8).
Ejemplo 4 NOR-1 es inducido por lipoproteínas en células endoteliales humanas y por factores de crecimiento en monocitos/macrófagos humanos 4.1. NOR-1 es inducido en células endoteliales por lipoproteínas de baja densidad (LDL) y factores mitogénicos
Concentraciones crecientes de lipoproteínas de baja (LDL), pero no de lipoproteínas de alta densidad (HDL), indujeron los niveles de ARNm de NOR-1 en células endoteliales humanas de cordón umbilical (HUVEC) (Figura 8A). En CMLV tanto las LDL como las HDL indujeron la expresión de NOR-1 (Figura 8B). El 10% suero y la trombina (10 U/mL) también indujeron la expresión de NOR-1 tanto en HUVEC como en células endoteliales de arteria aorta porcina (PAEC) (Figura 8C). En estos experimentos las células endoteliales en estado de semiconfluencia, cultivadas en medio de bajo contenido en suero, fueron inducidas con concentraciones crecientes de lipoproteínas o el resto de inductores durante 1 h.
4.2. NOR-1 es inducido por factores de crecimiento en monocitos/macrófagos humanos en cultivo
Monocitos humanos fueron incubados 24 horas en placas multipocillo y posteriormente se expusieron durante 1 h a diferentes inductores [10% suero humano, 5 \mumol/L PDGF-BB, 10 U/mL de trombina, y un inductor de la PKC (PMA, 5 \mumol/L)] y se determinó los niveles de ARNm de NOR-1 mediante RT-PCR. En la figura 9 se muestran los niveles de expresión de NOR-1 alcanzados en estas células expuestas a los distintos inductores.
En la siguiente sección de Materiales y Métodos se identifican las células, plásmidos, secuencias antisentido, oligonucleótidos y animales utilizados en dichos Ejemplos así como los métodos para evaluar la expresión de las proteínas de interés de la presente invención NOR-1 y Nur77 (Northern blot, in situ RT-PCR, EMSA), western blot, la técnica de angioplastia, técnica de lesión de CMLV y el análisis estadístico.
Materiales y métodos Cultivo de células
Las CMLV fueron obtenidas por la técnica de explantes a partir de arterias coronarias de humanas y porcinas (Martínez-González J, Viñals M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135: 213-223). Las células fueron cultivadas como se ha descrito previamente y en los experimentos se usaron células comprendidas entre el 2º y el 5º pasaje. Las células se sembraron en placas multi-pocillo y cuando llegaron a confluencia se indujo quiescencia incubándolas 48 horas en medio con un 0,4% de suero fetal de ternera (SFT). Las células quiescentes fueron estimuladas con 10% de suero humano o con 5 nmol/L del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (Platelet-Derived Growth Factor-BB, PDGF-BB) (Amersham-Pharmacia), 10 U/mL de \alpha-trombina (Diagnostica-Stago), 10 nmol/L del factor de crecimiento semejante a la insulina-1 (Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1) (Sigma), 1 \mumol/L de insulina (Novo-Nordisk), 10 nmol/L del factor de crecimiento epidérmico (Epidermal growth factor, EGF) (Amersham-Pharmacia), 25 nmol/L del factor de crecimiento básico de fibroblastos (basic Fibroblast Growth Factor, bFGF) (Amersham-Pharmacia), 5 nmol/L del factor de necrosis tumural-\alpha (Tumor Necrosis Factor-\alpha, TNF-\alpha) (Amersham-Pharmacia), 5000 U/mL de interleucina-1\beta (IL-1\beta) (Amersham-Pharmacia), 0,1 nmol/L del factor de crecimiento transformante beta (Transforming Growth Factor, TGF\beta) (Amersham-Pharmacia) o por concentraciones crecientes de A23187 (Alexis) y 4-\beta-forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (Sigma) en distintos experimentos. Cuando se utilizaron inhibidores, las CMLV fueron preincubadas 30 minutos antes del estimulo. Los inhibidores usados fueron: 1 \mug/mL de toxina pertussis (Sigma), 50 \mumol/L de PD98059 (Sigma), 15 [\mumol/L del éster acetoximetil del ácido 1,2-bis(2aminofenoxy)etano-N,N,N',N'-tetrakis etraacetico (BAPTA-AM) (Sigma) o concentraciones crecientes de GF-109203X (Sigma) o EDTA.
Las células endoteliales humans de cordón umbilical (HUVEC) y de arteria aorta porcina (PAEC) fueron obtenidas mediante el método de digestión con colagenasa y cultivadas según hemos describimos previamente (Martínez-González J, Raposo B, Rodríguez C, Badimon L. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibition prevents endothelial NO synthase downregulation by atherogenic levels of native LDLs. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:804-809).
Los monocitos humanos fueron obtenidos mediante elutriación a partir de concentrados de células blancas de acuerdo con metodologías descritas previamente (Sanderson RJ et al. Isolation and enumeration of peripheral blood monocytes. J Immunol 1977; 118: 1409-1414).
Los inhibidores no produjeron ningún efecto en la morfología celular, apoptosis celular (analizada por tinción con el colorante Hoesch 33258) o en la viabilidad celular analizada con un kit comercial la actividad deshidrogenasa mitocondrial (XTT based assay for cell viability, Roche).
Análisis mRNA-DD
Se aisló el RNA total de la C MLV procedentes de la túnica media de arterias coronarias porcinas, quiescentes o estimuladas 1 hora con 10% de suero humano, 10 U/mL de \alpha-trombina o 5 nmol/L de PDGF-BB utilizando QuickPrep™ (Amersham-Pharmacia). El análisis mRNA-DD fue realizado con el Delta™ RNA fingerprinting Kit (Clontech) tal como esta descrito (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274). Las bandas diferenciales fueron clonadas en el vector pGEM-T™ (Promega) y secuenciadas con el ABIPrism dRhodamine Terminator Sequencing kit (Perkin Elmer).
Análisis de la librería de ADNc
La banda número 2 identificada por mRNA-DD fue utilizada como sonda para el análisis en una librería de ADNc en \lambdaZAPII (Stratagene) preparada a partir de ARNm de CML de arterias coronarias porcinas (estimuladas con suero humano durante 1 hora). En un análisis de 1x10^{6} colonias se identificaron 101 clones positivos, los cuales fueron caracterizados por mapeo con enzimas de restricción. Los clones \lambdaSsNor32 y \lambdaSsnor83 se subclonaron para los posteriores análisis. La secuencia de nucleotidos se obtuvo por secuenciación automática de ambas hebras del ADNc. Los alineamientos múltiples de proteína se obtuvieron usando el servicio ClustalW del Instituto Europeo de Bioinformática.
Análisis mediante Northern blot
El RNA total se obtuvo como se ha explicado anteriormente y se analizó mediante Northern blot como esta descrito previamente (Martínez-González J, Viñals M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135: 213-223). Como sondas se utilizaron el ADNc de NOR-1\alpha, un ADNc de rata de c-fos y un ribosomal ADNc (para normalizar las membranas).
Ensayo de retardación en la movilidad electroforética (EMSA)
Se utilizaron extractos nucleares (3 \mug) de CMLV humanas y las sondas de doble cadena correspondientes a la secuencia del promotor humano de NOR-1 (de -84 hasta -41; Nor/3CRE), la cual contiene los tres sitios CRE o una sonda que contiene una secuencia consenso NBRE, tal como esta descrito (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274). Los experimentos de super-retardación se realizados usando anticuerpos contra CREB, c-Fos y c-Jun (Santa Cruz Biotechnology).
Análisis de Western blot
Se analizaron por Western blot los niveles de CREB (de las formas fosforilada y desfosforilada) en extractos celulares provenientes de CMLV (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274) usando anticuerpos específicos (Santa Cruz Biotechnology).
Construcción de los plásmidos del promotor de NOR-1
El plásmido pNOR\alpha/-1703 que contiene el promotor humano de NOR-1 (de -1703 a +264) nos fue gentilmente cedido por el Dr. N. Ohkura. La mutagenesis dirigida sobre los tres posibles sitios CRE presentes en el promotor de NOR-1 fueron realizada con el QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Los cambios introducidos en la secuencia de la construcción mutante [pNOR\alpha/-1703-(M)] fueron> (-79) TGcatcAGCGTCCCATGcatgCACATTGcgt
aCT(-46) (SEQ ID NO1) (los cambios se indican por las letras en minúsculas). La nueva secuencia se analizó mediante programas de análisis de promotores para confirmar que no se habían creado nuevos elementos de respuesta.
Transfección transitoria y ensayo con luciferasa
Las células NIH-3T3 fueron transfectadas con vectores de expresión de luciferasa utilizando el sistema Nucleofactor™ (Amaxa Biosystems) siguiendo las especificaciones del fabricante. Se indujo quiescencia en las células transfectadas incubándolas 36 horas en un medio con un 0,4% de SFT y posteriormente se estimularon con suero durante 4 horas. La actividad luciferasa se determinó en los lisados celulares con un luminometro. Se utilizó el pSV\beta-gal (Promega) como control interno.
Muestras de arterias humanas
Se obtuvieron muestras de aortas y arterias coronarias de corazones transplantados provenientes de pacientes humanos con cardiomiopatía idiopática (DIC) o de CAD. Las arterias coronarias fueron examinadas a bajo aumento y clasificadas en dos categorías: áreas con lesiones ateroscleroticas y áreas sin lesión aterosclerotica. El estudio y todas las muestras humanas siguieron las directrices internas y fue aprobado por el Comité de Etica del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.
Angioplastia en el modelo porcino
Se seleccionaron cerdos Yorkshire-Albino (peso corporal de 30-35 Kg) para realizar las angioplastias. El manejo, mantenimiento y cuidado de los animales, así como los procedimientos realizados en este estudio fueron realizados siguieron las directrices institucionales así como las directrices de la Asociación Americana del Corazón (American Heart Assciation) para la investigación con animales. La metodología para la angioplastia con balón coronaria ha sido ampliamente descrita.^{13} Las lesiones coronarias fueron realizadas inflando tres veces a 8 atmósferas un catéter balón (Cordis) de 4,0x20,0 mm. Una vez finalizada la angioplastia los animales fueron sacrificados a 1, 2, 4 y 6 horas (n=20). Este procedimiento de angioplastia produce una sobre extensión de la arteria causando un severo daño.
Análisis de la expresión génica en arterias humanas y porcinas
La expresión de NOR-1, Nur77 y Nurrl fue analizada por RT-PCR. Los oligonucleotidos específicos utilizados fueron NOR-1 5'-AGGGCTGCAAGGGCTTTTTCAAGAGA-3' (SEQ ID NO2) y 5'-TGCTTTCTACAGGAGCTGCT-3' (SEQ ID NO3); Nur77, 5'-CCACAGCCTCCAGCCTTTT-3' (SEQ ID NO4) y 5'-TTTCGCCGCCTCTTGTCCAC-3' (SEQ ID NO5); Nurr1, 5'-CTCCCGCCTCTCCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO10) y 5'-TTGGTCGGCTTTGGGCAGGT-3' (SEQ ID NO11). Los niveles de la gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH) se utilizaron para normalizar I os resultados (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88: 268-274). La amplificación se realizó a 24 (NOR-1, Nur77 y Nurrl) o 22 (GAPDH) ciclos: desnaturalización, 94ºC durante 30 s: anillamiento a 61ºC (NOR-1, Nurrl y GAPDH) o 55ºC (Nur77) durante 1 minuto y polimerización, 72ºC durante 1 min. 30 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se resolvieron en geles de agarosa, se transfirieron a membranas de nylon (Schleicher & Schuell) y se detectaron tal como esta descrito (Rodríguez C, Martínez-González J, Sánchez-Gómez S, Badimon L. LDL downregulate CYP51 in vascular endothelial cells and in the arterial wall through a SREBP-2 dependent mechanism. Circ Res. 2001; 88:268-274).
In situ RT-PCR
La in situ RT-PCR se realizó en especímenes sometidos a PTCA usando el EZ rTth RNA PCR Kit™ (Perkin Elmer) según el protocolo del fabricante. Los cebadores usados para amplificar el ARNm fueron: 5'-GATGCTATCCCAGCAGGAAA-3' (SEQ ID NO 8) y 5'-CATCAAGAACGGCCAAAAT-3' (SEQ ID NO9). La amplificación se realizó durante 25 ciclos y las condiciones de anillamiento especificas fueron 55ºC durante 90 s. Los productos de PCR marcados con dioxigenina se detectaron usando un sistema acoplado a la fosofatasa alcalina y NBT/BCP.
Determinación de la síntesis de ADN y de la distribución del ciclo celular
CML de arteria coronaria humanas quiescentes se indujeron con 10% de suero humano en medio de cultivo con 0,5 \muCi/mL de [^{3}H]timidina en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de oligodeoxinucleótidos fosforotioados (ODNs) y se determinó la incorporación de [^{3}H]timidina cómo se ha descrito (Martínez-González J, Viñals M, Vidal F, Llorente-Cortés V, Badimon L. Mevalonate deprivation impairs IGF-I/insulin signaling in human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1997; 135: 213-223). El efecto de los ODNs sobre el ciclo celular se analizó mediante citometria de flujo como se ha descrito (Darzinkiewic Z, Juan G. Nucleic acid analysis. In: Robinson JP. ed. Current Protocols in Cytoretry. New York, John Wiley and Sons, Inc. 1997: 1-24). Los ODNs antisentido utilizados fueron: NOR-1 antisentido-1 (AS_{1}-NOR; 5'-TTGGACGCAGGGCAT-3') (SEQ ID NO 6) y antisentido-2 (AS_{2}-NOR; 5'-GCTGCCAAGGTCCAT-3') (SEQ ID NO 7), complementarios de los nucleótidos 732 a 746 y 849 a 863 del RNAm de NOR-1 humano (Nº de acceso NM-006981) respectivamente. Como controles se utilizaron las correspondientes secuencias sentido y ODNs antisentido contra c-fos, utilizados previamente para analizar el papel de este proto-oncogen en proliferación celular (Leon Y, Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM, Giraldez F, Represa J, Varela-Nieto I. Insulin-like growth factor-I regulates cell proliferation in the developing inner ear, activating glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos expression. Endocrinology. 1995; 136: 3494-3503).
Lesión de CMLV in vitro
La capacidad de los ODNs antisentido de inhibir la reparación tisular de las CMLV después de lesión mecánica fue analizada en CML de arteria coronaria humana en cultivo como se ha descrito previamente (Lowe HC, Fahmy RG, Kavurna MM, Baker A, Chesterman CN, Khachigian LM. Catalytic oligodeoxynucleotides define a key regulatory role for early growth response factor-1 in the porcine model of coronary in-stent restenosis. Cir Res. 2001; 89: 670-677). Brevemente, CML de arteria coronaria humana en estado de confluencia y quiescentes fueron raspadas y después se incubaron durante 72 h a 37ºC en presencia y ausencia de los O DNs indicados previamente. Las células se fijaron y tiñeron con azul de metileno. Las imágenes fueron digitalizadas mediante una cámara Sony 3CCD y se determinó en número de células en la zona denudada.
Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como la media\pmEEM. Para los análisis se utilizó el programa Stat Viev™ II (Abacus Concepts) para ordenador Macintosh. Se compararon múltiples grupos mediante un factor ANOVA, seguido del test de Fisher PLSD para determinar diferencias específicas entre grupos.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
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<120> PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE NOR-1 (NEURON-DERIVED ORPHAN RECEPTOR-1), NUEVA DIANA DIAGNÓSTICA Y TERAPÉUTICA DE ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES
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<130> NOR-1
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<160> 11
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Oligo NOR-1
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<400> 1
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26 
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<210> 2
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
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<223> Oligo NOR-lb
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<400> 2
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20 
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<210> 3
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<223> Oligo Nur77 a
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19 
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<211> 20
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<223> Oligo Nur77 b
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20 
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<223> Secuencia pNORa/-1703-(M)
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<400> 5
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34 
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<223> Oligo NOR-1 antisentido-1
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<223> NOR-1 antisentido-2
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<223> Oligo NOR-1 in situ RT-PCR a
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<223> Oligo NOR-1 in situ RT-PCR b
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catcaagaac ggccaaaat 
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<223> Oligo Nurr1 a
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<212> DNA
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<223> Oligo Nurr1 b
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ttggtcggct ttgggcaggt 
\hfill
20

Claims (4)

1. Procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nurr1 en muestras biológicas de mamíferos, preferentemente humanos, para el diagnóstico, seguimiento de enfermedades cardiovasculares que cursan con activación de NOR-1 o para la monitorización, seguimiento o evaluación de la eficacia de tratamientos farmacológicos de dichas enfermedades cardiovasculares, caracterizado porque comprende las siguientes partes:
a)
obtención de la muestra biológica mediante extracción sanguínea o intervención intravascular, y
b)
identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nurr1 en dicha muestra biológica, donde un resultado positivo o incrementado respecto a un nivel basal considerado fisiológico indicará existencia de una enfermedad cardiovascular que cursa con activación de proteínas de la familia NGFI-B, o donde la comparación de los niveles de NOR-1 determinados a lo largo del tiempo indicarían la evolución de la enfermedad cardiovascular o si, por ejemplo, el tratamiento administrado para dicha enfermedad presenta algún efecto terapéutico.
2. Procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nurr1 según la reivindicación 1 caracterizado porque la identificación de NOR-1 se realiza mediante la determinación de los niveles de expresión de NOR-1 humano, en cualquiera de sus dos isoformas alfa y beta, y/o de Nur77 y/o de Nurr1, ya sea de su ARN mensajero o de las proteínas correspondientes.
3. Procedimiento de identificación de NOR-1 y/o Nur77 y/o Nurr1 según la reivindicación 1 caracterizado porque la muestra biológica consiste en corporales como la sangre (especialmente en sus constituyentes celulares), células vasculares así como muestras de tejidos periféricos.
4. Procedimiento de identificación de NOR-1 según la reivindicación 1 caracterizado los métodos utilizados para la determinación de niveles de RNAm pertenecen, entre otros, al siguiente grupo: RT-PCR, Northern blot, DNA arrays o biochips de DNA o oligonucleótidos, hibridación in situ o in situ RT-PCR; o de niveles de proteínas mediante anticuerpos policlonales o monoclonales que reconozcan a NOR-1 como, entre otros, Western blot, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica y biochips de proteínas.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110237087A (zh) * 2019-07-25 2019-09-17 上海交通大学医学院附属瑞金医院 核糖体s6激酶抑制剂sl0101在制备治疗心血管疾病药物中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARIN E et al. "Protective function of transcription factor TR3 orphan receptor in Atherogenesis: decreased lesion formation in carotid artery ligation model in TR3 transgenic mice". Circulation, 17 Sep 2002, Vol. 106, Nº 12, páginas 1530-1535. *
MARUYAMA K et al. "Expression of the putative transcription factor NOR-1 in the nervous, the endocrine and the immune systems and the developing brain of the rat". Neuroencocrinology, 1997, Vol. 65, páginas 2-8. *
OHKUBO T. et al. "Early induction of the orphan nuclear receptor NOR-1 during cell death of human breast cancer cell line MCF-7". Mol. Cell Endocrinol., Abril 2000, Vol. 162, Nº 1-2, páginas 151-156. *
OHKURA N et al. "Structure, mapping and expression of a human NOR-1 gene, the third member of the Nur77/NGFI-B". Biochim. Biophys. Acta, Sep 1996, Vol. 1308, Nº 3, páginas 205-214. *

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