ES2270998T3 - Procedimiento para la preparacion de hidrogeles a base de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un hidrogel hidrófilo polimerizado hinchable en agua que comprende: (a) proporcionar una solución acuosa que contiene un bis (carbonato de nitrofenilo) de PEG; (b) proporcionar una solución de una proteína de origen vegetal, de origen marino o de leche en una solución acuosa no tamponada en condiciones básicas que son proporcionadas por una base fuerte, seleccionada de entre el grupo constituido por LiOH, NaOH, KOH, RbOH y CsOH, (c) hacer reaccionar las soluciones de (a) y (b) con el fin de inducir la polimerización.
Description
Procedimiento para la preparación de hidrogeles
a base de proteínas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de hidrogeles a base de proteínas.
Más específicamente, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de hidrogeles bioartificiales en
solución acuosa con un contenido elevado de agua reticulando una
proteína de origen vegetal (tal como la proteína de soja
hidrolizada o la proteína de trigo hidrolizada), de la leche (tal
como caseína) o de origen marino (tal como proteína de pescado o
algas) con glicoles bifuncionalizados de polietileno. La invención
comprende además los hidrogeles producidos por este proceso y su
utilización en una variedad de aplicaciones farmacéuticas, médicas
y cosmecéuticas.
Los hidrogeles son matrices de polímeros de
origen sintético o natural que contienen una gran cantidad de agua
(normalmente superior a 50% de su peso). Presentan capacidad para
hincharse y normalmente no se disuelven en agua (1). En términos
generales, los hidrogeles se preparan mezclando polímeros hidrófilos
en condiciones que permitan interacciones físicas entre los
polímeros, o la reticulación tridimensional de estos polímeros en
un grado suficiente para formar un gel. Los hidrogeles
bioartificiales o semisintéticos pueden también prepararse mediante
la adición covalente de agentes bifuncionales a las proteínas de
modo que las proteínas se reticulan para formar una matriz
tridimensional.
Se ha utilizado una amplia variedad de monómeros
o polímeros en la formación de biomatrices. Los más frecuentes son
metacrilato de 2-hidroxietilo, denominada HEMA,
poli(etilenglicol) y poli(óxido de etileno), denominados PEG
y PEO, respectivamente (2). Los polímeros HEMA, PEG y PEO presentan
ventajas en la preparación de biomatrices ya que son estables en
las condiciones de pH, temperatura y salinidad encontradas
normalmente en los medios bio-
lógicos (3).
lógicos (3).
E. M. D'urso y G. Fortier prepararon y
caracterizaron hidrogeles formados por la combustión de albúmina de
suero bovino (BSA) con PEG en solución alcalina (3, 4). En estos
hidrogeles, las moléculas de proteína servían como puntos de
anclaje y se reticulaban entre sí mediante la utilización de PEG
bifuncionalizado. El grado de reticulación era par-
cialmente dependiente del número de grupos lisil amino accesibles disponible en las superficies de las proteínas (6).
cialmente dependiente del número de grupos lisil amino accesibles disponible en las superficies de las proteínas (6).
Los hidrogeles resultantes eran translúcidos y
brillantes y demostraban propiedades mecánicas en condiciones
húmedas muy similares a un gel de poliacrilamida (4). También
presentaban buena retención de BSA (0,4 a 0,5 mg) de BSA/mg de
PEG), un contenido elevado de agua (aproximadamente 97%) y buena
hidrofilia, haciéndoles muy adecuados para las aplicaciones
biomédicas, particularmente en vista de la baja inmunogenicidad
asociada a las proteínas modificadas con PEG (3, 5). Además, la
alta porosidad de los hidrogeles permitió la difusión proteica, lo
que sugiere que los hidrogeles podrían utilizarse como sistemas de
administración controlada por macromoléculas (3).
La patente US nº 5.514.379 (Weissleder et
al.) da a conocer la síntesis de hidrogeles biocompatibles y
biodegradables que utilizan proteínas o polisacáridos con agentes de
reticulación tales como los derivados polivalentes de polietileno o
polialquilenglicol. Más específicamente, los agentes de reticulación
se seleccionan de entre el grupo siguiente: éster
bis-hidroxisuccinimida de diácido y
polialquilenglicol ("PAG"), éster
bis-hidroxisulfosuccinimida de diácido y PAG,
bis-imidato de diácido y PAG,
bis-imidazolida de diácido y PAG,
bis-imidazolida de PAG, bis-haluro
de PAG, bis-cloranhídrido de PAG y diácido, bis
(n-amino alquil) de PAG y bis
(polioxialquilen-bis, o bis benzooxazolida de PAG).
La reacción entre el agente de reticulación y una proteína, tal como
BSA, tiene lugar en solución de DMSO. Se dice que los hidrogeles
resultantes son adecuados para la carga con marcadores de
diagnóstico (tales como fármacos quimioterapéuticos, antibióticos o
células que producen agentes terapéuticos). Otra aplicación
sugerida consiste en
la utilización de estos hidrogeles en detección por imagen durante los procedimientos de intervención de un paciente.
la utilización de estos hidrogeles en detección por imagen durante los procedimientos de intervención de un paciente.
La patente US nº 5.733.563 (Fortier) da a
conocer la preparación en solución básica de hidrogeles
bioartificiales constituidos por una mezcla tridimensional
reticulada de un óxido de polietileno bifuncionalizado con una
proteína de tipo albúmina. El óxido de polietileno bifuncionalizado
es preferentemente polietilenglicol y la proteína de tipo albúmina
se selecciona de entre varias fuentes, tal como BSA, lactoalbúmina y
ovoalbúmina. La patente comprende un procedimiento para la
preparación de los hidrogeles, los hidrogeles y varias aplicaciones
para los hidrogeles.
Las características físicas de los hidrogeles
han conducido a su utilización de numerosas maneras, incluyendo
como implante de materiales (7), lentes de contacto (8) y vendas (9)
y como soportes para la liberación controlada de medicaciones
(10).
Un inconveniente principal encontrado en los
procedimientos disponibles actualmente es su tiempo de reacción
lento, haciéndoles inconvenientes y/o inadecuados para la producción
en masa de hidrogeles. Dichos procedimientos utilizan típicamente
sistemas de tampón (tal como tampones de fosfato o borato) para
tener una reacción de reticulación controlada y para obtener
resultados reproducibles. El pH constante que puede obtenerse
mediante la utilización de un tampón inhibe las variaciones que
pueden absorberse entre diferentes lotes de materias primas. Sin
embargo, la utilización de un tampón también presenta un impacto
sobre la dinámica de la reacción de reticulación, produciendo
tiempos de reacción prolongados que son poco prácticos para
producciones a gran escala.
Existe por lo tanto necesidad de un
procedimiento más rápido y menos costoso para la preparación de
hidrogeles con un contenido alto de agua que sean adecuados para
numerosas aplicaciones farmacéuticas, médicas y cosmecéuticas.
Se ha descubierto actualmente que la síntesis de
hidrogeles procedente de la reticulación de una proteína de origen
vegetal (como por ejemplo proteína de soja hidrolizada o proteína de
trigo hidrolizado), de la leche (tal como caseína) o de origen
marino (como proteína de pescado o algas) con bis(carbonato
de nitrofenilo) de PEG puede realizarse convenientemente utilizando
una base fuerte en solución acuosa sin un sistema de tampón.
Por consiguiente, los nuevos hidrogeles poseen
muchas propiedades ventajosas tales como retención de la forma,
memoria de la forma y alto contenido en agua (superior a
aproximadamente 95% (p/p) referido al peso en seco del hidrogel).
Los nuevos hidrogeles poseen asimismo buenas propiedades mecánicas y
ópticas. Los hidrogeles poseen además una variedad de
características (biocompatibilidad, liberación controlada de
medicaciones o fármacos, superficie hidrófila, permeabilidad al
oxígeno y porosidad controlada) que les harían muy adecuados para
aplicaciones farmacéuticas, médicas y cosmecéuticas.
De manera ventajosa, la selección de una
proteína de origen vegetal o de la leche (como por ejemplo la
proteína de soja hidrolizada, la proteína de trigo hidrolizada o la
caseína) al reaccionar con bis(carbonato de nitrofenilo) de
PEG permite la preparación de hidrogeles translúcidos con un alto
contenido en agua (>95%) a un coste mínimo. Estas proteínas se
pueden obtener fácilmente de diferentes fuentes y por consiguiente
son significativamente menos costosas que las proteínas de animales
(tal como BSA) que se han utilizado anteriormente para preparar
biogeles bioartificiales. Además, las proteínas de origen vegetal o
de la leche están exentas de priones y virus que pueden estar
presentes en las proteínas derivadas de la sangre, tal como BSA.
Estas propiedades hacen a estas proteínas muy convenientes para la
producción de hidrogeles a gran escala.
La presente invención proporciona por
consiguiente un procedimiento para la preparación de hidrogeles, los
nuevos hidrogeles producidos de este modo y una variedad de
aplicaciones farmacéuticas, médicas y cosmecéuticas basadas en
estos nuevos hidrogeles.
Los nuevos hidrogeles son geles hidrófilos
polimerizados que están constituidos esencialmente por una mezcla
reticulada de: (a) un bis(carbonato de nitrofenilo) de PEG: y
(b) una proteína de origen vegetal (como por ejemplo proteína de
soja hidrolizada o proteína de trigo hidrolizada), de la leche (tal
como caseína) o de origen marino (como proteína de pescado o
algas).
Preferentemente, la proteína es proteína de soja
hidrolizada, proteína de trigo hidrolizada o caseína.
Una variedad de aplicaciones farmacéuticas,
médicas y cosmecéuticas para los nuevos hidrogeles se ha previsto
asimismo y se reivindican métodos para la preparación de los
productos relacionados con las aplicaciones.
Otros objetivos, ventajas y características de
la presente invención resultarán evidentes a partir de la lectura,
haciendo referencia a los dibujos adjuntos, de la descripción no
limitativa siguiente de las formas de realización preferidas de la
misma.
En las figuras adjuntas:
La Figura 1 es una composición de las cinéticas
de reacción cuando se polimerizan hidrogeles de
PEG-soja en solución de NaOH 0,15 N, solución NaOH
0,13 N, solución NaOH 0,12 N y solución NaOH 0,09 N;
la Figura 2 es una comparación entre las
cinéticas de reacción para los hidrogeles de
PEG-soja sintetizados en solución NaOH 0,12 N,
solución NaOH 0,09 N y solución tampón de borato 200 mM pH 9,4;
la Figura 3 pone de manifiesto la
correspondencia entre el momento en que las soluciones comienzan a
solidificar y el tiempo final de la polimerización para la síntesis
de hidrogeles de PEG-soja;
la Figura 4 es una comparación gráfica de los
porcentajes de PEG y de proteína de soja hidrolizada no incorporados
en los hidrogeles resultantes cuando se inicia la reacción ya sea
en presencia de una base fuerte o en solución tampón de borato;
la Figura 5 es una comparación de las cinéticas
de reacción cuando los hidrogeles PEG-caseína se
polimerizan en solución NaOH 0,20 N, solución NaOH 0,19 N y
solución NaOH 0,15 N;
la Figura 6 es una comparación de las cinéticas
de reacción cuando los hidrogeles PEG-caseína se
polimerizan en solución NaOH 0,19 N, solución NaOH 0,15 N y
solución tampón de borato 200 mM a pH 9,4;
la Figura 7 presenta la correlación lineal entre
el tiempo de solidificación inicial y el tiempo final de
polimerización para los hidrogeles de PEG-caseína
preparados en solución de NaOH;
la Figura 8 es una comparación gráfica de los
porcentajes de PEG y de caseína no incorporados en los hidrogeles
resultantes cuando se inicia la reacción ya sea en presencia de una
base fuerte o en solución tampón de borato;
la Figura 9 presenta el efecto de la fuerza
iónica de la solución sobre el contenido en agua (C_{w})
de los hidrogeles producidos mediante el procedimiento de la
invención;
la Figura 10 presenta el efecto de la fuerza
iónica de la solución sobre la absorción de agua (C_{u})
de los hidrogeles producidos mediante el procedimiento de la
invención;
la Figura 11 presenta los efectos de las fuerzas
iónicas de las soluciones de tampón de fosfato sobre los volúmenes
de expansión de los hidrogeles producidos mediante el procedimiento
de la invención;
la Figura 12 presenta los efectos del pH de la
solución sobre el contenido en agua (C_{w}) de los
hidrogeles producidos mediante el procedimiento de la
invención;
la Figura 13 presenta los efectos del pH de la
solución sobre la absorción de agua (C_{u}) de los
hidrogeles producidos mediante el procedimiento de la
invención;
la Figura 14 presenta el efecto del pH de las
soluciones de tampón de fosfato y borato sobre los volúmenes de
expansión de los hidrogeles producidos mediante el procedimiento de
la invención; y
la Figura 15 presenta la absorción relativa de
4-nitrofenol y del azul de metileno por los
hidrogeles en función del tiempo.
Según la invención, el PEG se activó en primer
lugar con cloroformato de 4-nitrofenilo para obtener
el carbonato de PEG-dinitrofenilo (o
PEG-(NPC)^{2}), reactivo adecuado para la reacción con
grupos aminos, de la manera descrita brevemente a continuación.
El PEG con un PM de 8 kDa se preparó en Fluka y
se adquirió en Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville,
Ontario, Canadá). El cloroformato de 4-nitrofenilo
era de Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) y se utilizó tal
como se recibe. Todos los demás reactivos químicos y bioquímicos
eran de las calidades más puras disponibles.
Los carbonatos de
PEG-dinitrofenilo se obtuvieron utilizando el método
de Laliberté y Fortier (11). Específicamente, antes de su
utilización, el PEG se deshidrató disolviendo 1,0 mmoles de PEG en
acetonitrilo y calentando a reflujo a 80ºC durante 24 horas en un
extractor Soxhlet^{TM} que contenía 2,0 g de sulfato de sodio
anhidro. La solución deshidratada que contenía 1,0 mmoles de PEG se
activó en presencia de por lo menos 10,0 mmoles de cloroformato de
4-nitrofenilo en acetonitrilo que contiene hasta 5,0
mmoles de trietilamina. La mezcla de reacción se calentó a 60ºC
durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se filtró y el
carbonato de PEG-dinitrofenilo sintetizado se
precipitó añadiendo éter dietílico a temperatura ambiente y
enfriando la solución a 4ºC. El porcentaje de activación se evaluó
siguiendo la liberación de 4-nitrofenol en el PEG
activado en solución de tampón de borato 0,1 M, pH 8,5, a 25ºC. La
reacción de hidrólisis se controló a 400 nm hasta obtener una
absorbancia constante. La pureza se calculó basándose en la relación
de la cantidad de 4-nitrofenol liberada y la
detectada por espectrofotometría frente a la cantidad de
4-nitrofenol que se espera que se libere por peso
de PEG activado utilizado para el experimento. La pureza de los
productos finales se observó que era de aproximadamente 100%.
Para los presentes fines están disponibles
carbonatos de PEG-dinitrofenilo comerciales
adecuados (Sharewater, Huntsville, Alabama, USA).
Se adquirió proteína de soja en ADM Protein
Specialties (Decatur, Illinois).
Se preparó proteína de soja hidrolizada por
reacción con PEG de la siguiente manera. Se preparó una solución al
10% (p/v) combinando proteína anhidra con agua destilada y
homogeneizando en un mezclador. La temperatura de la solución
obtenida se aumentó a 80ºC y se añadieron 2,15 moles de HCl por kg
de proteína de soja. La solución resultante se agitó intensamente
durante 4 horas a 80ºC y se dejó enfriar a temperatura ambiente. El
pH de la solución se aumentó a continuación entre 9 y 10 añadiendo
NaOH mientras se continuaba agitando fuertemente. El pH de la
solución se disminuyó posteriormente hasta aproximadamente 4 y el
precipitado obtenido como resultado de la disminución del pH se
recogió por centrifugación a 2.000 G durante 10 minutos. El
precipitado que contenía la proteína de soja hidrolizada se lavó
dos veces eliminando el sobrenadante, mezclando con un volumen
equivalente de agua destilada y centrifugando la solución obtenida a
2.000 G durante 10 minutos. El precipitado final de proteína de
soja hidrolizada se disolvió en un volumen de 1 a 5 ml de agua
destilada por g de proteína y la solución se equilibró a pH 7. La
solución neutra se hidrolizó para obtener un polvo anhidro.
Para reticular covalentemente el PEG activado
con proteína de soja hidrolizada, se disolvió la proteína de soja
hidrolizada a una concentración de aproximadamente 3,5% a
aproximadamente 8% (p/v) en una solución acuosa que contenía una
base fuerte (tal como NaOH, KOH, LiOH, RbOH y CsOH). Esta solución
se combinó con una solución acuosa de PEG bifuncionalizado que
presenta una concentración comprendida entre aproximadamente 2% y
aproximadamente 30% (p/v). La solución resultante se mezcló
intensamente hasta que tuvo lugar la homogeneización. Se observó la
polimerización completa en periodos comprendidos entre
aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos,
dependiendo del volumen de base añadido.
La Figura 3 pone de manifiesto la
correspondencia entre los momentos en que las soluciones comienzan a
solidificar y el momento final de la polimerización. Como se pone
de manifiesto en las Figuras 1 y 2, la velocidad con la que tiene
lugar la polimerización o la reticulación aumenta significativamente
cuando se utilizan bases fuertes. Debe indicarse que la cantidad de
base fuerte añadida a la solución de PEG-soja para
obtener un tiempo de polimerización dado variará dependiendo de las
fuentes de proteína de soja hidrolizada y de PEG utilizadas. Por
consiguiente, siempre que se utilice proteína de soja hidrolizada o
PEG procedente de una serie o lote diferente, es preferible
realizar experimentos de prueba preliminares para optimizar las
condiciones experimentales antes de preparar grandes cantidades de
hidrogeles de PEG-soja.
Se activó PEG con cloroformato de
4-nitrofenilo para obtener carbonato de
PEG-dinitrofenilo, tal como se describió
anteriormente en relación con el hidrogel de
PEG-soja. (Alternativamente, pudo haberse utilizado
carbonato de PEG-dinitrofenilo disponible en el
mercado para preparar los hidrogeles).
La caseína se adquirió en la American Casein
Company of Burlington, New Jersey.
Para reticular covalentemente el PEG activado
con proteína de soja hidrolizada, se disolvió la proteína de soja
hidrolizada a una concentración de aproximadamente 3% a
aproximadamente 9% (p/v) en una solución acuosa que contenía una
base fuerte (tal como NaOH, KOH, LiOH, RbOH y CsOH). Esta solución
se combinó con una solución acuosa de PEG bifuncionalizado que
presenta una concentración comprendida entre aproximadamente 3% y
aproximadamente 30% (p/v). La solución resultante se mezcló
intensamente hasta que se produjo la homogeneización. Se observó la
polimerización completa en periodos comprendidos entre
aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos,
dependiendo del volumen de base añadido.
La Figura 7 pone de manifiesto la
correspondencia entre los momentos en que las soluciones comienzan a
solidificar y el momento final de la polimerización. Como se pone
de manifiesto en las Figuras 5 y 6, la velocidad con la que tiene
lugar la polimerización o la reticulación aumenta significativamente
cuando se utilizan bases fuertes. Obsérvese que la cantidad de base
fuerte añadida a la solución de PEG-caseína para
obtener un tiempo de polimerización dado variará dependiendo de las
fuentes de caseína y de PEG utilizadas. Por consiguiente, siempre
que se utilice caseína o PEG procedente de una serie o lote
diferente, es preferible realizar experimentos de prueba
preliminares para optimizar las condiciones experimentales antes de
preparar grandes cantidades de hidrogeles de
PEG-caseína.
La caseína procedente de numerosas leches
debería ser adecuada para la preparación de hidrogeles según el
presente método, como lo serían otras proteínas derivadas de la
leche. De hecho, en un experimento de la prueba, se observó que la
proteína de la leche completa no reacciona con el PEG
bifuncionalizado para formar un hidrogel, aunque el gel resultante
presentaba propiedades mecánicas débiles. Asimismo, las proteínas de
un origen marino, tal como la proteína de la leche y algas, es de
esperar que formen hidrogeles con propiedades similares.
Se activó PEG con cloroformato de
4-nitrofenilo para obtener carbonato de
PEG-dinitrofenilo, tal como se describió
anteriormente en relación con el hidrogel de
PEG-soja. (Alternativamente, pudo haberse utilizado
carbonato de PEG-dinitrofenilo disponible en el
mercado para preparar los hidrogeles).
Se adquirió proteína de trigo en ADM Protein
Specialties (Decatur, Illinois).
La proteína de trigo hidrolizada para la
reacción con PEG se preparó de la misma manera que la proteína de
soja hidrolizada (descrita anteriormente).
Para reticular covalentemente el PEG activado
con proteína de trigo hidrolizada, se disolvió la proteína de soja
hidrolizada a una concentración de aproximadamente 8% a
aproximadamente 12% (p/v) en una solución acuosa que contenía una
base fuerte (tal como NaOH, KOH, LiOH, RbOH y CsOH). Esta solución
se combinó con una solución acuosa de PEG bifuncionalizado que
presenta una concentración comprendida entre aproximadamente el 13%
y aproximadamente el 15% (p/v). La solución resultante se mezcló
intensamente hasta que se produjo la homogeneización. Se observó la
polimerización completa en periodos comprendidos entre
aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos,
dependiendo del volumen de base añadido.
Obsérvese que la cantidad de base fuerte añadida
a la solución de PEG-trigo para obtener un tiempo de
polimerización dado variará dependiendo de las fuentes de proteína
de trigo y de PEG utilizadas. Por consiguiente, siempre que se
utilice proteína de trigo o PEG procedente de una serie o lote
diferente, es preferible realizar experimentos de prueba
preliminares para optimizar las condiciones experimentales antes de
preparar grandes cantidades de hidrogeles de
PEG-trigo.
Como apreciará un experto en la materia, pueden
sustituirse otras proteínas vegetales por proteína de soja o de
trigo en la preparación de hidrogeles como se describe en la
presente memoria sin apartarse de la esencia y el espíritu de la
invención. Experimentando con varios tipos de proteína, se ha
determinado que la cantidad de carbohidrato acoplado a la proteína
puede tener un efecto directo sobre la idoneidad de una fuente dada.
Por ejemplo, los experimentos realizados con proteína de guisante
(que presentan un gran contenido de carbohidrato) produjeron
hidrogeles con propiedades mecánicas más débiles.
En las condiciones especificadas de la solución,
el contenido en agua (C_{w}) y la absorción de agua
(C_{u}) de un hidrogel sintetizado pueden evaluarse
comparando el peso del hidrogel anhidro (W_{0}) con el
peso del hidrogel en estado hinchado (W_{sw}). El contenido
en agua y la absorción de agua se calcularon utilizando las
siguientes ecuaciones que se extrajeron del trabajo de Richard J.
LaPorte (14):
(1)C_{w}=[(W_{sw}-W_{0})/W_{sw}]
\times
100
(2)C_{u}=[(W_{sw}-W_{0})/W_{0}]
\times
100
La síntesis de los hidrogeles de
PEG-soja, PEG-caseína o
PEG-trigo que utilizan NaOH como catalizador se
caracterizan por dos factores: el tiempo de solidificación, que
corresponde al tiempo en el que la solución de polimerización es
demasiado viscosa para ser moldeada o formada en una forma deseada y
el tiempo final (o tiempo de terminación) de polimerización, que se
corresponde con el tiempo en el que el hidrogel puede lavarse con
pérdida mínima de PEG y proteína.
Para evaluar los tiempos de solidificación en
relación con una determinada cantidad de NaOH, se utiliza una
prueba de identificación sencilla en las diferentes formulaciones de
hidrogeles.
Ejemplo
1
Para los hidrogeles preparados de PEG de 8 kDa y
proteína de soja hidrolizada (9% y 6%, respectivamente), se
prepararon dos soluciones: 20 ml de PEG-(NPC)^{2} de 8 kDa
al 18% en agua y 20 ml de proteína de soja hidrolizada al 13,3% en
agua. La solución de proteína de soja hidrolizada se diluyó en 30
muestras de 450 \mul, y las muestras se ajustaron para dar una
concentración de proteína final de 12% añadiendo 50 \mul de un
volumen apropiado de NaOH para obtener una normalidad de NaOH
comprendida entre 0,01 N y 0,3 N en las diferentes muestras. La
solución de PEG-(NPC)^{2} se separó también en 30 muestras
de 500 \mul. A las diferentes muestras de PEG-(NPC)^{2},
se añadieron y mezclaron 500 \mul de proteína de soja hidrolizada
a diferentes normalidades de NaOH. La solución de los dos polímeros
se dejó en reposo y se anotó el tiempo de solidificación para una
normalidad de NaOH específica. Cuando la solidificación fue mayor de
10 minutos, la solución no se siguió observando porque los
hidrogeles normalmente no solidifican pasado este tiempo o presentan
pocas propiedades mecánicas si es que las presentan.
Dos horas después del mezclado de los dos
polímeros, las propiedades mecánicas del hidrogel se evaluaron
cualitativamente utilizando la escala siguiente: muy consistente,
consistente, moderadamente consistente, débilmente consistente y
blando.
Ejemplo
2
Para los hidrogeles preparados de PEG de 8 kDa y
caseína (9% y 7%, respectivamente), se prepararon dos soluciones:
20 ml de PEG-(NPC)^{2} de 8 kDa al 18% en agua y 20 ml de
caseína al 15,6% en agua. La solución de caseína se diluyó en 30
muestras de 450 \mul, y las muestras se ajustaron para dar una
concentración de proteína final de 14% añadiendo 50 \mul de un
volumen apropiado de NaOH para obtener una normalidad de NaOH
comprendida entre 0,01 N y 0,3 N en las diferentes muestras. La
solución de PEG-(NPC)^{2} se separó también en 30 muestras
de 500 \mul. A las diferentes muestras de PEG-(NPC)^{2},
se añadieron y mezclaron 500 \mul de caseína a diferentes
normalidades de NaOH. La solución de los dos polímeros se dejó en
reposo y se anotó el tiempo de solidificación para una normalidad
de NaOH específica. Cuando la solidificación fue superior a 10
minutos, la solución no se siguió observando porque los hidrogeles
normalmente no solidifican pasado este tiempo o presentan pocas
propiedades mecánicas si es que las presentan.
Dos horas después del mezclado de los dos
polímeros, las propiedades mecánicas del hidrogel se evaluaron
cualitativamente utilizando la escala siguiente: muy consistente,
consistente, moderadamente consistente, débilmente consistente y
blando.
Ejemplo
3
Para los hidrogeles preparados de PEG de 8 kDa y
proteína de trigo hidrolizada (14% y 9%, respectivamente), se
prepararon dos soluciones: 20 ml de PEG-(NPC)^{2} de 8 kDa
al 28% en agua y 20 ml de proteína de trigo hidrolizada al 20% en
agua. La solución de proteína de trigo hidrolizada se diluyó en 30
muestras de 450 \mul, y las muestras se ajustaron para dar una
concentración de proteína final del 18% añadiendo 50 \mul de un
volumen apropiado de NaOH para obtener una normalidad de NaOH
comprendida entre 0,01 N y 0,3 N en las diferentes muestras. La
solución de PEG-(NPC)^{2} se separó también en 30 muestras
de 500 \mul. A las diferentes muestras de PEG-(NPC)^{2},
se añadieron y mezclaron 500 \mul de proteína de trigo hidrolizada
a diferentes normalidades de NaOH. La solución de los dos polímeros
se dejó en reposo y se anotó el tiempo de solidificación para una
normalidad específica de NaOH. Cuando la solidificación fue
superior a 10 minutos, la solución no se siguió observando porque
los hidrogeles normalmente no solidifican pasado este tiempo o
presentan pocas propiedades mecánicas si es que las presentan.
Dos horas después del mezclado de los dos
polímeros, las propiedades mecánicas del hidrogel se evaluaron
cualitativamente utilizando la escala siguiente: muy consistente,
consistente, moderadamente consistente, débilmente consistente y
blando.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se evaluaron las cinéticas y los tiempos finales
de polimerización mediante la terminación controlada por el tiempo
de la polimerización utilizando una etapa de lavado. El tiempo final
de polimerización se define como el punto donde las pérdidas en PEG
y proteína alcanzan un mínimo en el proceso de lavado. Las pérdidas
en PEG y proteína en el tiempo final de polimerización también
sirven para evaluar la calidad de la polimerización, ya que se ha
observado que la intensidad de las propiedades mecánicas de los
hidrogeles está inversamente relacionada con las pérdidas de PEG y
proteína durante las etapas de lavado.
Por ejemplo, para los hidrogeles preparados
utilizando un determinado lote de PEG de 8 kDa y proteína de soja
hidrolizada (9% y 6% respectivamente), se determinó que para obtener
los tiempos de solidificación de 60 segundos, 40 segundos, 30
segundos y 20 segundos, las reacciones de polimerización tendrían
que tener lugar en soluciones de NaOH 0,09 N, 0,12 N, 0,13 N y 0,15
N, respectivamente. La calidad y los tiempos finales de
polimerización de hidrogeles sintetizados utilizando NaOH se
compararon también con los hidrogeles sintetizados en solución
tampón mediante la terminación controlada de la polimerización. En
este caso, el tampón utilizado para preparar hidrogeles de
PEG-soja fue un tampón de borato 200 mm (pH
9,4).
Se preparó una solución de 100 ml de
PEG-(NPC)^{2} de 8 kDa al 18% en agua con 20 ml de una
solución de proteína de soja hidrolizada al 12% en NaOH 0,09 N, 20
ml de una solución de proteína de soja hidrolizada al 12% en NaOH
0,12 N, 20 ml de una solución de proteína de soja hidrolizada al 12%
en NaOH 0,13 N, 20 ml de una solución de proteína de soja
hidrolizada al 12% en NaOH 0,15 N y 20 ml de una solución de
proteína de soja hidrolizada al 12% en tampón de borato 200 mm (pH
9,4).
La terminación controlada de la polimerización
se realizó por triplicado transfiriendo 1 ml de solución de PEG a
tres tubos de 50 ml. Un ml de la solución de proteína de soja
hidrolizada deseada (0,09 N, 0,12 N, 0,13 N, 0,15 N o tampón borato
200 mm pH 9,4) se añadió a cada tubo. Rápidamente, se mezclaron las
dos soluciones y el tubo se dejó en reposo para dejar que el
hidrogel forme una película fina. La polimerización se interrumpió
en el momento preciso succionando el hidrogel de la superficie del
tubo y añadiendo 48 ml de solución de tampón de borato 10 mm (pH
8,5).
La terminación controlada de la polimerización
se realizó a intervalos de 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4
minutos y 5 minutos para las polimerizaciones realizadas en solución
de NaOH 0,15 N. Esto se realizó a intervalos de 2 minutos, 4
minutos, 8 minutos, 15 minutos y 30 minutos para las
polimerizaciones realizadas en soluciones de NaOH 0,13 N y 0,12 N,
y a intervalos de 8 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y
120 minutos para las polimerizaciones en solución de NaOH 0,09 N.
Para los hidrogeles sintetizados en tampón borato 200 mm (pH 9,4),
se realizó a intervalos mayores correspondientes a 30 minutos, 60
minutos, 120 minutos, 480 minutos y 960 minutos.
La proteína y el PEG que no polimerizaron se
recuperaron en las soluciones de lavado. Para asegurar que un
máximo de proteína y de PEG se habían difundido en la solución de
lavado, el hidrogel se mantuvo en agitación durante por lo menos 1
hora durante proceso de lavado. Para recuperar toda la proteína y el
PEG no incorporados, fueron necesarios tres lavados. Las muestras
para cada lavado se extrajeron para determinar las cantidades de
proteína y de PEG liberado.
Las proteínas se midieron utilizando un análisis
con ácido bicincónico (BCA) (12). Se preparó un kit micrométodo
según las instrucciones del fabricante (Pierce). Se mezclaron dos
partes de reactivo MC (sulfato cúprico al 4%) con 48 partes de
reactivo MB (BCA al 4% en agua) y 50 partes de reactivo MA
(carbonato sódico, bicarbonato sódico y tartrato sódico en NaOH 0,2
N). Se añadieron 100 \mul de esta solución a 100 \mul de las
muestras de proteína que deben analizarse o a la muestra de
referencia. Se realizó una medición de la absorbancia a 562 nm
después de una incubación de 3 horas a 37ºC.
Se midió el PEG mediante la formación de un
complejo PEG/yoduro potásico (13). Se añadieron 50 \mul de cloruro
de bario (BaCl_{2} al 5% en HCl 1 N) a 200 \mul de la muestra
de PEG que debe analizarse o a la referencia. Se añadieron 25
\mul de yodo (KI al 2% en I_{2} 0,05 N) para iniciar la
reacción. La solución se mezcló en las microplacas y se incubó
durante 15 minutos en oscuridad total. Tras la incubación, se
realizó una medición de la absorbancia a 532 nm.
Para determinar las cinéticas de la reacción de
polimerización para las soluciones de NaOH 0,15 N, 0,13 N, 0,12 N y
0,09 N, se sustrajo la cantidad de PEG liberado durante los tres
lavados de la cantidad de PEG presente en los 2 ml iniciales de
solución de polimerización. Esto se realizó para determinar la
cantidad de PEG presente en el gel final, lo que a su vez permitió
la determinación del alcance (o porcentaje) de polimerización. El
cien por cien de la polimerización corresponde al punto en el que la
pérdida de PEG está en su valor más bajo posible. La Figura 1
demuestra que la polimerización completa se consiguió a intervalos
de 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 60 minutos para las
soluciones de NaOH 0,15 N, 0,13 N, 0,12 N y 0,09 N,
respectivamente.
La Figura 2 es una comparación de las cinéticas
de reacción cuando los hidrogeles se polimerizaron en solución NaOH
0,12 N, solución NaOH 0,09 N y solución de tampón de borato 200 mm
(pH 9,4). Puede observarse que la reacción es significativamente
más prolongada que la solución de tampón de borato ya que la
polimerización completa tiene lugar a los 960 minutos en solución
de tampón en comparación con los 60 minutos para la reacción de
polimerización completa más lenta utilizando NaOH (NaOH 0,09 N).
Esto representa un tiempo de reacción que es 16 veces mayor. Cuando
se compara con la reacción que utiliza NaOH 0,15 N, la reacción en
la solución tampón es 192 veces más lenta (no mostrado).
La Figura 3 presenta la correlación
aproximadamente lineal entre el tiempo de solidificación lineal y el
tiempo final de polimerización para los hidrogeles de
PEG-soja preparados utilizando NaOH.
La Figura 4 es un diagrama de barras que
presenta las pérdidas totales de PEG y de proteína de soja
hidrolizada para los hidrogeles preparados en tampón de borato y
para los hidrogeles preparados utilizando NaOH. Puede observarse
que las pérdidas en PEG son significativamente mayores cuando los
hidrogeles se preparan en tampón de borato. Una posible explicación
para esta observación es que la red tridimensional no es tan fuerte
en los hidrogeles preparados en tampón borato, y esto produce
hidrogeles con propiedades mecánicas más débiles (es decir, los
grados de plasticidad y elasticidad son menores en los hidrogeles
donde existe menos reticulación). La Figura 4 también demuestra que
las pérdidas en proteína de soja hidrolizada no difieren
significativamente si los hidrogeles se preparan en solución tampón
o se preparan utilizando NaOH como catalizador. Esto puede
explicarse por el hecho de que las proteínas actúan como puntos de
anclaje para el PEG bifuncionalizado y pueden ser atrapadas
eficazmente en el hidrogel aun cuando la reticulación sea débil.
Ejemplo
5
Se evaluaron las cinéticas y los tiempos finales
de polimerización mediante la terminación controlada por el tiempo
de la polimerización utilizando una etapa de lavado. El tiempo final
de polimerización se define como el punto donde las pérdidas en PEG
y proteína alcanzan un mínimo en el proceso de lavado. Las pérdidas
en PEG y proteína en el tiempo final de polimerización también
sirven para evaluar la calidad de la polimerización, ya que se ha
observado que la intensidad de las propiedades mecánicas de los
hidrogeles está inversamente relacionada con las pérdidas de PEG y
proteína durante las etapas de lavado.
Por ejemplo, para los hidrogeles preparados
utilizando un determinado lote de PEG de 8 kDa y caseína (9% y 7%
respectivamente), se determinó que para obtener los tiempos de
solidificación de 90 segundos, 30 segundos y 15 segundos, las
reacciones de polimerización tendrían que tener lugar en soluciones
de NaOH 0,15 N, 0,19 N y 0,20 N, respectivamente. La calidad y los
tiempos finales de polimerización de hidrogeles sintetizados
utilizando NaOH se compararon también con los hidrogeles
sintetizados en solución tampón mediante la terminación controlada
de la polimerización. En este caso, el tampón utilizado para
preparar hidrogeles de PEG-caseína fue un tampón de
borato 200 mm (pH 9,4).
Se preparó una solución de 100 ml de
PEG-(NPC)^{2} de 8 kDa al 18% en agua con 20 ml de una
solución de caseína al 14% en NaOH 0,15 N, 20 ml de una solución de
caseína al 14% en NaOH 0,19 N, 20 ml de una solución de caseína al
14% en NaOH 0,20 N y 20 ml de una solución de caseína al 14% en
tampón de borato 200 mm (pH 9,4).
La terminación controlada de la polimerización
se realizó por triplicado transfiriendo 1 ml de solución de PEG a
tres tubos de 50 ml. Se añadió a cada tubo un ml de la solución de
caseína deseada (0,15 N, 0,19 N, 0,20 N o tampón borato 200 mm pH
9,4). Se mezclaron las dos soluciones rápidamente y el tubo se dejó
en reposo para dejar que el hidrogel forme una película fina. La
polimerización se interrumpió en el momento preciso succionando el
hidrogel de la superficie del tubo y añadiendo 48 ml de solución de
tampón de borato 10 mm (pH 8,5).
La terminación controlada de la polimerización
se realizó a intervalos de 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4
minutos y 5 minutos para las polimerizaciones realizadas en solución
de NaOH 0,20 N. Esto se realizó a intervalos de 2 minutos, 4
minutos, 8 minutos, 15 minutos y 30 minutos para las
polimerizaciones realizadas en soluciones de NaOH 0,19 N, y a
intervalos de 8 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120
minutos para las polimerizaciones en solución de NaOH 0,15 N. Para
los hidrogeles sintetizados en tampón borato 200 mm (pH 9,4), se
realizó a intervalos mayores correspondientes a 120 minutos, 240
minutos, 480 minutos y 960 minutos.
La proteína y el PEG que no polimerizaron se
recuperaron en las soluciones de lavado. Para asegurar que un
máximo de proteína y de PEG se habían difundido en la solución de
lavado, el hidrogel se mantuvo en agitación durante por lo menos 1
hora durante el proceso de lavado. Para recuperar toda la proteína y
el PEG no incorporados, fueron necesarios tres lavados. Las
muestras para cada lavado se extrajeron para determinar las
cantidades de proteína y de PEG liberado.
Las proteínas se midieron utilizando un análisis
con ácido bicincónico (BCA) (12). Se preparó un kit micrométodo
según las instrucciones del fabricante (Pierce). Se mezclaron dos
partes de reactivo MC (sulfato cúprico al 4%) con 48 partes de
reactivo MB (BCA al 4% en agua) y 50 partes de reactivo MA
(carbonato sódico, bicarbonato sódico y tartrato sódico en NaOH 0,2
N). Se añadieron 100 \mul de esta solución a 100 \mul de las
muestras de proteína que deben analizarse o a la muestra de
referencia. Se realizó una medición de la absorbancia a 562 nm
después de una incubación de 3 horas a 37ºC.
Se midió el PEG mediante la formación de un
complejo PEG/yoduro potásico (13). Se añadieron 50 \mul de cloruro
de bario (BaCl_{2} al 5% en HCl 1 N) a 200 \mul de la muestra
de PEG que debe analizarse o a la referencia. Se añadieron 25
\mul de yodo (KI al 2% en I_{2} 0,05 N) para iniciar la
reacción. La solución se mezcló en las microplacas y se incubó
durante 15 minutos en oscuridad total. Tras la incubación, se
realizó una medición de la absorbancia a 532 nm.
Para determinar las cinéticas de la reacción de
polimerización para las soluciones de NaOH 0,20 N, 0,19 N y 0,15 N,
se sustrajo la cantidad de PEG liberado durante los tres lavados de
la cantidad de PEG presente en los 2 ml iniciales de solución de
polimerización. Esto se realizó para determinar la cantidad de PEG
presente en el gel final, lo que a su vez permitió la determinación
del alcance (o porcentaje) de polimerización. El cien por cien de
la polimerización corresponde al punto en el que la pérdida de PEG
está en su valor más bajo posible. La Figura 5 demuestra que la
polimerización completa se consiguió a intervalos de 5 minutos, 30
minutos y 120 minutos para las soluciones de NaOH 0,20 N, 0,19 N y
0,15 N, respectivamente.
La Figura 6 es una comparación de las cinéticas
de reacción cuando los hidrogeles se polimerizaron en solución NaOH
0,19 N, solución NaOH 0,15 N y solución de tampón de borato 200 mm
(pH 9,4). Puede observarse que la reacción es significativamente
más prolongada que la solución de tampón de borato ya que la
polimerización completa tiene lugar a los 960 minutos en solución
de tampón en comparación con los 120 minutos para la reacción de
polimerización completa más lenta utilizando NaOH (NaOH 0,15 N).
Esto representa un tiempo de reacción que es 8 veces mayor. Cuando
se compara con la reacción que utiliza NaOH 0,20 N, la reacción en
la solución tampón es 192 veces más lenta (no mostrado).
La Figura 7 presenta la correlación lineal entre
el tiempo de solidificación lineal y el tiempo final de
polimerización para los hidrogeles de PEG-caseína
preparados utilizando NaOH.
La Figura 8 es un diagrama de barras que
presenta las pérdidas totales de PEG y caseína para los hidrogeles
preparados en tampón de borato y para los hidrogeles preparados
utilizando NaOH. Puede observarse que las pérdidas en PEG son
significativamente mayores cuando los hidrogeles se preparan en
tampón de borato. Una posible explicación para esta observación es
que la red tridimensional no es tan fuerte en los hidrogeles
preparados en tampón borato, y esto produce hidrogeles con
propiedades mecánicas más débiles (es decir, los grados de
plasticidad y elasticidad son menores en los hidrogeles donde existe
menos reticulación). La Figura 8 también demuestra que las pérdidas
en caseína son significativamente mayores cuando los hidrogeles se
preparan en solución tampón en comparación con los preparados
utilizando solución de NaOH 0,20 N.
Ejemplo
6
Se hicieron mediciones del contenido de agua
(C_{w}) y de la absorción de agua (C_{u})
utilizando soluciones con diferentes fuerzas iónicas. Hidrogeles
preparados con PEG bifuncionalizado de 8 kDa y caseína (9% y 6%
respectivamente) se vertieron entre dos placas de vidrio separadas
por espaciadores de 1 mm. Los hidrogeles con un volumen de 1,25 ml
se dejaron hinchar y equilibrar posteriormente en una solución de
NaCl 10 mm hasta el punto en el que no era detectable
4-nitrofenol por lecturas de absorbancia a 400
nm.
Cada experimento se realizó por triplicado. Se
dejaron equilibrar los hidrogeles en diferentes concentraciones de
tampón de fosfato a pH 6 lavando cinco veces durante una hora cada
vez en 40 ml de tampón. Las diferentes concentraciones de tampón
fosfato utilizadas fueron las siguientes: 100 mm, 75 mm, 50 mm, 25
mm, 12,5 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm, 0,1 mm y 0 mm.
Para cada concentración de tampón, se separaron
los hidrogeles de la solución, se transfirió el agua de sus
superficies y los hidrogeles, se pesaron a continuación en su estado
hinchado (W_{sw}),. Los hidrogeles se secaron a
continuación hasta peso constante en una estufa a 80ºC y se midió
este peso seco (W_{0}). Los resultados se utilizaron a
continuación para calcular el contenido de agua (C_{w}) y
absorción de agua (C_{u}) según las ecuaciones (1) y (2),
anteriores. El efecto de la fuerza iónica de las soluciones de
tampón sobre el contenido de agua y la absorción de agua de los
hidrogeles se presenta gráficamente en las Figuras 9 y 10,
respectivamente. Puede observarse que el contenido de agua
(C_{w}) no se diferencia significativamente de
aproximadamente el 95% cuando la concentración del tampón está
comprendida entre 10 mm y 100 mm. Esto es incluso más evidente
cuando los mismos resultados se describen en términos de absorción
de agua (C_{u}). En la Figura 10 puede apreciarse que la
absorción de agua es casi constante con un valor de aproximadamente
20 veces el peso en seco del hidrogel cuando la concentración de
tampón está comprendida entre 10 mm y 100 mm. Existe, sin embargo,
un aumento drástico en el hinchamiento cuando se utilizan
concentraciones de tampón menores de 10 mm, alcanzando un máximo
cuando se utiliza agua desionizada. En ausencia de fuerza iónica,
el hinchamiento del hidrogel puede ser tal que alcance un contenido
en agua (C_{w}) de aproximadamente el 99%, correspondiente
a la absorción de agua (C_{u}) de aproximadamente 70 veces
el peso seco del hidrogel.
Ejemplo
7
Se hicieron mediciones de los volúmenes de
expansión utilizando soluciones con diferentes fuerzas iónicas.
Hidrogeles preparados con PEG bifuncionalizado de 8 kDa y proteína
de soja hidrolizada (9% y 6% respectivamente) se vertieron entre
dos placas de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm. La medición
del volumen de expansión se realizó por triplicado con un número
suficiente de hidrogeles que presentan un volumen de 1,25 ml. Estos
hidrogeles se pesaron inicialmente justo después de la síntesis para
medir sus volúmenes en su estado no expandido. Posteriormente, se
dejaron equilibrar los hidrogeles en diferentes concentraciones de
tampón de fosfato a pH 6 lavando cinco veces durante una hora cada
vez en 40 ml de tampón. Las diferentes concentraciones de tampón
fosfato utilizadas fueron las siguientes: 100 mm, 75 mm, 50 mm, 25
mm, 12,5 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm, 0,1 mm y 0 mm.
Para cada concentración de tampón, se separaron
los hidrogeles de la solución, se transfirió el agua de sus
superficies y los hidrogeles, se pesaron a continuación en su estado
expandido. La medición del volumen de expansión se realizó
dividiendo el peso del hidrogel en su estado expandido por el peso
del hidrogel en su estado no expandido. El efecto de las fuerzas
iónicas de las soluciones de tampón sobre los volúmenes de expansión
de los hidrogeles se presenta gráficamente en la Figura 11. Puede
observarse que el volumen de expansión no se diferencia
significativamente de 1,8 veces el volumen del gel no expandido
cuando la concentración del tampón está comprendida entre 10 mm y
100 mm. Existe, sin embargo, un aumento drástico en volumen de
expansión cuando se utilizan concentraciones de tampón menores de
10 mm, alcanzando un máximo cuando se utiliza agua desionizada. En
ausencia de fuerza iónica, el volumen de expansión del hidrogel
puede ser tal que alcance 5,5 veces el volumen del hidrogel
no
expandido.
expandido.
Ejemplo
8
Se hicieron mediciones del contenido de agua
(C_{w}) y de la absorción de agua (C_{u})
utilizando soluciones con diferentes pH. Hidrogeles preparados con
PEG bifuncionalizado de 8 kDa y proteína de soja hidrolizada (9% y
6% respectivamente) se vertieron entre dos placas de vidrio
separadas por espaciadores de 1 mm. Los hidrogeles con un volumen
de 1,25 ml se dejaron hinchar posteriormente y se equilibraron en
una solución de NaCl 10 mm hasta el punto en que ningún
4-nitrofenol era detectable por lecturas de
absorbancia a 400 nm.
\newpage
Cada experimento se realizó por triplicado. Se
dejaron equilibrar los hidrogeles en solución tampón de fosfato 10
mm o solución tampón de borato 10 mm con diferentes pH lavando cinco
veces durante una hora cada vez en 40 ml de estos tampones. Se
utilizaron soluciones de tampón de fosfato con pH de 4, 6 y 7. Se
utilizaron soluciones de tampón de borato con pH de 9 y 11.
Para cada concentración de tampón, se separaron
los hidrogeles de la solución, se transfirió el agua de sus
superficies y los hidrogeles, se pesaron a continuación en su estado
hinchado (W_{sw}),. Los hidrogeles se secaron a
continuación hasta peso constante en una estufa a 80ºC y se midió
este peso seco (W_{0}). Los resultados se utilizaron a
continuación para calcular el contenido de agua (C_{w}) y
absorción de agua (C_{u}) según las ecuaciones (1) y (2),
anteriores. El efecto del pH de las soluciones de tampón sobre el
contenido de agua y la absorción de agua de los hidrogeles se
presenta gráficamente en las Figuras 12 y 13, respectivamente.
Puede observarse que el contenido de agua (C_{w}) es
directamente proporcional al pH de la solución, comprendido entre
aproximadamente 94% y aproximadamente 97,5% desde pH de 4 a 11. El
mismo fenómeno puede observarse cuando se considera la absorción de
agua (C_{U}). En la Figura 13 puede apreciarse que la
absorción de agua es directamente proporcional al pH de la solución,
estando comprendida desde aproximadamente 17 veces el peso seco a
aproximadamente 30 veces el peso seco desde pH 4 a 11. Estas
variaciones en el contenido en agua (C_{W}) y en la
absorción de agua (C_{u}) pueden explicarse por la baja
solubilidad de la proteína de soja hidrolizada que comprende el
hidrogel a pH bajo y su creciente solubilidad a pH elevado.
Ejemplo
9
Se hicieron mediciones de los volúmenes de
expansión utilizando soluciones con diferentes pH. Hidrogeles
preparados con PEG bifuncionalizado de 8 kDa y proteína de soja
hidrolizada (9% y 6% respectivamente) se vertieron entre dos placas
de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm. La medición del
volumen de expansión se realizó por triplicado con un número
suficiente de hidrogeles que presentan un volumen de 1,25 ml. Estos
hidrogeles se pesaron inicialmente justo después de la síntesis
para medir sus volúmenes en su estado no expandido. Posteriormente,
se dejaron equilibrar los hidrogeles en solución de tampón fosfato
10 mm o en solución de tampón borato 10mm con diferentes pH lavando
cinco veces durante una hora cada vez en 40 ml de estos tampones. Se
utilizaron soluciones tampón de fosfato con pH de 4, 6 y 7. Se
utilizaron soluciones tampón de borato con pH de 9 y 11.
Para cada concentración de tampón, se separaron
los hidrogeles de la solución, se transfirió el agua de sus
superficies y los hidrogeles, se pesaron a continuación en su estado
expandido. La medición del volumen de expansión se realizó
dividiendo el peso del hidrogel en su estado expandido por el peso
del hidrogel no expandido. El efecto del pH de las soluciones de
tampón sobre los volúmenes de expansión de los hidrogeles se
presenta gráficamente en la Figura 14. Puede observarse que el
volumen de expansión es directamente proporcional al pH de la
solución, estando comprendido desde aproximadamente 1,2 veces el
volumen no expandido del hidrogel hasta aproximadamente 1,65 veces
el volumen no expandido del hidrogel desde pH 4 a 11. Estas
variaciones en el volumen de expansión pueden explicarse por la
baja solubilidad de la proteína de soja hidrolizada que comprende
el hidrogel a pH bajo y su creciente solubilidad a pH elevado.
Ejemplo
10
Se realizaron mediciones de los tiempos de
absorción de los ingredientes activos en la muestra de hidrogeles
PEG-soja utilizando 4-nitrofenol y
azul de metileno como moléculas modelo. Se prepararon películas de
hidrogel con PEG bifuncionalizado de 8 kDa y proteína de soja
hidrolizada (9% y 6% respectivamente) vertiendo la solución
polimérica entre dos placas de vidrio separadas por espaciadores de
1 mm. Los hidrogeles se cortaron posteriormente en pequeños
cuadrados y se dejaron hinchar y equilibrar en una solución tampón
de fosfato 10 mm pH 6 hasta el punto en que ningún
4-nitrofenol fuera detectable por lectura de
absorbancia a 400 nm. En su estado hinchado, el volumen de estos
hidrogeles fue de 745 \mul \pm 22 \mul.
La evaluación del tiempo de absorción de
4-nitrofenol y azul de metileno se realizó en primer
lugar preparando 1 ppm de solución de absorción de azul de metileno
y una solución al 0,4% de 4-nitrofenol. Se colocaron
tres hidrogeles en contacto con un volumen reciente de 90 ml de una
de estas soluciones de absorción para los siguientes intervalos de
tiempo: 1^{1/2} min, 3 min, 6 min, 15 min, 30 min y 60 min antes
de que fueran eliminados de la solución. Tras su eliminación, los
hidrogeles se transfirieron cuidadosamente de solución en exceso y
cada uno se transformó en 30 ml de 10 mm de solución tampón de
fosfato pH 6. Los hidrogeles se dejaron equilibrar en la solución
agitando durante 24 horas para asegurar que se alcanzaba el estado
de equilibrio. La absorción de 4-nitrofenol y de
azul de metileno se supuso que corresponde a la cantidad de estas
moléculas modelo liberadas en la solución de lavado. Se midió el
4-nitrofenol en solución por lecturas de absorbancia
a 400 nm comparando los resultados con una curva patrón comprendida
entre 80 y 1 \mug/ml. Se midió el azul de metileno por lecturas
de absorbancia a 655 nm comparando los resultados con una curva
patrón comprendida entre 3 y 0,00025 ppm. Para evaluar la absorción
relativa de una de estas moléculas modelo, se consideró que la
cantidad total de moléculas en la solución de 30 ml correspondía al
volumen inicial del hidrogel (745 \mul). La concentración de
moléculas modelo indicada en el hidrogel se comparó a continuación
(en porcentaje) con la concentración inicial de la solución de
absorción. La Figura 15 presenta la absorción relativa de
4-nitrofenol y azul de metileno en función del
tiempo. Puede observarse que ambas moléculas se difundieron muy
rápidamente en el hidrogel y alcanzaron la misma concentración que
la solución de absorción, en menos de 1½ minutos en el caso del
azul de metileno y en aproximadamente 15 minutos en el caso del
4-nitrofenol. El azul de metileno incluso llegó a
concentrarse en el hidrogel, hasta un punto en que alcanzó una
concentración correspondiente a más del 600% que la de la solución
circundante. Este fenómeno puede estar producido por la carga
latente del hidrogel o la afinidad natural del azul de metileno
para la proteína. Dado que lotes de otros ingredientes activos en
medicamentos presentan afinidades a la proteína similares a los
demostrados en la presente memoria por el azul de metileno, puede
suponerse que el mismo tipo de concentración de ingredientes activos
se observaría con ellos.
Pueden modificarse las condiciones
experimentales, como es conocido por los expertos en la materia, con
el fin de conseguir hidrogeles con consistencias adecuadas para
diferentes aplicaciones. Por lo tanto, por ejemplo, la plasticidad
y/o elasticidad de los hidrogeles puede modificarse variando las
cantidades de PEG y proteína utilizada para sintetizar los
hidrogeles, o la naturaleza de la proteína utilizada.
Además, el aspecto físico de los hidrogeles
puede ajustarse dependiendo de la aplicación. Por ejemplo, la
solución de hidrogel puede sintetizarse de diferentes formas (tal
como películas, bloques, etc.) vertiéndola entre placas de vidrio o
en un molde plástico. Una vez fijado, el hidrogel puede destruirse
para formar partículas de diferentes tamaños. Estas partículas
podrían también prepararse por suspensión o polimerización en
emulsión.
Las aplicaciones para los nuevos hidrogeles
preparados por el procedimiento descrito en la presente memoria
incluyen las siguientes:
- \bullet
- Dispositivos de liberación del fármaco que podrían utilizarse en aplicaciones generales, intratumorales, subcutáneas, tópicas, transdérmicas y rectales;
- \bullet
- Apósito para heridas o pieles artificiales;
- \bullet
- Medios de reacción sólidos humidificados para kits de diagnóstico, destinados a su utilización en investigación fundamental (PCR, RT-PCR, hibridación in situ, marcado in situ con antibióticos u otros marcadores tales como péptidos, sondas de ADN o de ARN, medicamentos u hormonas, etc.), etc.;
- \bullet
- Medios de transporte para células, tejidos, órganos, huevos, organismos, etc.;
- \bullet
- Medios de cultivo tisulares, con o sin agentes activos, para investigación fundamental o aplicaciones comerciales y terapéuticas;
- \bullet
- Materiales de electrodos (con o sin enzimas);
- \bullet
- Membranas iontoforéticas;
- \bullet
- Medios protectores humidificados para secciones tisulares (tales como cubreobjetos de sustitución para portaobjetos de microscopio); y
- \bullet
- Matrices para la inmovilización de enzimas o proteínas para su utilización in vivo, in vitro o ex vivo como agentes terapéuticos, biorreactores o biosensores.
- \bullet
- Aplicaciones cosmecéuticas, tales como hidratantes para la piel o humectantes.
Puede utilizarse también una forma anhidra de
estos hidrogeles (obtenidos tras la deshidratación al vació o en
acetona) de la siguiente manera: en primer lugar, como agua o
absorbente exudado en apósitos para heridas y en segundo lugar,
como un dispositivo de liberación del fármaco lenta o
controlada.
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and Pharmacy, Vol. 1-3, CRC Press, Boca Raton,
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Pennsylvania, USA, en las páginas 41-44.
Claims (18)
1. Procedimiento para la preparación de un
hidrogel hidrófilo polimerizado hinchable en agua que comprende:
- (a)
- proporcionar una solución acuosa que contiene un bis (carbonato de nitrofenilo) de PEG;
- (b)
- proporcionar una solución de una proteína de origen vegetal, de origen marino o de leche en una solución acuosa no tamponada en condiciones básicas que son proporcionadas por una base fuerte, seleccionada de entre el grupo constituido por LiOH, NaOH, KOH, RbOH y CsOH,
- (c)
- hacer reaccionar las soluciones de (a) y (b) con el fin de inducir la polimerización.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido
por proteína de soja hidrolizada, proteína de trigo hidrolizada,
proteína de guisante y caseína.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha base fuerte es NaOH o
KOH.
4. Hidrogel hidrófilo polimerizado hinchable en
agua producido por un procedimiento como el definido en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Hidrogel hidrófilo polimerizado hinchable en
agua que comprende una proteína seleccionada de entre un origen
vegetal, un origen marino, o leche reticulada con bis (carbonato de
nitrofenilo) de PEG.
en el que la reacción de reticulación se realiza
en una solución acuosa en condiciones básicas proporcionadas por la
base fuerte sin un sistema de tampón, y
en el que dicha base fuerte se selecciona de
entre el grupo constituido por LiOH, NaOH, KOH, RbOH y CsOH.
6. Hidrogel según la reivindicación 5, en el que
dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por
proteína de soja hidrolizada, proteína de trigo hidrolizada,
proteína de guisante y caseína.
7. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 en la preparación de un medicamento
que comprende un compuesto fisiológicamente activo que debe
administrarse a un mamífero en una cantidad terapéuticamente
eficaz.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la
que dicho medicamento se administra junto con un vehículo
fisiológicamente aceptable.
9. Utilización según la reivindicación 7 u 8, en
la que dicho hidrogel está constituido por una composición de
liberación controlada de fármaco en una forma fisiológica adecuada
para la administración generalizada, intratumoral, subcutánea,
tópica, transdérmica o rectal.
10. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en la que dicho hidrogel constituye un
apósito para heridas o una piel artificial.
11. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como matriz para la inmovilización de
enzimas o proteínas.
12. Utilización según la reivindicación 11, en
la que dicha matriz sirve como agente terapéutico, o forma parte de
un biorreactor o de un biosensor.
13. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como medio de reacción sólido
humidificado.
14. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como medio de transporte.
15. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como medio de cultivo tisular.
16. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como material de electrodo.
17. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como membrana iontoforética.
18. Utilización de un hidrogel según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6 como medio protector humidificado.
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