ES2266159T3 - Mejora de la galactosilacion de glicoproteinas recombinantes. - Google Patents

Abstract

Proceso para la producción celular de glicoproteínas con una mayor glicosilación, dicho proceso comprende: La expresión de la glicoproteína en las células con un aumento de la actividad CAD (complejo polipeptídico enzimático de carbamoilfosfato sintetasa II (CPSII)/aspartato transcarbamoilasa (AT- Case)/dihidroorotasa) comparada con las células huésped control; y en consecuencia la producción de glicoproteínas con una mayor glicosilación comparada con las células huésped control.

Description

Mejora de la galactosilación de glicoproteínas recombinantes.

La solicitud se ha registrado como una solicitud PCT por Genentech, INC., nacional y residente de Estados Unidos de América, designando todos los estados.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos, número de serie 60/181.108, registrada el 8 de Febrero, y la solicitud provisional de Estados Unidos con número de serie 60/191.641, registrada el 23 de Marzo del 2000.

Campo de la invención

Esta invención hace referencia a la glicosilación de glicoproteínas recombinantes y más particularmente la invención hace referencia a un proceso de producción de glicoproteínas dentro de las células con una aumento en su actividad CAD.

Antecedentes de la invención

Las glicoproteínas recombinantes expresadas por genes foráneos en las células huésped son de especial interés para la comunidad científica debido a su valor potencial como agentes profilácticos y terapéuticos. Las glicoproteínas recombinantes están compuestas de cadenas aminoacídicas que expresan una serie de complejos y diversas estructuras oligosacáridas. Mientras que la secuencia aminoacídica de las glicoproteínas recombinantes puede reproducirse de forma consistente, las cadenas laterales de los oligosacáridos son a menudo heterogéneas tanto en la composición como en la estructura. Rademacker y col., (1988) Annu Rev Biochem. 57:785-838; Spellman y col., (1989) J. Biol. Chem. 264 824):14100-14111; Spellman y col., (1991) Biochemistry 30.2395-2406; Kagawa y col., (1988) J. Biol. Chem. 263 (33):17508-17515.

La estructura oligosacárida heterogénea puede tener efectos desfavorables sobre las propiedades glicoproteicas, incluyendo: la función, la conformación, la solubilidad, la actividad específica, la antigenicidad e inmunogenicidad de la glicoproteína. Wiwer y col., (1990) Biochem. 29:4175-4180; Hart (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Parekh (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754. En consecuencia, la atención dentro de la comunidad científica se ha focalizado en la producción de glicoproteínas recombinantes que tengan la secuencia aminoacídica correcta y que expresen un perfil oligosacárido menos heterogéneo, preferentemente uno que corresponda con la proteína nativa. Ello es especialmente importante en la producción de agentes terapéuticos, dado que la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos requiere que se exprese el mismo patrón oligosacárido en cualquier agente terapéutico biológico.

Se han utilizado diversas estrategias para influir en la composición de los oligosacáridos de las glicoproteínas recombinantes. Dichas estrategias incluyen: (1) la producción de líneas celulares huéspedes recombinantes que sobreexpresen determinadas glicosiltransferasas con el objetivo de aumentar la biosíntesis; (2) la prevención de la degradación de oligosacáridos por las células huéspedes mediante la regulación de las enzimas glicohidrolíticas; y (3) el cultivo de células huéspedes productoras de glicoproteínas recombinantes en presencia de azúcares libres o de otros sustratos requeridos para la producción de oligosacáridos. Existen, sin embargo, ciertos inconvenientes asociados con estas estrategias. Por ejemplo, la eficiencia de las glicosiltransferasas depende de la cantidad de sustrato oligosacárido en la célula; la regulación de la degradación de oligosacáridos puede no ser eficaz si las proteínas se glicosilan inadecuadamente; y algunas estrategias de alimentación propuestas pueden ser de coste desorbitado costosas y pueden conducir a una inhibición por retroalimentación negativa de las glicotransferasas relevantes. En consecuencia, existe todavía una necesidad en la materia relativa a las glicoproteínas recombinantes de un procedimiento de producción de glicoproteínas recombinantes que expresen perfiles oligosacáridos consistentes. Teniendo en cuenta las anteriores consideraciones, se ha se ha desarrollado la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una mejor galactosilación y sialilación de las glicoproteínas recombinantes mediante la intensificación de la biosíntesis de novo de pirimidinas gracias al aumento en la actividad de la sintasa II Carbamoil-fosfato (CPS)/dihidro-orotasa (CAD). Es una característica de la presente invención que las glicoproteínas, producidas en las células que presentan un aumento en la actividad de CAD, expresen una mayor galactosilación. La invención es útil para la expresión de glicoproteínas de genes endógenos o de ácidos nucleicos introducidos en las células en condiciones adecuadas. La presente invención es especialmente útil, en consecuencia, para la expresión recombinante de proteínas que tienen residuos de galactosa necesarios para la actividad enzimática, inmunológica u otras actividades biológicas de interés, o para las características de aclaramiento de la proteí-
na.

En una realización preferida de la invención, las glicoproteínas se producen en células seleccionadas por tener una mayor actividad CAD. Por ejemplo, las células se seleccionan por su aumento en la actividad CAD mediante incubación con un inhibidor de CAD como el N-fosfonacetil-L-aspartato (PALA). Las células seleccionadas por su resistencia a PALA presentan un aumento de la actividad CAD.

Por lo general, la presente invención proporciona un proceso para la producción de glicoproteínas con un aumento de la glicosilación que comprende la etapa de expresión de la glicoproteína en una célula huésped que tiene una mayor actividad CAD intracelular comparada con las células huéspedes control. En realizaciones preferidas, una mayor actividad intracelular de CAD conduce a un aumento de la concentración intracelular de UTP, lo que conduce a una mayor galactosilación de las glicoproteínas recombinantes producidas. También se describen aquí las células huésped y las líneas celulares con una mayor actividad CAD intracelular así como una glicoproteína con una galactosilación mejorada producida por la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica la glicoproteína en una célula con una mayor actividad CAD.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1A y la 1B son representaciones esquemáticas de la vía de biosíntesis de novo de pirimidinas.

La Figura 2 es una representación esquemática del proceso utilizado para seleccionar las células CHO que presentan una actividad CAD elevada gracias al empleo de PALA.

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra la actividad de CPS II en las células CHO seleccionadas por PALA respecto a las células control.

La Figura 4 es un gel que muestra la expresión de CAD en las células CHO seleccionadas por PALA.

La Figura 5 muestra un cromatograma HPLC de nucleótidos intracelulares y azúcares de nucleótidos que incluyen el UTP y UDP-Galactosa en las células CHO seleccionadas por PALA.

La Figura 6 es una gráfica que muestra la estabilidad de los niveles de UTP y UDP-Galactosa en las células CHO seleccionadas por PALA durante 90 días.

La Figura 7 es un gráfico que muestra los niveles de UTP en las células CHO cultivadas en diversos niveles de uridina.

Las Figuras 8A y 8B son gráficos de barras que muestran los niveles de UTP (Figura 8A) y UDP-Galactosa (Figura 8B) en las células CHO incubadas con uridina; galactosa; y uridina y galactosa.

La Figura 9 es una representación esquemática de la relación entre CAD, uridina, UTP, galactosa y UDP-Galacto-
sa.

La Figura 10 es un gráfico que muestra el contenido de galactosa del anticuerpo aCD20 producido en las células CHO incubadas con uridina comparadas con el control.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

El término "célula eucariota" o línea celular se utiliza para referirse a las células establecidas en el cultivo ex vivo. Es una característica de la célula eucariota de la presente invención que expresa o es capaz de expresar una glicoproteína de interés. Las células eucariotas utilizadas en la producción de un producto proteico de interés tienen los medios para glicosilar las proteínas mediante adición de cadenas laterales de oligosacáridos. Dichas células, en ciertas realizaciones, también tienen la capacidad para eliminar y/o modificar enzimáticamente parte o todas las cadenas laterales de las glicoproteínas.

Ejemplos de células huéspedes eucariotas adecuadas en el contexto de la presente invención incluyen las células de insecto y las células de mamífero. Ejemplos de células huéspedes incluyen las células SF9 (Summers y Smith (1987) Texas Agriculture Experiment Station Bulletin, 1555; e Insect Cell Culture Engineering, Goosen Daugulis y Faulkner Eds. Dekkler, New York); células de ovario de hámster chino (CHO) (Puck y col., (1958) J. Exp.Med. 108:945-955; Puck (1985) Molecular Cell Genetics, Gottersman MM ed. Wiley Interscience pp 37-64) incluyendo la expresión por células CHO del TNFR-IgG y el anti-CD20; la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón de embrión humano (Graham y col., (1977) J. Gen Virol., 36:59); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); y células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2). La anterior lista de ningún modo pretende limitar el ámbito de la invención.

Tal como se utiliza aquí, el término "célula control" hace referencia a una célula que se ha cultivado en paralelo con una célula tratada en las condiciones experimentales especificadas pero al contrario que la célula tratada, la célula huésped control no se somete a la condición experimental especificada. Las células control representan el nivel basal a partir del cual se realizan las comparaciones.

El término "secuencia de ácido nucleico" hace referencia al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica. La secuencia desoxiribonucleotídica codifica en consecuencia la secuencia aminoacídica.

El término "vector de expresión" hace referencia a un fragmento de DNA, generalmente de cadena doble, que puede haberse insertado en un fragmento de DNA, por ejemplo, un fragmento de DNA foráneo. El DNA foráneo se define como el DNA heterólogo que es un DNA que no se halla de forma natural en la célula huésped e incluye copias adicionales de genes presentes de forma natural en el genoma del huésped. El vector se utiliza para transportar el DNA foráneo o heterólogo en una célula huésped adecuada. Una vez en el interior de la célula huésped, el vector es capaz de integrarse en los cromosomas de la célula huésped. El vector contiene los elementos necesarios para seleccionar células que contengan el DNA integrado así como los elementos para promocionar la transcripción del RNA mensajero poliadenilado (mRNA) a partir del DNA transfectado. De esta manera, es posible sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el DNA foráneo.

El término "expresión" o "expresa" se utiliza aquí para referirse a la transcripción y traducción que tiene lugar dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un producto génico en una célula huésped puede determinarse en relación con la cantidad del mRNA correspondiente presente en la célula o la cantidad de proteína codificada por el producto producida por la célula. Por ejemplo, el mRNA transcrito de un producto génico se cuantifica generalmente mediante hibridación de la transferencia de Northern, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína codificada por un gen puede cuantificarse bien mediante ensayos de la actividad biológica de la proteína o mediante ensayos independientes de su actividad, como la transferencia de western o el inmunoensayo con anticuerpos capaces de reaccionar con la proteína. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Tal como se utiliza aquí, "glicoproteína" hace referencia a péptidos y proteínas que tienen más de 10 aminoácidos y por lo menos un carbohidrato. Las glicoproteínas pueden ser homólogas a la célula huésped o, preferentemente, heterólogas, es decir foráneas a la célula huésped. Ejemplos de glicoproteínas que podrían expresarse mediante una de las realizaciones de la presente invención incluyen las moléculas como las citoquinas y sus receptores, las proteínas quiméricas, el factor de necrosis tumoral alfa y el beta, los receptores del factor de necrosis tumoral, la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento bovino, la hormona paratiroidea, la hormona estimulante del tiroides, las lipoproteínas, la alfa-1 antitripsina, la cadena A de la insulina, los receptores de célula T, las proteínas de la membrana de superficie celular, los anticuerpos monoclonales y las proteínas transportadoras. La lista de ejemplos es ilustrativa y de ningún modo debe considerarse como una limitación para el ámbito de la presente invención.

El término "glicoforma", tal como se utiliza aquí dentro del contexto de la presente invención, denota una glicoproteína que contiene una estructura o estructuras de carbohidratos particular.

El término "glicosilación", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, abarca el proceso por el cual una proteína está unida covalentemente con una o más cadenas oligosacáridas. El término "galactosilación" hace referencia a la adición de unidades de galactosa a una cadena oligosacárida en una glicoproteína y "sialilación" a la adición de un ácido siálico a una cadena oligosacárida en una glicoproteína.

El término "período de tiempo y en condiciones tales que se maximice el crecimiento celular", y similar, hace referencia a las condiciones de cultivo que, para una línea celular en particular, se determinan como óptimas para el crecimiento y división celular. Normalmente, durante el cultivo celular las células se cultivan en medios nutritivos con los aditivos necesarios a unos 30-40ºC, en atmósfera controlada y humedad, con el fin de lograr el crecimiento óptimo para cada línea celular.

El término, tal como se utiliza aquí, "cultivado durante el tiempo suficiente para que tenga lugar la selección" hace referencia al hecho de cultivar físicamente las células huésped eucariotas con el agente de selección hasta la aparición de clones resistentes que se crecerán y se ensayarán por sus características relevantes.

Tal como se utiliza aquí de modo intercambiable, los términos proteína, péptido y polipéptido se refieren a un polímero aminoacídico o a un grupo de dos o más polímeros aminoacídicos que interactúan o están unidos entre sí.

Tal como se utiliza aquí, el término "CAD" hace referencia al complejo polipeptídico multienzimático (carbamoil fosfato sintetasa (CPSII), aspartato transcarbamoilasa y dihidro-orotasa) que cataliza las tres primeras reacciones en la biosíntesis de novo de las pirimidinas (véase la Figura 1A). La etapa limitante para la biosíntesis de pirimidinas es la síntesis de carbamoil fosfato a partir del bicarbonato, ATP y glutamina por la CPS II (una de las actividades enzimáticas asociadas con CAD). (Irvine y col., (1997) Eur. J. Biochem 247:1063-1073). Por último, CAD en asociación con otras dos enzimas, la orotasa fosforibosil transferasa y orotidilato descarboxilasa, generan UMP que es finalmente convertido en UTP.

Tal como se utiliza aquí, los inhibidores de CAD incluyen cualquier sustancia conocida que inhiba las actividades del complejo de CAD. Los inhibidores de CAD incluyen el N-(fosfoacetil)-L-aspartato (véase la Figura 1B).

Modos para llevar a cabo la invención

La presente invención se basa, entre otras cosas, en el descubrimiento inesperado de que la producción de glicoproteínas en las líneas celulares huésped resulta por lo general en perfiles oligosacáridos de la glicoproteína infra-glicosilados. Según la presente invención, la expresión de glicoproteínas en una célula huésped con una mayor actividad CAD, si la célula huésped es capaz de expresar una glicoproteína de interés, resulta en perfiles oligosacáridos de la glicoproteína consistentemente aumentados.

Mayor actividad CAD

La selección de una mayor actividad CAD en una célula huésped que exprese o sea capaz de expresar una glicoproteína de interés puede tener lugar mediante cualquier medio conocido en la materia. En una realización particular, las células pueden tratarse con un inhibidor de CAD y las células resistentes, supervivientes se pueden seleccionar por su mayor actividad CAD. El inhibidor CAD puede ser cualquiera conocido en la materia. Un inhibidor de CAD preferido para utilizar en la presente invención es el P-(fosfonacetil)-L-Aspartato (PALA). Las células tratadas con PALA se seleccionan típicamente utilizando concentraciones finales de PALA de entre 2 a 10 mM.

Se selecciona una célula, preferentemente una célula de mamífero o una célula de insecto, más preferentemente una célula de ovario de hámster chino (CHO), como CHO DP12, CHO DG44 o CHO Kl, bajo la presión de un factor inhibidor de CAD como el PALA. Las células se cultivan en un medio basal como el de una formulación basada en DMEM/HAM F-12 (para la composición de DMEM y HAM F12, véanse las formulaciones de medios de cultivo del American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Sexta edición, 1988, pp. 346-349) (la formulación del medio tal como se describe en la patente americana U.S. 5.122.469 es especialmente adecuada) con el inhibidor de CAD adecuado, con concentraciones modificadas de algunos componentes como los aminoácidos, sales, azúcares y vitaminas, y opcionalmente con glicina, hipoxantina y timidina; insulina humana recombinante, peptona hidrolizada, como la Primatone HS o Primatone RL (Sheffield, England), o el equivalente; un agente protector celular, como el Pluronic F68 o el pluronic poliol equivalente; Gentamicina; y elementos traza.

Las células supervivientes, que crecen bajo la selección del inhibidor de CAD, es decir, las células resistentes al inhibidor de CAD, se analizan por su actividad CAD mediante cualquiera de los ensayos conocidos en la materia. Ejemplos incluyen, la reacción parcialmente dependiente de amoniaco (Shaw y col., (1992)) Eur. J Biochem.207:957-965) y el procedimiento radiométrico (Guy y col (1997) JBC 272 (46):29255-29262).

Una mayor actividad CAD intracelular también puede producirse por la sobreexpresión de CAD dentro de una célula. La CAD humana se clonó por Iwahana y col., (1996) (Biochemical and Biophysical Research Comm., 219:249-255) y demostró tener los dominios enzimáticos de la CAD de hámster. Davidson y col., (1995) Plenum Press, New York, 591-595. La sobreexpresión puede ser de toda la proteína CAD o de cualquier parte que proporcione suficiente actividad CAD para los propósitos de la presente invención. Es posible utilizar los procedimientos bien conocidos en la materia para la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican CAD. Estas incluyen los vectores plasmídicos, los vectores virales y otros procedimientos para la introducción de material genético en una célula huésped. Es necesario que los genes CAD se introduzcan de forma que la célula huésped exprese la proteína. Es preferible un nivel elevado de expresión de CAD. Las técnicas para la sobreexpresión de una proteína en una célula huésped se discuten con mayor detalle más adelante en el contexto de la producción de glicoproteína.

Otro procedimiento adecuado para aumentar la actividad CAD intracelular es la expresión de CAD mutada, donde la mutación reduce la regulación inhibidora por los productos enzimáticos, por ejemplo, por UTP o análogos de UTP. Son útiles las secuencias de ácido nucleico con una o más mutaciones en el sitio de unión del UTP, aunque la mutación puede ocurrir en cualquier lugar de la secuencia de ácido nucleico y ser suficiente como para interrumpir la regulación por UTP de la proteína CAD mutante codificada.

Aumento de los niveles de UTP y UDP-Galactosa

Una mayor actividad CAD intracelular conduce a un aumento de las concentraciones de UTP y UDP-Galactosa intracelulares. Las células que presentan una mayor actividad CAD se analizan por sus niveles de UTP y UDP-Galactosa mediante procedimientos conocidos en la materia como el procedimiento de Ryll y Wagner (1991). J. Chromatography, 570:77-88.

Glicoproteína

De acuerdo con la invención, las células huésped resistentes al inhibidor de CAD, como las descritas más adelante, se modifican para expresar funcionalmente una glicoproteína endógena o una glicoproteína recombinante. Una realización preferida de la presente invención proporciona células CHO resistentes a PALA, utilizadas para la obtención de niveles elevados de expresión de glicoproteínas a partir de vectores diseñados. La glicoproteína expresada por las células CHO se produce generalmente a partir del DNA transfectado en la célula. La estructura y la magnitud de la porción de carbohidratos de la glicoproteína se determinan por la maquinaria celular de la célula huésped, en este ejemplo, la célula CHO resistente a PALA.

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Las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de célula huésped endógena o una glicoproteína recombinante heteróloga están disponibles y pueden obtenerse fácilmente por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante procedimientos de síntesis in vitro o también a partir de librerías de cDNA. Los medios para la creación sintética del DNA, bien manuales o con ayuda de aparatos automáticos, son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos de las técnicas actuales disponibles para la síntesis del polinucleótido se hallan, por ejemplo, en Maniatis y col., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1984), y Horvath y col., An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleotide 3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154:313-326, 1987, incorporados aquí en las referencias. Alternativamente, la secuencia génica codificante de la glicoproteína recombinante se clona a partir de librerías de cDNA que utilizan técnicas disponibles por un experto en la materia. Por ejemplo, pueden utilizarse las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa con lo que se consigue amplificar una secuencia de ácido nucleico. Los cebadores oligonucleotídicos basados en las secuencias que corresponden con los extremos 3' y 5' del segmento del DNA a amplificar se hibridan en condiciones adecuadas y se utiliza la enzima Taq polimerasa, o la enzima equivalente, para sintetizar copias del DNA localizado entre los cebadores.

El procedimiento determinado que se utiliza para la expresión funcional de la glicoproteína recombinante no es crítico para la invención. Por ejemplo, puede utilizarse cualquier procedimiento para la introducción de secuencias nucleotídicas en las células huésped. Estos procedimientos incluyen la utilización de vectores plasmídicos, vectores virales, y otros procedimientos para la introducción de material genético en una célula huésped. Es necesario que el gen o el ácido nucleico a expresar se introduzcan de forma que la célula huésped exprese la proteína. Es preferible lograr niveles elevados de expresión.

Por ejemplo, la expresión se logra generalmente mediante la introducción en las células de la glicoproteína adecuada junto con otro gen, referido comúnmente como un gen de selección, que codifica un marcador seleccionable. Un marcador seleccionable es una proteína que es necesaria para el crecimiento o la supervivencia de una célula huésped en condiciones de cultivo elegidas, como una enzima que confiera resistencia a un antibiótico u otro fármaco, o una enzima que compense un defecto metabólico o catabólico en la célula huésped. Por ejemplo, genes seleccionables utilizados comúnmente con células eucariotas incluyen los genes para la aminoglicósido fosfotransferasa (APH), la higromicina fosfotransferasa (hyg), la dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (tk), la resistencia a neomicina, la resistencia a puromicina, la glutamina sintetasa, y la asparraguina sintetasa. En la selección de un sistema de expresión adecuado, se elige un marcador seleccionable para la glicoproteína con el fin de facilitar, si es necesario, una segunda transfección con un segundo marcador amplificable para la expresión de un segundo producto glicoproteico, o para permitir modificaciones adicionales de la célula huésped. Dichas modificaciones pueden incluir el aumento de otras actividades relacionadas para mejorar el metabolismo celular de la cantidad o calidad de la expresión del producto recombinante.

El nivel de expresión de un gen introducido en una célula huésped eucariota de la invención depende de factores múltiples, incluyendo el número de copias génicas, la eficiencia de la transcripción, el procesamiento del RNA mensajero (mRNA), la estabilidad y la eficiencia de traducción. Según ello, un elevado nivel de expresión de una glicoproteína de interés de acuerdo con la presente invención implicará la optimización de uno o más de estos
factores.

Además, puede aumentarse el nivel de producción de glicoproteína mediante la unión covalente de la secuencia codificante del gen con un promotor "fuerte" o un intensificador que proporcionará niveles elevados de transcripción. En el contexto de la presente invención, son adecuados los promotores y los intensificadores que interactúan específicamente con proteínas en una célula huésped resistente a PALA y que están implicados en la transcripción. Entre los promotores eucariotas que se han identificado como promotores fuertes para una expresión de nivel elevado preferidos en el contexto de la presente invención son el promotor temprano de SV40, el promotor tardío principal de SV40, el promotor de la metalotioneina de ratón, la repetición terminal larga del virus del Sarcoma de Rous y el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV). De especial utilidad en la expresión del producto de la glicoproteína de interés son los promotores virales fuertes como los del virus del sarcoma mieloproliferativo (Artel y col., (1988) Gene 68:213-220), el promotor temprano de SV40 (McKnight y Tijan (1986), Cell, 46:795-805).

Los intensificadores que estimulan la transcripción a partir de un promotor unido son también de utilidad en el contexto de la presente invención. Al contrario que los promotores, los intensificadores son activos cuando se colocan cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción o a una distancia considerable del promotor, aunque en la práctica los intensificadores pueden solapar física y funcionalmente con los promotores. Por ejemplo, muchos de los promotores fuertes citados más arriba también contienen intensificadores fuertes (Bending, (1988) Genetic Engineering, 7:91).

El nivel de la producción o expresión proteica también puede aumentarse incrementando el número de copias génicas para introducir directamente en la célula huésped copias múltiples del gen, por ejemplo, utilizando un exceso molar del producto génico relativo al gen seleccionable durante la cotransfección. Kaufman, (1990) Meth. Enzymol., 185537. Con este procedimiento, sin embargo, únicamente una pequeña proporción de células cotransfectadas contendrá el producto génico a un número elevado de copias. Para identificar los transfectantes deseados con un número elevado de copias, se requieren procedimientos de cribado.

También es preferible la utilización de vectores del tipo donante-ayuste como los descritos por Lucas y col., (1996) Nuc. Acid Res. 24(9).1774-1779 y la patente internacional WO/9604391.

Otro procedimiento para la obtención de un número elevado de copias génicas implica la amplificación génica en la célula huésped. La amplificación génica tiene lugar en las células eucariotas a una frecuencia relativamente baja (Schimke, (1988) J. Biol. Chem., 263:5989). Sin embargo, la amplificación génica también puede ser inducida, o al menos seleccionada para, mediante la exposición de las células huésped a una presión selectiva adecuada. Por ejemplo, en muchos casos es posible introducir un gen de glicoproteína junto con un gen de amplificación en una célula huésped y a continuación seleccionar por la amplificación del gen marcador mediante exposición de las células cotransfectadas a concentraciones crecientes de un agente selectivo.

Típicamente, el producto génico se coamplificará con el gen marcador en tales condiciones.

El gen amplificable más ampliamente utilizado para dicho propósito es un gen DHFR, que codifica una enzima dihidrofolato reductasa. El agente de selección utilizado junto con un gen DHFR es el metotrexato (MTX). En este ejemplo, se cotransfecta una célula resistente a PALA con el gen de la glicoproteína y un gen DHFR, y se identifican los transfectantes primero mediante el cultivo de las células en medio de cultivo que contiene MTX. Las células transfectadas se exponen a continuación a cantidades crecientes de MTX. Ello conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR, y concomitantemente a copias múltiples del gen de la glicoproteína (Schimke, (1988) J. Biol. Chem., 263:5989; Axel y col., patente americana U.S. 4.399.216; Axel y col., patente americana U.S. 4.634.665; Kaufman en Genetic Engineering, ed. J. Setlow (Plenum Press, New York), vol 9 (1987); kaufinan y Sharp, (1982) J. Mol. Biol. 159:601; Ringold y col., J. Mol. Appl. Genet., 1:165-175; Kaufman y col., Mol. Cell. Biol., 5:1750-1759; Kaetzel y Nilson, (1988) J. Biol. Chem., 263:6244-6251; Hung y col., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:261-264; kaufman y col., (1987) EMBO J., 6:87-93; Johnston y Kucey, (1988) Science, 242:1551-1554; Urlaub y col., (1983) Cell, 33:405-412.

Alternativamente, las células huésped pueden co-transfectarse con un gen de glicoproteína, un gen DHFR, y un gen de selección dominante, como el gen neo^{r}. Los transfectantes se identifican en primer lugar mediante el cultivo de las células en medio de cultivo con neomicina (o el fármaco relacionado G418), y a continuación se seleccionan los transfectantes identificados por la amplificación del gen DHFR y del producto génico mediante exposición a cantidades en aumento sucesivo de MTX.

Otro procedimiento implica la utilización de vectores de expresión de mRNA policistrónicos que contienen un gen en el extremo 5' de la región transcrita y un gen seleccionable en el extremo 3'. Ya que la traducción del gen seleccionable en el extremo 3' del mRNA policistrónico es ineficiente, dichos vectores presentan una traducción preferencial del gen de la glicoproteína y requieren niveles elevados del mRNA policistrónico para sobrevivir a la selección. Kaufman, (1990) Meth. Enzymol., 185:487; Kaufman, (1990) Meth. Enzymol., 185:537; Kaufman y col., EMBO J. 6:187. Según ello, las células que expresan niveles elevados de la proteína de interés pueden obtenerse en una sola etapa mediante el cultivo de los transfectantes iniciales en un medio que contenga un agente adecuado de selección para utilizar con el gen seleccionable particular.

Otro procedimiento adecuado dentro del contexto de la presente invención es integrar los genes que codifican la glicoproteína en una parte activa transcripcionalmente del genoma de células resistentes a PALA. Dichos procedimientos se describen en la solicitud de patente PCT/US/04469.

En el contexto de la presente invención, también son útiles otros vectores de expresión en mamíferos como los que tienen unidades de transcripción sencillas. Se han construido vectores retrovirales (Cepko y col., (1984) Cell, 37:1053-1062) en los que se inserta el cDNA entre los sitios endógenos donante y receptor de ayuste del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) seguido por un gen de resistencia a neomicina. Este vector se ha utilizado para expresar diversos productos génicos después de la infección retroviral de diversos tipos celulares.

La introducción de ácidos nucleicos que codifican la glicoproteína se logra mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Para las células de mamífero sin paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, (1978), Virology, 52:456-457. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamíferos se han descrito por Axel en la patente americana U.S. 4.399.216, publicada el 16 de Agosto de 1983. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para la introducción del DNA en las células, como la inyección nuclear, la fusión de protoplastos o la electroporación (Chisholm y col., (1995) DNA Cloning IV: A Practical Approach, Mammalian Systems, Glover y Hanes, eds., pp. 1-41). En la realización preferida, el DNA se introduce en las células huésped mediante lipofección. Véase, Andreason, (1993) J. Tiss. Cult. Meth., 15:56-62, para una revisión de las técnicas de electroporación de utilidad para la práctica de la presente invención.

La amplificación y/o la expresión génicas pueden cuantificarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia de Southern, transferencia de Northern convencionales para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), transferencia de mancha (análisis del DNA o el RNA), RT-PCR o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente, basada en las secuencias que aquí se proporcionan. Se pueden utilizar diversos marcajes para la generación de sondas, comúnmente los radioisótopos, en particular el P^{32}. Sin embargo, también pueden utilizarse otras técnicas como los nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve como el sitio de unión para la avidina o los anticuerpos, que pueden marcarse con diversos marcajes, como los radionuclidos, los fluorescentes, las enzimas o similares. Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse de modo que reconozcan duplex específicos, incluyendo duplex de DNA, duplex de RNA, y duplex híbridos de DNA-RNA o duplex de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo si el duplex está unido a una superficie, de modo que es posible detectar la formación del duplex en la superficie, la presencia del anticuerpo unido al duplex.

Para el cultivo de las células resistentes a PALA que expresan la proteína deseada y modificada tal como se describe para la presente invención, es posible utilizar numerosas condiciones de cultivo teniendo en cuenta las células resistentes a cultivar. Las condiciones de cultivo para células eucariotas son bien conocidas en la materia (J. Immunol. Methods (1983)56:221-234) o pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2º Ed., Rickwood, D. y Hames, B.D., eds, Oxford University Press, New York (1992)), y varían de acuerdo con las células seleccionadas en particular.

Para la producción de glicoproteínas, se utiliza generalmente la producción mediante el crecimiento de las células huésped de la presente invención en diversas condiciones de cultivo. Por ejemplo, los procedimientos del cultivo de células para la producción a pequeña o gran escala de proteínas son potencialmente útiles en el contexto de la presente invención. Se pueden utilizar los siguientes procedimientos, pero sin limitarse a ellos, como un bioreactor de lecho fluido, un bioreactor de fibra hueca, un cultivo en frascos rodantes, o un sistema de tanques en agitación; y los dos últimos sistemas pueden utilizarse con o sin microvehículos y operar alternativamente en modo de carga continua o cargas de alimentación.

Después de la fase de producción de glicoproteínas, el polipéptido de interés se recupera del medio de cultivo utilizando técnicas que están bien establecidas en la materia.

El polipéptido de interés se recupera preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse a partir de lisados celulares.

En una primera etapa, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para eliminar los restos de partículas celulares. A continuación, se purifica el polipéptido de las proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, con los procedimientos siguientes, como un ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o con una resina de intercambio catiónico como el DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A-Sepharose para eliminar los contaminantes como la IgG. Un inhibidor de la proteasa A como el fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación.

Glicosilación de glicoproteínas

La porción de carbohidratos del complejo de la glicoproteína producida por los procesos de la presente invención pueden analizarse fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos para confirmar el contenido de oligosacáridos de la glicoproteína. Por tanto, las técnicas como la transferencia de lectina o el análisis de monosacáridos, bien conocidas en la materia, revelan las proporciones de manosa terminal, N-acetilglucosamina, ácido siálico u otros azúcares como la galactosa.

Los carbohidratos resultantes pueden analizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia incluyendo los procedimientos descritos aquí. Para el análisis de glicosilación existen diversos procedimientos conocidos en la materia y que son de utilidad en el contexto de la presente invención. Dichos procedimientos proporcionan información respecto a la identidad y composición del oligosacárido unido al péptido. Los procedimientos para el análisis de carbohidratos de utilidad en la presente invención incluyen pero no se limitan a la electroforesis capilar (Rassi y Nashabeh, High Performance Capillary Electrophoresis of Carbohydrates and Glycoconjugates, In Carbohydrate Analysis (z. El Rassi,ed.) (1995) 58:267-360), electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (Starr y col., (1996) J. Chrom. A. 720:295-321), cromatografía de intercambio aniónico de pH alto pulsada por detección amperométrica (HPAEC PAD) (Lee (1996) J. Chrom. A 720:137-151), espectrometría de masas a tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matrices (Harvey (1996) J. Chrom. A:720:429-447; Papac y col., (1996) Anal. Chem. 68:3215-3223; Field y col., (1996) Anal. Biochem. 239:92-98; Hooker y col., (1995) Biotechnology and Bioeng. 48:639-648), cromatografía líquida de alta resolución (El Rassi (1995) Reversed phase and hydrophobic interaction chromatography of carbohydrates and glycoconjugates, En, Carbohydrate Analysis (Z. El Rassi, ed.) 58:267-360), y espectrometría de masas mediante ionización por electroaerosol, Roberts G.D. (1995) Anal. Chem. 67:3613-3625).

Los azúcares neutros y los amino-azúcares pueden determinarse mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución combinada con la detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD Carbohydrate Systems, Dionex Corp.). Por ejemplo, los azúcares pueden liberarse mediante hidrólisis en ácido trifluoroacético al 20% (v/v) a 100EC durante 6 h. Los hidrolisados se secan a continuación mediante liofilización, o con ayuda de una centrifugadora al vacío Speed-Vac (Savant-Intruments). Y los residuos se disuelven en solución de acetato sódico trihidrato al 1% y se analizan en una columna HPLC-AS6, tal como se describe por Anumula y col. (Anal. Biochem. 195:269-280 (1991).

Alternativamente, puede realizarse el análisis de los carbohidratos por inmunotransferencia. De acuerdo con dicho proceso, los carbohidratos unidos a proteínas se detectan con un sistema de detección de glicanos comercial (Boehringer), el cual está basado en el procedimiento de inmunotransferencia oxidativa descrito por Haselbeck y Hosel (Haselbek y col., (1990) Glycoconjugate J., 7:63). Se procede según el protocolo de tinción recomendado por el fabricante, excepto que la proteína se transfiere a una membrana de polivinilideno difluoruro en lugar de una membrana de nitrocelulosa y los tampones bloqueantes contienen albúmina sérica bovina al 5% en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, con cloruro sódico al 0,9%. La detección se realiza con anticuerpos anti-digoxigenina unidos con un conjugado de fosfatasa alcalina (Boehringer), dilución 1:1000 en tampón Tris salino con los sustratos de fosfatasas, cloruro de 4-nitroazul tetrazolio al 0,03% (p/v) y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato al 0,03% (p/v) en tampón Tris 100 mM, pH 9,5 con cloruro sódico 100 mM y cloruro magnésico 50 mM. Las bandas proteicas que contienen el carbohidrato se visualizan generalmente al cabo de 10 a 15 minutos.

El carbohidrato también puede analizarse mediante digestión con la péptido-N-glicosidasa F. De acuerdo con dicho procedimiento, el residuo se resuspende en 14F1 de un tampón que contiene SDS al 0,18%, beta-mercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3,6 mM a pH 6,8 y se calienta a 100ºC durante 3 min. Después de enfriar a temperatura ambiente, la muestra se divide en dos partes iguales. Una alícuota no se trata y sirve como control. La segunda fracción se ajusta con aproximadamente un 1% del detergente NP-40 y se añaden 0,2 unidades de péptido-N-glicosidasa F (Boehringer). Ambas muestras se calientan a 37ºC durante 2 h y luego se analizan mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención y no deberían considerarse como limitantes para el ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1 Células CHO resistentes a PALA que expresan un aumento en la actividad de la carbamoilfosfato sintetasa II

Las líneas celulares parentales CHO DP12 y CHO DG44 y CHO DP12 que expresan el TNFR-IgG y el anti-CD11a se cultivaron con o sin P-fosfonacitil-l-aspartato (PALA). Tal como se muestra en el esquema de la Figura 2, cada línea celular se sembró en una placa de cultivo a una confluencia del 10% en placas de Petri de 10 cm de diámetro mediante las técnicas estándares del cultivo de tejidos. Las células se cultivaron en medio con suero con PALA 0,1 mM. El medio de cultivo se cambió semanalmente. Los clones supervivientes se agruparon y subcultivaron con concentraciones crecientes de PALA hasta alcanzar la concentración de PALA deseada, es decir 2-10 mM. Después de la selección por el fenotipo PALA (véase más adelante), las células se pasaron a un medio con PALA o a un medio sin PALA y se cultivaron en suspensión en frascos de centrifugado. Las poblaciones celulares de dichos cultivos se subcultivaron cada 4-7 días. Las células seleccionadas en presencia de PALA son referidas como células resistentes a PALA, y las células cultivadas igual que las anteriores pero no tratadas con PALA son referidas como células control.

Las células CHO tratadas con PALA 3 mM se analizaron por la actividad CPS II, un indicador de la actividad CAD global, utilizando el procedimiento descrito en Mori y Tatibana. Mori y Tatibana (1978) Methods in Enzymology, 51:111-112. Para asegurarse de que los resultados eran consistentes con el fenotipo resistente a PALA y no específicos de una subpoblación de células tratadas, se analizaron dos subcultivos CHO resistentes a PALA, CHO-A y CHO-B.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Las células resistentes a PALA demostraron un aumento de la actividad CPS II respecto a las células CHO control. En particular, la línea de células CHO-B mostró un aumento de la actividad CPS II comparada con las células control.

Los resultados demuestran que las células CHO resistentes a PALA tienen una mayor actividad CPS II, y por tanto también una mayor actividad CAD, comparada con las células control no tratadas.

Ejemplo II Células CHO resistentes a PALA que tienen una mayor expresión de CAD

Las células resistentes a PALA obtenidas del Ejemplo 1 se utilizaron para determinar si la expresión de una mayor actividad de CPS II en las células resistentes a PALA era un resultado de la expresión de una aumento de la actividad CAD en aquellas células. La expresión de CAD se cuantificó en las células resistentes a PALA utilizando un ensayo de protección de la RNasa parecido al procedimiento descrito en Mahler y Mc Guire. Mahler y McGuire (1990), J. Clin. Invest., 86:1641-1648. En particular, las células TRY se seleccionaron con PALA 2 mM y se cuantificó la expresión del mRNa de CAD con el ensayo de protección de la RNasa.

Los resultados se muestran en la Figura 4, y demuestran que una mayor actividad CPS II en las células resistentes a PALA corresponde con un aumento de la de CAD en dichas células. Se observó un aumento superior a dos veces en el mRNA de CAD en las células seleccionadas por PALA comparadas con las células control.

Ejemplo III Aumento de UTP intracelular en las células con una mayor actividad CAD

Las células resistentes a PALA del Ejemplo 1 se utilizaron para demostrar si las células resistentes a PALA mostraban un aumento de la expresión de UTP.

Las células CHO se trataron con PALA 5 mM, se prepararon los extractos celulares y se cuantificaron los nucleótidos con un procedimiento similar a Ryll y Wagner. Ryll y Wagner (1991) J. Chromatography, 570:77-88. El experimento se realizó durante un tiempo de 10 a 90 días y los resultados se cuantificaron como el contenido de UTP de las células resistentes a PALA relativo al de las células control.

Tal como se muestra en la Figura 5, las células resistentes a PALA con un aumento de la actividad CAD mostraron unos picos de elución de UTP mayores que los picos de UTP de las células control. La Figura 6 muestra que el aumento en las concentraciones de UTP de las células resistentes a PALA fue estable durante un período de tiempo de al menos 90 días. Las células resistentes a PALA mostraron un aumento de aproximadamente el 200-350% en el contenido de UTP comparado con las células control durante el periodo completo del experimento.

Los resultados demostraron que las células que presentaban un aumento de la actividad CAD también tenían un aumento de los niveles de UTP. Se sabe que la actividad CPS II se inhibe por UTP (Carry, (1985) EMBO J. 4:3735-3742); (Chernova y col., (1998) MCB 18:536-545). En consecuencia, a concentraciones de UTP intracelulares elevadas se espera que la actividad de CPS II sea baja (inhibida). De modo similar, a niveles de UTP intracelulares bajos, se espera que la actividad de CPS II sea alta (no inhibida). Sorprendentemente, tal como se muestra en las Figuras 5 y 6, no fue ésta la situación que se observó en las células seleccionadas para una mayor actividad CAD. Las células con una actividad CAD elevada también demostraron niveles de UTP intracelulares elevados. Este fenotipo de niveles de UTP elevados fue bastante estable, así como las células con un aumento de la actividad CAD, también mostraron un aumento en los niveles de UTP durante al menos 90 días.

Ejemplo IV

Las células con un aumento de la actividad CAD tienen mayores niveles de UDP-Galactosa y presuntamente un aumento de la glicosilación.

Las células resistentes a PALA y los procedimientos del Ejemplo 1 se utilizaron para determinar si las células resistentes a PALA mostraban un aumento en la expresión de UDP-galactosa. Además, las células CHO DP12 resistentes a PALA que expresaban TNFR-IgG se sembraron a 4x10^{6} células por ml en cultivos de frascos de centrifugado y se incubaron a 31ºC y con butirato 6 mM durante 6 días. El sobrenadante del cultivo celular se cosechó y se recuperó el TNFR-IgG mediante un procedimiento de cromatografía por inmunoafinidad con proteína A bien conocido en la materia. Se analizaron los N-glicanos mediante espectrometría de masas MALDI utilizando el procedimiento descrito generalmente por Papac y col., (1996) Anal. Chem., 68:3215-3223. El contenido de ácido siálico del TNFR-IgG se determinó utilizando el procedimiento descrito por Anumula,(1995) Anal. Biochem., 230,
24-30.

Los resultados de UDP-Galactosa se muestran en las Figuras 5 y 6. En la Figura 5, las células resistentes a PALA con un aumento de la actividad CAD mostraron picos de elución UDP-galactosa aumentados en comparación con el pico de elución en las células control. En la Figura 6, el aumento de las concentraciones de UDP-galactosa en las células resistentes a PALA fue estable durante un periodo de tiempo de al menos 90 días. Las células resistentes a PALA mostraron un aumento del 200-350% del contenido de UDP-galactosa comparado con las células control durante el periodo completo del experimento. Se espera que tanto el contenido de N-glicanos como el de TNFR-IgG de las células con mayor actividad CAD estén incrementados en comparación con las células control.

Los resultados demuestran que las células resistentes a PALA con una mayor actividad CAD también tienen mayores niveles de UDP-galactosa intracelulares. El porcentaje del aumento es similar al aumento mostrado en el Ejemplo II anterior para el UTP. Por tanto, al igual que el UTP, el aumento en las concentraciones de UDP-galactosa fue muy marcado en las células con una mayor actividad CAD. Ya que estudios de alimentación han demostrado que el aumento de las concentraciones de UDP-galactosa intracelular se correlaciona con un aumento de la glicosilación de proteínas, los resultados presentes sugieren que la actividad CAD y el aumento en los niveles de UDP-galactosa intracelulares en las células seleccionadas producirán como resultado un aumento en la glicosilación de proteínas producidas en las células. La UDP-galactosa es un sustrato conocido en la vía de glicosilación.

Ejemplo V Las células cultivadas con uridina tienen mayores niveles de UTP

Las células CHO se incubaron según técnicas estándares del cultivo de tejidos en presencia y ausencia de uridina 1-20 mM durante 18 h y se analizaron las concentraciones de UTP con un procedimiento similar al de Ryll y Wagner. Los resultados cuantificados a partir de cultivos con uridina 0, 1, 2, 5, 10 y 20 mM se representaron en gráficos como una función de las concentraciones de UTP intracelulares normalizadas. Alternativamente, se cultivaron las células CHO en presencia de uridina 0,2 mM o galactosa 11 mM y se analizaron por sus concentraciones de UTP con el procedimiento de Ryll y Wagner.

Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8. En la Figura 7, los resultados demuestran que las células CHO cultivadas con uridina presentaban un aumento en los niveles de UTP intracelulares de forma dependiente de la dosis. En la Figura 8, los resultados confirman que la adición de uridina al cultivo de células CHO conduce a un aumento drástico de los niveles de UTP intracelulares. Además, en la Figura 8, los resultados demuestran que las células cultivadas con galactosa, en lugar de uridina, no presentaban un aumento de los niveles de UTP intracelulares pero sí de los niveles de UDP-galactosa intracelulares.

Los resultados demuestran que la incubación de células CHO con uridina conduce a un aumento de los niveles de UTP intracelulares. Este aumento de los niveles de UTP era el resultado del tratamiento con uridina, y el tratamiento con galactosa no produce el mismo efecto sobre los niveles celulares de UTP (ello era de esperar ya que la galactosa no es un sustrato para la producción de UTP, véase la Figura 9).

Ejemplo VI Las células incubadas con uridina muestran un aumento de la galactosilación

Una línea celular de CHO que produce una glicoproteína recombinante, el anticuerpo monoclonal (MAb) aCD20, se cultivó en presencia y ausencia de uridina 0,5 a 1,0 mM durante un periodo de tiempo de 7 días. El MAb aCD20 secretado se purificó mediante inmunoafinidad con el procedimiento de Ma & Mashbeh (1999) Analytical Chemistry 71(22):5185-92. Se analizó el contenido de galactosa de un CD20 purificado mediante electroforesis capilar de Ma&Masbeh y se representó en una gráfica como el contenido en porcentaje de galactosa.

Los resultados se muestran en la Figura 10. En la Figura 10, el MAb aCD20 de las células tratadas con uridina tenía un contenido superior de galactosa que el acD20 de células control no tratadas con uridina.

Los resultados demuestran que las células con concentraciones aumentadas de UTP muestran un aumento de la galactosilación proteínas producidas en las células.

Estos ejemplos tenidos en consideración demuestran que las células que expresan mayores niveles de CAD son huéspedes excelentes para la expresión de la producción de glicoproteína endógena y heteróloga. Las células con una mayor actividad CAD presentan un aumento de las cantidades de UTP y por tanto son capaces de soportar un aumento de la glicosilación. Las células capaces de soportar una mayor glicosilación son críticas para la producción de glicoproteínas con un mayor contenido de oligosacáridos.

Referencias

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PALA como inhibidor de CAD

PALA es capaz de amplificar la actividad CAD

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Claims (9)

1. Proceso para la producción celular de glicoproteínas con una mayor glicosilación, dicho proceso comprende:

La expresión de la glicoproteína en las células con un aumento de la actividad CAD (complejo polipeptídico enzimático de carbamoilfosfato sintetasa II (CPSII)/aspartato transcarbamoilasa (AT-Case)/dihidroorotasa) comparada con las células huésped control; y

en consecuencia la producción de glicoproteínas con una mayor glicosilación comparada con las células huésped control.

2. Proceso para la producción celular de glicoproteínas con una mayor glicosilación; en donde dicho proceso comprende las etapas siguientes:

La selección de células resistentes a un inhibidor de CAD y la expresión de glicoproteínas en dichas células resistentes, en donde dicha expresión produce glicoproteínas con un aumento de su glicosilación comparada con las células huésped control.

3. Proceso según la reivindicación 2, en donde el inhibidor de CAD es el N-fosfonacetil-L-aspartato.

4. Proceso según la reivindicación 2, en donde las células resistentes son las células CHO o las células de insecto.

5. Proceso según la reivindicación 2, en donde dicha expresión produce glicoproteínas con un aumento de su glicosilación y/o sialilación comparada con las células huésped control.

6. Proceso según la reivindicación 1, en donde la mayor actividad CAD el aumento en la actividad CAD se proporciona por la sobreexpresión de al menos una porción de CAD.

7. Proceso según la reivindicación 1, en donde la actividad CAD se proporciona por la expresión de una CAD mutada, en donde la mutación reduce la regulación inhibidora por los productos de CAD.

8. Proceso según la reivindicación 7, en donde la CAD mutada reduce la regulación inhibidora por UTP o los análogos de UTP.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende la recuperación de la glicoproteína del medio de cultivo.