ES2272010T3 - Variantes alelicas de la stat3 humana. - Google Patents

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Abstract

Una variante alélica de la proteína STAT3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.

Description

Variantes alélicas de la STAT3 humana.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una variante alélica de la STAT3 humana, a la secuencia de cDNA que la codifica, a su uso en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias, así como a composiciones farmacéuticas que la comprenden.
Antecedentes de la invención
Las proteínas Transductoras de Señal y Activadoras de la Transcripción (STAT) son una clase nueva de factores de transcripción intracelulares que desempeñan una función esencial en las respuestas celulares frente a las citoquinas (Stahl y col., 1994; Gouilleux y col., 1995; Azam y col., 1995; Tian y col., 1994; May y col., 1996; y Iwatsuki y col., 1997).
La mayoría de estas proteínas se encuentran perfectamente caracterizadas mediante secuenciación, y sus estructuras así como sus mecanismos de acción se han analizado extensamente y se encuentran muy bien documentados (Wegenka y col., 1993; Akira y col., 1994; Wegenka y col., 1994; Quelle y col., 1995 y Silva y col, 1996).
Estas proteínas contienen dominios SH2 y SH3 así como un sitio de fosforilación en su región carboxi-terminal (Kapetein y col., 1996; y Herman y col., 1996). Después de la activación del receptor de citoquinas a través de una unión de ligando, la porción intracelular del receptor se fosforila por acción de una quinasa asociada de la familia
JAK.
Las proteínas STAT se unen luego al receptor fosforilado, a través de sus dominios SH2 y son a su vez fosforiladas por acción de las JAK (Stahl y col., 1995). Las proteínas STAT fosforiladas después dimerizan y se desplazan hacia el núcleo, en donde son capaces de reconocer elementos de respuesta específicos de DNA (Seidel y col., 1995; y Harroch y col., 1994).
Se ha identificado la STAT3 como un importante mediador de la señal impartida por la familia de citoquinas IL-6, así como por el EGF y por varias otras interleuquinas y factores de crecimiento.
Se ha demostrado que la STAT3 desempeña un papel central en la regulación por aumento de proteínas hepáticas de fase aguda (Wegenka y col., 1993; y Zhang y col., 1996) en la parada del crecimiento de los monocitos (Yamanaka y col., 1996; y Minami y col., 1996) así como en la supervivencia de las células de mieloma (Harroch y col., 1994).
J. Biol. Chem., de 31 de Mayo de 1996, págs. 13221-13227, Caldenhoven E. y col., "STAT3\beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription", describe la proteína STAT3\beta humana. Además se describe una molécula de DNA que codifica dicha STAT3\beta y un vector de expresión en una célula hospedadora encargada de la producción recombinante de la proteína.
El documento EP 0 676 469 rescribe el factor de respuesta de fase aguda humano (APRF) (del inglés, "Acute Phase Response Factor") que transmite la señal de transcripción desde el receptor de IL-6 hasta el gen inducible por IL-6. Se describe también una molécula de DNA que codifica la proteína, un vector de expresión que comprende dicha molécula de DNA, una célula hospedadora que comprende dicho vector de expresión y un procedimiento recombinante para preparar dicha proteína.
Descripción de la invención
Durante experimentos realizados sobre el análisis de las interacciones de STAT3, los autores de la invención han amplificado mediante RT-PCR a partir de células HepG2, un fragmento de cDNA que corresponde al dominio SH2 de la STAT3 humana. Han encontrado mediante secuenciación del DNA que el dominio SH2 aislado muestra una divergencia de 13 residuos frente a la correspondiente secuencia del gen original publicado de la STAT3 humana (Akira y col., 1994).
Con el fin de determinar la naturaleza de esta variante de la secuencia, los autores de la invención han diseñado tres pares de cebadores con extremos 3' que corresponden a las posiciones de nucleótidos en divergencia entre las dos secuencias de cDNA humanas.
De estas investigaciones se obtuvo que la nueva variante corresponde a al menos el alelo más frecuente de la STAT3 humana.
Por lo tanto, el objetivo principal de esta invención es la variante alélica anteriormente mencionada de la proteína STAT3 humana, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, o una sal funcionalmente equivalente, o un derivado funcionalmente equivalente, o una fracción activa o una proteína de fusión.
La definición de "sal", según aquí se utiliza, se refiere tanto a sales de los grupos carboxilo como a las sales de las funciones amino del compuesto, obtenibles a través de métodos conocidos. Las sales de los grupos carboxilo comprenden sales inorgánicas como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, y sales con bases orgánicas como las formadas con una amina tal como trietanolamina, arginina o lisina. Las sales de los grupos amino comprenden, por ejemplo, sales con ácidos inorgánicos como el ácido clorhídrico, y con ácidos orgánicos tales como el ácido acético.
La definición de "derivado", según aquí se utiliza, se refiere a derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos N-terminal o C-terminal conforme a métodos conocidos y están comprendidos en la invención cuando son farmacéuticamente aceptables, es decir, cuando no destruyen la actividad de la proteína o cuando no confieren toxicidad a las composiciones farmacéuticas que los contienen. Esos derivados incluyen por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y N-acil-derivados de grupos amino libres, u O-acil-derivados de grupos hidroxilo libres, y se forman con grupos acilo como por ejemplo grupos alcanoilo o aroilo.
Por "fracción activa" de la proteína de la presente invención se hace referencia a cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptídica del propio compuesto, solo o en combinación con moléculas relacionadas o con residuos unidos a ella, por ejemplo, residuos de azúcares o fosfatos, o agregados de la molécula polipeptídica cuando esos fragmentos o precursores muestran la misma actividad como medicamento de la proteína de la invención.
La definición de "proteína de fusión", según aquí se utiliza, se refiere a polipéptidos que comprenden el polipéptido de la invención anteriormente especificado, fusionado con otra proteína y que poseen una semivida de más larga duración en los fluidos corporales. Puede por ejemplo estar fusionado con otra proteína tal como, por ejemplo, una inmunoglobulina.
Otro objetivo de la invención es la molécula de DNA que comprende la secuencia de DNA que codifica la variante alélica de la invención, incluyendo secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales.
"Secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales" incluye todas las otras secuencias de ácido nucleico que, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican las secuencias de aminoácidos mencionadas. En particular, la presente invención se refiere a la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 1.
La presente invención también se refiere a moléculas de DNA recombinante que se hibridan con la secuencia de DNA que codifica la variante alélica de la hSTAT3 anteriormente mencionada y cuyas secuencias de nucleótidos muestran al menos las mismas 13 diferencias en el dominio SH2 (con respecto a la secuencia de la STAT3 humana que se expone en Akira y col., 1994), mostradas en la Figura 1. El gen puede contener, o no contener, los intrones naturales y se puede obtener por ejemplo mediante extracción a partir de las células apropiadas y purificación con métodos conocidos.
Además, la presente invención también incluye moléculas de DNA recombinante que se hibridan en condiciones rigurosas con una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de hibridación y de los posteriores lavados a las que las personas con una experiencia ordinaria en la técnica se refieren convencionalmente como "rigurosas". Véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, supra. Interscience, N. Y., pare. 6,3 y 6,4 (1987, 1992), y Sambrook y col., 1989. Sin suponer una limitación, ejemplos de condiciones rigurosas incluyen condiciones de lavado de 12ºC-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio, p.ej., en SSC 2X y SDS al 0,5% durante 5 minutos, SSC 2X y SDS al 0,1% durante 15 minutos; SSC 0,1X y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30-60 minutos y a continuación SSC 0,1X y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos. Las personas con una experiencia ordinaria en la técnica saben que las condiciones rigurosas también dependen de la longitud de las secuencias de DNA, de las sondas oligonucleotídicas (tales como de 10-40 bases) o de la mezcla de sondas oligonucleotídicas. Si se usa una mezcla de sondas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Véase Ausubel, supra.
La invención también incluye vectores de expresión que comprenden los DNA anteriormente mencionados, células hospedadoras transformadas con esos vectores y un procedimiento de preparación de esa variante alélica de la hSTAT3, sus fragmentos activos o sus proteínas de fusión, a través del cultivo en medios de cultivo apropiados de dichas células transformadas.
La secuencia de DNA que codifica la proteína de la invención se puede insertar y ligar en un plásmido adecuado. Una vez formado, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora adecuada, que expresa luego el(los) vector(es) para producir la proteína deseada.
La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención aquí mencionadas se puede efectuar en células eucariotas (p.ej., levaduras, células de insectos o de mamíferos) o en células procariotas, usando los vectores de expresión apropiados. Se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, las moléculas de DNA que codifican las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriormente mencionados se insertan en vectores de expresión construidos adecuadamente mediante métodos muy conocidos en la técnica (véase Sambrook y col., 1989). La secuencia de cDNA bicatenaria se liga a vectores plasmídicos mediante técnicas de formación de colas de homopolímeros o mediante ligación por restricción que implica el uso de fragmentos de DNA conectores sintéticos o mediante técnicas de ligación de extremos romos: Para ligar las moléculas de DNA se usan DNA-ligasas y las uniones no convenientes se evitan mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con el fin de poder expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicas que contienen información de regulación transcripcional y de regulación traduccional, ligadas al DNA que codifica la proteína deseada de manera tal que permiten la expresión génica y la producción de la proteína. Primero en orden con respecto al gen que se ha de transcribir, éste debe ir precedido por un promotor reconocible por la RNA-polimerasa, al que la polimerasa se une y con ello inicia el proceso de transcripción. Existe una variedad de estos promotores en uso, que trabajan con diferentes eficiencias (promotores fuertes y promotores débiles).
En el caso de hospedadores eucariotas, se pueden utilizar diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Estas secuencias pueden derivar de fuentes víricas, tales como de adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de Simios o virus similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Son ejemplos el promotor de TK del Herpes virus, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de levaduras, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de la iniciación de la transcripción que permiten la represión y la activación, de manera que la expresión de los genes se puede modular.
La molécula de DNA que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la invención se inserta en un(os) vector(es), que tiene(n) las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción operativamente ligadas, y que es capaz de integrar las secuencias de los genes deseados en la célula hospedadora.
Las células que han sido transformadas de manera estable con el DNA introducido, se pueden seleccionar introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador también puede proporcionar fototrofía a un hospedador auxotrofo, resistencia a biocidas, p.ej., antibióticos o metales pesados tales como cobre, o biocidas similares. El gen del marcador de selección puede, o estar directamente ligado a las secuencias de DNA de los genes que han de ser expresadas, o introducirse en la misma célula mediante co-transfección. Para la síntesis óptima de las proteínas de la invención, también pueden necesitarse elementos adicionales.
Los factores de importancia en la selección de un plásmido o de un vector vírico particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas entre las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se requieren en un hospedador particular; y si es conveniente poder "transportar" el vector entre células hospedadoras de diferentes especies.
Una vez que el(los) vector(es) o la secuencia de DNA que contiene la construcción (construcciones) ha sido preparado para la expresión de la construcción (construcciones) de DNA, puede ser introducido en una célula hospedadora apropiada mediante cualquiera de los diversos medios convenientes: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.
Las células hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Se prefieren hospedadores eucariotas, p.ej., células de mamíferos, tales como células humanas, de mono y de ovario de hámster chino (CHO), debido a que proporcionan modificaciones post-traduccionales a moléculas de proteínas, que incluyen el plegamiento correcto o la glicosilación en sitios correctos. También las células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones post-traduccionales de péptidos, que incluyen la glicosilación. Existen varias estrategias con DNA recombinante que utilizan secuencias de promotores fuertes y un número elevado de copias de los plásmidos que pueden ser utilizados para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias conductoras en los productos génicos clonados procedentes de mamíferos y secreta péptidos que portan secuencias conductoras (es decir, pre-péptidos).
Después de la introducción del vector(es), las células hospedadoras se cultivan en un medio selectivo, que selecciona con respecto al crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de la(s) secuencia(s) génica clonada da como resultado la producción de las proteínas deseadas.
La purificación de las proteínas recombinantes se lleva a cabo mediante uno cualquiera de los métodos conocidos con este fin, es decir, mediante alguno de los procedimientos convencionales que implican extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o procedimientos similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede usar para purificar la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína diana y que se producen e inmovilizan en una matriz de gel contenida en una columna. Las preparaciones no puras que contienen la proteína recombinante se hacen pasar a través de la columna. La proteína se unirá a la columna por medio del anticuerpo específico mientras que las impurezas pasarán a través de la columna. Después de los lavados, la proteína es eluida del gel con un cambio en el pH o en la fuerza iónica.
Como ya se ha afirmado, la proteína de la invención es útil en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias. Por lo tanto, en un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y/o enfermedades inflamatorias.
El medicamento se presenta preferiblemente en forma de una composición farmacéutica que comprende la proteína de la invención junto con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Esas composiciones farmacéuticas constituyen todavía un aspecto más de la presente invención.
La invención se describirá ahora por medio de los Ejemplos que vienen a continuación, que no deben ser interpretados como que limiten en modo alguno la presente invención. Los Ejemplos hacen referencia a las Figuras que se especifican aquí más adelante.
Descripción de las figuras
Figura 1: Muestra una comparación de la secuencia de cDNA del dominio SH2 de la STAT3 humana depositada en EMBL-GB, con los correspondientes fragmentos de cDNA de células HepG2 humanas y de células de hígado de ratón. La secuencia de nucleótidos de 424 pb mostrada y su numeración proceden del dominio SH2 de la secuencia de cDNA de la STAT3 humana depositada en la base de datos EMBL-GB (Akira y col., 1994). Los nucleótidos en divergencia identificados en los cDNA de células HepG2 humanas (esta solicitud de patente) y de células de hígado de ratón (Akira y col., 1994) se describen encima de la secuencia completa, en negrilla y subrayados. También en negrilla y subrayado sobre la secuencia completa se indica el cambio de nucleótido que produce una variación en aminoácido, una Leucina codificada en la secuencia depositada que es sustituida por una Valina en la nueva secuencia de esta solicitud de patente. Los cebadores US0; LS0; US1; LS1; LS2; US3; LS3; US4 y LS4, usados en reacciones de RT-PCR, están indicados con una flecha en negrilla encima de las secuencias.
Figura 2. Describe la secuencia de nucleótidos completa de la STAT3 humana aislada de células HepG2 humanas, en particular la región codificadora.
A. Estrategia de la secuenciación. B. Secuencia de nucleótidos completa. Los nucleótidos en divergencia con la secuencia conocida publicada se muestran en negrilla y subrayados. Los residuos de aminoácidos modificados con respecto a la secuencia publicada se muestran debajo de la secuencia de nucleótidos.
Figura 3: Muestra el análisis de la expresión de la hSTAT3 originalmente publicada y los nuevos cDNA variantes de hSTAT3. El RNA se extrajo con el reactivo Trizol, se sometió a transcripción inversa con oligo (dT) y la reacción de PCR analítica se llevó a cabo con la Taq polimerasa en tubos capilares, según se describe en los Ejemplos.
A. Productos de PCR amplificados con el par de cebadores US1/LS1 específicos para la secuencia original de la hSTAT3 publicada.
B. Productos de PCR amplificados con el par de cebadores US3/LS3 específicos para la nueva variante de secuencia de la hSTAT3 encontrada en esta solicitud de patente. Pistas: M) Marcadores de tamaño molecular. 1) RNA de hígado. 2) RNA de bazo. 3) RNA de útero. 4) RNA de pulmón. 5) RNA de piel. 6) RNA procedente de células de sangre de cordón umbilical. 7) RNA de fibroblastos dérmicos. 8) RNA de corazón sin transcriptasa inversa. 9) RNA de corazón. 10) RNA de hígado fetal sin transcriptasa inversa. 11) RNA de hígado fetal. 12) RNA de intestino delgado sin transcriptasa inversa. 13) RNA de intestino delgado. 14) RNA de placenta sin transcriptasa inversa. 15) RNA de placenta.
Figura 4. Muestra la amplificación de un molde de DNA artificial con cebadores US1/LS1. El molde de DNA artificial compuesto por el fragmento de secuencia variante de la hSTAT3, flanqueado en su extremo 5' por la secuencia del cebador US1 y en su extremo 3' por la secuencia del cebador LS1, se creó mediante una PCR preparativa, usando los cebadores US4/LS4, a partir del cDNA de HepG2 (en el que sólo la secuencia variante pudo ser amplificada, dato no mostrado), según se describe en la sección Materiales y métodos. El molde artificial se sometió a fraccionamiento en gel de agarosa al 2% y la banda relevante de 285 pb se purificó con el kit de extracción de DNA en gel de agarosa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Este molde se adicionó luego en distintas concentraciones a 1 \mul del cDNA relevante (originado a partir de aproximadamente 100 ng del RNA correspondiente). Pistas: M) Marcadores de tamaño molecular. 1) No adición. 2) 0,3 fg de molde artificial adicionado. 3) 3 fg de molde artificial adicionado. 4) 30 fg de molde artificial adicionado. 5) 300 fg de molde artificial
adicionado.
Figura 5. Muestra el análisis por PCR de la hSTAT3 original y del nuevo fragmento variante de la secuencia genómica de la hSTAT3. Se usaron 40 ng de DNA genómico humano en reacciones de PCR analítica llevadas a cabo en tubos capilares, según se describe en la sección Materiales y métodos. Pistas: M) Marcadores de tamaño molecular. 1, 4) DNA genómico amplificado con el par de cebadores US1/LS1, específicos para la secuencia original de hSTAT3 publicada. 2) DNA genómico amplificado con el par de cebadores US1/LS2, específicos para la secuencia original de hSTAT3 publicada. 3) DNA genómico amplificado con el par de cebadores US3/LS3, específicos para la nueva secuencia variante de la hSTAT3. 5, 6, 7, 8) DNA genómico amplificado con el par de cebadores US1/LS1 y al que se han adicionado 0,3 fg, 3 fg, 30 fg y 300 fg, respectivamente, del molde de DNA artificial amplificado con
US4/LS4.
Ejemplos Materiales y métodos Materiales
La línea celular HepG2 de hepatoma humano procedió de la ATCC (Rockville, MD, EE.UU.). RNA humano total procedente de corazón, hígado, hígado fetal, intestino delgado y placenta, y DNA genómico humano se obtuvieron procedentes de Clontech (Palo Alto, CA, EE.UU.). Los otros RNA usados en esta solicitud de patente se prepararon en el laboratorio de los autores de la invención.
La Pfu polimerasa procedió de Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.); la Taq DNA-polimerasa procedió de Advanced Biotechnology, Leatherhead, Reino Unido. El kit de secuenciación de DNA procedió de Perkin Elmer (Applied Biosystems Division, Foster City, CA, EE.UU.); La transcriptasa inversa SuperScript II (200 U/\mul) y el reactivo Trizol para la extracción de RNA procedieron de Gibco (Grand Island, NY, EE.UU.).
Cebadores oligonucleotídicos
Todos los cebadores usados en esta solicitud de patente fueron diseñados en el laboratorio de los autores de la invención utilizando el programa OLIGO (National Biosciences, Plymouth, MN, EE.UU.) con el fin de optimizar la especificidad de la amplificación por PCR de secuencias de nucleótidos molde que difieren en solamente uno o unos cuantos nucleótidos.
Todos los cebadores fueron sintetizados en el laboratorio de los autores de la invención, con un 392 DNA/RNA Synthesizer procedente de Perkin Elmer (Applied Biosystems Division, Foster City, CA, EE.UU.). Un primer par de cebadores, US0/LS0, se usó para aislar los 424 pb que contienen el dominio SH2 completo del cDNA de la STAT3 humana.
Las secuencias de nucleótidos de todos los cebadores usados se muestran a continuación.
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1 
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La posición de los cebadores US0/LS0 en la secuencia de la hSTAT3 se muestra en la Figura 1.
Los cebadores adicionales para aislar el cDNA completo de la STAT3 humana fueron: Cebador STAU, Cebador STAL, Cebador STBU y Cebador STBL.
Dos pares de cebadores adicionales, denominados US1/LS1 y US1/LS2, que amplifican productos de 285 pb y 111 pb respectivamente, fueron exclusivamente específicos para la secuencia original publicada del cDNA de la STAT3 humana (Akira y col., 1994), pero no para la secuencia variante de la hSTAT3 que se ha encontrado en esta solicitud de patente. Al menos uno de los nucleótidos en divergencia entre la secuencia de la STAT3 publicada y la secuencia variante de la STAT3 estaba situada en el extremo 3' de cada cebador.
El par de cebadores US3/LS3 fue exclusivamente específico para la secuencia variante de la hSTAT3 descrita en esta solicitud de patente. Este par de cebadores US3/LS3 sí amplificó un fragmento de 111 pb de manera específica en la secuencia variante de la hSTAT3, que se corresponde con la secuencia amplificada por los cebadores US1/LS2 en la secuencia original publicada del cDNA de la hSTAT3.
Se ha usado un par de cebadores de validación, US4/LS4, para crear un molde artificial de la hSTAT3 de 285 pb que corresponde al producto esperado de los cebadores US1/LS1.
RNA y RT-PCR
Se preparó RNA total procedente de células HepG2 humanas mediante el método de Bimboim (Bimboim, 1988). En el caso de los demás tejidos y células, el RNA se extrajo con el reactivo Trizol disponible procedente de Gibco, Grand Island, NY, USA, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se usó un oligo (dT) para actuar como cebador en la transcripción inversa de 5 \mug de RNA total con 200 U de la transcriptasa inversa (RT) (del inglés, "Reverse Transcriptase") SuperScript II en 50 \mul de mezcla de reacción. La reacción de la RT se llevó a cabo a 37ºC durante 1 h y 30 min. Después se realizó una PCR preparativa usando los productos de la RT como los moldes de cDNA. Las mezclas de reacción de la PCR contenían 10 \mul de cDNA, 50 pmoles de cada cebador (véase más adelante), 2,5 unidades de la Pfu polimerasa de Stratagene, una concentración 0,2 mM de cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos, 10 \mul de tampón para Pfu, en un volumen de reacción de 100 \mul, cubierto con 50 \mul de aceite mineral.
La amplificación se realizó normalmente durante 30 ciclos con un perfil de temperaturas de 45 segundos a 94ºC (desnaturalización), 45 segundos de 50ºC a 60ºC (reasociación) y 5 minutos a 72ºC (extensión). Los productos de la PCR se purificaron mediante centrifugación a través de 100 filtros de Microcon (Amicon) y después se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en tampón de Tris/borato/EDTA. Las PCR analíticas se realizaron en tubos capilares, con la misma concentración de reactivos anteriormente descrita, en un volumen diez veces menor, a excepción de la Pfu polimerasa que se sustituyó con 0,5 U de Taq polimerasa. El perfil de temperaturas fue 94ºC para la desnaturalización, 55ºC para la reasociación y 72ºC para la extensión.
Secuenciación de DNA
Los productos resultantes de la PCR de la STAT3 se secuenciaron según se representa en la Figura 2. Las secuencias de DNA se realizaron con el método didesoxi, usando un kit de secuenciación de DNA (Perkin Elmer (Applied Biosystems Division, Foster City, CA, EE.UU.) en un secuenciador automático ABI modelo 373A, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de nucleótidos de todos los fragmentos de cDNA se determinaron a partir de la secuenciación de las dos cadenas de cDNA. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se compararon con las de GenBank y la base de datos Swiss-Prot.
Resultados y discusión Aislamiento y secuenciación de un fragmento de cDNA que codifica la STAT3 humana
Con el fin de aislar el dominio SH2 de la STAT3 humana, los autores de la invención han amplificado mediante RT-PCR un fragmento de cDNA de 424 pares de bases que corresponden a las posiciones de nucleótidos entre la 1909 y la 2332 de la secuencia de cDNA publicada de la STAT3 de placenta humana (Akira y col., 1994), usando RNA total procedente de células HepG2.
Este fragmento resultante de la PCR se insertó después en un vector de expresión, y se determinó la secuencia de nucleótidos. Los resultados (Figura 1) mostraron que 13 residuos de nucleótidos diferían de la secuencia original del cDNA de placenta humana. La mayoría de los 13 residuos modificados estaban localizados en la posición del tercer codón, no produciendo ningún cambio en la correspondiente secuencia de aminoácidos.
Solamente uno de los residuos de nucleótidos mutados produjo la sustitución de la leucina de la posición 667 en la proteína STAT3 humana con una valina (Figura 1). Se han amplificado luego a partir de células HepG2, dos fragmentos de cDNA adicionales que corresponden a la región codificadora completa del cDNA de la STAT3 humana. La secuenciación de estos fragmentos (Figura 2) mostró que los 43 nucleótidos en su totalidad eran divergentes con la secuencia publicada, lo que corresponde a un total de 6 cambios de aminoácidos (Akira y col.,
1994).
Se sabe que las secuencias consenso publicadas de la STAT3 humana y la STAT3 de ratón difieren en 172 nucleótidos, mientras que la nueva secuencia de la STAT3 humana que aquí se presenta difiere en 193 residuos con la secuencia de ratón (Raz y col., 1994; Akira y col., 1994; Zhong y col., 1994).
Por lo tanto, con respecto a los nucleótidos, la nueva secuencia de la STAT3 humana arroja una distancia evolutiva ligeramente aumentada con la secuencia de ratón. Una región que varía entre los nucleótidos 1680 y 1940 de la secuencia humana original, mostró una elevada conservación de nucleótidos entre hombre y ratón. Esa conservación se pierde cuando se considera la nueva secuencia humana presentada en esta solicitud de patente.
Por el contrario, con respecto a los aminoácidos, la nueva secuencia humana está más estrechamente relacionada con la secuencia de ratón. Los seis cambios en la nueva secuencia de aminoácidos de la STAT3 humana restituyen los residuos originales correspondientes de ratón (y rata), de manera que solamente uno de los residuos está ahora en divergencia entre la secuencia humana y la secuencia consenso de 770 aminoácidos de la STAT3 de ratón: el ácido glutámico de la posición 760 de la secuencia humana está sustituido con un ácido aspártico en la secuencia de ratón. La secuencia de STAT3 codificada resulta ser ahora por lo tanto una de las más conservadas entre los determinantes genéticos conocidos. Como dato de referencia, las proteínas STAT1 y STAT5 humanas y de ratón difieren en 67 y 29 residuos de aminoácidos respectivamente.
Se sabe que la STAT3, al igual que otros miembros de la familia STAT, se une a varias proteínas diferentes con el fin de realizar múltiples funciones (Darnell, 1997). El dominio SH2 de STAT3 interacciona con la porción intracelular de moléculas receptoras transductoras de señales, mientras que la región C-terminal es importante para la activación y dimerización (Sasse y col., 1997), y la región central es importante para la unión a DNA. (Horvath y col.,
1995).
Entre los seis cambios de aminoácidos descritos en la presente solicitud de patente, uno de ellos cae dentro de la región N-terminal, en la posición 288. El segundo cambio de aminoácido cae en la posición 460, en el dominio de unión a DNA. Dos cambios adicionales caen dentro del dominio SH3, en la posición 548 y 561 respectiva-
mente.
Finalmente, dos cambios de aminoácidos más caen dentro del dominio SH2 en la posición 667 y dentro de la región C-terminal en la posición 730 respectivamente (véase la Figura 2).
Caracterización de la nueva variante de la secuencia de STAT3
Con el fin de determinar la naturaleza de la nueva variante de secuencia que aquí se presenta, se han diseñado tres pares de cebadores con extremos 3' que corresponden a posiciones de nucleótidos en divergencia entre las dos secuencias de cDNA humanas. El primer y el segundo par de cebadores (US1/LS1 y US2/LS2) fueron exclusivamente específicos para la secuencia de nucleótidos original publicada del cDNA de la hSTAT3, mientras que el tercer par de cebadores (US3/LS3) fue exclusivamente específico para la nueva secuencia de nucleótidos variante de la STAT3 humana, determinada por los autores de la invención.
Se han usado los dos pares de cebadores US1/LS1 y US3/LS3 (específicos para la secuencia original y para la nueva secuencia variante respectivamente) para amplificar los RNA de 11 tejidos humanos diferentes en 22 reacciones independientes de RT-PCR. Cada una de las fuentes de RNA estudiadas derivó de materiales reunidos procedentes de 1 a 17 individuos, con un total de 31 individuos analizados.
Debido a que la secuencia original de cDNA de la hSTAT3 derivaba de placenta humana, este tejido se incluyó entre las 11 fuentes de DNA ensayadas. Como se muestra en la Figura 3, solamente el par de cebadores específico para la nueva variante de secuencia fue capaz de amplificar los once RNA ensayados, dando como resultado el producto de amplificación esperado, mientras que no pudo obtenerse ninguna banda significativa en ninguno de los RNA ensayados con los cebadores correspondientes a la secuencia original publicada de la hSTAT3. Ya que los cebadores US1/LS1 no dieron como resultado ningún producto de amplificación significativo, se quiso verificar si este fallo era debido a un defecto de los cebadores, ya fuera en su capacidad intrínseca para reasociarse al molde apropiado, o en su capacidad para actuar como cebadores en la reacción de amplificación.
En otras palabras, los autores de la invención quisieron validar el par de cebadores US1/LS1. Los cebadores de la validación, US4/LS4, se diseñaron para que correspondieran exactamente con los cebadores US1/LS1, pero teniendo cada cebador una extensión 3' que corresponde con la secuencia variante de la hSTAT3 determinada en este
trabajo.
La amplificación daría entonces como resultado un molde híbrido artificial compuesto por el fragmento de la secuencia variante de la hSTAT3, con sus extremos 5' y 3' idénticos a los de los cebadores US1 y LS1 respectivamente. Este molde artificial debería permitir una amplificación efectiva con los cebadores US1/LS1, incluso en ausencia del molde de DNA natural correspondiente (es decir, el fragmento original publicado de cDNA de la hSTAT3 de
285 pb).
Este molde artificial se obtuvo mediante PCR con los cebadores US4/LS4, y se adicionó a concentraciones diferentes en cDNA de placenta humana y en otros cDNA humanos. Los cebadores US1/LS1 se usaron luego para amplificar estos cDNA que llevan la adición, y un producto de la PCR del tamaño esperado se obtuvo con facilidad (Figura 4). Este resultado por lo tanto excluía un fallo del par de cebadores US1/LS1 en la reacción de amplificación.
\newpage
Se han usado después los pares de cebadores US1/LS1, US1/LS2 y US3/LS3 para amplificar el DNA genómico humano. El producto de amplificación esperado se obtuvo de nuevo solamente con el par de cebadores específico para la nueva secuencia variante que los autores de la invención han determinado (Figura 5).
Se ha demostrado que las secuencias de proteína de la STAT3 de ratón y de la STAT3 humana revisada están altamente conservadas, habiendo solamente un único residuo en divergencia entre las dos especies sobre 770 residuos de aminoácido de longitud total.
No se pudo detectar la secuencia de nucleótidos de la hSTAT3 originalmente descrita por Akira y col. (Akira y col., 1994) en ninguna de las fuentes genómicas humanas ni de cDNA humano que se han estudiado. La secuencia de nucleótidos original publicada y la nueva secuencia variante no son por lo tanto genes diferentes ni variantes de corte y empalme presentes al mismo tiempo en el mismo genoma, ya que solamente una de las secuencias (la secuencia identificada en esta solicitud de patente se detectó en cada una de las fuentes de ácidos nucleicos humanas ensayadas. Las dos variantes de la secuencia de la hSTAT3 pudieran ser alelos diferentes.
En este caso sin embargo, la nueva secuencia variante es probable que sea predominante, ya que estaba representada en todas las muestras de ácidos nucleicos ensayadas, derivadas de un total de 31 individuos. La secuencia original publicada de la hSTAT3 no estaba representada en todos estos individuos.
Referencias bibliográficas
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11. Kapetein, A., et al., (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 5961-5964;
12. May, P., et al., (1996) FEBS Lett. 394, 221-226;
13. Minami, M., et al., (1996) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 3963-3966;
14. Quelle, F.W., et al., (1995) Molecular & Cellular Biology 15, 3336-3343;
15. Raz, R., et al., (1994) Journal of Biological Chemistry 269, 24391-24395;
16. Sasse, J. et al., (1997) Mol. Cell Biol. 17, 4677-4686;
17. Seidel, H.M., et al., (1995) Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 92, 3041-3045;
18. Shi, W., et al., (1996) International Immunology 8, 1205-1211;
19. Silva, C.M., et al., (1996) Molecular Endocrinology 10, 508-518;
20. Stahl, N., et al., (1994) Science 263, 92-95;
21. Stahl, N., et al., (1995) Science 267, 1349-1353;
22. Tian, S.S., et al., (1994) Blood 84, 1760-1764;
23. Wegenka, U.M., et al., (1993) Mol. Cell Biol. 13, 276-288;
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25. Yamanaka, Y., et al., (1996) EMBO Journal 15, 1557-1565;
26. Zhang, D., et al., (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 9503-9509;
27. Zhong, Z., et al., (1994) Science 264, 95-98.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ASR HOLDING N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: CURACAO
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: NINGUNO
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 599-9-639300
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 599-9-614129
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: NINGUNO
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VARIANTE ALÉLICA DE LA STAT3 HUMANA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release Núm. 1.0, Versión 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2334 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..2310
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2
3
4
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 770 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 423 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..423
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..423
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/nota= "dominio SH2 de la secuencia publicada de la hSTAT3 (Akira y col.)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 423 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..423
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..423
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/nota= "dominio SH2 de la STAT3 murina"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACACCATGG CCTGGCTAGA CAATATCATC GACCTTGTGA AAAAGTA 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATATGGAT CCTGGGGCAG CGCTACCTGG GTCAGCTTC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCCCGGAAG CTTCACACGC GCAGCCCCGG CTTCT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTCATCACT TTTGTGTTTG TGCCCAGAAT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACAAAGACT CTGGGGACGT TGCAGCTCTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGTCCTCG AGTATCTTTC TGCAGCTTCC GTTCT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAAGGGTAC ATCATGGGTT TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGGATAGA GATAGACAAG TGGAGACAA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCCTTCTT TGCTGCTTTC ACTGAAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAGGGTAC ATCATGGGCT TT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCCTTCTT TGCTGCTTTC ACTGAATCTT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAAGGGTAC ATCATGGGTT TCATCAGTAA GGA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGGATAGA GATAGACAAG TGGAGACAAC AGGATAT 
\hfill
37

Claims (14)

1. Una variante alélica de la proteína STAT3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. Una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
3. La proteína según la reivindicación 1 ó 2, en forma de una sal, un derivado, o una proteína de fusión.
4. La proteína según la reivindicación 1 ó 2, fusionada con una inmunoglobulina.
5. Una molécula de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 1 ó 2.
6. Una molécula de DNA recombinante que se hibrida en condiciones rigurosas, es decir, SSC 2X y SDS al 0,5% durante 5 minutos, SSC 2X y SDS al 0,1% durante 15 minutos; SSC 0,1X y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30-60 minutos y a continuación SSC 0,1X y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos, con una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
7. Uso de una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para la detección de una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
8. Una molécula de DNA según la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
9. Un vector de expresión que comprende una molécula de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones de 5 a 6, u 8.
10. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.
11. Un procedimiento recombinante para preparar la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, que comprende cultivar en un medio de cultivo apropiado las células de la reivindicación 10.
12. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, para usar como medicamento.
13. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y/o enfermedades inflamatorias.
14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína definida en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, junto con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
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