ES2286911B1 - Procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores del proceso de polimerizacion de filamentos tau tipo phfs y sus aplicaciones. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores del proceso de polimerizacion de filamentos tau tipo phfs y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención presenta un procedimiento de identificación de compuestos reguladores, preferentemente inhibidores, del proceso de polimerización de filamentos tau tipo PHFs, basado en un modelo celular eucariota transformado mediante ingeniería genética, que expresa una forma proteica de tau mutante que se comporta como hiperfosforilada, preferentemente la forma tauVLW, que contiene mutaciones en las posiciones G272V, de P301L, y de R406W. Otros objetos de la presente invención lo constituyen un modelo celular transformado por un sistema o vector de expresión tauVLW, construcciones genéticas tauVLW y los sistemas de expresión tauVLW necesarios para la expresión de dicha proteína tau hiperfosforilada y para la formación de los filamentos tipo PHFs. Estos compuestos podrán ser utilizados en la elaboración de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o de otras enfermedades neurodegenerativas denominadas Taupatías.
Description
Procedimiento de identificación de compuestos
inhibidores del proceso de polimerización de filamentos tau tipo
PHFs y sus aplicaciones
La presente invención se enmarca en el campo de
la biomedicina y en concreto en el área del descubrimiento de
nuevos compuestos terapéuticos de patologías humanas
neurodegenerativas como la Enfermedad de Alzheimer u otras
tautopatías. De forma más particular la patente se refiere a
procedimientos de formación del proceso de polimerización o
ensamblaje de filamentos tau tipo PHF para la elaboración de
procedimientos de identificación de compuestos terapéuticos.
El sistema nervioso (SN) es ciertamente el
órgano más complejo y menos conocido del cuerpo humano. Esto es en
parte debido a su gran número de células, y a la gran variedad de
éstas. No obstante, si sólo considerásemos estos aspectos del SN lo
podríamos comparar con algunos otros sistemas. La característica que
lo hace único, es que en el SN sus componentes celulares
principales, las neuronas, establecen entre sí y con sus dianas
contactos muy precisos que confieren una increíble diversidad
funcional y estructural al sistema. Desgraciadamente, el tejido
nervioso se caracteriza también por su muy limitada capacidad de
reparación y reposición celular. Este hecho conlleva un aumento
progresivo de alteraciones celulares resultando a largo plazo en la
aparición de enfermedades de tipo neurodegenerativo tardío. Así
pues, en sociedades como la nuestra donde el desarrollo sanitario
ha mejorado notablemente la calidad de vida de sus ciudadanos
prolongando su longevidad por encima de los 70-80
años, patologías neurodegenerativas del tipo enfermedad de
Alzheimer, representan una de las más graves preocupaciones
sociales y económicas del presente y futuro.
La enfermedad de Alzheimer fue descrita por
primera vez en 1906 por un psiquiatra alemán, Alois Alzheimer. Esta
enfermedad de aparición esporádica a principios del siglo XX donde
la vida media era de alrededor de 50 años, es hoy en día una de
nuestra grandes preocupaciones sociales dado que aproximadamente el
10% de los mayores de 65 años, y casi el 50% de los mayores de 85
presentan esta patología, caracterizada por un deterioro progresivo
de las funciones cognitivas (demencia). Se trata, por tanto, de una
de las enfermedades con mayor impacto sociosanitario tanto en la
actualidad como en el futuro, y para la cual no existe ningún
tratamiento eficaz.
Desde el punto de vista histopatológico, la
enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de dos
tipos de depósitos proteicos anormales, los ovillos neurofibrilares
y las placas amiloides y, en zonas específicas de la corteza
cerebral de los pacientes y, finalmente, por la atrofia de las
regiones cerebrales afectadas, que resulta de la masiva pérdida de
sinapsis y neuronas.
Tau es una colección de proteínas asociadas a
microtubulos (MAPs) que se expresan desde un único gen en el
cromosoma 17. Recientemente se identificaron numerosas mutaciones
en el gen de tau en pacientes con demencias frontotemporales y
Parkinson ligado al cromosoma 17. Este hecho corrobora genéticamente
la importancia de la implicación de tau en enfermedades como
Alzheimer. Los ovillos neurofibrilares (NFT, del inglés
neurofibrillary tangles) son agregados intracelulares de
filamentos helicoidales apareados (paired helical filaments
PHFs) y filamentos rectos (straight filaments, SFs),
constituidos fundamentalmente por formas hiperfosforiladas de la
proteína tau. Estos filamentos de tau se encuentran no sólo en los
ovillos neurofibrilares sino también en el interior de neuritas
distróficas.
La proteína tau hiperfosforilada se acumula en
el citoplasma de las neuronas afectadas y da origen a la formación
de ovillos neurofibrilares. En este sentido, hay que indicar la
correlación existente entre el número de ovillos neurofibrilares y
el grado de demencia en los pacientes con la enfermedad de
Alzheimer, así como la coincidencia en los patrones de progresión
de la patología de la enfermedad de Alzheimer y los depósitos en
las regiones afectadas. La importancia de la proteína tau está
fuertemente favorecida por el hecho de que los acúmulos de tau
también aparecen, en ausencia de placas amiloides, en otras
enfermedades neurodegenerativas denominadas Taupatías que incluyen:
la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la degeneración
corticobasal (CBD), la enfermedad de Pick (PD) y la demencia
frontotemporal con parkinsonismo ligada al cromosoma 17
(FTDP-17). Además, el descubrimiento de mutaciones
autosómicas dominantes en el gen de tau que están ligadas a
distintas familias con FTDP-17 constituye una
prueba inequívoca de que las alteraciones en la proteína tau son
suficientes para causar una degeneración neuronal en la corteza
cerebral y dar lugar a los síntomas típicos de una demencia.
En consecuencia, se ha propuesto una versión
modificada de la hipótesis de la cascada del amiloide postulando que
la acumulación del péptido \beta-amiloide
induciría la imperforación de la proteína tau, la cual sufriría un
cambio conformacional que llevaría a su agregación y posterior
disfunción y muerte celular. La aparición de taupatías se podría
explicar asimismo por un cambio conformacional en la proteína tau,
que podría ser inducido en estos casos por mutaciones o por otros
factores ambientales (Figura 1).
En el hombre, el gen de la proteína tau se
localiza en el cromosoma 17 y se traduce, en el sistema nervioso
central, en una familia de 6 proteínas derivadas por splicing
alternativo de un transcrito primario común. Las isoformas de tau
difieren en el número de dominios de unión a tubulina que contienen
(de 31-32 aminoácidos); tres en el caso de 3L, 3S y
3, o cuatro en 4L, 4S y 4 en su extremo C-terminal,
o dos (3L, 4L), uno (3S, 4S) o ningún (3, 4) inserto de 29
aminoácidos cada uno en el extremo N-terminal. Los
dos insertos del extremo amino-terminal (1 y 2)
están codificados por el exón 2 y 3 respectivamente. Siendo
aparentemente el exón 10 el que tiene más afinidad por los
heterodímeros de tubulina y el que aumenta la estabilidad
microtubular. Algunos estudios funcionales han indicado que la
proteína tau podría estar implicada en la regulación del ensamblaje
y estabilización de los microtúbulos, principalmente dentro de los
axones neuronales donde la proteína tau es más abundante. La
interacción de tau con los microtúbulos se ve regulada mediante
procesos de fosforilación, a mayor fosforilación, menos tau unida a
microtúbulos.
Por ello, se considera que la fosforilación de
la proteína tau es uno de los mecanismos más importantes que
regulan la dinámica de los microtúbulos, sobre todo en los axones.
A favor de esta hipótesis está el hecho de que la organización y
estabilidad de los microtúbulos en células
no-neurales que expresan tau mediante transfección
se modifica al fosforilarse la proteína tau cuando se realiza una
co-transfección con una proteína quinasa. Además,
la fosforilación de la proteína tau podría modular su asociación a
membranas celulares, pudiendo estar implicada en la modulación de
algunos procesos de transducción de señales.
La fosforilación normal de la proteína tau está
regulada durante el desarrollo del organismo. Así, la proteína tau
se encuentra mucho más fosforilada en el cerebro embrionario y
fetal que en el cerebro de mamíferos adultos. Algo similar se ha
descrito para la fosforilación de otras MAPs. Estos datos han
llevado a la hipótesis de que el estado fosforilado de las MAPs
(incluyendo tau) típico del cerebro embrionario podría ser útil
para mantener unos microtúbulos dinámicos, que son necesarios para
el crecimiento axonal, mientras que el estado desfosforilado típico
del cerebro de mamíferos adultos favorecería una mayor estabilidad
de los microtúbulos, lo cual podría ser importante para la
maduración y el mantenimiento de axones y dendritas.
La proteína tau se hiperfosforila de manera
anormal en los cerebros de pacientes afectados con la enfermedad de
Alzheimer o con taupatias, siendo esta forma alterada de la
proteína el mayor componente de los PHFs y SFs. En cerebros
afectados por la enfermedad de Alzheimer, y otras taupatias, la
forma hiperfosforilada de tau se encuentra tanto en forma soluble
como polimerizada en PHFs y SFs.
La hiperfosforilación de la proteína tau es uno
de los sucesos más tempranos que se observan en los cerebros de los
pacientes con la enfermedad de Alzheimer siendo posiblemente
responsable de la desestabilización de los microtúbulos en las
neuronas afectadas. De hecho, la proteína tau hiperfosforilada
aislada de los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer
no se une a los microtúbulos in vitro, careciendo de la
capacidad de estimular el ensamblaje y la estabilización de los
mismos. Se cree que tau hiperfosforilado presente como proteína
soluble (o micro-agregada) en las neuronas
afectadas en los primeros estadios de la enfermedad sería el
precursor de los agregados fibrilares. Estudios de microscopia
electrónica han revelado que los microtúbulos desaparecen
progresivamente de las neuronas afectadas, siendo reemplazados por
haces de fibras de tau durante el curso de la enfermedad.
Puesto que los microtúbulos están implicados en
el transporte bidireccional de orgánulos entre el cuerpo neuronal y
los terminales sinápticos, la despolimerización de los microtúbulos
causada por la hiperfosforilación de la proteína tau resultaría en
una inhibición del transporte, conduciendo a una degeneración
progresiva de las sinapsis y posterior muerte neuronal. No
obstante, se ha sugerido que la desorganización de los microtúbulos
en la enfermedad de Alzheimer y las taupatias no seria simplemente
la consecuencia de la perdida de la función normal de la proteína
tau, sino que tau hiperfosforilado actuaría también como un
elemento "tóxico" en el citoplasma neuronal. Es decir, la
hiperfosforilación induciría un cambio conformacional en la proteína
tau que llevaría no sólo a la perdida de la función normal de la
misma sino también a una ganancia de una nueva función tóxica. En
este sentido, se ha sugerido que la forma hiperfosforilada de tau,
o micro-agregados de la misma, podrían actuar
secuestrando proteínas celulares. esenciales, causando de esta
manera una progresiva disfunción que finalmente podría llevar a la
muerte celular.
De hecho, se ha demostrado que tau
hiperfosforilado es capaz de interaccionar in vitro con
otras proteínas, incluyendo al tau normal y a otras MAPs,
secuestrándolas en micro-agregados y bloqueando su
asociación a los microtúbulos y, por ello, provocando la
despolimerización masiva de los microtúbulos.
Otra consecuencia importante de la
hiperfosforilación de la proteína tau, y de su consiguiente cambio
conformacional, es su mayor resistencia a la acción de proteasas, lo
cual disminuye su tasa de recambio celular y favorece su
acumulación. Además, se ha demostrado que la hiperfosforilación
también favorece la agregación de la proteína tau. Mientras que la
hiperfosforilación de la proteína tau (que se produciría en
respuesta a la acumulación del péptido
\beta-amiloide) sería responsable del cambio
conformacional de la proteína tau en la enfermedad de Alzheimer, la
aparición de formas mal plegadas de la proteína tau puede ocurrir
en respuesta a otros factores, incluyendo mutaciones en el propio
gen de tau tal y como sucede en los casos de
FTDP-17. El esquema de la Figura 1 ilustra esta
posibilidad. De acuerdo con este esquema, las mutaciones en el gen
de tau y la acumulación de péptido \beta-amiloide
podrían tener un efecto sinérgico, lo cual ha sido comprobado en un
modelo murino transgénico.
La función biológica de la proteína tau se viene
investigando desde hace tiempo. Así por ejemplo, un ratón
deficiente en tau producido mediante "gene targeting" fue
caracterizado (Harada A., Oguchi K., Okabe S., Kuno J., Terada S.,
Ohshima T., Sato-Yoshitake R., Takei Y., Noda T. and
Hirokawa N. (1994) Altered microtubule organization in
small-calibre axons of mice lacking tau protein.
Nature 369, 488-491). Sin embargo, no se observó
ninguna gran diferencia con el ratón original, probablemente,
debido a la redundancia de la función del tau con la de otras
proteínas asociadas a microtubulos neuronales (MAPs) (Ditella M.
C., Feiguin F., Cam N., Kosik K. S. and Caceres A. (1996) MAPIB/TAU
functional redundancy during laminin-enhanced axonal
growth. J Cell Sci 109, 467-477). Así, para un
conocimiento más claro de la función de tau, se han realizado
también numerosos experimentos in vivo, por ejemplo con
células que expresaban tau en cultivos celulares no neuronales. En
células no neuronales transfectadas con el cDNA para tau, se
consiguió la estabilización de los microtubulos, la formación de
haces y la aparición de extensiones citoplasmáticas (Kanai Y.,
Takemura R., Oshima T., Mori H., Ihara Y., Yanagisawa M., Masaki T.
and Hirokawa N. (1989) Ex-
pression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. J Cell Biol 109, 1173-1184; Medina M., Montejo de Garcini E. and Avila J. (1995) The role of tau phosphorylation in transfected COS-1 cells. Mol. Cell. Biochem 148, 79-88).
pression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. J Cell Biol 109, 1173-1184; Medina M., Montejo de Garcini E. and Avila J. (1995) The role of tau phosphorylation in transfected COS-1 cells. Mol. Cell. Biochem 148, 79-88).
Un modelo mas claro para estudiar la acción de
tau en microtúbulos en ausencia de MAPs neuronales ha sido
proporcionado estudiando la expresión del gen de tau desde un
vector baculoviral en células Sf9 de insecto. Esta expresión da
lugar a la formación de extensiones citoplásmicas largas (Knops J.,
Kosik K. S., Lee G., Pardee J. D., Cohen-Gould L.
and McConlogue L. (1991) Overexpression of tau in a nonneuronal cell
induces long cellular processes. J Cell Biol 114,
725-733; Frappier T. F., Georgieff I. S., Brown K.
and Shelanski M. L. (1994) tau regulation of
microtubule-microtubule spacing and bundling. J
Neurochem 63, 2288-2294) que se asemejan a algunas
características de los microtubulos axonales (Baas P. W.,
Pienkowski T. P., Cimbalnik K. A., Toyama K., Bakalis S., Ahmad F.
J. and Kosik K. S. (1994) Tau Confers Drug Stability But Not Cold
Stability to Microtubules iu Living Cells. J Cell Sci 107,
135-143).
Un acercamiento similar fue utilizado para
estudiar la función de otras MAPs (LeClerc N., Kosik K. S., Cowan
N., Pienkowski T. P. and Baas P. W. (1993) Process formation in Sf9
cells induced by the expression of a microtubule associated protein
2C-like construct. Proc Nall Acad Sci U S A 90,
6223-6227; Boucher M., Belanger D., Beaulieu C. and
Leclerc N. (1999) Tau-mediated process outgrowth is
differentially altered by the expression of MAP2b and MAP2c in Sf9
cells. Cell Motility Cytoskel 42, 257-273).
Además, usando el sistema del baculovirus se
observó que la sobreexpresión de la forma normal de tau confería
estabilidad microtubular al tratamiento con determinadas drogas
pero no al frío (Baas P. W., Pienkowski T. P., Cimbalnik K. A.,
Toyama K., Bakalis S., Ahmad F. J. and Kosik K. S. (1994) Tau
Confers Drug Stability But Not Cold Stability to Microtubules iu
Living Cells. J Cell Sci 107, 135-143). También, la
función de la tau mutada en el residuo 337 (V337M) se ha estudiado
con este sistema (Frappier T., Liang N. S., Brown K., Leung C. L,
Lynch T., Liem R. H. K. and Shelauski M. L. (1999) Abnormal
microtubule packing in processes of SF9 cells expressing the
FTDP-17 V337M tau mutation. Febs Left 455,
262-266) pero en este caso no se describió la
formación de polímeros filamentosos.
La proteína tau en forma hiperfosforilada parece
ser el componente principal de las estructuras aberrantes,
filamentos helicoidales pareados (PHFs) encontrados en el cerebro
de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer
(Grundke-Iqbal L, Iqbal K., Quinlan M., Tung Y. C.,
Zaidi M. S. and Wisniewski H. M. (1986)
Microtubule-associated protein tau. A component of
Alzheimer paired helical filaments. J. Biol. Chem. 261,
6084-6089). En las células de insecto Sf9 tau puede
ser fosforilado en algunas sitios que lo son en las formas de tau
aisladas de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (Mailliot C.,
Bussiere T., CailletBoudin M. L., Delacourte A. and Buee L. (1998)
Alzheimer-specific epitope of AT100 in transfected
cell lines with tau: toward an efficient cell model of tau abnormal
phosphorylation. Neurosci Lett 255, 13-16; Biernat
J. and Mandelkow E. M. (1999) The development of cell processes
induced by tau protein requires phosphorylation of serme 262 and
356 in the repeat domain and is inhibited by phosphorylation in the
proline-rich domains. Mol Biol Cell 10,
727-740), Ahora bien, no existe ninguna descripción
acerca de la formación de PHFs mediante la utilización de este
sistema a pesar de que en este sistema tau se puede fosforilar de la
misma manera que en otros.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación y/o determinación de compuestos
reguladores, preferentemente inhibidores, del proceso de ensamblaje
o polimerización de filamentos tau tipo PHFs, basado en un modelo
celular eucariota transformado mediante ingeniería genética, que
expresa una forma proteica de tau mutante que se comporta como
hiperfosforilada, preferentemente la forma tau^{VLW}. que
contiene mutaciones en las posiciones G272V, de P301L, y de R406W
(SEQ ID NO 2).
Otros objetos de la presente invención lo
constituyen un modelo o cultivo celular transformado por un sistema
o vector de expresión tau^{VLW}, que contiene la construcción
genética tau^{VLW} que permite la expresión de la proteína
tau^{VLW} y la formación de los PHFs, construcciones genéticas
tau^{VLW} y los sistemas o vectores de expresión tau^{VLW} (por
ejemplo, el plásmido pFastBac^{VLW}) necesarios para la expresión
de dicha proteína tau hiperfosforilada, en un modelo celular
eucariota, y para la formación de los filamentos o agregados tipo
PHFs, y que contienen, al menos, una secuencia de nucleótidos
codificante de una proteína tau^{VLW}, preferentemente la SEQ ID
NO 1.
Finalmente, otro objeto particular de la
presente invención lo constituye el uso del procedimiento de
identificación y de los distintos objetos necesarios para su
desarrollo de la presente invención (construcciones genéticas,
vectores de expresión y modelos celulares) para la identificación
de nuevos compuestos reguladores. Estos compuestos podrán ser
utilizados en la elaboración de medicamentos para el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer o de otras enfermedades
neurodegenerativas denominadas Taupatías.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que, usando un modelo celular eucariota,
la expresión de una forma mutada, que se comporta como una forma
hiperfosforilada, parece ser esencial para la agregación de tau en
filamentos PHFs similares a los observados en los pacientes con
enfermedad de Alzheimer.
En las condiciones de las pruebas realizadas,
una alta expresión de proteína tau salvaje (tau42) da lugar a la
aparición de extensiones citoplásmicas y a la formación de
agregados amorfos. La expresión de forma proteica tau^{VLM}
también da lugar a la aparición de extensiones citoplasmáticas pero
los agregados encontrados son filamentos de aspecto similar a
aquellos encontrados en pacientes con la enfermedad de Alzheimer
(PHFs). A partir de lo descrito en esta invención se pueden producir
modelos celulares eucariotas mediante su transformación genética
con un gen mutado de tau, que permite que la forma proteica se
encuentre en un estado de hiperfosforilación dando lugar al proceso
de formación de filamentos de tau tipo PHFs, y su uso para el
análisis farmacológico de compuestos que afecten a su formación y/o
eliminación.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación y/o determinación de
compuestos reguladores, preferentemente inhibidores, del proceso de
ensamblaje o polimerización de filamentos tau tipo PHFs, en
adelante procedimiento de identificación de la presente invención,
basado en un modelo celular eucariota transformado mediante
ingeniería genética, que expresa una forma proteica de tau mutante
que se comporta como hiperfosforilada, preferentemente la forma
tau^{VLW}, y que está constituido por los siguientes pasos:
- i)
- preparación de un modelo celular eucariota transformado mediante un sistema o vector de expresión génica tau^{VLW} que contiene una construcción genética tau^{VLW}, que permite la expresión de una forma proteica de tau hiperfosforilada, y la formación de filamentos tau PHFs en condiciones adecuadas,
- ii)
- adición de los potenciales compuestos inhibidores de la polimerización de filamentos tau, objeto del procedimiento de identificación,
- iii)
- determinación del efecto sobre la capacidad de polimerización o ensamblaje de dichos filamentos tau, e
- iv)
- identificación de compuestos inhibidores de la polimerización de filamentos tau en el caso que dicha capacidad de polimerización o ensamblaje los filamentos tau se reduzca o desaparezca.
Tal coma se utiliza en la presente invención el
término "identificación y/o determinación compuestos
reguladores" se refiere no sólo a la identificación de nuevos
compuestos reguladores del proceso de ensamblaje o polimerización de
filamentos tau, preferentemente inhibidores, sino también a la
determinación y comparación de la actividad inhibidora de
compuestos ya conocidos.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "forma proteica de tau que se comporta como
hiperfosforilada", se refiere preferentemente a la forma
tau^{VLW} con las tres mutaciones en las posiciones G272V, de
P301L, y de R406W (SEQ ID NO 2).
El término “construcción genética tau^{VLW}”
tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una
secuencia de nucléotidos, que comprende, al menos, la región
codificante de una forma proteica de tau hiperfosforilada,
preferentemente la proteína tau^{VLW}, y otras secuencias que
permiten la regulación de dicha expresión génica. Por otro lado, el
término "región codificante de una forma proteica de tau
hiperfosforilada" tal como se utiliza en la presente invención
comprende, además de las secuencias de nucleótidos descritas, otras
secuencias análogas a éstas. Tal como se utiliza en la presente
invención el término "análoga" pretende incluir a cualquier
secuencia de ADN que puede ser aislada o construida sobre la base
de la secuencia de nucleótidos codificantes aquí descritas, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.
En general, una molécula de ADN análoga es sustancialmente homóloga
a la secuencia de nucleótidos descrita. En el sentido utilizado en
esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga"
significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un
grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 80%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
En la presente invención el término “sistema de
expresión genica tau^{VLW}” se refiere a un sistema o vector de
expresión génica que comprende la construcción genética tau^{VLW}
de la presente invención con al menos, un promotor que dirige la
transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés
(tau^{VLW}), al que está operativamente enlazado, y otras
secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su
regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de
inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación,
origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de
vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con
las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre
plásmidos, bacmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs),
cromosomas artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs),
cósmidos, o virus, que pueden contener, además, un origen de
replicación bacteriano o de levadura para que pueda ser amplificado
en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para
seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de
interés. Múltiples sistemas o vectores de expresión pueden ser
obtenidos por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor
Laboratory] y forman parte de la presente invención.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el procedimiento de identificación de la presente
invención en el que el modelo celular transformado consiste en un
cultivo de células de insecto, por ejemplo Sf9, transformado por un
sistema de baculovirus recombinante que contiene la construcción
genética tau^{VLW}, que permite la expresión de la proteína
tau^{VLW} y la formación de los PHFs.
Otro objeto particular de la presente invención
es el procedimiento de identificación de la invención en el que la
determinación de la polimerización o autoensamblaje de tau se
realiza mediante el aislamiento de los PHFs y su visualización
posterior mediante inmunomicroscopía electrónica con anticuerpos
adecuados (ver ejemplo 1.2).
Otro objeto particular de la presente invención.
es el procedimiento. de identificación de la invención en el que la
determinación de la polimerización o autoensamblaje de tau se
realiza mediante la determinación cuantitativa de los agregados
PHFs por western blot con anticuerpos adecuados (ver Ejemplo 2,
Figura 7).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un modelo o cultivo celular transformado por un sistema
o vector de expresión tau^{VLW}, que contiene la construcción
genética tau^{VLW} que permite la expresión de la proteína
tau^{VLW} y la formación de los PHFs y que es un elemento
necesario para la realización del procedimiento de identificación
de la presente invención. Una realización particular de la presente
invención lo constituye un modelo o cultivo celular transformado
mediante ingeniería genética que consiste. en cultivo de células de
insecto, preferentemente Sf9, transformado por un sistema de
baculovirus recombinante, que permite la expresión de la proteína
tau^{VLW} y la formación de los PHFs.
De igual forma, son objetos de la presente
invención las construcciones genéticas tau^{VLW} y los sistemas o
vectores de expresión tau^{VLW} (por ejemplo, el plásmido
pFastBac^{VLW}) necesarios para la expresión de dicha proteína tau
hiperfosforilada, en un modelo celular eucariota, y parada
formación de los filamentos o agregados tipo PHFs, y que contienen,
al menos, una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína
tau^{VLW}, preferentemente la SEQ ID NO 1. Esta secuencia SEQ ID
NO 1 es un fragmento de la secuencia de nucleótidos codificante de
la proteína tau^{VLW} (SEQ ID NO 2) que incluye a título
ilustrativo las mutaciones de tau^{VLW}.
Finalmente, otro objeto particular de la
presente invención lo constituye el uso del procedimiento de
identificación y de los distintos objetos necesarios (construcciones
genéticas, vectores de expresión y modelos celulares) para su
desarrollo de la presente invención para la identificación de
nuevos compuestos reguladores, preferentemente inhibidores, de la
polimerización de tau o para la determinación de los niveles de
dicha capacidad inhibidora de compuestos ya conocidos.
Estos compuestos candidatos a ser evaluados como
reguladores del proceso de ensamblaje de tau pueden ser producidos,
por ejemplo por microorganismos como bacterias o levaduras, por
plantas, producidos por síntesis química o por ingeniería genética;
pudiendo ser de origen natural o artificial.
Estos compuestos podrán ser utilizados en la
elaboración de medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer o de otras enfermedades neurodegenerativas denominadas
Taupatias que incluyen: la parálisis supranuclear progresiva
(PSP), la degeneración corticobasal (CBD), la enfermedad de Pick
(PD) y la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligada al
cromosoma 17 (FTDP-17).
Figura
1
La acumulación del péptido
\beta-amiloide induciría la hiperfosforilación de
la proteína tau por alguna de las quinasas conocidas. Como
consecuencia de esto, la proteína tau sufriría un cambio
conformacional que llevaría a su agregación y a la posterior
disfunción y muerte celular.
Figura
2
Se observan células de insecto que expresan la
proteína tau42 (A) y tau mutante tau^{VLW} (B) así como la
formación de extensiones citoplasmáticas. En la figura se aprecia
el resultado de una inmunofluorescencia en la que se utiliza el
anticuerpo anti \alpha-tubulina DM1A.
\newpage
Figura
3
Detalle de la expresión de tau mutante mediante
inmunocitoquimica donde se puede apreciar como algunas células que
sobreexpresan la proteína alterada no forman extensiones
citoplasmáticas con el anticuerpo anti-tau humano
T14.
Figura
4
Semicuantificación mediante inmunodetección con
el anticuerpo anti-tau 7.51 y utilizando un
anticuerpo anti-tubulina como control.
Figura
5
Los paneles A y B muestran microfotografías de
extractos insolubles en sarcosil en el caso de células Sf9 que
expresan la variante normal de tau42 teñidos levemente con el
anticuerpo AT8 (flechas en panel A) y no teñidos con el anticuerpo
7.51 (panel B).
Figura
6
Se utilizan diferentes anticuerpos
anti-tau. Los dos primeros paneles superiores
muestran filamentos PHFs decorados con el anticuerpo AT8 en ausencia
(panel izquierdo) o presencia (panel derecho) del inhibidor de cdk5
butirolactona-I. Los paneles inferiores muestran
filamentos PHFs decorados con los anticuerpos Br133 y Br134.
Figura
7
C, control; Li, Litio y But, butirolactona
I.
Los genes de las diferentes proteínas candidatas
(tau y el mutante triple) se donaron en vectores especiales para su
transposición al genoma de baculovirus como se describe más
adelante. El cDNA correspondiente a la isoforma más larga humana de
tau que contiene el exon 10 y los exones 2 y 3 (Goedert M.,
Spillantini M. G., Jakes R.,
Rutherford D. and Crowther R. A. (1989) Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron 3, 519-526) con o sin mutaciones en las posiciones G272V, de P30IL, y de R406W, fueron digeridos de los vectores de mamíferos pSGT42 y pSGTVLW (Lim F., Hernandez F., Lucas J. J., Gomez-Ramos P., Moran M. A. and Avila J. (2001) FTDP-17 mutations in tau transgenic mice provoke lysosomal abnormalities and Tau filaments in forebrain. Mol Cell Neurosci 18, 702-714) con XbaI y XhoI, e insertados en el plásmido pFastBacl, el vector utilizado para la transposición al genoma de baculovirus de los genes seleccionados, cortado con las mismas endonucleasas de restricción para crear los plásmidos: pFastBacTau^{42} (que contiene la secuencia del cDNA de tau original) y pFastBac^{VLW} (que contiene la secuencia del cDNA para tau con las tres mutaciones descritas anteriormente). Los plásmidos recombinantes fueron utilizados para transformar las células competentes de DH10BAC para la transposición de los genes seleccionados a los vectores con el genoma del Bácmido. Los recombinantes del Bácmido fueron identificados mediante selección en las placas de X-Gal y de IPTG de aquellas colonias que reciben el transposón dentro del fragmento del gen LacZ y el DNA del Bácmido con el inserto apropiado se identificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos del baculovirus y específicos para cada gen. El DNA del Bácmido se aisló, se purificó y se transfectó a monocapas de células de insecto Sf9 mediante la utilización de los reactivos A y B de Pharmingen.
Rutherford D. and Crowther R. A. (1989) Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron 3, 519-526) con o sin mutaciones en las posiciones G272V, de P30IL, y de R406W, fueron digeridos de los vectores de mamíferos pSGT42 y pSGTVLW (Lim F., Hernandez F., Lucas J. J., Gomez-Ramos P., Moran M. A. and Avila J. (2001) FTDP-17 mutations in tau transgenic mice provoke lysosomal abnormalities and Tau filaments in forebrain. Mol Cell Neurosci 18, 702-714) con XbaI y XhoI, e insertados en el plásmido pFastBacl, el vector utilizado para la transposición al genoma de baculovirus de los genes seleccionados, cortado con las mismas endonucleasas de restricción para crear los plásmidos: pFastBacTau^{42} (que contiene la secuencia del cDNA de tau original) y pFastBac^{VLW} (que contiene la secuencia del cDNA para tau con las tres mutaciones descritas anteriormente). Los plásmidos recombinantes fueron utilizados para transformar las células competentes de DH10BAC para la transposición de los genes seleccionados a los vectores con el genoma del Bácmido. Los recombinantes del Bácmido fueron identificados mediante selección en las placas de X-Gal y de IPTG de aquellas colonias que reciben el transposón dentro del fragmento del gen LacZ y el DNA del Bácmido con el inserto apropiado se identificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos del baculovirus y específicos para cada gen. El DNA del Bácmido se aisló, se purificó y se transfectó a monocapas de células de insecto Sf9 mediante la utilización de los reactivos A y B de Pharmingen.
La muestra viral fue recogida después de 96
horas y su titulo viral de los baculovirus fue amplificado mediante
sucesivos pases sobre cultivos de células Sf9 según las
recomendaciones del fabricante (Life Technologies) hasta obtener un
título apropiado.
Las células de insecto Sf9 (Invitrogen) fueron
infectadas con el baculovirus que contenía el cDNA (que expresa la
isoforma más larga de tau42 presente en el sistema nervioso central
humano) con o sin las mutaciones descritas anteriormente. Una vez
obtenidos los virus con un titulo apropiado se procedió al estudio
de las cinéticas de producción de proteína en función de la
relación MO1 (virus/célula). Las células productoras de las
proteínas de interés se recogieron y lavaron congelándose a -70°C
hasta su procesamiento y ensayos posteriores.
La influencia de la expresión de estas
proteínas, tau y tau^{VLW}, en células de insecto infectadas con
los baculovirus descritos anteriormente, se evaluó mediante
estudios de inmunofluorescencia. Para la realización de los estudios
de inmunofluorescencia las células Sf9 fueron sembradas sobre
cubres de cristal pretratados con polilisina a una concentración de
10 \mug/ml y se infectaron según se describe arriba. Los cubres
fueron incubados durante 48 y 72 horas desde la infección, se
lavaron con el tampón salino PBS y se fijaron durante 5 minutos en
metanol frío (-20°C), transferidos a acetona absoluta fría (-20°C)
durante 5 minutos, secados al aire, y después rehidratados en PBS
que contenía 0,05% (vol/vol) de Tween-20 (Kuriyama
R., Dragas-Granoic S., Maekawa T., Vassilev A.,
Khodjakov A. and Kobayashi H. (1994) Heterogeneity and microtubule
interaction of the CHO1 antigen, a mitosis-specific
kinesin-like protein. Analysis of subdomains
expressed in insect sf9 cells. J Cell Sci 107,
3485-3499). Los anticuerpos primarios fueron
incubados en PBS que contenía 0.05% Tween-20
durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con
PBS, se incubaron con los anticuerpos secundarios durante 45
minutos, lavadas otra vez tres veces en PBS, y finalmente montadas
usando el reactivo de FluorSave (Calbiochem).
Tanto las expresiones del gen tau42 como del
tau^{VLW} producen, en ambos casos, un cambio morfológico de las
células de insecto infectadas (Figuras 2 y 3). Estas células
presentan una morfología redondeada amplia con algunos procesos
largos que se asemejan a las neuritas observadas en algunos modelos
neuronales de cultivos (Figuras 2 y 3).
En los cultivos infectados con baculovirus que
permiten la expresión de la proteína tau42 ó de la proteína mutante
tau^{VLW} no se encontraron grandes diferencias en el número de
células que presentaban procesos o en la longitud de estos procesos
cuando se compararon ambos cultivos (Figura 2 paneles A y B).
También, se observó que una expresión enorme de la proteína
tau^{VLW} puede dar lugar a una disminución de la extensión de
procesos celulares, según se desprende de las pruebas de la reacción
del tau^{VLW} con el anticuerpo tau14 (Figura 3).
Además, la sobreexpresión de cada proteína,
tau42 y tau^{VLW}, se detectó mediante geles de SDS de los
respectivos extractos tenidos con azul de Coomassie y también
mediante "western blot" utilizando anticuerpos específicos como
se indica a continuación. Las células Sf9 infectadas fueron
recogidas en 48 6 72 horas después de la infección, lavadas con
PBS, y resuspendidas en tampón de carga de electroforesis 2X. La
mezcla fue calentada hasta 100°C durante 5 minutos. Los geles de
electroforesis desnaturalizantes se realizaron al 10%
(SDS-PAGE), una vez terminada la electroforesis
fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa. Las membranas
fueron bloqueadas para evitar una interacción no específica con
leche en polvo desnatada al 5% en PBS y 0,05% del detergente Tween
20. Los anticuerpos primarios fueron utilizados en este mismo
tampón de bloqueo e incubado con las membranas durante toda la noche
a 4°C. Después de la incubación con los anticuerpos secundarios
unidos a HRP) (DakoA/S, Carpinteria, CA), las proteínas fueron
detectadas usando el reactivo de detección ECL (Perkin Elmer Life
Sciences, Oak Brook, IL). En ambos casos, la infección de las
células Sf9 con baculovirus recombinantes conteniendo el cDNA para
tau42 ó bien la forma mutada tau^{VLW}, produjo una expresión
enorme de la proteína según se determina mediante Western blot
(Figura 4).
En los ensayos de Western blot y en los de
inmunofluorescencia microscópica se utilizaron los siguientes
anticuerpos primarios de tau: según la enumeración de residuos de
la isoforma humana más larga de tau de 441 aminoácidos:
- -
- el antisuero Br133 anti-tau de conejo (proporcionado por Dr. C.M. Wishek) reconoce un epitopo que está situado en el extremo N-terminal
- -
- El epitopo reconocido por el antisuero Br134 anti-tau de conejo (proporcionado por el Dr. C.M. Wishek) está situado en el extremo C-terminal,
- -
- El anticuerpo AT8 (Innogenetics) reconoce la proteína de tau cuando el residuo Ser-202 esta fosforilado,
- -
- El anticuerpo AT180 (Innogenetics), y
- -
- El anticuerpo tau14 (laboratorios de Zymed) dirigido al epitopo que está situado dentro de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los residuos 141-178 y no es dependiente del estado de fosforilación de tau.
Las fuentes de otros anticuerpos usados son: oro
coloidal de 10 nm conjugado con cabra anti-ratón o
conjugado con cabra anti-conejo (BioCell Research
Laboratories), Alexa-488 de cabra
anti-ratón y cabra anti-conejo
Alexa-594 (Molecular Probes).
El método utilizado para el aislamiento de
filamentos de tau a partir de las células infectadas Sf9 fue una
modificación del método de aislamiento de PHFs de Greenberg et
al (Greenberg S. G. and Davies P. (1990) A preparation of
Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau
proteins by polyacrylamide gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 5827-5831). Así, 2 x 10^{7} células
infectadas fueron recogidas por centrifugación, lavados con PBS y
homogenizadas en 0,5 ml del tampón siguiente: 10 mM Tris, 1mM EGTA,
0,8 M NaCl, 10% de sucrosa, pH 7,4. Después de una centrifugación a
20.000 g durante 20 minutos a 4°C, el sobrenadante fue retirado y
guardado y el precipitado fue homogeneizado con 0,5 ml del tampón
anterior y centrifugada a 20.000 g durante 20 minutos. Los
sobrenadantes fueron combinados, ajustados a 1% (wt/vol) de
N-laurilsarcosina y 1% (vol/vol)
2-mercaptoetanol, e incubados a 37° C durante 2,5
horas mientras se mezclaban en un incubador orbital. Todos los
pasos siguientes fueron hechos a temperatura ambiente. Después de la
centrifugación a 92000 x g durante 40 minutos, los filamentos
contenidos en el precipitado fueron homogeneizados en 0,5 ml del
buffer anterior con 1% (wt/vol) de CHAPS y 1% (vol/vol) de
2-mercaptoetanol, centrifugado otra vez a 92000 x g
y el nuevo precipitado resuspendido finalmente en 50 \mul del
buffer con 1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol.
La formación de agregados y filamentos en estas
células de insecto se evaluó mediante técnicas de microscopía a e
inmunomicroscopía electrónica tal como se indica a continuación.
Para probar la presencia de filamentos aislados, 10 \mul de las
muestras obtenidas como se describe en el apartado anterior fueron
colocados en una rejilla recubiertas de carbón durante 2 minutos y
después sombreadas con 2% (w/v) de acetato de uranilo durante 1
minuto. La microscopia electrónica de transmisión fue realizada en
un microscopio electrónico modelo 1200EX de JEOL funcionado en 100
kV. La microscopia inmunoelectrónica fue realizada después de la
adsorción de 10 \mul de las muestras para microscopia electrónica
a las rejillas recubiertas de carbón y tras incubar el primer
anticuerpo (1/100) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un
intensivo lavado del primer anticuerpo, las rejillas fueron
incubadas con el anticuerpo secundario (1/40) conjugado con las
partículas de oro con diámetro 10-nm. Finalmente,
las muestras fueron sombreadas con 2% de acetato de uranilo durante
1 minuto. La transmisión microscópica electrónica fue realizada en
una microscopio electrónico modelo 1200EX de JEOL funcionando a 100
kV.
Una muestra obtenida de esta manera en el caso
de la proteína tau42 expresada en células de insecto produjo la
formación de agregados de polímeros amorfos que no siendo
filamentos pueden visualizarse mediante técnicas de microscopia e
inmunomicroscopía electrónica (Figura 5). Estos agregados se
identifican usando los anticuerpos (ab) contra tau, el ab Br133 ó
el ab AT8, no obstante ninguna reacción se obtuvo con el ab 7,51.
Estos resultados sugieren que la agregación de estos polímeros
ocurre por la región de interacción con la tubulina presente en tau,
puesto que el epitopo reconocido por el ab 7,51 está dentro de esta
región. Por el contrario, la expresión de la forma proteica
tau^{VLW} mediante la infección de las células SD con baculovirus
recombinante conteniendo el cDNA portador del gen mutado tau^{VLW}
produjo la formación de los filamentos PHFs de tau (Figura 6).
En la Figura 6 (panel superior) se muestran los
filamentos teñidos con diferentes anticuerpos contra tau en forma
fosforilada como AT8 y AT180 (no se muestra) a partir de extractos
de cultivos de células Sf9 infectados con baculovirus recombinantes
con el gen alterado tau^{VLW}. También se observó como estos
filamentos no se tiñen con el anticuerpo ab 7,5 (no se muestra).
Este resultado se puede explicar porque el epitopo para este
anticuerpo está enmascarado en los filamentos de una manera similar
a como ocurre en el caso de PHFs aislados de pacientes de la
enfermedad de Alzheimer (Goedert M., Jakes R., Crowther R. A.,
Cohen P., Vanmechelen E., Vandermeeren M. and Cras P. (1994)
Epitope mapping of monoclonal antibodies to the paired helical
filaments of Alzheimer's disease: identification of phosphorylation
sites in tau protein. Biochem J 301 (Pt 3),
871-877). Los filamentos también fueron reconocidos
con dos anticuerpos policlonales que reconocen los extremos del
C-terminal (Br 134) y del N-terminal
(Br 133) (Figura 6, panel inferior).
Por otro lado, la expresión de la proteína
alterada tau^{VLW}, determinada por análisis de Western Blot
produjo una reacción más alta en este caso con algunos de los
anticuerpos que reaccionan con la versión de la proteína fosforilada
(AT8), esta reacción disminuye tras el tratamiento con litio (no se
muestra). Esta diferencia en la expresión de la proteína tipo
salvaje de tau y el mutado tau^{VLW} teñidos con anticuerpos que
reconocen tau fosforilado en las células Sf9 sugiere una posible
diferencia en sus niveles de fosforilación. Este hecho podría ser
determinante a la hora de explicar porque en un caso se obtienen
filamentos y en el otro caso no. Así, esta fosforilación podría
influir no tanto en la agregación de las dos formas de tau, tau42 y
tau^{VLW}, sino en la forma y características de estos agregados
de tau, puesto que en ambos casos existen agregados.
Si la diferencia en la forma de los agregados y
por tanto en la formación de los filamentos se debiera al diferente
grado de fosforilación de la proteína tipo salvaje (tau42) y la
versión mutada (tau^{VLW}), los inhibidores de proteínas quinasas
implicadas en la hiperfosforización de tau podrían prevenir la
formación de los filamentos de tau^{VLW}.
Existen dos proteínas quinasas bastante bien
caracterizadas que han sido implicadas en esta modificación de tau,
quinasa I (GSK3) y quinasa II (cdk5) (Hanger D. P., Hughes K.,
Woodgett J. R., Brion J. P. and Anderton B. H. (1992) Glycogen
synthase kinase-3 induces Alzheimer's
disease-like phosphorylation of tau: generation of
paired helical filament epitopes and neuronal localisation of the
kinase. Neurosci Lett 147, 58-62; Baumann K.,
Mandelkow E. M., Biernat J., Piwnicaworms H. and Mandelkow E.
(1993) Abnormal Alzheimer-Like Phosphorylation of
Tau-Protein by Cyc 1 inDependent Kinases Cdk2 and
Cdk5. FEBS Lett 336, 417-424). Por ello, se analizó
la expresión de tau^{VLW} en presencia del litio (un inhibidor de
GSK3) o en presencia de butirolactona I (un inhibidor de cdk5). El
litio, un inhibidor para GSK3 (Muñoz-Montano J. R.,
Moreno F. J., Avila J. and Diaz-Nido J. (1997)
Lithium inhibits Alzheimer's disease-like tau
protein phosphorylation in neurons. FEBS Lett
411,183-188; Alvarez G.,
Muñoz-Montafio J. R., Satrústegui J., Avila J.,
Bogonez E. and Díaz-Nido J. (1999) Lithium protects
cultured neurons against
beta-amyloid-induced
neurodegeneration. I,EBS Left. 453, 260-264) se
obtuvo de Merck, y la butyrolactona I, un inhibidor para cdk5, fue
obtenido de Calbiochem.
Las células Spodoptera frugiperda Sf9
fueron cultivadas a 27°C en una botella de cultivo en suspensión en
medio Grace (Gibco), suplementado con un 10% de suero vacuno fetal,
100 \mug/ml Penicilina-Streptomicina y 0,05%
(vol/vol) de ácido plurónico F68 (Gibco). Los cultivos en monocapas
o en suspensión de las células Sf9 fueron infectados con los
baculovirus recombinantes, que permiten la expresión de la proteína
tau^{VLW}, a una determinada multiplicidad que varió entre 2 y 8
m.o.i. (relación del número de virus al número de células). Las
muestras fueron tomadas en 48 y 72 horas desde la infección y el
nivel de la expresión de tau fue determinado midiendo la reacción
con el anticuerpo 7,51 por Western Blot tal como se indicó
anteriormente. La cuantificación de la señal quemiluminiscente se
llevó a cabo utilizando un escaneado densitométrico con el Software
GS-710 (Bio-Rad, Riclunond,
CA.).
El litio fue añadido al medio de cultivo a una
concentración final de 20 mM durante 4 horas. La butirolactona fue
disuelta en dimetilsulfóxido y añadido al medio de cultivo a una
concentración final de 1 \muM durante 4 horas. Las células de
control fueron incubadas con el mismo volumen de medio en cada
caso.
La Figura 7 muestra como respecto al control (el
extracto sarcosil-insoluble antes del tratamiento
con los inhibidores de quinasas) se observa una disminución de la
formación de los filamentos de tau bajo el tratamiento con litio. En
cambio, en presencia de butirolactona I, la cantidad total de
filamentos no se modificó. Este resultado sugiere que la
fosforilación por GSK3 de tau^{VLW} facilita su agregación en
filamentos que se asemejan a los encontrados en los pacientes con la
enfermedad de Alzheimer.
La diferencia principal observada entre la
tau42, sin mutaciones, con respecto a la tau^{VLW} reside en que
cuando se expresan en las células Sf9 la tau^{VLW} aparece estar
en forma hiperfosforilada. Esta hiperfosforilación aparece por
tanto como consecuencia de esas mutaciones. La explicación a este
fenómeno bien podría ser que se produzca un mal reconocimiento por
las fosfatasas celulares de la proteína alterada como consecuencia
de las mutaciones. Como consecuencia de todo esto la proteína
alterada tau^{VLW} no podría ser desfosforilada y acabe siendo
hiperfosforilada. Como alternativa más improbable se podría sugerir
en una diferente afinidad de las quinasas y/o fosfatasas implicadas
en la fosforilación/desfosforilación de tau en el caso del sistema
celular utilizado. Hay que indicar que estas hipótesis se presentan
a título de discusión sin pretender establecer ningún modelo que
pueda limitar el alcance de la presente invención.
Tau puede ser fosforilada por varias quinasas
pero GSK3 (tau quinasa I) es probablemente la que presenta un
potencial más alto de modificación dado que para GSK3 existen
muchos residuos fosforilables en la molécula de tau (Reynolds C. H.,
Betts J. C., Blackstock W. P., Nebreda A. R. and Anderton B. H.
(2000) Phosphorylation sites on tau identified by nanoelectrospray
mass spectrometry: differences in vitro between the
mitogen-activated protein kinases ERK2,
c-Jun N-terminal kinase and P38,
and glycogen synthase kinase-3beta. J. Neurochem.
74, 1587-1595; Sperber B. R., Leight S., Goedert M.
and Lee V. M. Y. (1995) Glycogen synthase kinase-3
beta phosphorylates tau protein at multiple sites in intact cells.
Neuroscience Letters 197, 149-153). Trabajos
anteriores han indicado que el litio bloquea la fosforilación de tau
por GSK3 (Muñoz-Montano J. R., Moreno F. J., Avila
J. and Diaz-Nido J. (1997) Lithium inhibits
Alzheimer's disease-like tau protein phosphorylation
in neurons. FEBS Lett 411,183-188) en células
neuronales en cultivo. También, en células en cultivo se sugirió
(Perez M., Hernandez F., Gomez-Ramos A., Smith M.,
Perry G. and Avila J. (2002) Formation of aberrant phosphotau
fibrillar polymers in neural cultured cells. Eur JBiochem
269,1484-1489) una correlación posible entre la
falta de fosforilación de tau por GSK3 y la agregación de tau.
Otras variantes de tau, como aquellas que sufrieron el cambio
V337M, afectan a la organización microtubular cuando se manifiestan
en las células Sf9 (Frappier T., Liang N. S., Brown K., Leung C.
L., Lynch T., Liem R. H. K. and Shelauski M. L. (1999) Abnormal
microtubule packing in processes of SF9 cells expressing the
FTDP-17 V337M tau mutation. Febs Left 455,
262-266) pero en ese caso no se describió la
formación de polímeros filamentosos.
En resumen, en la presente invención se ha
descubierto que tal fosforilación podría tener implicaciones en las
características morfológicas de los agregados de tau, puesto que
tau con un nivel más bajo de fosforilación puede también agregar
aunque con una morfología amorfa. Estos resultados apoyan la
hipótesis anterior de que la fosforilación de tau podría dar lugar
a un cambio de conformación que podría permitir la formación de
polímeros fibrilares.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE
COMPUESTOS INHIBIDORES DEL PROCESO DE POLIMERIZACIÓN DE FILAMENTOS
TAU TIPO PHFs Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Filamentos PHFs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de tauVLW
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutation
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G272V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutation
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (121)..(123)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> P301L
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutation
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (436)..(438)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R406W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína tauVLW
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTAGEN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (272)..(272)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G272V
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTAGEN
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<222> (301)..(301)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> P301L
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTAGEN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (406)..(406)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R406W
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Procedimiento de identificación y/o
determinación de compuestos reguladores, preferentemente
inhibidores, del proceso de ensamblaje o polimerización de
filamentos tau tipo PHFs:
- i)
- preparación de un modelo celular eucariota transformado mediante un sistema o vector de expresión génica tau^{VLW} que contiene la secuencia ID NO 1, que permite la expresión de una forma proteica de tau hiperfosforilada, y la formación de filamentos tau PHFs en condiciones adecuadas,
- ii)
- adición de los potenciales compuestos reguladores, preferentemente inhibidores, de la polimerización de filamentos tau, objeto del procedimiento de identificación,
- iii)
- determinación del efecto sobre la capacidad de polimerización o ensamblaje de dichos filamentos tau tipo PHFs.
2. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 1 caracterizado porque el modelo celular
transformado consiste en un cultivo de células de insecto,
transformado por un sistema de baculovirus recombinante que
contiene la secuencia ID NO 1.
3. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 1 caracterizado porque la determinación de la
polimerización o autoensamblaje de tau se realiza mediante el
aislamiento de los PHFs y su visualización posterior mediante
inmunomicroscopía electrónica con anticuerpos adecuados.
4. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 1 caracterizado porque la determinación de la
polimerización o autoensamblaje de tau se realiza mediante la
determinación cuantitativa de los agregados PHFs por western blot
con anticuerpos adecuados.
5. Modelo o cultivo celular eucariota
transformado mediante ingeniería genética necesario para la
realización del procedimiento según las reivindicaciones 1 a la 4
caracterizado porque contiene un sistema o vector de
expresión tau^{VLW}, que contiene la construcción genética
tau^{VLW}, que permite la expresión de la proteína tau^{VLW} y
la formación de los PHFs.
6. Modelo o cultivo celular eucariota según la
reivindicación 5 caracterizado porque consiste en cultivo de
células de insecto, preferentemente Sf9, transformado por un
sistema de baculovirus recombinante, que permite la expresión de la
proteína tau^{VLW} y la formación de los PHFs.
7. Una construcción genética tau^{VLW} y
sistema o vector de expresión que la contenga, que codifique la
proteína de secuencia SEQ ID NO 2 caracterizado porque
contiene la secuencia SEQ ID NO 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200303031A ES2286911B1 (es) | 2003-12-22 | 2003-12-22 | Procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores del proceso de polimerizacion de filamentos tau tipo phfs y sus aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200303031A ES2286911B1 (es) | 2003-12-22 | 2003-12-22 | Procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores del proceso de polimerizacion de filamentos tau tipo phfs y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2286911A1 ES2286911A1 (es) | 2007-12-01 |
| ES2286911B1 true ES2286911B1 (es) | 2008-11-01 |
Family
ID=38698459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200303031A Expired - Lifetime ES2286911B1 (es) | 2003-12-22 | 2003-12-22 | Procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores del proceso de polimerizacion de filamentos tau tipo phfs y sus aplicaciones. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2286911B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1077990A1 (en) * | 1998-05-01 | 2001-02-28 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Pathogeniv tau mutations |
| EP1248518A2 (en) * | 2000-01-21 | 2002-10-16 | PHARMACIA & UPJOHN COMPANY | Transgenic mouse model of human neurodegenerative disease |
-
2003
- 2003-12-22 ES ES200303031A patent/ES2286911B1/es not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FRAPPIER T. et al. "{}Abnormal microtubule packing in processes of SF9 cells expressing the FTDP-17 V337M tau mutation". FEBS Letters. 23.07.1999. Vol. 455, Nº 3, páginas 262-266. * |
| VOGELSBERG-RAGAGLIA V. et al. "Distinct FTDP-17 missense mutations in Tau produce Tau aggregates and other pathological phenotypes in transfected CHO cells". Molecular Biology of the Cell. Dic 2000. Vol.11, páginas 4093-4104. * |
| VON BERGEN M. et al. "Mutations of tau protein in frontotemporal dementia promote aggregation of paired helical filaments by enhancing local beta-structure". The Journal of Biological Chemistry. 21.12.2001. Vol. 276, Nº 51, páginas 48165-48174. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2286911A1 (es) | 2007-12-01 |
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|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20071201 Kind code of ref document: A1 |
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| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2286911B1 Country of ref document: ES |
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Effective date: 20090506 |