ES2269486T3

ES2269486T3 - Utilizacion de celulas madre y celulas madre con deplecion de cd6 para la induccion de tolerancia frente a transplantes alogenicos y/o para el tratamiento de la leucemia.

Info

Publication number: ES2269486T3
Application number: ES01986605T
Authority: ES
Inventors: Hans-Jochen Kolb; Wolfgang Gunther
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: DE10050334A1; JP2004510821A; WO2002030433A2; US8562968B2; WO2002030433A3; US20030232433A1; PT1370641E; DE50110773D1; EP1370641A2; DK1370641T3; ATE336568T1; JP4106488B2; EP1370641B1

Abstract

Utilización de una composición que contiene células madre y células madre con depleción de CD6 para la preparación de una composición farmacéutica para la aplicación secuencial en el tiempo, para la inducción de tolerancia frente a transplantes alogénicos y/o para el tratamiento de enfermedades sanguíneas, inmunológicas o cancerígenas, caracterizada por el hecho de que primero se aplican las células madre y finalmente las células madre con depleción de CD6, excluyéndose las células madre embrionales humanas.

Description

Utilización de células madre y células madre con depleción de CD6 para la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos y/o para el tratamiento de la leucemia.

La presente invención se refiere a la utilización de una composición que contiene células madre así como células madre con depleción de CD6 para la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos y/o para el tratamiento de enfermedades sanguíneas, inmunológicas y cancerígenas para su aplicación escalonada en el tiempo, aplicándose primero las células madre y finalmente las células madre con depleción de CD6. La presente invención se refiere además a una preparación combinada, que contiene células madre y células madre con depleción de CD6.

Estado de la técnica anterior a la invención

El trasplante de células madre hematopoyéticas y de la médula ósea pertenece al estado de la técnica. Primero se destruyen en medida suficiente células inmunocompetentes del receptor mediante un pretratamiento como por ejemplo mediante quimioterapia o irradiación, para permitir el crecimiento de las células del donante, incluidas las células madre y las células inmunocompetentes. En general, se realiza el trasplante de células madre en enfermedades con fallo de la función de la médula ósea, por ejemplo en el marco de la terapia de la leucemia aguda, pero también en otras enfermedades sanguíneas e inmunológicas así como en enfermedades cancerígenas. Este espectro de enfermedades a aplicar terapia se basa en el hecho de que en todos los casos se trata de enfermedades que se basan en una disfunción de la formación de la sangre. De esta manera, pueden aplicarse las células madre a enfermedades de la sangre no malignas (como por ejemplo la anemia aplástica severa (SAA), la anemia aplástica, la anemia de células sichel, la talasemia), a enfermedades del sistema inmune (esclerosis múltiple (MS), reuma (CP) esclerodermia) así como a enfermedades sanguíneas malignas (leucemia agua y crónica de origen mieloide y linfático). Normalmente, para ello se extraen preparados que contienen células madre del donante, como médula ósea y leucocitos sanguíneos y se le administra al receptor de forma intravenosa. Dicho trasplante de células madre puede comportar tolerancia frente a órganos como el corazón, los pulmones, etc, así como frente a células de origen sanguíneo del donante de células madre (1). Sin embargo, una desventaja de un trasplante de células madre de este tipo es que, por un lado, el trasplante del paciente puede ser rechazado, por otro lado las células inmunocompetentes del trasplante pueden llevar al receptor a una enfermedad de injerto versus huésped (GVH), en la cual las células T del trasplante reconocen como extrañas las células del receptor, las atacan y pueden perjudicarlas. Al contrario que en trasplante de órganos sólidos, en el caso de trasplante de células madre puede suspenderse el tratamiento inmunosupresor después de algunos meses o años, sin que aparezca un rechazo o una reacción GVH. Esto se basa en una inmunotolerancia recíproca.

Para impedir o para debilitar la reacción injerto versus huésped, se separan las abundantes células inmunocompetentes, en particular los linfocitos T, del trasplante. Sin duda, de esta manera se produce frecuentemente un rechazo del trasplante (2); en el caso del tratamiento de la leucemia aparecen múltiples casos de recidiva de la enfermedad. La recidiva en el caso del tratamiento de la leucemia, así como el rechazo del trasplante se reduce probablemente al hecho de que no existen células T del donante en el trasplante, las cuales se encuentren en posición de eliminar las células T remanentes del receptor (3). El riesgo de complicaciones de este tipo en el caso de identidad HLA del donante y del receptor no es bajo; más aún, en el caso de diferencias HLA es muy elevado.

El trasplante de células madre para la inducción de tolerancia frente a trasplantes o bien para el mantenimiento de la tolerancia se llevó a cabo originariamente partiendo de la base que el sistema inmune del paciente se substituye por el del donante de células madre, el cual no ataca el órgano trasplantado. Por tanto, en cuanto un organismo haya aceptado células madre extrañas, dicho organismo aceptará también otros órganos (4). De hecho, dado que el trasplante de células madre en caso de diferencias HLA comporta un elevado riesgo, dicho método no ha podido emplearse hasta el momento para la inducción de tolerancia frente a órganos trasplantados.

En el caso de perros pudo mostrarse que mediante la depleción de las células T de la médula ósea en determinadas combinaciones donante-receptor, es posible evitar una reacción fuerte injerto versus huésped. En combinaciones de donantes homocigotos DLA y receptores heterocigotos DLA, la reacción es débil y va en dirección huésped versus injerto, en oposición a la dirección GVH, se crea un completo quimarismo con tolerancia continua en el caso de haplotipo DLA diferenciable. Por el contrario, diferencias DLA fuertes del donante heterocigoto conducen casi siempre al rechazo y no permiten una tolerancia recíproca.

Ya existen diferentes ensayos y posibilidades para impedir o bien disminuir un rechazo debido a diferencias de HLA en humanos.

Por ejemplo se ha descrito que la utilización de grandes cantidades de células madre sanguíneas CD34 positivas en adultos (6) y en niños (7) puede inducir tolerancia. En caso de donantes grandes y receptores pequeños, que es frecuentemente el caso en el trasplante de padres a niños, puede obtenerse células madre sanguíneas en cantidades suficientes. En el caso de relaciones de tamaño no apropiadas, la obtención de células madre sanguíneas en cantidades suficientes es problemático.

Como procedimiento adicional para la inducción de tolerancia en caso de diferencias de HLA se propuso el trasplante de médula ósea conjuntamente con una combinación de ciclofosfamida, irradiación del timo y globulina antitimocitos (ATG) (8). En el caso de pacientes con linfoma altamente maligno, dicho procedimiento fue exitoso, sin embargo, dichos pacientes están inmunosuprimidos debido a su enfermedad y la quimioterapia precedente. Así pues, puede deducirse que un tratamiento de este tipo no será suficiente en pacientes con una inmunosupresión previa más débil. Una desventaja adicional de este procedimiento, como en el caso de todos los agentes inmunosupresores puramente inespecíficos, una mayor susceptibilidad a infección del organismo tratado.

Un procedimiento adicional es la utilización de CTLA4, un ligando para la molécula coestimuladora B7.1. CTLA4 limita, entre otros, la activación de las células T a la estimulación de antígeno. La expresión de la molécula coestimuladora B7.1 en las células presentadoras de antígeno es necesaria para la activación de las células T. En el procedimiento mencionado, se añade la proteína de fusión CTLA4-IgG a la médula ósea antes de la transferencia, se bloquea la molécula coestimuladora B7.1, de esta manera les falta a las células T del receptor la segunda señal importante para la activación. Las células T no pueden reaccionar ("anergia") y su capacidad de conducir a una reacción injerto frente a huésped se reduce (9). Dicho procedimiento se probó en doce pacientes, de los cuales cuatro pacientes se encontraban en un grupo de riesgo bueno y ocho pacientes en un grupo con un riesgo elevado. "Riesgo bueno" significa pacientes jóvenes, pocos ensayos de terapia, pocas células leucémicas y ninguna aparición anterior de la enfermedad, mientras que dichas circunstancias no se dan en el caso de "riesgo elevado". Sin embargo, en dichos procedimientos las células sanguíneas del receptor irradiadas deben tratarse mediante una incubación de 36 horas. Aparte de un peligro de infección elevado, se espera un riesgo elevado de inducción de tolerancia frente a las células leucémicas del receptor.

Es objeto de la presente invención posibilitar un trasplante de células madre también en el caso de diferencias en HLA, por un lado para garantizar también un trasplante de células madre en el caso de pacientes sin donantes con identidad HLA apropiados, lo cual hasta ahora sólo ha sido posible con bajo éxito y con las desventajas descritas más arriba, y por otro lado para inducir tolerancia frente a los órganos trasplantados, los cuales siempre proceden de donantes con HLA diferente.

Este objeto se ha alcanzado mediante la utilización de células madre y células madre con depleción de CD6 para la preparación de una composición farmacéutica según la reivindicación 1 y mediante un preparado combinado según la reivindicación 13. Algunas realizaciones preferidas de la invención derivan de las reivindicaciones dependientes. La invención no comprende células madre embrionales humanas.

Figuras

La Fig. 1 muestra la supresión de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediante células madre negativas para CD6 en recipientes de cultivo.

La Fig. 2 muestra un modelo de supresión de la aloreacción mediante células positivas para CD8 y negativas para CD6.

La Fig. 3 es una representación temporal de un esquema preferido para el trasplante según la presente invención.

Tablas

La Tabla 1 muestra el comportamiento de crecimiento de las células madre en el trasplante en caso de HLA haploidéntico y la enfermedad injerto versus huésped para diferentes diferencias en HLA en trasplantes de células madre según la invención y en trasplantes de células madre según el estado de la técnica.

Las Tablas 2 y 3 muestran datos de pacientes y resultados de tratamiento de pacientes tratados según la invención.

La Tabla 4 muestra en fenotipo así como la composición de PBSC después de la depleción de CD6 de diferentes preparaciones celulares.

La Tabla 5 muestra la supresión de MLR mediante diferentes preparados celulares.

La Tabla 6 muestra la actividad supresora de MLR de diferentes preparados celulares.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención se utiliza una composición que contiene células madre y células madre con depleción de CD6 para su aplicación secuencial en el tiempo, para la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos y/o para el tratamiento de la leucemia, de enfermedades sanguíneas, inmunológicas y/o cancerígenas, aplicándose en primer lugar las células madre y finalmente las células madres con depleción de CD6. Preferentemente se aplican las células con depleción de CD6 de cuatro a ocho días, mayoritariamente seis días, después del trasplante de células madre. La combinación de células madre y de células madre con depleción de CD6 presenta, entre otras, la ventaja de que debido a la aplicación en dos etapas, el trasplante posibilita una gran cantidad de células madre.

Según la presente invención, las células madre pueden proceder de la médula ósea, de la sangre periférica o de sangre del cordón umbilical. Dichos tipos diferentes de células madre pueden combinarse según la invención con el mismo tipo o con un tipo diferente de células madre con depleción de CD6. Por ejemplo, puede aplicarse en primer lugar células madre de médula ósea y finalmente células madre de médula ósea con depleción de CD6, células madre sanguíneas periféricas con depleción de CD6 y/o células madre sanguíneas de cordón umbilical con depleción de CD6. De la misma manera, se proporcionan según la invención todas las demás combinaciones. Se prefieren las combinaciones: células madre de médula ósea - células madre de médula ósea con depleción de CD6, células madre de médula ósea - células madre de sangre periférica con depleción de CD6, células madre de sangre periférica - células madre de sangre periférica con depleción de CD6, células madre de sangre periférica - células madre de médula ósea con depleción de CD6 o células madre de sangre de cordón umbilical - células madre de sangre de cordón umbilical con depleción de CD6.

También pueden presentarse según la invención, en el contexto de un trasplante, células madre de diferentes fuentes, puede aplicarse también una mezcla de por ejemplo células madre de médula ósea y células madre de sangre periférica y finalmente una mezcla de células madre de médula ósea con depleción de CD6 y células de sangre periférica con depleción de CD6. Aquí quedan comprendidas también el conjunto de combinaciones según la invención.

Según la invención, se utiliza el término células madre entendiéndose las preparaciones de células madre o las preparaciones enriquecidas con células madre o las preparaciones ricas en células madre. Por ejemplo, la médula ósea es una "preparación rica en células madre". Según la invención, el término médula ósea puede utilizarse como sinónimo de células madre de médula ósea. Sin embargo, existe también la posibilidad según la invención de que la médula ósea se trate antes del trasplante de manera que se separen los corpúsculos sanguíneos rojos.

Según la invención, se entiende bajo células madre de sangre periférica, aquellas células madre que se encuentran en la periferia. Mediante la administración de cómo mínimo un factor de crecimiento celular (por ejemplo G-CSF, es decir, el factor estimulador de colonia de granulocitos, o GM-CSF), puede conseguirse que las células madre de la médula ósea se movilicen en la sangre, un comportamiento que también se presenta de forma natural en el contexto de infecciones agudas y pérdidas de sangre.

Según la invención, bajo el término células madre de la sangre del cordón umbilical se entiende aquellas células madre que se obtienen por punción de la vena del cordón umbilical de un niño recién nacido después de la omfalotomía.

Se sabe que un gran número de células madre comporta una mejor separación del trasplante alogénico (10-13). Dado que según la presente invención se lleva a cabo dos veces una aplicación de células madre, cada una de ellas en la cantidad habitual, de la misma manera que en trasplantes habituales de células madre, se influencia la eficacia del procedimiento según la invención de manera positiva.

Mediante la aplicación según la invención, secuencial en el tiempo, de células madre y finalmente de células madre que presentan una depleción de células T CD6-positivas, se posibilita que el trasplante de células madre pueda, en primer lugar, crecer. Bajo el término aumentar se entiende que las células madre aplicadas de forma intravenosa, se unen a con sus receptores dirigentes en la médula ósea, se dividen y comienzan a producir células.

Normalmente, algunos días después del trasplante de células madre, se produce un rechazo del trasplante debido al desencadenamiento de una respuesta inmune. Para suprimir y/o impedir dicha respuesta inmune, se aplican según la invención las células madre con depleción de CD6. Dichas células muestran un efecto inmunomodulador. Durante los primeros seis días, en el caso de diferencias en HLA entre el donante y el receptor, pueden aparecer linfocitos ya activados, los cuales pueden conducir a un rechazo, o bien a una reacción GVH. Según la invención, dichas células activadas pueden reconocerse y desactivarse en este momento mediante la adición de células madre con depleción de CD6, sin que las células madre del donante se vean afectadas.

En el marco de dicha invención se ha encontrado que las preparaciones de células madre con depleción de células T CD6-positivas tienen la capacidad de desactivar linfocitos activados de forma inespecífica en cuanto a su cantidad/proliferación. Se conoce poco hasta el momento sobre el significado biológico del antígeno CD6. Es un ligando para AL-CAM (molécula de adhesión celular de linfocitos activados), los linfocitos activados por marcadores. Después de la depleción de células T CD6-positivas, se separan casi todas las células T CD4-positivas (por ejemplo células T coadyuvantes) y la mayoría de las células T CD8-positivas (por ejemplo las células T citotóxicas). Las células agresoras naturales (natural killer, NK) remanecen.

La depleción de células T CD6-positivas se introdujo hace tiempo para la profilaxis de la enfermedad GVH en algunos centros, apareciendo la enfermedad GVH en grado reducido tanto en trasplantes con identidad HLA (14, 15) como en el caso de diferencias en HLA (16). Según dichos procedimientos se trasplantaron exclusivamente células madre con depleción de CD6 con el objetivo de que con la depleción de CD6, como se ha mencionado más arriba, se separaran considerablemente las células T del trasplante. Las desventajas de un trasplante sin células T se han descrito al principio. La presente invención se refiere por el contrario a la actividad supresora de las células con depleción de CD6, es decir, de las células remanentes después de la depleción de CD6.

Tal como ha podido demostrarse según la invención, la células madre CD6-negativas en cultivo suprimen la formación de células T citotóxicas (véase la fig. 1). La fig. 1 muestra la supresión de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediante células madre CD6-negativas en recipientes de cultivo. Se representa la actividad relativa de linfocitos T citotóxicos (actividad CTL) para diferentes muestras en cultivo en función de diferentes preparaciones de células madre de sangre periférica (PBSC). En un cultivo mixto de linfocitos se añadieron linfocitos de un donante (A) y células estimuladoras irradiadas de un donante (B) (= sin células madre de la sangre periférica (PBSC)). A dicha suspensión celular se le añadió PBSC sin depleción, PBSC con depleción de CD6, las células CD8-positivas que remanecieron después de la depleción de CD6 o PBC con depleción de CD6 y también de CD8 de un donante (C). Después de 7 o de 14 días, se analizó la actividad CTL en las células cultivadas. Para ello se les añadió a los CTL'ss blastos del estimulador (B) marcados con cromo radioactivo en una relación efector: diana de 40:1, 20:1, 10:1, 5:1 y 2:1. Como control se utilizaron blastos del efector (A) y del donante de PBSC (C). En presencia de (A) y (C), la actividad CTL estaba en todos los casos por debajo del 5%. La actividad CTL sin la adición de células madre se ajusta al 100%. Mediante la adición de PBSC sin depleción, la actividad CTL relativa a aproximadamente el 63%. Mediante la adición de PBSC con depleción de CD6 baja la actividad CTL relativa a aproximadamente el 45%. En el caso de la depleción de CD6 y de CD8, la actividad CTL se eleva a aproximadamente el 110%, mientras que las células CD8 positivas de las células remanentes después de la depleción de CD6 producen una mayor reducción de la actividad relativa CTL a aproximadamente el 30%. La depleción de células NK no disminuye la actividad supresora. Las células madre CD34-positivas enriquecidas, las cuales se encuentran también en la fracción con depleción de CD6 no muestran aisladamente un efecto supresor. Según la invención, puedo mostrarse que las preparaciones de células madre sanguíneas y de células madre de médula ósea con depleción de CD6 suprimen de forma inespecífica la reacción inmune contra células alogénicas in vitro así como la formación de ^{3}H-timidina en el cultivo mixto de linfocitos y la generación de células T. El efecto supresor se media principalmente mediante la depleción de CD6 en las células CD8-positivas remanentes en el trasplante.

Además del efecto supresor de las preparaciones de células madre con depleción de CD6 tiene importancia la el curso de la reacción en el tiempo. La fracción de células madre con depleción de CD6 se administra de 4 a 8 días, preferentemente aproximadamente 6 días, después del trasplante de células madre. En este estadio de tiempo, los linfocitos del receptor del donante ya se han activado en el paciente, en caso de que existan diferencias en HLA entre el donante y el paciente. En el cultivo, las preparaciones de células madre CD6-negativas muestran una acción supresora, la cual se pone de manifiesto independientemente del tipo de HLA y la cual se pone de manifiesto de la misma manera sobre las células del donante, del paciente y de una tercera persona. El efecto inespecífico de las preparaciones de células madre sobre las células T activadas descarta las características individuales tipo antígenos HLA como estructuras objetivo. Probablemente se trata más bien de estructuras que aparecen en general en la transformación de linfocitos activados.

La presente invención posibilita ahora un trasplante de células madre y eventualmente, adicionalmente de órganos, incluso en el caso de diferencias en HLA. Los padres e hijos del paciente son haploidénticos en HLA por herencia, es decir, la mitad de los antígenos HLA, que se heredan con una porción de cromosoma, son idénticos. La identidad para los antígenos del segundo haplotipo HLA (en general se determinan los antígenos para HLA-A, HLA-B y HLA-DR; es posible una determinación más amplia pero para el objetivo de la invención tiene una relevancia poco clara) es casual, como en el caso de las personas no emparentadas. La media estadística es también que la mitad de los hermanos son haploidénticos en HLA, un cuarto es idéntico en HLA al paciente y un cuarto es totalmente diferente del paciente. Por tanto, nuestra invención significa que prácticamente para cada paciente con leucemia u otras enfermedades sanguíneas puede encontrarse un donante en la propia familia. Incluso en el trasplante de órganos, la probabilidad aumenta considerablemente cuando el donante coincide con el paciente en 3 antígenos HLA. La coincidencia de más antígenos HLA es ventajosa, dado que sólo pueden reconocerse las estructuras substanciales propias del cuerpo cuando son presentadas por los propios antígenos HLA. Según la invención, la diferencia en HLA puede ser también mayor de 3, teóricamente hasta 6 de 6 antígenos determinados.

En la utilización de células madre y preparaciones de células madre con depleción de CD6 según la invención, los receptores de trasplante se someten a un pretratamiento inmunosupresor con irradiación de cuerpo entero, quimioterapia y anticuerpos. De esta manera se destruye la formación de la sangre y el sistema de defensa inmune del receptor casi completamente, pudiéndose reforzar por otro lado el efecto inmunosupresor de la ciclofosfamida mediante la transfusión de leucocitos del donante antes del tratamiento de forma específica.

La preparación de células madre de médula ósea y la obtención de células madre sanguíneas se lleva a cabo según la invención según el estado de la técnica. En el caso de compatibilidad de grupo sanguíneo, se separan los corpúsculos sanguíneos rojos, para evitar una disolución (hemólisis). Las células madre obtenidas deben, cuando sea posible, obtenerse directamente antes (hasta 48 h) del trasplante. En caso que esto no sea posible, las células madre pueden también obtenerse en un estadio de tiempo más temprano y almacenarse mezcladas con un crioprotector (por ejemplo DMSO) hasta -196ºC (en fase de nitrógeno líquido o gaseoso) hasta el trasplante.

La obtención de células madre se lleva a cabo según la invención de tal manera que se le administra al donante primero un factor de crecimiento celular (por ejemplo G-CSF) durante 4 a 6 días, y cuando se alcance una cantidad alta de células madre CD34 positivas (aproximadamente > 10/\mul sangre) del donante, se le extrae sangre mediante citaféresis.

Con ayuda de un anticuerpo dirigido contra el epítopo CD6, las células T CD6-positivas se separan de la preparación de células madre. Después de incubar la fracción aferisada celular obtenida con un anticuerpo CD6 y de lavar el anticuerpo en exceso, se añaden partículas magnéticas (por ejemplo partículas de hierro) o alternativamente también partículas de mayor densidad (por ejemplo partículas de níquel), las cuales sólo se unen al anticuerpo CD6. La suspensión células-anticuerpos se conduce a lo largo de un imán, sobre el cual se unirán todas las células que llevan la combinación antígeno-partícula. Las células CD6-positivas cargadas con partículas densas se separan mediante sedimentación. Mediante ambos procedimientos, la recuperación de células CD6-negativas alcanza hasta el 100%. Las células madre con depleción de CD6 deben obtenerse, cuando sea posible, directamente antes (hasta 48 h) del trasplante. En caso que esto no sea posible, las células madre pueden también obtenerse en un estadio de tiempo más temprano y después de la separación almacenarse mezcladas con un crioprotector (por ejemplo DMSO) hasta -196ºC (en fase de nitrógeno líquido o gaseoso) hasta el trasplante.

Las cantidades de células madre aplicadas según la invención en el caso de las células madre sin depleción CD6 son aproximadamente 1 - 4 x 10^{8}, preferentemente 2 - 4 x 10^{8} células mononucleares/Kg peso corporal, intentándose el mayor número posible. En el caso de las células madre con depleción de CD6, la cantidad es aproximadamente 0,4 - 2,0 x 10^{6}, preferentemente 0,8 - 2,0 x 10^{6} células CD34-positivas/Kg peso corporal. También en este caso se intenta una cantidad de células lo más alta posible.

Tanto las células madre de médula ósea como las células madre sanguíneas se le administran al paciente de forma intravenosa.

En el caso de trasplantes de órganos, se ofrecen diferentes posibilidades de aplicar la invención. En el caso de donantes vivos (riñones) puede plantearse un pretratamiento inmunosupresor similar al de donantes de células madre. Después de la donación de órganos, el donante puede estimularse con un factor de crecimiento y, como en el caso del trasplante de células madre, aferizarse después de aproximadamente 6 días. Alternativamente, puede obtenerse también médula ósea. Las preparaciones, o bien se infunden frescas o bien se crioconservan después de la extracción. En el caso de donantes cadáveres, la inmunosupresión puede comenzar justo después del momento del trasplante, la extracción de médula ósea debe llevarse a cabo al mismo tiempo que la extracción de órgano. La médula ósea se crioconserva después de la separación de CD6.

La tolerancia se mantiene después de la supresión del rechazo y de la reacción GVH iniciales mediante quimarismo, es decir, mediante la continuación de la formación de sangre extraña en el paciente. Las preparaciones de células madre sanguíneas y de médula ósea pueden presentarse también según la invención como preparaciones combinadas, dado que según la invención no es necesaria una identidad HLA de las preparaciones con depleción de CD6 con el trasplante de órgano, o bien con el trasplante de células madre. Mientras la diferencia en HLA se encuentre en el rango de tolerancia según la invención, no es necesario recurrir a una preparación combinada. En el caso de utilizar preparaciones de diversos donantes, la preparación sin depleción comporta quimarismo.

Según la invención se contempla, además de la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos, el tratamiento de enfermedades sanguíneas, inmunológicas y cancerígenas, las cuales se deben a una función errónea en la formación de sangre, por ejemplo las enfermedades no malignas de la sangre (por ejemplo la anemia aplástica aguda, la anemia aplástica, la anemia aplástica, la anemia de células sichel o la talasemia), las enfermedades del sistema inmune (por ejemplo la esclerosis múltiple, el reuma (CP), la esclerodermia) y las enfermedades sanguíneas malignas (por ejemplo la leucemia aguda y crónica de origen mieloide y linfático).

A continuación se ilustra la invención con la ayuda de ejemplos, los cuales sin embargo no deben limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

En el contexto de un estudio según la invención se transplantó a 21 pacientes con leucemias refractarias a otras terapias en el marco de un ensayo de curación, con una preparación combinada según la invención de células madre de médula ósea y células madre sanguíneas y células madre sanguíneas con depleción de CD6. Se trataba de pacientes con un riesgo elevado. Para poder comparar, los pacientes se llevaron a un mismo estadio de leucemia, llevándose a cabo en ellos un tratamiento según el estado de la técnica. En conjunto se investigaron 5 grupos de pacientes. Los resultados se representan en la tabla I.

1. Obtención de células madre de médula ósea

Después de investigar a fondo la idoneidad del paciente y de comprobar la misma por el médico encargado del examen, aproximadamente 3 semanas antes de la extracción de médula ósea planeada, el donante, dependiendo del número de células/ml en la médula ósea del donante y del peso del paciente, se extrajo en cada caso aproximadamente 100-1500 ml de médula ósea de los donantes a partir ambas crestas ilíacas bajo anestesia total y se añadió a un medio apropiado (por ejemplo RPMI 1640) con heparina o de heparina y disolución de citrato (ACD). Dicha médula ósea se aplicó en caso de compatibilidad de grupo sanguíneo sin más tratamiento. En caso que este no fuera el caso, se llevo a cabo una depleción de eritrocitos mediante sedimentación o centrifugación tras la adición de un acelerador de la sedimentación.

2. Obtención de las células madre sanguíneas

Después de investigar a fondo la idoneidad del paciente y de comprobar la misma por el médico encargado del examen, aproximadamente 5 días antes de la obtención de células madre planeada, se aplicó de forma subcutánea el factor de crecimiento G-CSF en una dosificación de 5 - 12,5 \mug/kg de peso corporal. A partir del día 4, se analizó en el laboratorio el contenido en células T CD34 positivas en la sangre del donante. Tan pronto como pudo ponerse de manifiesto la existencia de más de 10 células CD34 positivas/\mul, se llevó a cabo una aféresis de leucocitos mediante un separador celular. Mediante la aféresis de leucocitos, se coaguló la sangre fuera del cuerpo del donante con la ayuda de heparina y ACD. Las preparaciones de leucocitos ricas en células madre se añadieron a una bolsa de sangre separada con medio de cultivo de tejidos (por ejemplo RPMI 1640), mientras que el resto de sangre se devolvió al donante. En caso de que las cantidades celulares obtenidas no sean suficientes para el trasplante, al día siguiente se lleva a cabo una segunda citaféresis, siempre y cuando el estado corporal del donante lo permita.

3. Obtención de células madre de cordón umbilical

Después del nacimiento y omfalotomía del niño recién nacido, se obtuvo la sangre del cordón umbilical que se encontraba aún en la vena del cordón umbilical y en la placenta, mediante punción de la vena del cordón umbilical, siendo dicha sangre muy rica en células madre. La sangre del cordón umbilical obtenida se separa mediante sedimentación de un gran parte de los eritrocitos y finalmente se separa una parte del plasma mediante centrifugación. La sangre del cordón umbilical tratada de esta manera se divide como mínimo en dos bolsas de sangre y se almacena a -196ºC tras la adición de un crioprotector hasta su utilización.

4. Depleción CD6 de las células madre

Las células madre obtenidas, después de la 1 extracción por lavado de los trombocitos mediante centrifugación, se incuban en una concentración de aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml con una concentración de anticuerpo anti-CD6 (por ejemplo MT404 de P. Rieber/ G-Riethmüller; siendo posibles otros anticuerpos anti-CD6) que se encuentra sobre el rango de saturación (\sim1 mg/50 x 10^{8} células) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos en exceso no unidos se extraen por lavado mediante la adición de medio de lavado (por ejemplo RPMI) y centrifugado, dos veces. La separación de las células CD6 positivas se llevó a cabo mediante las denominadas partículas inmunomagnéticas, las cuales son partículas de hierro, las cuales se encuentran recubiertas por un anticuerpo dirigido contra el primer anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo de cabra anti-ratón, en el caso de que el primer anticuerpo proceda de ratón. De esta manera, las partículas de hierro se enganchan a la superficie de las células CD6-positivas y permiten la inmovilización en la bolsa mediante un imán. En el caso de utilizar partículas magnéticas (por ejemplo Dynabeads®), después de una incubación de 30 minutos a 4ºC, se coloca la bolsa de sangre sobre un imán. El contenido CD6-negativo de la bolsa se transfiere mediante una bomba (peristáltica) a través de un tubo flexible sobre un imán secundario a una nueva bolsa de sangre. Dicho procedimiento se repite una vez.

En el caso de la separación con micropartículas de mayor densidad (por ejemplo partículas de níquel), las células CD6-positivas no se separan mediante un imán sino por sedimentación.

Después de la separación, se analiza el número de células y la proporción de células CD34-positivas, CD8-positivas y CD6-positivas en la suspensión celular obtenida.

5. Pretratamiento de los pacientes

El tratamiento conduce en conjunto a una supresión aguda de la formación de sangre y a un debilitamiento del sistema de defensa inmune, de manera que las células de leucemia se eliminan lo más ampliamente posible y la reacción de rechazo contra el trasplante extraño se suprime lo más completamente posible.

Los pacientes de todos los grupos se sometieron una irradiación de cuerpo entero, cada uno de ellos con 4 Gy por día durante tres días consecutivos.

El Grupo 1 se sometió adicionalmente a un tratamiento con ciclofosfamida (CY). Para ello se les administró a los pacientes 0,50 mg de CY por kg de peso corporal diariamente de forma intravenosa durante cuatro días consecutivos.

Los pacientes del Grupo 2 se sometieron de la misma manera a un tratamiento CY, como el grupo 1, pero en el último día de irradiación, es decir, el día antes del primer tratamiento con CY, se sometieron a una transfusión de leucocitos del donante (DBC). Para ello a cada uno de los pacientes se le administró la cantidad total de leucocitos que pudo obtenerse en una leucaféresis de aproximadamente dos horas a partir del donante. Dichos leucocitos conducen a una estimulación y proliferación de los linfocitos del paciente, los cuales reconocen los antígenos de histocompatibilidad del donante. Los linfocitos que se encuentran en estadio de división son particularmente sensibles al tratamiento con CY, el cual se llevó a cabo al día siguiente.

El Grupo 3 no se sometió a leucocitos del donante, sino a 20 mg/kg de globulina anti-timocitos humanos de conejo (ATG Fresenius®) en la mañana del día del tratamiento CY.

El Grupo 4 se sometió al mismo pretratamiento que el grupo 3, sin embargo, se llevó a cabo adicionalmente la transfusión de leucocitos del donante en el día del primer tratamiento ATG/CY.

El Grupo 5 es el grupo en el cual se llevó a cabo el tratamiento según la presente solicitud de patente. Dicho grupo se sometió al mismo pretratamiento que el grupo 4, pero se le aplicó adicionalmente con células madre con depleción de CD6 6 días después del trasplante de células madre.

6. Trasplante de células madre

En el día que finalizó cada pretratamiento, a cada uno de los pacientes se les administró de forma intravenosa 1 - 4 x 10^{8} de células mononucleares por kg de peso corporal.

7. Trasplante de células madre con depleción de CD6

A los pacientes del Grupo 5 se les aplicó de forma intravenosa 0,4 - 2 x 10^{6} células madre con depleción de CD6, CD34-positivas por kg de peso corporal, de 4 a 8 días después del trasplante de células madre.

8. Profilaxis GVH

Todos los pacientes se sometieron a un tratamiento profiláctico intravenoso según el estado de la técnica con ciclosporina A a partir del día -1 y con metotrexato en el día 1, 3 y 6 o respectivamente 7, después del trasplante.

En el contexto del ciclo de ensayos, se trataron pacientes con el procedimiento según la invención, los cuales diferían con sus donantes en diversos antígenos HLA. En el caso de que el donante posea antígenos HLA que sean extraños para el paciente, se habla de diferencias en dirección huésped versus injerto, es decir, en la dirección de rechazo del trasplante. En el caso que el paciente posea antígenos HLA que sean extraños para el donante, se habla de diferencias en dirección injerto versus huésped. Como diferencia se entiende tradicionalmente la diferencia en un antígeno definido serológicamente. No se valoran las diferencias a nivel genético, que es posible determinar recientemente mediante el análisis de ADN.

Ejemplo:: haplotipo HLA común en cursiva

\quad: Diferencia en dirección HVG: A1 y B5

\quad: Diferencia en dirección GVH: B8 y DR 1

Donante:		Paciente HLA:

A = 2	A = 1		A = 2	A = 2
B = 27	B = 5		B = 8	B = 27
DR = 3	DR = 3		DR = 1	DR = 3

Los resultados se representan en la Tabla 1. En el caso de trasplante de células madre haploidéntico, se llevaron a cabo diferentes modelos de trasplante con diferentes acondicionamientos. De forma similar, en todos los casos se realiza una infusión de células madre (células madre de médula ósea o células madre de sangre periférica) el día después de la finalización del pretratamiento. En el Grupo II, IV y V los pacientes se sometieron después de TBI (irradiación de cuerpo entero) a DBC (administración de leucocitos del donante). Los pacientes del Grupo V se sometieron adicionalmente a células madre con depleción de CD6 4 - 8 días después del trasplante.

La columna 1 describe los diferentes grupos de tratamiento, siendo los grupos I - IV grupos comparativos respecto el grupo V (trasplante según la invención). La segunda columna indica el número de pacientes trasplantados de cada grupo. La columna 3 muestra a) el número de diferencias (diferencias en HLA), b) la cantidad de pacientes que han sido trasplantados con X diferencias y c) los loci HLA, sobre los cuales se presentan las diferencias en dirección HVG, es decir, las características que hacen que el receptor reconozca al donante como extraño. En la columna "crecimiento" se indica el número de pacientes en los cuales se constató un crecimiento del trasplante. La quinta columna corresponde a la columna 3, sólo que aquí desde el punto de vista del trasplante, es decir, cuántas características HLA reconoce el trasplante como extrañas en el receptor. En la última columna se indica el número de pacientes en los cuales se constató una reacción del trasplante contra el receptor. A partir de Grado II, dichas reacciones deben someterse a la terapia de un tratamiento adicional. El Grado IV es el grado GVH más grave, el cual mayoritariamente conduce a la muerte.

A pesar de las grandes diferencias en HLA en el grupo tratado según la invención, el porcentaje de pacientes en los cuales GVH es de grado II o superior es como mínimo comparable al porcentaje de los pacientes tratados según el estado de la técnica. Además pudo constatarse que incluso en el caso de una leucemia avanzada, con mayores diferencias en HLA y una proporción inferior de niños, el índice de supervivencia no era malo en el caso de tratamiento según la invención. Además, en una gran número de casos no era necesario llevar a cabo una inmunosupresión adicional duradera después del tratamiento.

En las tablas 2 y 3 se indica información más detallada de los pacientes especificados en el grupo 5 de la tabla 1 así como algunos otros pacientes, que se trataron también.

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Abreviaturas en las tablas 2 y 4:

AML:: leucemia mieloide aguda

NHL:: linfoma no Hodgkin

ALL:: leucemia linfática aguda

CLL:: leucemia linfática crónica

CML:: leucemia mieloide crónica

T-ALL:: leucemia linfática aguda de células T

sAML:: AML secundaria

OMF:: osteomielofibrosis

MDS:: síndrome mielodisplástico

RA:: anemia refractaria

UPN:: número de pacientes desconocido

Take:: crecimiento.

Un "-" en el paciente 1138 significa que no tuvo lugar ningún crecimiento después de 8 días, sino más tarde.

Otros ejemplos de realización

La presente invención trata de la utilización de células T supresoras o "células facilitadotas" que no sólo suprimen la reacción injerto versus huésped, sino también la reacción de rechazo. Dichas células supresoras son CD6-negativas, es decir, en presencia de células CD6-positivas no son activas. Después de la depleción de CD6, encontramos una depleción prácticamente completa de las células T CD4-positivas y una marcada depleción de células T CD8-positivas, de las cuales sin embargo, remanecieron aproximadamente un 4 - 5% (tabla 4). Las células madre CD34-positivas y las CD16-positivas CD56-positivas, es decir, las células denominadas agresoras naturales (natural killer), se mantienen. Se analizó el efecto inmunosupresor de dicha preparación celular con depleción de CD6 en el cultivo de linfocitos mixto ("reacción mixta de leucocitos" - MLR), según la cual se añadieron los linfocitos de dos personas con diferencias HLA a un recipiente de cultivo, promoviendo la división después del reconocimiento de los determinantes HLA-D diferentes. Para determinar la dirección de la reacción, se detiene el crecimiento de las células de una persona mediante irradiación. Si se añade a la MLR médula ósea o las denominadas células madre sanguíneas, la reacción se suprime de forma insignificante (tabla 5). En el caso de añadir preparaciones celulares con depleción de CD6 de médula ósea o de las denominadas células madre sanguíneas a la preparación anterior, la reacción se suprime marcadamente. Presumiblemente, la supresión de la reacción no viene determinada por las células madre CD34-positivas, dado que las células CD34-positivas seleccionadas positivamente sólo suprimen la reacción ligeramente (tabla 5). La supresión de la MLR se neutraliza considerablemente si además de separar las células CD6-positivas, se separan las células CD8-positivas. La suposición de que las células CD8-positivas, las cuales son CD6-negativas, son responsables de la supresión, se determina mediante la selección positiva de las células CD8-positivas a partir de las preparaciones CD6-negativas (tabla 6). Mientras que la subpoblación CD8-negativa de las células CD6-negativas tiene una escasa acción supresora, la supresión por parte de la subpoblación CD8-positiva es espectacular. En la tabla 5 y 6, significa:

cpm - cuentas por minuto (unidades de contaje por minuto), medidas a partir de la incorporación de ^{3}H-timidina en las células

SI - índice de estimulación (factor)

ARI - "average relative index", índice relativo medio

I, II: diferentes ensayos

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TABLA 4 Trasplante HLA - haploidéntico

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Fenotipo de PBSC después de la depleción de CD6

1

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TABLA 5 Trasplante HLA - haploidéntico

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Fenotipo de PBSC después de la depleción de CD6

2

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TABLA 6 Trasplante HLA - haploidéntico

La actividad supresora de MLR se encuentra en la fracción CD6-negativa y CD8-positiva

3

Mecanismo, esquema temporal y ventajas de la presente invención

El mecanismo de la supresión de una reacción inmune contra células y órganos con diferencias en HLA no está claro por el momento. Sabemos exclusivamente que la supresión no es específica, es decir, las preparaciones de células madre CD6-negativas CD8-positivas no sólo suprimen la reacción de linfocitos extraños contra los propios órganos en el sentido de una reacción injerto versus huésped y la reacción de los propios linfocitos contra las células y órganos extraños en el sentido de una reacción huésped versus injerto, es decir, una reacción de rechazo, sino también la reacción entre terceros. Así pues, entran en juego sólo las reacciones independientes de HLA, por ejemplo contra linfocitos activados de cualquier tipo de procedencia. Las células supresoras CD8-positivas han sido descritas por Reich-Zeiliger et al. (17) y Gandy et al. (18) en ratón. Sin embargo, ninguno de ambos grupos de investigación ha descrito que la depleción de CD6 sea decisiva para conseguir el objetivo. En la figura 2 se representa un modelo de supresión de la aloreacción por parte de células CD6-negativas, CD8-positivas. El ligando del antígeno CD6 sobre la superficie celular es ALCAM (molécula de adhesión de leucocitos activados), las células CD8-positivas son células citotóxicas, las cuales en presencia de células CD6-positivas presumiblemente sin su receptor de células T específico pueden ser citotóxicas si las células objetivo expresan marcadores de activación en el marco de una reacción inmune. Reisner et al. han verificado la citotoxicidad de dichas células, que han definido como mediador de la citotoxicidad FAS-L. Dado que la activación aparece unos pocos días después de la estimulación por antígeno, se indica la adición secuenciada en el tiempo (el día 6 después del trasplante) de células con depleción de CD6 (para el esquema temporal del trasplante, véase la figura 3).

Abreviaturas en la fig. 3:

TBI -: irradiación de cuerpo entero

DBC -: leucocitos del donante

CSA -: ciclosporina A

MTX -: metotrexato

BMT -: trasplante de médula ósea

ATG -: globulina antitimocítica

CY -: ciclofosforamida.

Los resultados del trasplante no pueden demostrar el mecanismo, sino sólo comprobar el efecto. En este contexto tiene una marcada relevancia el hecho de que nuestros pacientes se diferencien de sus donantes en más de un antígeno HLA. En el trabajo de Champlin et al. (19) predomina el porcentaje de pacientes con donantes idénticos en HLA y donantes emparentados, los cuales o bien son idénticos en HLA fenotípicamente o sólo se diferencian en un antígeno HLA. El trabajo trata sobretodo la cuestión de la depleción de células T del trasplante, la comparación de la depleción de todas las células T con depleción de sólo una parte de las células T y el trasplante de preparaciones no tratadas. No hace referencia al trasplante secuenciado en el tiempo de preparaciones de células madre que contengan células supresoras. En (20), Craddock et al., Blood 2000; 96: 86-90, se contempla otro objetivo. En dicho trabajo, en el momento de una reincidencia de leucemia, se transfunden linfocitos del donante para suprimir la leucemia. El trasplante de médula ósea con depleción de células T CD6+ también ha sido descrito por el Instituto Dana Farber, donde también se utilizaron donantes no idénticos en HLA (16). Sin embargo, en este estudio tampoco se administra un trasplante de células madre sanguíneas secuenciado en el tiempo para el trasplante de médula ósea. A pesar de la alta dosificación de la irradiación para acondicionar al paciente (7,5 - 10,5 Gy de irradiación linfoide total y 14 Gy de irradiación de cuerpo entero), 3 de 27 pacientes no presentaron un crecimiento estable. En los pacientes en un estadio temprano de la enfermedad, la probabilidad de supervivencia a 2 años era del 69%, en estadios avanzados del 20%. En comparación con dicho trabajo, son notables nuestros resultados alcanzados en el marco de ensayos de curación, con una menor irradiación y en estadios de enfermedad mucho más avanzados. Preferentemente, se lleva a cabo la irradiación según la invención con aproximadamente 4 Gy, preferentemente en los tres días consecutivos
siguientes.

Según la presente invención, se contempla, puede realizarse y tiene sentido tanto la utilización de células madre sanguíneas con depleción de CD6 como el trasplante de médula ósea y células madre sanguíneas en el caso de diferentes HLA, así como el trasplante de órganos como riñones y lóbulos del hígado a partir de donantes de hígado. En ambas situaciones, el momento del trasplante es también el momento del primer encuentro con el antígeno HLA diferente. Por eso se administra, en el contexto temporal, una adición secuenciada en el tiempo de células madre sanguíneas con depleción de CD6.

Lista de publicaciones

1. Prehn RT, Main JM: J. Natl. Cancer Inst. 18: 769-778, 1957.

2. Marmont AM, Horowitz MM, Gale RP et al.: depleción de células T de trasplantes HLA-idénticos en leucemia. Blood; 78: 2120-2130, 1991.

3. Martin, PJ, Akatsuka Y, Hahne M et al.: Implicación del mecanismo efector de células T del donante en la prevención del rechazo de injerto de médula alogénico. Blood, 92, 2177-2181, 1998.

4. Shapiro R, Starzi TE: aumento de médula ósea en receptores de trasplante renal. Transplant Proc. 30, 1371-1374, 1998.

5. Schumm, M., Günther, W, Kolb HJ, Rieber, P, Büttner, M, Voss, C, Retmeier, P, Thierfelder, S, Wilmanns, W (1994). Prevención de la enfermedad injerto versus huésped en perros con diferencias en el haplotipo DLA e injerto hematopoyético de médula con depleción CD6 con y sin tratamiento cG-CSF después del trasplante. Tissue antigens, 43: 170-178, 1994.

6. Aversa F, Tabilio A, Velard A, Cunningham I, Terenzi A, Falzetti F, Ruggeri L, Barbabietola G, Aristeo C, Latini P, Reisner Y, Martelli MF: tratamiento de la leucemia aguda de elevado riesgo con células madre con depleción de células T a partir de donantes emparentados con un haplotipo HLA totalmente diferente. N. Eng. J. Med. 339: 1186-1193, 1998.

7. Handgretinger R, Schumm M, Lang P, Greil J, Reiter A, Bader P, Niethammer D, Klingebiel T: trasplante de megadosis de células madre haploidénticas purificadas. Ann N Y Acad Sci. 30 de abril de 1999; 872: 351-61; discusión 361-2.

8. Sykes M et al.: quimarismo linfohematopoyético mixto y efectos injerto versus linfoma después de la terapia no-mieloablativa y del trasplante de médula ósea con diferencias en HLA. Lancet 358: 1755-1759, 1999.

9. Guinan EC, Boussiotis VA, Neuberg D, Brennan LL, Hirano N, Nadler LM, Gribben JG: trasplante de aloinjertos de médula ósea histoincompatibles anérgicos. N. Eng. J. Med. 340: 1704-1714, 1999.

10. Barrett AJ, Ringden O; Zhang MJ, Bashey A, Cahn JY, Cairo MS, Gale RP, Gratwohl A, Locatelli F, Martino R, Schultz KR, Tiberghien P: efecto de la dosis de células nucleadas de médula sobre la recaída y supervivencia en trasplantes de médula ósea de gemelos idénticos contra la leucemia. Blood, 1 de junio del 2000; 95 (11): 3323-7.

11. Mavroudis D, Fox M, Read EJ, Carter C, Barrett AJ. Efecto de la dosis de células CD34 sobre el resultado después del trasplante de médula con depleción de células T. Blood, 1996; 88: 3223.

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12. Ringden O, Nilsson B. Muerte por enfermedad injerto versus huésped asociada a diferencias en HLA, elevada edad del receptor, baja dosis de células de médula y esplenectomía. Transplantation. 1985; 40: 39.

13. Paulin T. Importancia de la dosis celular de médula ósea en el trasplante de médula ósea. Clin Transplant. 1992; 6; 48.

14. Soiffer RJ, Ritz J: depleción de células T selectiva de la médula alogénica del donante con anticuerpo monoclonal anti-CD6: fundamento y resultados. Bone Marrow Transplant. 12 suplemento 3: S7-10, 1993.

15. Soiffer RJ, Fairclough D, Robertson M, Alyea EP, Anderson K, Freedman AS, Bartlett-Pandite L, Fisher D, Schlossman SF, Stone R, Murria C, Freeman A, Marcus KC, Mauch P, Nadler LM, Ritz J: trasplante de médula ósea alogénica con depleción CD6 contra la leucemia aguda en la primera remisión completa. Blood 89: 3039-3047, 1997.

16. Soiffer RJ, Match P, Fairclough D, Alyea E, Anderson K, Fisher D, Freedman A, Bartlett-Pandite L, Robertson M, Schlossman R, Gollob J, Marcus K, Murray C, Kuhlman C, Freeman A, Nadler L, Ritz J: trasplante de médula ósea alogénica con depleción de células T CD6+ a partir de donantes emparentados con HLA no idéntico genotípicamente. Biol Blood Marrow Transplant. 3: 11-17, 1997.

17. Reich Zeiliger S, Zhao Y, Krautghamer R, Bachar-Lustig E, Reisner Y. CTLs anti CD8+ de terceros como células veto potentes: coexpresión de CD8 y FasL es un prerrequisito. Immunity 2000; 13: 507-515.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims

1. Utilización de una composición que contiene células madre y células madre con depleción de CD6 para la preparación de una composición farmacéutica para la aplicación secuencial en el tiempo, para la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos y/o para el tratamiento de enfermedades sanguíneas, inmunológicas o cancerígenas, caracterizada por el hecho de que primero se aplican las células madre y finalmente las células madre con depleción de CD6, excluyéndose las células madre embrionales humanas.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que las células madre son células madre de médula ósea, células madre de sangre periférica y/o células madre de sangre del cordón umbilical y las células madre con depleción de CD6, independientemente, proceden de células madre de médula ósea, de células madre de sangre periférica y/o de células madre de sangre del cordón umbilical.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por el hecho de que las células madre con depleción de CD6 se aplican 4 - 8 días, preferentemente 6 días, después de las células madre.

4. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que se obtienen las células madre con depleción de CD6 separando las células T CD6-positivas de las preparaciones de células madre o de las preparaciones enriquecidas en células madre, con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra el epítopo CD6.

5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada por el hecho de que en el anticuerpo se encuentra unida una partícula magnética y que las células T CD6-positivas se separan con la ayuda de un imán.

6. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada por el hecho de que en el anticuerpo se encuentra unida una partícula densa y que las células T CD6-positivas se separan por sedimentación.

7. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que las células madre y las células madre con depleción de CD6 se aplican de forma intravenosa.

8. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el donante y el receptor se diferencian en hasta 6 antígenos HLA, preferentemente de 0 a 3 antígenos HLA.

9. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que las células madre se aplican en una cantidad de 1 - 4 x 10^{8}, preferentemente de 2 - 4 x 10^{8} células mononucleares/Kg peso corporal, y por el hecho de que las células madre con depleción de CD6 se aplican en una cantidad de 0,4 - 2,0 x 10^{6}, preferentemente de 0,8 - 2,0 x 10^{6} células CD34-positivas/Kg peso corporal.

10. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que se aplica la siguiente combinación de células madre y de células madre con depleción de CD6: células madre de médula ósea - células madre de médula ósea con depleción de CD6, células madre de médula ósea - células madre de sangre periférica con depleción de CD6, células madre de sangre periférica - células madre de sangre periférica con depleción de CD6, células madre de sangre periférica - células madre de médula ósea con depleción de CD6 o células madre de sangre de cordón umbilical - células madre de sangre de cordón umbilical con depleción de CD6.

11. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el donante de células madre y el donante de células madre con depleción de CD6 son diferentes personas.

12. Utilización según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores para el tratamiento de la leucemia.

13. Preparación combinada que contiene células madre y células madre con depleción de CD6, para su utilización secuencial en el tiempo, para la inducción de tolerancia frente a trasplantes alogénicos y/o para el tratamiento de enfermedades sanguíneas, inmunológicas o cancerígenas, excluyéndose las células madre embrionales humanas.

14. Preparación combinada según la reivindicación 13, caracterizada por el hecho de que las células madre son células madre de médula ósea, células madre de sangre periférica y/o células madre de sangre del cordón umbilical y las células madre con depleción de CD6, independientemente, proceden de células madre de médula ósea, de células madre de sangre periférica y/o de células madre de sangre del cordón umbilical.

15. Preparación combinada según la reivindicación 13 ó 14, caracterizada por el hecho de que las células madre con depleción de CD6 se aplican 4 - 8 días, preferentemente 6 días, después de las células madre.

16. Preparación combinada según cualquiera o varias de las reivindicaciones 13 a 15 para el tratamiento de la leucemia.