CN113227788B - 一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂 - Google Patents

一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN113227788B
CN113227788B CN202080005864.6A CN202080005864A CN113227788B CN 113227788 B CN113227788 B CN 113227788B CN 202080005864 A CN202080005864 A CN 202080005864A CN 113227788 B CN113227788 B CN 113227788B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
phosphorylation
pink1
drp
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202080005864.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113227788A (zh
Inventor
张灼华
韩海龙
谭洁琼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiangya Hospital of Central South University
Original Assignee
Xiangya Hospital of Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiangya Hospital of Central South University filed Critical Xiangya Hospital of Central South University
Publication of CN113227788A publication Critical patent/CN113227788A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113227788B publication Critical patent/CN113227788B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂，其中Drp1的磷酸化水平(特别是Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平)能够指示帕金森病的风险，而能够提高Drp1蛋白磷酸化水平的试剂(包括能够提高Drp1蛋白磷酸化水平的相关基因、蛋白和小分子)，例如PINK1，可以被用于治疗帕金森病。

Description

一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂
本申请要求于2019年3月19日提交中国专利局、申请号为201910208612.2、发明名称为“一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)的诊断和治疗方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是目前最常见的神经退行性运动障碍性疾病之一。越来越多的研究表明由环境因素(如MPTP、鱼藤酮、百草枯等农药暴露)(1)以及遗传因素(PD相关基因的突变，如PARK2(2),PINK1(3)，LRRK2(4)等)造成的线粒体功能障碍在帕金森病发病过程中扮演着重要角色。
PINK1是常染色体隐性遗传PD相关的常见致病基因，其编码合成具有丝-苏氨酸激酶活性的线粒体外膜蛋白。PINK1的突变与线粒体功能紊乱以及进一步造成的细胞损伤密切相关，大量的研究表明，如当线粒体受损时，PINK1可通过磷酸化泛素从而招募并激活parkin介导线粒体自噬的发生(5,6)。在果蝇模型中，PINK1基因缺失造成线粒体问题导致果蝇寿命减短，运动能力减弱，背部塌陷等表型(7,8)。进一步的遗传学及相关功能学研究表明，线粒体电子呼吸链复合物1(9,10)，线粒体自噬(或自噬)相关蛋白parkin(11-13),Bnip3(14)，MUL1(15)等，以及线粒体动态平衡相关基因Drp1，OPA1,MFN1/2(16-19)的干预均能恢复PINK1缺失导致的果蝇表型，同样，在PINK1缺失的小鼠胚胎层纤维细胞(MouseEmbryonic Fibroblasts，MEF)及PINK1突变的PD病人皮肤细胞中均发现线粒体膜电位降低和线粒体电子传递链复合物1的活性减弱(10)。线粒体动态平衡对于维持线粒体膜电位及电子传递的功能起着重要作用(20)。
然而，本领域仍不清楚PINK1与线粒体发生作用的分子机制，以及在PD的病理过程中具有关键作用的通路或分子机制，这极大的制约了目前针对PD的早期诊断或药物的有效开发。
发明内容
经过发明人多年的研究，发现Drp1 S616位点的磷酸化水平在帕金森家系中与患病个体具有很高的关联率，因此所述位点的磷酸化水平可以有效的作为帕金森病的辅助诊断标记。经过进一步的研究，发明人还发现在PINK1缺失的细胞中，Drp1 S616位点的磷酸化水平明显降低，申请人还意外的发现，PINK1直接介导了该位点的磷酸化，进而调节了线粒体的动态平衡。正是基于上述突破性的发现，完成了本发明。
本发明的第一个方面，涉及Drp1蛋白作为帕金森病的辅助诊断标志物的应用。
在一个实施方案中，所述Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平用于指示帕金森病，其中
与已知不患有帕金森病的个体或来自所述个体的离体样本中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平相比，当受试者或来自受试者的离体样本中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平较低时，提示受试者具有患有帕金森病的风险或者是潜在的患病者。
本发明的第二个方面，涉及一种帕金森病的辅助诊断试剂，其包括检测Drp1蛋白磷酸化或磷酸化水平的试剂，优选的，所述Drp1蛋白磷酸化或磷酸化水平是指Drp1蛋白S616位点的磷酸化或磷酸化水平。
在一个实施方案中，所述检测的方法包括免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)和/或质谱法。
在另一个实施方案中，其中所述检测Drp1蛋白磷酸化的试剂是抗体、特异性结合多肽或小分子，优选的，所述试剂能够区分Drp1蛋白S616位点的磷酸化状态，例如所述试剂能够特异性结合具有磷酸化S616位点或者非磷酸化S616位点的Drp1蛋白。
本发明的第三个方面，涉及一种帕金森病的辅助诊断试剂盒，其包括第二个方面所述的辅助诊断试剂。
本发明的第四个方面，涉及一种用于检测Drp1蛋白磷酸化或磷酸化水平的试剂在制备帕金森病的辅助诊断试剂或试剂盒中的应用，优选的，所述Drp1蛋白的磷酸化或磷酸化水平是指Drp1蛋白S616位点的磷酸化或磷酸化水平。
本发明的第五个方面，涉及一种帕金森病的患病风险评估方法或者辅助诊断方法，其包括测定受试者或来自受试者的离体样本中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平，
其中，与已知不患有帕金森病的个体或所述个体的离体样本中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平相比，当所述受试者或来自受试者的离体样本中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平较低时，提示受试者是具有患有帕金森病的风险或者是潜在的患病者。
优选的，所述离体样本是受试者细胞、体液和组织，更优选皮肤细胞、血液、脑脊液、唾液和/或尿液样品中的细胞。
本发明的第六个方面，涉及一种用于治疗帕金森病的药物，其中包含能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中，所述试剂为PINK1，或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
本发明的第七个方面，涉及一种治疗帕金森病的方法，其包括：
对患者施用能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂，所述试剂优选为PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂，或者
对患者施用根据本发明第六个方面的药物。
本发明的第八个方面，涉及一种筛选治疗帕金森病的药物的方法，包括使待测物与包含Drp1蛋白的样品接触，检测所述样品中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平，与未与待测物接触的样品相比，所述磷酸化水平的提高指示所述待测物是治疗帕金森病的潜在药物，
优选的，所述检测的方法包括免疫印迹、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、免疫酶联和/或质谱法。
本发明的第九个方面，涉及能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂在制备治疗帕金森病的药物中的用途，优选的所述试剂是为PINK1，或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
本发明的第十个方面，涉及PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂在制备提高Drp1蛋白S616位点磷酸化水平的试剂或试剂盒中的用途。
本发明的第十一个方面，涉及一种提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的方法，其包括：
将包含Drp1蛋白的样品暴露于PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
本发明的第十二个方面，涉及一种筛选能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂的方法，包括使待测物与包含Drp1蛋白的样品接触，检测所述样品中Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平，与未与待测物接触的样品相比，所述位点磷酸化水平的提高指示所述待测物是能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂，
还优选的，所述所述检测的方法包括免疫印迹、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、免疫酶联和/或质谱法。
在以上各方面中，所述Drp1蛋白优选为人Drp1蛋白。
进一步的，在以上各方面中，所述Drp1蛋白S616位点具体指代如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列中第616位丝氨酸(Ser，S)或者人Drp1蛋白其它异构体(isoform)中对应于SEQID NO：1所示序列中S616的丝氨酸。
人Drp1蛋白至少包含8个自然存在的异构体(isoform)(分别如SEQ ID NO：1-8所示)，SEQ ID NO：2-7所示的异构体中对应于SEQ ID NO：1所示序列中S616位点的丝氨酸位置如下：SEQ ID NO：2所示的序列第590位；SEQ ID NO：3所示的序列第579位；SEQ ID NO：4所示的序列第605位；SEQ ID NO：5所示的序列第629位；SEQ ID NO：6所示的序列第618位；SEQ ID NO：7所示的序列第413位；SEQ ID NO：8所示的序列第592位。
以上仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或更多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
附图说明
图1显示了PINK1体外磷酸化DRP1的S616位点的实验结果，(a)显示了DRP1 616位点的在不同种群中的保守性分析；(b,c)显示了体外激酶实验结果，其中图1b为蛋白电泳及印迹实验结果，CBB表示考马斯亮蓝染色，TcPINK1表示昆虫红色面粉甲虫来源的重组PINK1，ATP表示三磷酸腺苷，SAP表示虾碱性磷酸酶；图1c为结果统计图，其中***p<0.001，表示差异具有统计学意义。
图2显示了在缺失PINK1的HEK293细胞系中，DRP1蛋白S616位点磷酸化水平的变化情况。(a)显示了蛋白质印迹结果。(b)显示了相关统计结果，n＝3，其中*p<0.05，表示差异具有统计学意义。(c)细胞免疫荧光实验检测结果，其中红色(最左列)代表磷酸化的DRP1蛋白，绿色(中间列)代表细胞中所有DRP1蛋白，比例尺＝10μm。(d)相关实验统计图，n＝3，每组统计细胞个数>100。其中*p<0.05，表示差异具有统计学意义。
图3显示了PINK1缺失的MEF细胞中(b,c)以及小鼠黑质区域中(d-f)，DRP1 616位点磷酸化水平的变化情况。(a)显示了野生型小鼠与PINK1缺失小鼠的鼠尾基因型鉴定结果。其中WT条带为350bp，PINK1缺失条带为550bp。(b,c)PINK1缺失的MEF细胞中蛋白印迹结果显示DRP1 S616磷酸化水平和实验统计图，n＝3，其中*p<0.05,差异具有统计学意义。
(d)PINK1缺失的小鼠黑质区域中免疫荧光显示DRP1 S616磷酸化水平，其中红色(左列)表示磷酸化的DRP1染色，绿色表示TH染色(中间)。比例尺＝25μm。(e,f)小鼠黑质区域组织样本中DRP1 S616磷酸化位点的蛋白印迹检测结果，以及统计数据，其中n＝3，**p<0.01,表示差异具有统计学意义。
图4显示了在PINK1缺失的细胞中过表达PINK1野生型及突变体，检测DRP1 S616位点磷酸化的变化情况。(a)蛋白印迹检测结果。D384N为激酶活性致死突变，G309D为疾病相关突变，△110为缺失线粒体定位序列突变。(b)对a中的S616磷酸化的DRP1和总的DRP1比值进行统计的结果，n＝3，其中***p<0.001，表示差异具有统计学意义；ns,差异没有统计学意义。
图5显示了在PINK1缺失的原代神经元中过表达Drp1野生型或S616A突变体后，神经元轴突和/或树突中线粒体形态和分布结果。(a)显示了荧光观察结果，其中绿色荧光(左列和右列)指示表达Mito-GFP的线粒体；红色荧光(中间列)指示外源Drp1的表达。比例尺＝25μm。(b)mitochondrial Index(用来表示神经元树突或轴突中线粒体的分布情况)的统计结果。其中每组神经元的统计数目>20,每个神经元统计3-5根树突或轴突的mitochondrialindex，n＝3。其中*p<0.05，***p<0.001，表示差异具有统计学意义；ns表示差异没有统计学意义。
图6显示了Drp1及其S616位的磷酸化介导了由PINK1介导的线粒体碎裂过程。(a)重组PINK1激酶结构功能区域被招募至线粒体的示意图。(b)显示了将(a)中的蛋白Δ110-PINK1-GFP-FKBP及FRB-FIS1(MTS)瞬时转染入野生型Hela或DRP1敲除的Hela细胞系，再加入Rapalog处理并固定后进行免疫荧光染色的结果。其中红色表示抗体TOM20染色(最左列)，代表线粒体分布情况，绿色为重组PINK1的分布情况(左二列)，蓝色为DAPI染色代表细胞核。比例尺＝25μm。(c)将(a)中蛋白Δ110-PINK1-GFP-FKBP及FRB-FIS1(MTS)瞬时转染入敲除DRP1的Hela细胞中，同时共转pcDNA3.1骨架质粒或DRP1野生型或DRP1 S616A突变体，加入Rapalog处理后固定并进行免疫荧光染色的结果，其中蓝色为抗体TOM20染色(最左列)，指示线粒体分布情况，红色(左二列)为过表达Drp1的分布情况，绿色(中间列)为重组PINK1的分布情况，灰色为DAPI染色代表细胞核。比例尺＝25μm。
图7:PD相关的PINK1缺失的果蝇模型验证Drp1及其616位点的磷酸化与PINK1的相互关系。(a)不同基因型的果蝇背部照片(上)及扫描电镜照片(下)。黄色三角箭头指示：异常的背部塌陷表型。(b)异常果蝇背部塌陷(a)的相关统计图，每组果蝇统计数目N>200,n＝3，其中***p<0.001,差异具有统计学意义。
图8显示了携带PINK1基因纯合突变的PD病人及散发PD病人源的皮肤成纤维细胞中Drp1 616位点磷酸化的改变情况。(a-d)携带PINK1基因纯合突变的PD病人家系以及病人的基因测序图谱。(e、f)蛋白电泳检测不同样本中Drp1 616位点磷酸化(g)实验统计图，其中*p<0.05,差异具有统计学意义。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
定义
除非另有说明，本发明所用术语具有本领域技术人员通常理解的含义。
术语“帕金森病”，又叫做“帕金森症”、“帕金森氏症”、Parkinson’s disease或PD，又被称作震颤麻痹，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，其主要病变在黑质和纹状体，震颤、肌强直及运动减少是本病的主要临床特征。已知由多种原因导致的线粒体障碍与帕金森症的具有关联。其主要原理在于，当线粒体受损后，需要立即被清除(如通过线粒体的自噬)，而一旦由于相关的通路发生紊乱，或者相关基因功能的缺失，导致受损线粒体无法被及时清除，将会导致细胞受损(例如神经细胞)，进而潜在诱发帕金森症。
术语“Drp1”或者“Drp1蛋白”，即“动力相关蛋白1”或“dynamin-related protein1”，也叫做“Dynamin-1-like protein”，是一种能够调节线粒体分裂(mitochondriafission)的GTP酶(GTPase)，在人类基因组中，Drp1蛋白由DNM1L基因编码。
术语“Drp1蛋白的S616位点”表示Drp1蛋白中与帕金森病密切相关的指定丝氨酸位点，由于Drp1蛋白在体内存在多种异构体(isoform)形式(至少包含8种)，各异构体长短不一，因此该丝氨酸位点在不同的异构体中的具体位置并不相同，但是通过相邻氨基酸的序列可以毫无意义的在各个变体中确定该特定丝氨酸位点的存在。为了清晰地界定所述位点的位置，本发明中的“S616位点”是根据SEQ ID NO：1所示的序列中该丝氨酸位点位于第616位而命名，并且SEQ ID NO：1也是人体内主要的异构体形式。但是需要明确的是，“Drp1蛋白的S616位点”并不仅限于SEQ ID NO：1序列中的第616位丝氨酸位点，还包括Drp1蛋白各异构体中对应于SEQ ID NO：1序列中的第616位丝氨酸的丝氨酸残基。还包括了人体内自然存在的其他Drp1蛋白变体(例如一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失的自然突变体)，通常而言，所述突变基本上不会改变Drp1蛋白的功能。
人Drp1蛋白的8种异构体形式如下：
Drp 1isoform 1的全长736aa，序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eengveaeew gkflhtknkl ytdfdeirqe ieneterisg
121 nnkgvspepi hlkifspnvv nltlvdlpgm tkvpvgdqpk dielqireli lrfisnpnsi
181 ilavtaantd matsealkis revdpdgrrt lavitkldlm dagtdamdvl mgrvipvklg
241 iigvvnrsql dinnkksvtd sirdeyaflq kkypslanrn gtkylartln rllmhhirdc
301 lpelktrinv laaqyqslln sygepvddks atllqlitkf ateycntieg takyietsel
361 cggaricyif hetfgrtles vdplgglnti diltairnat gprpalfvpe vsfellvkrq
421 ikrleepslr cvelvheemq riiqhcsnys tqellrfpkl hdaivevvtc llrkrlpvtn
481 emvhnlvaie layintkhpd fadacglmnn nieeqrrnrl arelpsavsr dksskvpsal
541 apasqepspa asaeadgkli qdsrretknv asggggvgdg vqepttgnwr gmlktskaee
601 llaeekskpihavnlldvpv pvarklsare qrdcevierl iksyflivrk
661 niqdsvpkav mhflvnhvkd tlqselvgql ykssllddll tesedmaqrr keaadmlkal
721 qgasqiiaei rethlw(SEQ ID NO:1)
Drp1 isoform2的全长为710aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eengveaeew gkflhtknkl ytdfdeirqe ieneterisg
121 nnkgvspepi hlkifspnvv nltlvdlpgm tkvpvgdqpk dielqireli lrfisnpnsi
181 ilavtaantd matsealkis revdpdgrrt lavitkldlm dagtdamdvl mgrvipvklg
241 iigvvnrsql dinnkksvtd sirdeyaflq kkypslanrn gtkylartln rllmhhirdc
301 lpelktrinv laaqyqslln sygepvddks atllqlitkf ateycntieg takyietsel
361 cggaricyif hetfgrtles vdplgglnti diltairnat gprpalfvpe vsfellvkrq
421 ikrleepslr cvelvheemq riiqhcsnys tqellrfpkl hdaivevvtc llrkrlpvtn
481 emvhnlvaie layintkhpd fadacglmnn nieeqrrnrl arelpsavsr dkliqdsrre
541 tknvasgggg vgdgvqeptt gnwrgmlkts kaeellaeekpqkghavnll
601 dvpvpvarkl sareqrdcev ierliksyfl ivrkniqdsv pkavmhflvn hvkdtlqsel
661 vgqlykssll ddlltesedm aqrrkeaadm lkalqgasqi iaeirethlw(SEQ ID NO:2)
Drp1 isoform3的全长为699aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eengveaeew gkflhtknkl ytdfdeirqe ieneterisg
121 nnkgvspepi hlkifspnvv nltlvdlpgm tkvpvgdqpk dielqireli lrfisnpnsi
181 ilavtaantd matsealkis revdpdgrrt lavitkldlm dagtdamdvl mgrvipvklg
241 iigvvnrsql dinnkksvtd sirdeyaflq kkypslanrn gtkylartln rllmhhirdc
301 lpelktrinv laaqyqslln sygepvddks atllqlitkf ateycntieg takyietsel
361 cggaricyif hetfgrtles vdplgglnti diltairnat gprpalfvpe vsfellvkrq
421 ikrleepslr cvelvheemq riiqhcsnys tqellrfpkl hdaivevvtc llrkrlpvtn
481 emvhnlvaie layintkhpd fadacglmnn nieeqrrnrl arelpsavsr dkvasggggv
541 gdgvqepttg nwrgmlktsk aeellaeeksqkghavnlld vpvpvarkls
601 areqrdcevi erliksyfli vrkniqdsvp kavmhflvnh vkdtlqselv gqlyksslld
661 dlltesedma qrrkeaadml kalqgasqii aeirethlw(SEQ ID NO:3)
Drp1 isoform 4的全长为725aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eengveaeew gkflhtknkl ytdfdeirqe ieneterisg
121 nnkgvspepi hlkifspnvv nltlvdlpgm tkvpvgdqpk dielqireli lrfisnpnsi
181 ilavtaantd matsealkis revdpdgrrt lavitkldlm dagtdamdvl mgrvipvklg
241 iigvvnrsql dinnkksvtd sirdeyaflq kkypslanrn gtkylartln rllmhhirdc
301 lpelktrinv laaqyqslln sygepvddks atllqlitkf ateycntieg takyietsel
361 cggaricyif hetfgrtles vdplgglnti diltairnat gprpalfvpe vsfellvkrq
421 ikrleepslr cvelvheemq riiqhcsnys tqellrfpkl hdaivevvtc llrkrlpvtn
481 emvhnlvaie layintkhpd fadacglmnn nieeqrrnrl arelpsavsr dksskvpsal
541 apasqepspa asaeadgkva sggggvgdgv qepttgnwrg mlktskaeel laeekskpip
601 avnlldvpvp varklsareq rdcevierli ksyflivrkniqdsvpkavm
661 hflvnhvkdt lqselvgqly kssllddllt esedmaqrrk eaadmlkalq gasqiiaeir
721 ethlw(SEQ ID NO:4)
Drp1 isoform 5的全长为749aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eendpatwkn srhlskgvea eewgkflhtk nklytdfdei
121 rqeieneter isgnnkgvsp epihlkifsp nvvnltlvdl pgmtkvpvgd qpkdielqir
181 elilrfisnp nsiilavtaa ntdmatseal kisrevdpdg rrtlavitkl dlmdagtdam
241 dvlmgrvipv klgiigvvnr sqldinnkks vtdsirdeya flqkkypsla nrngtkylar
301 tlnrllmhhi rdclpelktr invlaaqyqs llnsygepvd dksatllqli tkfateycnt
361 iegtakyiet selcggaric yifhetfgrt lesvdplggl ntidiltair natgprpalf
421 vpevsfellv krqikrleep slrcvelvhe emqriiqhcs nystqellrf pklhdaivev
481 vtcllrkrlp vtnemvhnlv aielayintk hpdfadacgl mnnnieeqrr nrlarelpsa
541 vsrdksskvp salapasqep spaasaeadg kliqdsrret knvasggggv gdgvqepttg
601 nwrgmlktsk aeellaeeksqkghavnlld vpvpvarkls areqrdcevi
661 erliksyfli vrkniqdsvp kavmhflvnh vkdtlqselv gqlyksslld dlltesedma
721 qrrkeaadml kalqgasqii aeirethlw(SEQ ID NO:5)
Drp1 isoform 6的全长为738aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eendpatwkn srhlskgvea eewgkflhtk nklytdfdei
121 rqeieneter isgnnkgvsp epihlkifsp nvvnltlvdl pgmtkvpvgd qpkdielqir
181 elilrfisnp nsiilavtaa ntdmatseal kisrevdpdg rrtlavitkl dlmdagtdam
241 dvlmgrvipv klgiigvvnr sqldinnkks vtdsirdeya flqkkypsla nrngtkylar
301 tlnrllmhhi rdclpelktr invlaaqyqs llnsygepvd dksatllqli tkfateycnt
361 iegtakyiet selcggaric yifhetfgrt lesvdplggl ntidiltair natgprpalf
421 vpevsfellv krqikrleep slrcvelvhe emqriiqhcs nystqellrf pklhdaivev
481 vtcllrkrlp vtnemvhnlv aielayintk hpdfadacgl mnnnieeqrr nrlarelpsa
541 vsrdksskvp salapasqep spaasaeadg kvasggggvg dgvqepttgn wrgmlktska
601 eellaeekskkghavnlldv pvpvarklsa reqrdcevie rliksyfliv
661 rkniqdsvpk avmhflvnhv kdtlqselvg qlyksslldd lltesedmaq rrkeaadmlk
721 alqgasqiia eirethlw(SEQ ID NO:6)
Drp1 isoform 7的全长为533aa，其序列如下：
1 mfhkkingkq qekkmtllhg ktqdtflkgw kqkngvnfft pkirsqldin nkksvtdsir
61 deyaflqkky pslanrngtk ylartlnrll mhhirdclpe lktrinvlaa qyqsllnsyg
121 epvddksatl lqlitkfate ycntiegtak yietselcgg aricyifhet fgrtlesvdp
181 lgglntidil tairnatgpr palfvpevsf ellvkrqikr leepslrcve lvheemqrii
241 qhcsnystqe llrfpklhda ivevvtcllr krlpvtnemv hnlvaielay intkhpdfad
301 acglmnnnie eqrrnrlare lpsavsrdks skvpsalapa sqepspaasa eadgkliqds
361 rretknvasg gggvgdgvqe pttgnwrgml ktskaeella eekskpipim
421 nlldvpvpva rklsareqrd cevierliks yflivrkniq dsvpkavmhf lvnhvkdtlq
481 selvgqlyks sllddlltes edmaqrrkea admlkalqga sqiiaeiret hlw(SEQ IDNO:7)
Drp1 isoform 8的全长为712aa，其序列如下：
1 mealipvink lqdvfntvga diiqlpqivv vgtqssgkss vleslvgrdl lprgtgivtr
61 rplilqlvhv sqedkrkttg eendpatwkn srhlskgvea eewgkflhtk nklytdfdei
121 rqeieneter isgnnkgvsp epihlkifsp nvvnltlvdl pgmtkvpvgd qpkdielqir
181 elilrfisnp nsiilavtaa ntdmatseal kisrevdpdg rrtlavitkl dlmdagtdam
241 dvlmgrvipv klgiigvvnr sqldinnkks vtdsirdeya flqkkypsla nrngtkylar
301 tlnrllmhhi rdclpelktr invlaaqyqs llnsygepvd dksatllqli tkfateycnt
361 iegtakyiet selcggaric yifhetfgrt lesvdplggl ntidiltair natgprpalf
421 vpevsfellv krqikrleep slrcvelvhe emqriiqhcs nystqellrf pklhdaivev
481 vtcllrkrlp vtnemvhnlv aielayintk hpdfadacgl mnnnieeqrr nrlarelpsa
541 vsrdkvasgg ggvgdgvqep ttgnwrgmlk tskaeellae ekskpipimp
601 lldvpvpvar klsareqrdc evierliksy flivrkniqd svpkavmhfl vnhvkdtlqs
661 elvgqlykss llddlltese dmaqrrkeaa dmlkalqgas qiiaeireth lw(SEQ IDNO:8)
其中上述序列中方框内的丝氨酸残基即表示本发明的S616位点，具体而言，所述S616位点是isoform1(如SEQ ID NO:1所示)的第616位丝氨酸；isoform 2(SEQ ID NO：2所示的序列)的第590位丝氨酸；isoform 3(SEQ ID NO：3所示的序列)的第579位丝氨酸；isoform 4(SEQ ID NO：4所示的序列)的第605位丝氨酸；isoform 5(SEQ ID NO：5所示的序列)的第629位丝氨酸；isoform 6(SEQ ID NO：6所示的序列)的第618位；isoform 7(SEQ IDNO：7所示的序列)的第413位丝氨酸；isoform 8(SEQ ID NO：8所示的序列)的第592位丝氨酸。
在本发明的一个实施方案中，Drp1蛋白被作为帕金森病的一个辅助诊断或检测标记，特别的，Drp1蛋白S616位点的磷酸化或磷酸化水平用于指示帕金森病的存在。
PINK1蛋白
术语“PINK1”或“PINK1蛋白”，即PTEN induced putative kinase 1，是存在于线粒体中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在人类基因组中，由PINK1基因所编码。
虽然PINK1是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并且参与介导了受损线粒体的自噬，进而清除受损线粒体。但是在现有技术中并不清楚PINK1在上述过程中所有的关键底物，本公开则首次披露了PINK1能够直接磷酸化Drp1蛋白，特别是在S616位点，并通过调节Drp1S616位点的磷酸化介导线粒体的动态平衡(包括线粒体的破碎(自噬))。
在一个实施方案中，所述PINK1是哺乳动物例如人的PINK1，或者是与人PINK1(如SEQ ID NO：2所示)的氨基酸序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％一致性并具有PINK1活性的肽。
在一个替代实施方案中，所述PINK1是哺乳动物PINK1或人PINK1，或者是哺乳动物PINK1或人PINK1(SEQ ID NO：9)经过替换、缺失或添加一个或更多个氨基酸并且具有PINK1活性的肽。
人PINK1的氨基酸序列如下：
1 mavrqalgrg lqlgralllr ftgkpgrayg lgrpgpaagc vrgerpgwaa gpgaeprrvg
61 lglpnrlrff rqsvaglaar lqrqfvvraw gcagpcgrav flafglglgl ieekqaesrr
121 avsacqeiqa iftqkskpgp dpldtrrlqg frleeyligq sigkgcsaav yeatmptlpq
181 nlevtkstgl lpgrgpgtsa pgegqerapg apafplaikm mwnisagsss eailntmsqe
241 lvpasrvala geygavtyrk skrgpkqlap hpniirvlra ftssvpllpg alvdypdvlp
301 srlhpeglgh grtlflvmkn ypctlrqylc vntpsprlaa mmllqllegv dhlvqqgiah
361 rdlksdnilv eldpdgcpwl viadfgccla desiglqlpf sswyvdrggn gclmapevst
421 arpgpravid yskadawavg aiayeifglv npfygqgkah lesrsyqeaq lpalpesvpp
481 dvrqlvrall qreaskrpsa rvaanvlhls lwgehilalk nlkldkmvgw llqqsaatll
541 anrltekccv etkmkmlfla nlecetlcqa alllcswraa l(SEQ ID NO:9)
磷酸化
本发明所述的“磷酸化”是指由经由蛋白质激酶的催化将ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上的过程，蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的一个普遍而且重要的机制。
现有技术中已有多种氨基酸磷酸化的检测方法，例如利用磷酸化特异性抗体，在本发明的一个实施方案中，通过Drp1 S616位点的磷酸化特异性抗体检测所述位点的磷酸化状态，所述磷酸化特异性抗体是商业化的或自行制备的单克隆抗体。或者，还可以通过通过设计核酸探针/适配体特异性进行磷酸化检测，在本发明的一个实施方案中，对Drp1S616位点即使用核酸探针或者适配体进行检测。
本发明中所述的“磷酸化水平”，是指存在于含有目标蛋白的样本中，目标蛋白的特定位点的磷酸化程度，所述磷酸化程度可以是对特定位点本身磷酸化水平进行定量或定性分析的结果，也可以是目标蛋白的特定位点中发生磷酸化的蛋白量占目标蛋白总量的比例。有多种方法可以检测目标蛋白的磷酸化程度，在本发明的一个或多个实施方案中，Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的检测方法包括但不限于免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)、分子探针法和/或质谱法。本发明所述的“磷酸化状态”是指在目标蛋白的指定位点(例如Drp1 S616位点)是否存在磷酸化修饰的事件。
免疫印迹(immunoblotting,western blot)法使用SDS-PAGE分离样品，随后转移到膜(通常是PVDF或尼龙膜)上，之后利用磷酸化特异性的抗体来鉴定目的蛋白，以确定目的蛋白的磷酸化水平。同时，还可以用一个不区分磷酸化状态的目的蛋白的抗体去检测目的蛋白的总水平，从而得到磷酸化蛋白占总目的蛋白的比例。
酶联免疫吸附分析(ELISA)对磷酸化分析的定量能力要强于Western blot，通常采用微孔板形式的分析，即首先是利用目的蛋白特异的捕获抗体(和磷酸化状态无关)结合目的蛋白。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
流式细胞术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品,通过检测标记荧光的荧光强度来确定所检测细胞或细胞因子的浓度。应用流式细胞技术检测荧光标记的磷酸化蛋白质特异性抗体可以精确测量单细胞内的多参数磷酸化，可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高了工作量。
免疫细胞化学(ICC)是指利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测，而免疫组织化学(IHC)是指对完整组织切片中的蛋白进行检测。与流式细胞术相似，都需要高亲和力、高特异性的抗体、以及阻断、对照和抗体滴定，以避免因非特异性结合而带来的不明确结果。通过流式细胞术和ICC来检测磷酸化蛋白要求蛋白是稳定的，且抗体能够接近。细胞通常经过刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交联磷酸化蛋白，使其稳定，便于分析。
质谱法也常常被用于测定蛋白质磷酸化，依据电离源的不同，可以分为基质辅助激光解析飞行时间质谱和电喷雾电离质谱。质谱仪首先将蛋白多肽离子化，因质荷比不同，多肽在进入分析器时发生分离，通过测量分离肽段离子的相关参数，运用软件实现蛋白鉴定及功能分析。磷酸化蛋白肽段常不稳定，在质谱中会由于自发亚稳态分解或碰撞诱导裂解。利用磷酸酯酶处理后，磷酸化肽段易于丢失H3PO4或HPO3，磷酸化丝氨酸或苏氨酸质量数丢失98u，而磷酸化酪氨酸由于磷酸基团连接在苯环上只丢失80u。质谱利用这些特征可以对磷酸化肽段进行鉴定。
进一步的，还可以对目的蛋白特定位点的磷酸化水平进行比较，例如比较两个样本之间所述位点的磷酸化水平的差异，从而得出某个样本相对于另一个样本的磷酸化水平较高、相同或较低的；或者比较同一个样本中进行特定处理前后或不同状态间磷酸化水平的差异。
术语“药学上可接受的载体或赋形剂”指可用于医药应用的载体或赋形剂，其一般为惰性。
具体而言，药学上可接受的载体可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体氧化硅、尿素等。此外，可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方式中，当给予患者时，活性化合物或组合物和药学上可接受的载体无菌。当静脉内给予活性化合物时，水是示范性载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油的水溶液也可用作液体载体，尤其是注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物也可含有少量湿润剂或乳化剂，或PH缓冲剂。
术语“治疗”指治疗性和预防性手段，目的是预防或减慢或治愈不良生理改变或失调，如减缓帕金森病的发展、蔓延或者完全治愈。对于本发明目的，有益或所需的临床结果包括但不限于：可检测或不可检测的症状缓解、疾病程度减轻，疾病状态稳定(即不恶化)，疾病进展延迟或减慢，疾病状态改善或减轻，以及缓解(部分或全部)。
实施例
材料与方法
材料：脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；质粒构建过程中所需各种限制性内切酶购自Thermo公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；细胞培养所用培养基DMEM-高糖培养基及胎牛血清购自Gibco公司；质粒pDsRed-mito购自于Clontech公司，pGEX4T-2购自于G.E.公司，pcDNA3.1-myc-his(-)购自于Invitrogen公司；抗体TOM20(sc-17764)购自于Santa Cruz公司，flag-tag(F7425)及β-actin(A5441)购自于Sigma-Aldrich公司；Drp1(8570)、Drp1-pS616(4494)、Drp1-pS637(6319)、PINK1(6946)及myc-tag(3936)购自于Cell signaling公司，GFP(632381)购自于Takara公司，TyrosineHydroxylase(ab76442)购自于Abcam公司；蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制购自于Selleckchem公司，其余专利中所用的相关药物均购自于Sigma-Aldrich公司。
PINK1敲除的HEK293细胞系和Drp1敲除的Hela细胞系的构建及鉴定
采用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行打靶敲除。整体流程如下：
利用CRISPR设计工具(CRISPR design[http://crispr.mit.edu/])，分别选取合适的靶向PINK1和Drp1的sgRNA(引导RNA)序列。然后，将该序列构建至pLentiCRISPR V2载体(Addgene,49535)中。将构建好的载体与pVSVg(AddGene,8454)和psPAX2(AddGene,12260)按照1：1：1的比例同时转染293T细胞，48小时后收取上清，2000rpm离心5分钟，取上清分装。用病毒上清感染目的细胞，8小时后换成正常培养基。感染48小时后，将细胞稀释接种至新的培养皿中并用含一定浓度的嘌呤霉素的培养基筛选阳性克隆，每两天换一次新鲜培养基。待克隆形成后，挑至24孔板中，并通过免疫印迹的方式进行克隆鉴定。选择至少3个细胞系进行重复实验。敲除基因PINK1的sgRNA序列为：5’-CGCCACCATGGCGGTGCGAC-3’(SEQID NO:3)；敲除基因Drp1的sgRNA序列为：5’-CCACCGTGTTGAAGACGTCC-3’(SEQ ID NO:4)。
HEK293T和Hela细胞转染：利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒，根据说明书进行。概括描述如下：
细胞贴壁后(HEK293细胞覆盖率约50％时，Hela细胞覆盖率70％时)，对细胞进行饥饿处理(将培养基换成Opti-MEM),同时滴入一定量的质粒/脂质体混合液(比例1μg/2.5μL)，一定时间后(HEK293转染时间为3小时，Hela转染时间为2小时)更换为正常培养基，24-36小时后进行后续实验；
原代神经元细胞转染：利用磷酸钙转染法进行。过程概括描述如下：
待原代神经元贴壁4天(DIV4)后，将待转染质粒与氯化钙进行混合，并缓慢滴入2×Hank's平衡盐溶液(HBSS)(pH7.05)，从而使DNA附着于形成的磷酸钙沉淀，静置10分钟后，将混合均匀的磷酸钙沉淀缓慢滴入神经元培养皿中。转染90分钟后，使用HBSS润洗细胞，并更换为正常神经元培养基。48小时后进行后续相关实验。
人源原代皮肤成纤维细胞系的建立
取正常人或患者表皮面积约1cm2大小皮肤组织转移至培养皿中。使用PBS(含双抗：100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)润洗对分离的皮肤进行润洗3遍，并转移至新的培养皿。使用剪刀去除皮下脂肪，然后其剪成更小的组织块并置于无菌的15mL离心管中，并加入胰蛋白酶(0.25％)放置于4℃冰箱中消化8-12小时。消化完成后，使用DMEM完全培养基终止消化并用尖镊轻轻揭下组织的表皮层，并将真皮层置于新的培养皿中，并使用剪刀将其剪成更小的组织块(0.1cm3)，缓慢的将剪好的组织块贴于细胞培养皿。并使用DMEM培养基保持组织块的湿润同时防止其悬浮。4-6小时后，待组织块贴壁牢固后，缓慢滴加培养基直至覆盖整个组织块。24小时后更换新鲜培养基。以后每72小时更换一次新鲜培养基。约14天后，对长出的成纤维细胞进行传代培养。
免疫印迹
利用4℃预冷的PBS轻轻洗涤细胞一次，吸去PBS。使用2×SDS Sample buffer(2％SDS,10％甘油，62.5mM Tris-HCl pH6.8,蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂)裂解细胞，95℃孵育10min，超声5秒×3次。使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。取20μg总蛋白加入上样缓冲液，95℃孵育5分钟，离心，上样。根据分子克隆所示方法制备SDS-PAGE胶，以80V恒压电泳20分钟后，改为120V恒压电泳。290mA，转膜1.5h。5％脱脂牛奶(0.1％PBST)封闭1h；一抗4℃孵育10至12h；0.1％PBST洗膜3次，每次10min；二抗室温孵育1h；0.1％PBST洗膜3次，每次10min；显影。
免疫荧光
将预先接种于放入了盖玻片的24孔板细胞进行固定处理：加入固定液(含4％多聚甲醛，10％蔗糖的磷酸盐缓冲液pH7.4)。十分钟后，使用PBS润洗3遍。加入渗透液(含0.1％TrionX-100的磷酸盐缓冲液pH7.4)，室温下静置10分钟。然后使用PBS润洗3遍并对已经透化好的细胞进行封闭处理：加入封闭液(含5％BSA的磷酸盐缓冲液pH7.4)，室温静置1小时。封闭完成后，进行一抗杂交：用封闭液稀释抗体，去除封闭液，加入抗体，室温静置1小时，或4℃过夜。洗一抗：去除一抗，用1×PBS冲洗3次，加入1×PBS，室温静置5分钟，去除1×PBS，如此重复洗5次。然后进行二抗杂交：用封闭液稀释抗体，去除封闭液，加入抗体，室温静置1小时。洗二抗：去除二抗，用1×PBS冲洗3次，加入1×PBS，室温静置5分钟，去除1×PBS，如此重复洗5次。最后进行DAPI染色：用1×PBS将DAPI稀释至1μg/ml，加入稀释好的DAPI，室温静置5分钟，去除DAPI，用1×PBS冲洗3次。润洗结束后进行封片：用去离子水冲洗一次，向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在的一面靠近载玻片，用吸水纸将多余的封片剂吸除，用指甲油固定盖玻片边缘。4℃避光保存。
Drp1蛋白质纯化
将编码人Drp1(isform1,580-736)C端结构域的cDNA插入pGEX-4T-2载体，构成重组质粒pGEX-4T-2-Drp1及其相关突变体(S616A)。将相关质粒常规转化至BL21(DE3)感受态细胞，取单菌落克隆若干植入10mL LB培养基(每升含1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g NaCl和氨苄青霉素)，37℃过夜振荡预培养后转移至1L新鲜LB培养基(含氨苄)中，37℃振荡培养3h，加IPTG(终浓度0.01mM)，继续培养3小时后收获细菌，以冰冷PBS(含蛋白酶抑制剂)悬浮细菌，超声充分破碎，向破碎的菌液中添加Triton X-100(终浓度为l％)，压力破碎。然后4℃离心(12000g，1小时)，并取上清。在上清中加入GST-beads，对上清中所需蛋白进行富集。使用预冷的PBS对beads进行润洗5遍。然后，加入含有10mM还原性谷胱甘肽(含1mM DTT)的PBS对beads上富集的蛋白进行洗脱，3遍。根据纯化蛋白的等电点选取阴离子交换层析，对纯化蛋白进行进一步纯化。最后，采用SDS-PAGE方法对蛋白质的纯度进行鉴定。
体外磷酸化
将纯化的蛋白片段(包括Drp1野生型形式以及S616A突变型)分别加入含有激酶活性的T.c.PINK1(赤拟谷盗的重组PINK1蛋白)的缓冲液中(终浓度为100μM ATP，1mM DTT,50mM pH7.4 Tris-HCl,0.1mM EGTA,10mM Mg(OA)2)，并以不含ATP的相同反应体系为阴性对照。混合均匀后，30℃反应1小时，置于95℃5分钟以终止反应。待降至室温后，将上述反应体系分别进行等分，并在其中一份中加入一定量的磷酸酶，37℃反应30分钟，加入4×SDSSample buffer(4％SDS,20％甘油，125mM Tris-HCl pH6.8，磷酸酶抑制剂)终止反应。并使用考马斯亮蓝和蛋白免疫印迹的方式鉴定。
统计分析
本专利中所使用到的统计分析均采用Prism 5software(GraphPad)软件进行统计分析。对于两组比较采用双尾Student’s t检验；对于3组或3组以上的比较，采用One-wayANOVA和Tukey's检验(用于组内两两比较)或Dunnett’s Multiple Comparison Test(用于处理组与对照组的比较)。
实施例1 PINK1可在体外直接磷酸化DRP1的S616位点
首先，对不同物种(包括人、小鼠、大鼠、狗、斑马鱼、果蝇和线虫)中DRP1氨基酸序列第612位至620位的片段进行了保守性分析，发现其中的第S616位点非常保守(参见图1a)，接下来进行了体外激酶实验，将野生型DRP1(WT)及S616位点突变体(616A)的体外重组蛋白与有激酶活性的PINK1进行体外反应，并通过蛋白电泳及免疫印迹的方法检测DRP1S616位点的磷酸化情况。结果显示，野生型DRP1的S616位点可被PINK1磷酸化(图1b和c)。
实施例2 PINK1蛋白缺失导致DRP1蛋白S616位点磷酸化水平降低
在野生型HEK293细胞系和PINK1缺失的HEK293细胞系中，分别检测了DRP1蛋白S616位点的磷酸化水平(图2)，蛋白印迹的结果显示，在野生型HEK293细胞系中，S616位点存在高水平的磷酸化，但在PINK1缺失的细胞系中(PINK1KO)，DRP1蛋白S616位点磷酸化水平则明显下降，同时DRP1蛋白的表达水平基本保持不变(图2a)，统计结果也表明，在缺失PINK1的HEK293细胞系中，S616位点磷酸化水平的下降达到了显著的程度(图2b)。进一步的，使用免疫荧光的手段在野生型HEK293细胞系和PINK1缺失的细胞系中，观察DRP1 616位点磷酸化情况，与Western blot的察结果一致，可以发现在PINK1缺失的细胞系中，S616位点的磷酸化水平显著下降(图2c和d)。
进一步的，构建了PINK1缺失的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞系)和PINK1敲除小鼠，构建结果见图1a，蛋白印迹结果表明在MEF细胞系中，敲除DRP1 616位点后，磷酸化水平显著降低(图3b和c)，而利用免疫荧光的手段观察小鼠的黑质区后，发现在野生型小鼠中，TH阳性神经细胞的DRP1中S616位点存在着广泛的磷酸化现象(图3d右栏WT行)，但是在PINK1缺失的小鼠中，DRP1蛋白S616位点的磷酸化水平显著下降(图3d右栏PINK1KO行)，蛋白印迹以及统计结果也同样证实了上述观察结果(图3e和f)。
实施例3过表达野生型PINK1蛋白能够拯救PINK1缺失的表型
接下来研究了在PINK1缺失的细胞中过表达PINK1蛋白，是否能够增加DRP1 S616位点磷酸化水平。在PINK1缺失的HEK293细胞中分别过表达野生型PINK1，或PINK1激酶活性缺失的相关突变体(D384N或G309D)或PINK1缺失线粒体定位序列的突变体(Δ110)。结果显示，在野生型PINK1蛋白能够显著提高PINK1缺失的HEK293细胞中DRP1 S616位点的磷酸化水平，使之接近野生型HEK293细胞系的磷酸化水平；然而D384N、G309D或Δ110突变体均无法恢复DRP1 S616位点磷酸化水平，本实施例进一步证实了PINK1蛋白对于DRP1 S616位点磷酸化的作用。
实施例4在PINK1缺失的原代神经元中过表达Drp1蛋白，能够恢复神经元轴突和/或树突中线粒体的形态和分布。
分别在体外培养野生型及PINK1缺失的原代神经元，并在体外培养的第四天，进行磷磷酸钙转染。在神经元中分别过表达Drp1野生型或S616A突变体(模拟Drp1 S616位点去磷酸化突变体)，同时共转mito-GFP(mito-GFP携带了定位于线粒体的定位序列，因此能特异性地定位于线粒体，通过绿色荧光即可清晰分辨线粒体形态)。转染48小时后，固定细胞，并进行荧光染色，观察不同组别神经元中线粒体的分布情况。
结果表明，在野生型的神经元中(转染空载体3.1)，线粒体呈现点状分布(图5a)，然而在PINK1缺失的原代神经元中，线粒体出现了融合，线粒体体积增大。转染了野生型Drp1的组(Drp1WT)中产生了与PINK1野生型神经元类似的线粒体形态和分布。而转染空载体组(3.1)以及Drp1 S616A突变体组(Drp1S616A)的神经元，并不能恢复到PINK1野生型中的线粒体一样的形态和分布。
为了进一步对不同基因型的线粒体形态进行分析，定义分析距离神经元胞体10μm-100μm树突中线粒体的分布情况的指标为线粒体指数(mitochondrial index％)：即线粒体的长度与相关树突长度的比例(％)，在三次不同实验批次中，每种基因型随机统计5-10个神经元，每个神经元随机统计3-5根树突神经元的分布情况，如图5b所示，PINK1缺失并转染空载体(3.1)的原代神经元，与野生型的神经元(转染空载体3.1)相比，线粒体指数显著增高，表明线粒体发生了融合。而转染了野生型Drp1的组(Drp1WT)中，线粒体指数恢复至与PINK1野生型神经元类似，然而Drp1 S616A突变体组(Drp1S616A)的神经元，则仍然保持较高的线粒体指数。这与免疫荧光的结果是相同的。
实施例5 Drp1及其S616位点的磷酸化在PINK1介导的线粒体碎裂过程中的相关作用。
发明人设计了一个体外模型，以验证Drp1及其S616位点的磷酸化在PINK1介导的线粒体碎裂过程中的相关作用，本实施例的原理见图6a。如图所示，在正常状态下，缺失线粒体定位序列、但融合了FKBP序列的重组PINK1蛋白呈现胞浆分布。FIS1-FRB由于携带线粒体定位序列能锚定FRB到线粒体上，而当使用药物Rapalog处理时，FRB、Rapalog和FRBP三者形成复合体，使得PINK1将被重新招募至线粒体外膜，而由于其本身融合有绿色荧光蛋白而使线粒体呈现绿色。
具体的，将Δ110-PINK1-GFP-FKBP和FRB-FIS1(MTS)蛋白瞬时转染入Hela野生型或DRP1敲除的细胞中，24小时后，添加Rapalog(或DMSO)处理2小时，处理结束后，利用多聚甲醛固定细胞并进行免疫荧光染色，观测细胞线粒体的变化情况，结果显示在野生型Hela细胞系中，经过Rapalog处理后，Δ110-PINK1-GFP-FKBP定位到线粒体中，并且进一步介导了线粒体的碎裂；然而在DRP1被敲除的细胞系中，虽然经过Rapalog处理后，Δ110-PINK1-GFP-FKBP同样被定为到线粒体外膜，但是却并不能介导线粒体的碎裂，因而线粒体呈现了连续的分布(图6b)。
接下来，将Δ110-PINK1-GFP-FKBP及FRB-FIS1(MTS)瞬时转染入敲除了DRP1的Hela细胞中,同时共转pcDNA3.1骨架质粒，DRP1野生型蛋白或DRP1 S616A突变型蛋白。转染24小时后，使用Rapalog(或DMSO)处理2小时，多聚甲醛固定细胞后进行免疫荧光染色，观测细胞线粒体的变化情况。结果显示，只有转入DRP1野生型蛋白后，在Δ110-PINK1-GFP-FKBP在定位到线粒体外膜时才能够进一步介导线粒体的碎裂(图6c)。
实施例6利用PD相关的果蝇模型验证Drp1及其S616位点的磷酸化与PINK1的相互关系
本实施例利用了PINK1缺失的果蝇模型(PINK1 KO，购自Bloomington StockCenter)，该果蝇具有胸部塌陷的表型(图7a中黄色箭头所示)，并且也是与人类PD症状相关的表型。通过显微注射法获得过表达人源的野生型Drp1(DrpWT)果蝇，与PINK1 KO杂交后能够恢复PINK1缺失所致的胸部塌陷表型，而模拟S616去磷酸化的突变体S616A(DrpS616A)则不能恢复(图7a)。统计图为胸部塌陷的果蝇占所有果蝇的比例(图7b)。这一方面进一步表明了Drp1的S616磷酸化作用于PINK1的下游，并且能够直接拯救PINK1的功能缺失；另一方面，由于Drp1的S616磷酸化能够恢复PD相关的果蝇模型的胸部塌陷的症状，这也表明了通过恢复Drp1的S616磷酸化，能够有效的逆转PD的表现，因此具有不可估量的治疗PD的潜在价值。
实施例7 Drp1 S616位点磷酸化可以用于指示PD。
首先，对携带PINK1基因纯合突变的PD病人进行了基因组测序，建立了测序图谱。如图显示，病人1携带有PINK1第492位点的纯合无义突变(R492X)；病人2及病人3，为混合杂合无义突变，体突变位点均分别为(R492X及R501X)(图8a-d)。利用蛋白电泳及免疫印迹检测技术，分析了携带PINK1基因纯合突变的PD病人及散发PD病人的皮肤层纤维细胞Drp1S616位点的磷酸化水平，并与正常人的皮肤层纤维细胞进行比较，可以发现不论在携带PINK1基因纯合突变的PD病人的细胞中，还是在散发PD病人的细胞中，Drp1 S616位点的磷酸化水平相比于正常人的细胞均显著下降(图8e-g)，从该结果可以看出，Drp1 S616的磷酸化(水平)与PD存在直接的密切关联，也就是说，Drp1 S616的磷酸化水平的降低即可用于指示PD的存在或者风险。
参考文献：
1.Di Monte,D.A.,Lavasani,M.,and Manning-Bog,A.B.(2002)Environmentalfactors in Parkinson's disease.Neurotoxicology 23,487-502
2.Kitada,T.,Asakawa,S.,Hattori,N.,Matsumine,H.,Yamamura,Y.,Minoshima,S.,Yokochi,M.,Mizuno,Y.,and Shimizu,N.(1998)Mutations in the parkin genecause autosomal recessive juvenile parkinsonism.Nature 392,605-608
3.Valente,E.M.,Abou-Sleiman,P.M.,Caputo,V.,Muqit,M.M.,Harvey,K.,Gispert,S.,Ali,Z.,Del Turco,D.,Bentivoglio,A.R.,Healy,D.G.,Albanese,A.,Nussbaum,R.,Gonzalez-Maldonado,R.,Deller,T.,Salvi,S.,Cortelli,P.,Gilks,W.P.,Latchman,D.S.,Harvey,R.J.,Dallapiccola,B.,Auburger,G.,and Wood,N.W.(2004)Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations inPINK1.Science 304,1158-1160
4.Zimprich,A.,Biskup,S.,Leitner,P.,Lichtner,P.,Farrer,M.,Lincoln,S.,Kachergus,J.,Hulihan,M.,Uitti,R.J.,Calne,D.B.,Stoessl,A.J.,Pfeiffer,R.F.,Patenge,N.,Carbajal,I.C.,Vieregge,P.,Asmus,F.,Muller-Myhsok,B.,Dickson,D.W.,Meitinger,T.,Strom,T.M.,Wszolek,Z.K.,and Gasser,T.(2004)Mutations in LRRK2cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.Neuron 44,601-607
5.Kane,L.A.,Lazarou,M.,Fogel,A.I.,Li,Y.,Yamano,K.,Sarraf,S.A.,Banerjee,S.,and Youle,R.J.(2014)PINK1 phosphorylates ubiquitin to activateParkin E3 ubiquitin ligase activity.J Cell Biol 205,143-153
6.Koyano,F.,Okatsu,K.,Kosako,H.,Tamura,Y.,Go,E.,Kimura,M.,Kimura,Y.,Tsuchiya,H.,Yoshihara,H.,Hirokawa,T.,Endo,T.,Fon,E.A.,Trempe,J.F.,Saeki,Y.,Tanaka,K.,and Matsuda,N.(2014)Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 toactivate parkin.Nature 510,162-166
7.Clark,I.E.,Dodson,M.W.,Jiang,C.,Cao,J.H.,Huh,J.R.,Seol,J.H.,Yoo,S.J.,Hay,B.A.,and Guo,M.(2006)Drosophila pink1 is required for mitochondrialfunction and interacts genetically with parkin.Nature 441,1162-1166
8.Park,J.,Lee,S.B.,Lee,S.,Kim,Y.,Song,S.,Kim,S.,Bae,E.,Kim,J.,Shong,M.,Kim,J.M.,and Chung,J.(2006)Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1mutants is complemented by parkin.Nature 441,1157-1161
9.Pogson,J.H.,Ivatt,R.M.,Sanchez-Martinez,A.,Tufi,R.,Wilson,E.,Mortiboys,H.,and Whitworth,A.J.(2014)The complex I subunit NDUFA10selectivelyrescues Drosophila pink1 mutants through a mechanism independent ofmitophagy.PLoS Genet 10,e1004815
10.Morais,V.A.,Haddad,D.,Craessaerts,K.,De Bock,P.J.,Swerts,J.,Vilain,S.,Aerts,L.,Overbergh,L.,Grunewald,A.,Seibler,P.,Klein,C.,Gevaert,K.,Verstreken,P.,and De Strooper,B.(2014)PINK1 loss-of-function mutations affectmitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.Science344,203-207
11.Geisler,S.,Holmstrom,K.M.,Skujat,D.,Fiesel,F.C.,Rothfuss,O.C.,Kahle,P.J.,and Springer,W.(2010)PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependenton VDAC1 and p62/SQSTM1.Nat Cell Biol 12,119-131
12.Narendra,D.P.,Jin,S.M.,Tanaka,A.,Suen,D.F.,Gautier,C.A.,Shen,J.,Cookson,M.R.,and Youle,R.J.(2010)PINK1 is selectively stabilized on impairedmitochondria to activate Parkin.PLoS Biol 8,e1000298
13.Vives-Bauza,C.,Zhou,C.,Huang,Y.,Cui,M.,de Vries,R.L.,Kim,J.,May,J.,Tocilescu,M.A.,Liu,W.,Ko,H.S.,Magrane,J.,Moore,D.J.,Dawson,V.L.,Grailhe,R.,Dawson,T.M.,Li,C.,Tieu,K.,and Przedborski,S.(2010)PINK1-dependentrecruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy.Proc Natl Acad Sci U S A107,378-383
14.Zhang,T.,Xue,L.,Li,L.,Tang,C.,Wan,Z.,Wang,R.,Tan,J.,Tan,Y.,Han,H.,Tian,R.,Billiar,T.R.,Tao,W.A.,and Zhang,Z.(2016)BNIP3 Protein SuppressesPINK1 Kinase Proteolytic Cleavage to Promote Mitophagy.J Biol Chem 291,21616-21629
15.Yun,J.,Puri,R.,Yang,H.,Lizzio,M.A.,Wu,C.,Sheng,Z.H.,and Guo,M.(2014)MUL1 acts in parallel to the PINK1/parkin pathway in regulatingmitofusin and compensates for loss of PINK1/parkin.Elife 3,e01958
16.Yu,W.,Sun,Y.,Guo,S.,and Lu,B.(2011)The PINK1/Parkin pathwayregulates mitochondrial dynamics and function in mammalian hippocampal anddopaminergic neurons.Hum Mol Genet 20,3227-3240
17.Deng,H.,Dodson,M.W.,Huang,H.,and Guo,M.(2008)The Parkinson'sdisease genes pink1 and parkin promote mitochondrial fission and/or inhibitfusion in Drosophila.Proc Natl Acad Sci U S A 105,14503-14508
18.Poole,A.C.,Thomas,R.E.,Andrews,L.A.,McBride,H.M.,Whitworth,A.J.,and Pallanck,L.J.(2008)The PINK1/Parkin pathway regulates mitochondrialmorphology.Proc Natl Acad Sci U S A 105,1638-1643
19.Yang,Y.,Ouyang,Y.,Yang,L.,Beal,M.F.,McQuibban,A.,Vogel,H.,and Lu,B.(2008)Pink1 regulates mitochondrial dynamics through interaction with thefission/fusion machinery.Proc Natl Acad Sci U S A 105,7070-7075
20.Flippo,K.H.,and Strack,S.(2017)Mitochondrial dynamics in neuronalinjury,development and plasticity.J Cell Sci 130,671-681
21.Liu,W.,Acin-Perez,R.,Geghman,K.D.,Manfredi,G.,Lu,B.,and Li,C.(2011)Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery viamitochondrial fission.Proc Natl Acad Sci U S A 108,12920-12924

Claims (10)

1.一种帕金森病的辅助诊断试剂，其包括检测Drp1蛋白磷酸化或磷酸化水平的试剂，所述Drp1蛋白磷酸化或磷酸化水平是指PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂提高后的Drp1蛋白S616位点的磷酸化或磷酸化水平。
2.根据权利要求1所述的辅助诊断试剂，其中所述检测的方法包括免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、酶联免疫吸附法ELISA和/或质谱法。
3.根据权利要求1所述的辅助诊断试剂，其中所述检测Drp1蛋白磷酸化的试剂是抗体、特异性结合多肽或小分子，所述试剂能够区分Drp1蛋白S616位点的磷酸化状态。
4.一种帕金森病的辅助诊断试剂盒，其包括权利要求1至3中任一项所述的辅助诊断试剂。
5.根据权利要求1至3任一项所述的辅助诊断试剂在制备帕金森病的辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
6.一种用于治疗帕金森病的药物，其中包含能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂；
所述试剂为PINK1，或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
7.一种筛选治疗帕金森病的药物的方法，包括使待测物与包含Drp1蛋白的样品接触，检测所述样品中PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂提高后的Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平，与未与待测物接触的样品相比，所述磷酸化水平的提高指示所述待测物是治疗帕金森病的潜在药物，
所述检测的方法包括免疫印迹、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、免疫酶联和/或质谱法。
8.能够提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的试剂在制备治疗帕金森病的药物中的用途，所述试剂是为PINK1，或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
9. PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂在制备提高Drp1蛋白S616位点磷酸化水平的试剂或试剂盒中的用途。
10.一种提高Drp1蛋白S616位点的磷酸化水平的方法，其包括：
将包含Drp1蛋白的样品暴露于PINK1或者能够提高PINK1活性或表达量的试剂。
CN202080005864.6A 2019-03-19 2020-03-11 一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂 Active CN113227788B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019102086122 2019-03-19
CN201910208612 2019-03-19
PCT/CN2020/078736 WO2020187104A1 (zh) 2019-03-19 2020-03-11 一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113227788A CN113227788A (zh) 2021-08-06
CN113227788B true CN113227788B (zh) 2023-11-21

Family

ID=72519675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080005864.6A Active CN113227788B (zh) 2019-03-19 2020-03-11 一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113227788B (zh)
WO (1) WO2020187104A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661032A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 生物远景技术有限公司 帕金森病的生物标志物
EP3109636A1 (en) * 2014-02-18 2016-12-28 Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science Biomarker for parkinson's disease and use therefor

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011053825A2 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for the treatment or prevention of mitochondrial diseases
GB201206382D0 (en) * 2012-04-11 2012-05-23 Univ Dundee Parkinson's disease biomarker
CA2890485A1 (en) * 2012-11-07 2014-05-15 Vib Vzw Restoring phosphorylation of a novel pink1 substrate to treat parkinson's disease
US9861596B2 (en) * 2012-11-09 2018-01-09 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for treating neurological diseases or injury
US9265788B2 (en) * 2013-02-26 2016-02-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for treatment of mitochondrial diseases
CN108034714A (zh) * 2017-12-29 2018-05-15 北京泱深生物信息技术有限公司 Arhgap26基因在制备帕金森诊断工具中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661032A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 生物远景技术有限公司 帕金森病的生物标志物
EP3109636A1 (en) * 2014-02-18 2016-12-28 Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science Biomarker for parkinson's disease and use therefor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rojeen Shahni等.Signal transducer and activator of transcription 2 deficiency is a novel disorder of mitochondrial fission.《BRAIN》.2015,第138卷(第10期),第2834-2846页. *
Toward a new STATe: The role of STATs in mitochondrial function;Meier JA等;《Semin Immunol》;第26卷;第20-28页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020187104A1 (zh) 2020-09-24
CN113227788A (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. M-Phase Phosphoprotein 9 regulates ciliogenesis by modulating CP110-CEP97 complex localization at the mother centriole
Stefanini et al. Trichothiodystrophy: from basic mechanisms to clinical implications
Geisler et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations
Madeo et al. Tyrosine phosphorylation regulates cell cycle-dependent nuclear localization of Cdc48p
JP2023081919A (ja) チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患を処置するための方法及び医薬組成物
Myer et al. Absence of polo-like kinase 3 in mice stabilizes Cdc25A after DNA damage but is not sufficient to produce tumors
Hachimi et al. Smoothelin-like 2 inhibits coronin-1B to stabilize the apical actin cortex during epithelial morphogenesis
CN113227788B (zh) 一种辅助诊断和治疗帕金森病的方法和试剂
CN110237257B (zh) Ube3a泛素化PP2A激活因子PTPA在治疗天使综合症和孤独症中的应用
Bardetti et al. Cytoplasmic retention and degradation of a mitotic inducer enable plant infection by a pathogenic fungus
Cai et al. USP25 contributes to defective neurogenesis and cognitive impairments
Marchesan et al. Activation of Ca2+ phosphatase Calcineurin regulates Parkin translocation to mitochondria and mitophagy in flies
Eroglu et al. Dusp26 phosphatase regulates mitochondrial respiration and oxidative stress and protects neuronal cell death
US20160031955A1 (en) Methods for Treating Mitochondrial Disorders and Neurodegenerative Disorders
Lu et al. Dual effects of α-synuclein on neurotoxicity induced by low dosage of rotenone are dependent on exposure time in dopaminergic neuroblastoma cells
US20230374518A1 (en) Marf/mfn modulators and uses thereof
Azuma et al. and Toshiki Mizuno
WO2016025533A2 (en) Compositions and methods for treating synucleinopathies
Boehm Molecular investigations of the pathogenesis of Leber congenital amaurosis
Corral Serrano Molecular insights into PCARE-associated retinal disease
Chen et al. Ubiquitin phosphorylation accelerates protein aggregation and promotes neurodegeneration in the aging brain
Gómez-Deza et al. DLK-dependent axonal mitochondrial fission drives degeneration following axotomy
ABE Localization of NDR2 to peroxisomes and its role in primary cilium formation
De Pins Pathophysiological role of Pyk2 in the nervous system
Soueid A Functional Characterization of SPG7 and Its Relation to KIF1C in Accelerating Neurodegeneration in Childhood Hereditary Spastic Paraplegia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant