ES2265798A1 - Uso de flavonoides para disminuir la excrecion en leche de avermectinas y/o milbemicinas. - Google Patents

Abstract

Uso de flavonoides para disminuir la excreción en leche de avermectinas y/o milbemicinas. La administración de los flavonoides a animales rumiantes productores de leche a los que se les administra un fármaco del grupo de las avermectinas y/o del grupo de las milbemicinas disminuye la concentración del fármaco excretada a leche, disminuyendo el riesgo para el consumidor de ingerir cantidades superiores a las consideradas tolerables según la legislación. En el caso concreto de la moxidectina, su coadministración con quercitina a ovejas disminuye claramente la cantidad total de moxidectina excretada a la leche, así como la relación entre la moxidectina excretada a leche y la moxidectina que circula en el plasma, sin que la concentración circulante en plasma aumente sustancialmente. Este efecto es extrapolable a otros animales rumiantes y a otros diversos flavonoides.

Description

Uso de flavonoides para disminuir la excreción en leche de avermectinas y/o milbemicinas.

Campo técnico

La invención se refiere a la utilización de flavonoides, sustancias naturales presentes en multitud de alimentos de origen vegetal, para disminuir la excreción en leche de fármacos antiparasitarios del grupo de las avermectinas o del grupo de las milbemicinas. Más concretamente, la invención se refiere a la administración concomitante de algún flavonoide, con el propósito de disminuir la excreción del fármaco en la leche. Por ser los animales habitualmente utilizados como productores de leche, la invención está especialmente dirigida a los animales rumiantes. En cuanto al fármaco antiparasitario, la invención se refiere especialmente a la milbemicina denominada moxidectina, fármaco con un ratio leche/plasma superior a otros antiparasitarios de estructura molecular estrechamente relacionados como puede ser la ivermectina.

Antecedentes de la invención

Las avermectinas y milbemicinas se consideran como lactonas macrocíclicas estrechamente relacionadas entre sí (Takiguchi y cols., 1980). Estructuralmente, son derivados semisintéticos procedentes de productos de fermentación bacteriana de Streptomyces, y presentan similar actividad biológica. Estos macrólidos son compuestos endectocidas muy utilizados en medicina veterinaria por su amplio espectro de actividad frente a diversas parasitosis. Las milbemicinas, familia a la que pertenece la moxidectina, se descubrieron en 1973; sin embargo, el verdadero potencial de estos compuestos no se conoció hasta 1975, cuando científicos de Merck descubrieron la actividad frente a ácaros, insectos y nemátodos de las avermectinas (Egerton y cols., 1979). La moxidectina, al igual que los fármacos del mismo grupo, es un agonista del GABA, pero aún falta mucho por aclarar debido a que este medicamento presenta efecto contra parásitos resistentes a otras ivermectinas, lo que sugiere un diferente y desconocido mecanismo de acción, Se ha descrito que la moxidectina es eficaz frente a Otostrongylus circumlitus y Parafilaroides gymnurus (Vercruysse y cols., 2003), Trichostrongylus colubriformis (Williams y De Rosa, 2003), Haemonchus contortus (Paiement y cols., 1999). También se ha demostrado la eficacia de la moxidectina en ganado infestado naturalmente con Chorioptes bovis y Sarcoptes scabiei (Losson y Lonneux, 1993), agentes causantes de la sarna. Por otra parte, estos compuestos tienen un efecto tóxico en los organismos acuáticos y en los escarabajos coprófagos, aunque poco duradero por su depósito y fotodegradación. Su toxicidad en mamíferos y aves es baja.

Los estudios desarrollados en lactonas macrocíclicas, y entre ellas la moxidectina, demuestran que estos fármacos son excretados hacia la leche en diferentes especies animales, incluidas especies de interés ganadero para la producción de leche. En el caso concreto de la moxidectina y de la avermectina conocida como doramectina, Carceles y cols. (2001) estudiaron su cinética en cabras, encontrando que la fracción total de la dosis de moxidectina recuperada en la leche fue aproximadamente 7,7 veces mayor que la de la doramectina. Otro estudio realizado en camellos lactantes demostró que existen grandes diferencias entre los perfiles plasmáticos y de leche de la moxidectina; en este caso, tanto los valores de concentración máxima (Cmax) como de área bajo la curva (AUC) fueron de tres a cuatro veces mayores en leche que en plasma y los ratios leche/plasma en esta especie fueron casi cuatro veces mayores en el caso de la moxidectina que en el caso de otra avermectina, la ivermectina (4,01 vs. 1,26) (Oukessoy y cols., 1999). Imperiale y cols. (2004) estudiaron los modelos de excreción de leche de estos dos fármacos, comprobando que ambos fármacos se distribuyen ampliamente desde la sangre hacia la leche, siendo especialmente significativo el caso de la moxidectina, con un ratio leche/plasma de 18,5 frente a un ratio de 2,5 en el caso de la ivermectina.

Los mecanismos por los cuales las avermectinas, milbemicinas y otros diversos fármacos pasan al tejido mamario, siendo muchos de ellos secretados en la leche, suscitan un elevado interés por su relación con la aparición de residuos en leche. Estos residuos pueden constituir un peligro para la salud al poder ser tóxicos para los seres humanos, provocarles alergias o hipersensibilidad o incluso ser mutagénicos, teratogénicos o carcinogénicos (McManaman y Neville, 2003).

En el caso de los animales, la presencia de fármacos en leche esta regulada, de forma explícita, a través de las agencias de control de medicamento. Así, la normativa legal (EMEA/CVMP/187/00-FINAL, Council Regulation Nº 2377/90) exige la espera, por parte de los productores, de un tiempo mínimo que garantice la eliminación del fármaco hasta niveles inferiores a los límites máximos de residuos. Los tiempos de supresión establecidos para los macrólidos, en comparación con otros fármacos de uso común en Veterinaria, son muy elevados. Tras su administración subcutánea, se difunden por todo el organismo y se acumulan en el hígado y el tejido adiposo, siendo su eliminación muy lenta. El tiempo de supresión en carne requerido para la ivermectina son 21-28 días cuando es administrada por vía subcutánea. El tiempo de supresión se asocia con pérdidas económicas y existen referencias que demuestran que no siempre se cumplen los tiempos de espera reglamentarios (Imperale y cols., 2004), con lo que no sólo se incumplen las normas y directrices adoptadas para la seguridad en el uso de medicamentos veterinarios, sino que no queda garantizada para el consumidor la inocuidad de los productos de origen animal a su disposición. Imperiale y cols. (2002) señalan específicamente que la utilización de ivermectina y moxidectina es generalizada en vacas, ovejas y cabras; estos fármacos se usan a menudo con carácter preventivo, siendo inoculados en el mismo momento a todos los animales de la explotación, lo que hace muy costoso para el ganadero tener que respetar los tiempos de espera hasta que los residuos presentes en la leche han descendido hasta los niveles a partir de los cuales está autorizado que la leche se utilice para el consumo humano. La situación es especialmente problemática en el caso de la moxidectina, cuya vida media en bovinos es de 9 a 11 días en promedio, con un efecto residual de tres semanas. Lespine y cols. (2004), quienes realizaron estudios en ovejas, señalan niveles de moxidectina en el plasma de estos animales hasta 11 días tras dosis subcutánea (0,2 mg/kg) y de 8 días en administración oral. En estudios farmacocinéticos en cabras, Carceles y cols., (2001) señalan valores de MRT (tiempo medio de residencia del fármaco) de 15 días para la moxidectina administrada a una dosis de 0,2 mg/kg por vía subcutánea, la más habitual. Esta problemática ha hecho que la European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA) contemple la presencia de los residuos de moxidectina en leche de vacas y de ovejas y, recientemente (en el año 2001 en el caso de bovino y en el 2004 en el caso de ovino) se han incluido enmiendas que fijan niveles máximos legales residuales en leche para la moxidectina de 44 \mug/kg de leche, tanto si la leche es de oveja como de vaca. Los niveles que se alcanzan en la leche dependen de la vía de administración, que en general es subcutánea. En el informe de la EMEA incluido en la enmienda se señala que, en el caso de las ovejas, los valores legales admisibles para la moxidectina en leche se alcanzan al quinto ordeño (aproximadamente 3 días) tras administración oral, sin indicar la dosis. En el trabajo de Imperiale y cols. (2004), cuando se administra una dosis subcutánea de 0,2 mg/kg, los niveles legales se alcanzan tras 5-6 días.

Todo ello indica que, en general, modular el transporte de fármacos a la leche es importante para controlar los niveles de residuos y acortar los tiempos de supresión, siendo esta necesidad de particular importancia en el caso de fármacos como la moxidectina, que son de uso generalizado en rumiantes y que presentan un elevado tiempo medio de residencia en el animal, lo que da lugar a la aparición de elevadas concentraciones de dicho fármaco en la leche de vacas, ovejas y otros productores de leche durante tiempo prolongado. El hallazgo de algún método que propiciara una disminución de la aparición de residuos de estos fármacos en leche, permitiría su utilización en productores de leche. Para ello, sin embargo, sería interesante conocer cuál es el mecanismo mediante el cual estos fármacos pasan a leche.

Se sabe que la transferencia de fármacos a leche está determinada por factores como la ionización, el grado de unión a las proteínas del plasma, el peso molecular y la lipofilicidad del fármaco. Las características bioquímicas de la leche, relacionadas con su bajo pH y el elevado contenido lipídico, también contribuyen a este fenómeno (Ito y Lee, 2003). En el caso concreto de la ivermectina y la moxidectina, el elevado ratio leche/plasma (uno de los factores de predicción para el establecimiento de la secreción activa de fármacos hacia la leche) obtenido tras estudios farmacocinéticos induce a pensar que podría haber algún mecanismo de transporte activo implicado en el paso de estos fármacos desde la sangre hacia la leche, es decir, alguna proteína transportadora, presente en la glándula mamaria, que participara en la secreción activa de la moxidectina y la ivermectina hacia la leche, pero esta hipótesis aún no ha sido demostrada. A veces, esta predicción se realiza con distintos modelos, contemplando factores de naturaleza físico-química (Agatonovic-Kustrin y cols., 2002) y estableciéndose la correlación con los estudios farmacocinéticos, pero en la actualidad se desconoce cuál es el ratio leche/plasma esperado para estos fármacos según los modelos matemáticos. Con todo ello, la posible implicación de alguna proteína transportadora en la secreción de la moxidectina hacia la leche y el grado de contribución que el mecanismo de transporte activo mediado por dicha proteína transportadora pudiera tener están aún por establecer.

El uso de nuevas tecnologías en biología molecular ha permitido profundizar en el estudio de los mecanismos a través de los cuales fármacos y metabolitos de los mismos pasan al tejido mamario, siendo muchos de ellos excretados a la leche. Así, existen algunas evidencias que señalan a los macrólidos como sustratos y/o inhibidores de los transportadores de tipo ABC (ATP-Binding-Casette), que son un numeroso grupo de proteínas "exportadoras" dependientes de ATP, y que juegan un importante papel en la biodisponibilidad de muchos fármacos. Entre ellos, la glicoproteína P/MDR1 (P-gp), que es el transportador ABC mejor caracterizado hasta el momento. Schinkel y cols., (1994), en un estudio realizado en ratones, demostraron que la ivermectina, macrólido perteneciente a la familia de las avermectinas, es un excelente sustrato del Mdr1, homólogo de la P-gp en esta especie. Dos años después, Didier y Loor, (1996) estudiaron en ratones el efecto de un potente inhibidor de la P-gp, el PSC 833, y observaron una fuerte inhibición de la P-gp en la barrera hematoencefálica asociada a una disfunción del sistema nervioso central provocada por la presencia de ivermectina en dicho sistema. Otro estudio realizado por estos autores demostró que la ivermectina, actuando como inhibidor de la P-gp, es capaz de revertir algunas situaciones de multirresistencia frente a antitumorales, asociadas a este transportador. El estudio realizado en líneas celulares resistentes mostró que la ivermectina era 4 y 9 veces más potente que la ciclosporina A y el verapamilo, respectivamente (Didier y Loor; 1995), ambos compuestos son considerados como buenos sustratos de la P-gp. Recientemente, Korystov y cols., (2004) mediante citometría de flujo, observaron que en células tumorales (líneas Hep2 y P388), las avermectinas inhibían el transporte de la rodamina 123, conocido sustrato de la P-gp. Los estudios in vivo, realizados por Molento y cols. (2004) en ovejas, confirman la interacción entre el verapamilo y la ivermectina. Los autores observaron que la administración de verapamilo incrementa significativamente la biodisponibilidad plasmática de ivermectina cuando se comparó con el tratamiento control.

Griffin y cols., (2005) estudiaron el transporte in vitro de la ivermectina, selamectina y moxidectina en dos modelos celulares que expresan P-gp; células epiteliales de intestino (Caco-2) y linfocitos caninos. Los autores observaron que la ivermectina, selamectina y moxidectina son sustratos de la P-gp con ratios absorción/secreción de 7,5; 4,7; y 2,6, pero el verapamilo, inhibidor de la P-gp, solamente inhibió el transporte de la ivermectina y la selamectina.

La moxidectina también ha sido estudiada para conocer su posible relación con los transportadores ABC, específicamente la P-gp. En este sentido, se ha estudiado, en cultivos de hepatocitos de rata, la influencia del verapamilo sobre la moxidectina, observándose que la cantidad de moxidectina en las células se incrementa después de 24, 48, y 72 horas de cultivo, resultado que hizo pensar que la P-gp podría estar implicada en el transporte de la moxidectina (Dupuy y cols., 2001). Posteriormente, estos autores investigaron, utilizando estos mismos cultivos primarios y farmacocinéticas realizadas en corderos, la interacción de la moxidectina con distintos sustratos e inhibidores de la P-gp: la ivermectina, el ketoconazol y la quercitina, un flavonoide ampliamente presente en productos naturales, varios de ellos utilizados en alimentación de rumiantes, del que se conoce, como de otros flavonoides, que puede ser sustrato e inhibidor de las proteínas transportadoras de tipo ABC (Imai y cols., 2004). Los resultados mostraron únicamente cierta correspondencia entre los estudios in vivo e in vitro en el caso de la quercitina, que aumentó la acumulación de moxidectina en los cultivos e incrementó significativamente la biodisponiblidad plasmática del fármaco en los corderos, mientras que la ivermectina, que es muy buen sustrato de la P-gp, no modificó los niveles plasmáticos de la moxidectina (Dupuy y cols., 2003). En el ensayo, realizado con ratones macho, no se determinó la posible influencia que la quercitina pudiera tener en el secreción de la moxidectina a leche, ni sus autores sugirieron que tal relación pudiera existir. En cuanto a la posible implicación de la P-gp en el transporte activo de la moxidectina en glándula mamaria, si bien es cierto que, mediante técnicas de inmunohistoquímica y utilizando el anticuerpo MRK-16, se ha detectado la presencia de la proteína P-gp en el epitelio mamario humano (van der Valk y cols., 1990; Scala y cols., 1995), llaman la atención las evidencias que demuestran una supresión de la expresión de la P-gp en el epitelio mamario en lactación (Alcorn y cols., 2002). El mecanismo involucrado en este fenómeno aún se desconoce; sin embargo, se sabe que citoquinas pro-inflamatorias suprimen la expresión de la P-gp (Sukhai y cols., 2001), lo que hace pensar que estas moléculas podrían estar implicadas en este fenómeno. También se ha demostrado la expresión del gen por RT-PCR y la proteína (detectada por el anticuerpo MRK16) en las células epiteliales mamarias humanas (línea celular MCF12A); sin embargo, los niveles de expresión de la proteína son demasiado bajos para mostrar actividad transportadora de los compuestos hidrofóbicos cargados positivamente, considerados sustratos de esta proteína (Ito y Alcorn., 2003). La ausencia de la P-gp en glándula mamaria de vacas y ratones fue confirmada por el equipo del Dr. Schinkel (Jonker y cols., 2005). Estos resultados excluyen la presencia de la glicoproteína P como un transportador mayoritario presente en el epitelio mamario de rumiantes, hecho que descarta que esta proteína pueda estar implicada en el transporte activo de la moxidectina a leche.

A diferencia de la P-gp, si se ha demostrado la expresión de otros transportadores de tipo ABC en glándula mamaria durante el período de lactación. Los estudios de Alcorn y cols. (2002) demostraron la expresión de los transportadores MRP1, MRP2, y MRP5 en células epiteliales de glándula mamaria en lactación, aunque la localización celular y la función exacta de estos transportadores en el epitelio mamario no ha sido aún estudiada. Estudios más recientes realizados por Jonker y cols., (2005), han demostrado que la glándula mamaria de ratones en lactación (2 semanas) no expresa ni P-gp, ni Mrp1 y ni Mrp2. En relación a ABCG2/BCRP, estudios inmunohistoquímicos y por western blot, realizados en diferentes estados de desarrollo del epitelio mamario, han revelado que la Bcrp1, homólogo de la BCRP en ratón, no se expresa en vírgenes de 8 ó 14 semanas de edad, pero durante la preñez y especialmente en la lactación aumenta considerablemente, disminuyendo rápidamente su expresión durante la involución. Estos estudios además demostraron que la Bcrp1 se localiza principalmente en la membrana apical de las células epiteliales alveolares mamarias, no detectándose en los conductos principales. Este patrón de expresión de la BCRP también fue observado en vacas y humanos (Jonker y cols., 2005). En esta misma publicación se indica que la BCRP es responsable de la secreción activa de diversas sustancias con importancia clínica y toxicológica, entre las que se encuentran tanto carcinógenos como el PhIP como fármacos tales como el topotecán y la cimetidina, por lo que todos aquellos fármacos que se apliquen durante la lactación de seres humanos y animales productores de leche, que sean buenos sustratos de la BCRP y cuya concentración en leche no sea deseable, deberían evitarse durante la lactación, sugiriéndose también la inhibición farmacológica de dicho transportador como una posibilidad para evitar la concentración de sustancias indeseadas en leche. En una reciente revisión elaborada por miembros del mismo grupo (Van Herwaarden AE y Schinkel AH, 2006) se sugiere también que la aplicación de un inhibidor de la BCRP podría ser interesante cuando se desea modular la concentración en leche de fármacos suministrados a animales productores de leche, aunque se especifica claramente que lo más preferible sería que el inhibidor elegido no pasará a la leche. En ninguno de estos dos trabajos, sin embargo, se menciona que entre los posibles fármacos candidatos a sustratos de la BCRP se encuentre la moxidectina ni se indica qué compuestos podrían ser adecuados para disminuir la concentración en leche de este antiparasitario o de lactonas macrocíclicas del grupo de las avermectinas. Una posible interacción de la moxidectina con la BCRP está por demostrar. Es más, Dupuy y cols., trabajando con hepatocitos, han excluido la interacción de la BCRP con moxidectina, aunque la interpretación de este estudio in vitro es compleja, porque en el hepatocito se expresan multitud de transportadores y enzimas que pueden influir en el metabolismo de la
moxidectina.

En conclusión, los mecanismos por los cuales la moxidectina y otras lactonas macrocíclicas aparecen en la leche están todavía por dilucidar. Aunque existen evidencias que parecen indicar que podría existir un transporte activo implicado en dicha secreción, no se ha dilucidado el grado de importancia que este transporte activo pueda tener en la aparición de moxidectina en leche con respecto al transporte pasivo por difusión ni qué proteína o proteínas podrían ser los transportadores responsables de dicho transporte. Aunque se ha demostrado la expresión en glándula mamaria en lactación de algunos transportadores tipo ABC, como por ejemplo la BCRP, no se ha demostrado que esta proteína esté implicada en el transporte activo de moxidectina a leche. La falta de conocimientos sobre los factores específicos que determinan la aparición de la moxidectina en leche y el mecanismo por el que es transferida desde la sangre al alveolo mamario ha dificultado que alguien se plantee modular su aparición en leche, idea que no aparece específicamente mencionada en ninguno de los documentos citados y para la que no existen estudios previos en los que se desarrolle. Sin embargo, teniendo en cuenta que su utilización es generalizada en vacas, ovejas y cabras, que aparece en leche en concentraciones elevadas presentando un ratio leche/plasma altísimo (18,5) y que el tiempo medio de residencia del fármaco en los animales es también elevado, sería interesante encontrar la forma de disminuir la concentración de aparición de este fármaco en leche. Ello permitiría plantearse la autorización de su uso para el tratamiento de animales productores de leche, una disminución de los tiempos de espera necesarios para autorizar el consumo por parte de seres humanos de leche procedente de dichos animales y una disminución del riesgo de ingestión de moxidectina o de lactonas macrocíclicas de grupos de las avermectinas junto con la leche consumida. La presente invención proporciona una solución a este problema.

Para ello se recurre a los flavonoides, un grupo de compuestos ampliamente presentes en los productos naturales. Constituyen una de las clases más características de compuestos de las plantas superiores, en las que aparecen, por ejemplo, tanto como pigmentos de las flores en la mayor parte de las familias de las angiospermas como en cualquier otra parte de la planta. Los flavonoides se encuentran en una amplia gama de alimentos de origen vegetal, como los cítricos, la soja, las manzanas, el té, las uvas o los arándanos.

La definición genérica de "flavonoides" se aplica a un grupo de compuestos polifenólicos, en general solubles en agua, que poseen 15 átomos de carbono, dispuestos de tal manera que forman 2 anillos de benceno unidos por tres átomos de carbono, átomos de carbono que pueden formar un brazo lineal o formar parte a su vez de un tercer ciclo que incluye también un átomo de O. La estructura química de los flavonoides puede considerarse basada en un esqueleto de 15 átomos de carbono con un anillo de cromano (C) que soporta un segundo anillo aromático B en la posición 2, 3 ó 4, tal como se muestra a continuación en la Fórmula I:

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aunque, en algunos casos, el anillo heterocíclico C, en lugar de constar de seis miembros, consta de cinco miembros (caso de las auronas, cuya estructura general se muestra en la Fórmula II) o se presenta en una forma abierta (como es el caso, por ejemplo, de las chalconas, grupo al que corresponde el compuesto representado en la Fórmula III, que es precisamente el compuesto que da nombre al subgrupo, la chalcona):

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Los flavonoides se dividen en distintos subgrupos siguiendo distintos criterios, lo que da lugar a distintas clasificaciones según los autores. Atendiendo a criterios como los patrones de sustitución de los carbonos que pueden conformar el ciclo C de la Fórmula I, el estado de oxidación de dicho anillo heterocíclico, la posición del anillo B y la sustitución del anillo heterocíclico C por una forma abierta, pueden distinguirse siete subgrupos principales, que son los de: isoflavonoides o isoflavonas (en los que, a diferencia de los demás subgrupos, el anillo B se une al anillo C en la posición 3 en lugar de en la posición 2), flavonas, flavonoles, flavanonas, flavonololes, antocianinas y chalconas. Entre los flavonoides más conocidos se incluyen genisteína, daidzeína, quercitina, rutina, hesperetina o los flavonoides de los cítricos.

Al estar ampliamente extendidos entre los alimentos de origen vegetal, los flavonoides forman parte de la dieta habitual tanto de los seres humanos como de los animales. Pueden encontrarse cantidades considerables de isoflavonas y de sus metabolitos en productos animales tales como la leche y los huevos, a los que se transfieren de forma natural, lo que no supone ningún problema dada su inocuidad. En la leche de vaca se encuentran daidzeína y genisteína, así como el metabolito de esta última conocido como equol, en concentraciones del rango de \mug/litro (Antignac y cols., 2003).

Aunque no están considerados nutrientes esenciales, algunos flavonoides parecen tener efectos beneficiosos sobre la salud como el reforzamiento de los capilares y otros tejidos conectivos, la protección de los vasos sanguíneos, o efectos antiinflamatorios, antihistamínicos, antivirales o antioxidantes. Para algunos de ellos, se ha sugerido incluso una capacidad antitumoral (Moon y cols., 2006). Entre ellos se encuentra la llamada quercitina o quercetina, que pertenece a la familia de los flavonoles y es una 3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavona (2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-1-benzopiran-4-ona), compuesto al que muchas plantas medicinales parece deber gran parte de su actividad. Junto con la rhamnosa, forma el glicósido quercitrina. Los alimentos ricos en quercitina incluyen manzanas, té, cebolla, uvas tintas, cítricos, hortalizas de hoja verde y cerezas. Su fórmula estructural es la que se muestra a continuación:

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Se sabe que los flavonoides pueden ser sustratos e inhibidores de las proteínas transportadoras de tipo ABC (Imai y cols, 2004), incluidos la glicoproteína P y la BCRP. Zhang y cols. (2005), realizando ensayos con 25 flavonoides pertenecientes a los subgrupos de las flavonas, isoflavonas, chalconas, flavonoles y flavanonas, encontraron que todos los flavonoides ensayados eran capaces de incrementar la acumulación de un sustrato de la BCRP, la mitoxantrona, en más de un 300% con respecto a células que no expresaban BCRP, aunque existen sensibles diferencias en la capacidad inhibitoria de la BCRP que presenta cada flavonoide, dependiendo de características estructurales tales como la presencia del doble enlace entre los carbonos de las posiciones 2 y 3 del anillo C y la posición de un unión del ciclo B, que es preferiblemente la posición 2. En esta publicación y en trabajos previos (Zhang y cols., 2004b), se muestra como tanto la genisteína como la daidzeína, ambos compuestos flavonoides presentes en la soja, son potentes inhibidores del transportador de tipo ABC, ABCG2/BCRP con valores EC_{50} (\muM) de 14,9 \pm 2,69 y 57,3 \pm 15,8. El grupo de estos mismos autores (Zhang y cols., 2004a) ha demostrado también que la quercitina es capaz de inhibir a diversos transportadores de tipo ABC. En ninguna de estas tres publicaciones, sin embargo, se demuestra que la quercitina tenga capacidad de inhibir la BCRP in vivo. Tampoco se menciona una posible relación entre la administración de quercitina o cualquier otro flavonoide a animales y una posible disminución de la transferencia de fármacos a la leche.

En la presente invención sí se establece esa relación, proporcionando con ello un modo de disminuir los tiempos de espera necesarios para que las concentraciones en leche de fármacos como la moxidectina y la ivermectina desciendan hasta niveles que hagan aceptable su consumo por el ser humano.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un medio de disminuir los tiempos de espera necesarios para que se alcancen en la leche de animales rumiantes los niveles aceptables para el consumo humano de fármacos de uso común en rumiantes como las avermectinas y las milbemicinas, que son transferidos a la leche producida por estos animales y que requieren tiempos de espera prolongados hasta que su concentración en la leche desciende hasta los niveles máximos admitidos para que esa leche pueda ser destinada al consumo humano. La solución aportada por la presente invención es administrar al animal, junto con el fármaco, uno o más compuestos del grupo de los flavonoides, sustancias que forman parte de la dieta natural tanto de los animales como de los seres humanos.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de flavonoides para disminuir la excreción de un fármaco del grupo de las avermectinas o del grupo de las milbemicinas, en leche de animales rumiantes, mediante la administración al animal de uno o más compuestos flavonoides de forma concomitante a la administración del fármaco. En una realización particularmente preferida de la invención, el fármaco cuya excreción en la leche se desea disminuir es la moxidectina, que pertenece al grupo de las milbemicinas. En una realización preferida de la invención, el flavonoide que se administra al animal se elige entre la quercitina, la genisteína o la daidzeína.

En cuanto a la vía de administración de los flavonoides, se prefiere una vía que permita la interacción del flavonoide con el fármaco cuando éste último alcance elevados niveles plasmáticos, como puede ser la vía intramuscular, intravenosa o subcutánea.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1a muestra un gráfico en el que se representan las concentraciones plasmáticas de moxidectina, en microgramos por mililitro, frente al tiempo, medido en horas, tras la administración intravenosa de moxidectina (0,2 mg/kg) sin administración de flavonoides (grupo control MOXI, datos representados mediante cuadrados rellenos, 100) y tras su coadministración con quercitina subcutánea a una dosis de 10 mg/kg (grupo MOXI+QUER, datos representados mediante circunferencias sin relleno, 101) en ovejas merinas.

La Fig. 1b muestra un gráfico en el que se representan las concentraciones en leche de moxidectina, en microgramos por mililitro, frente al tiempo, medido en horas, tras la administración intravenosa de moxidectina (0,2 mg/kg) sin administración de flavonoides (grupo control MOXI, datos representados mediante cuadrados rellenos, 100) y tras su coadministración con quercitina subucutánea a una dosis de 10 mg/kg (grupo MOXI+QUER, datos representados mediante circunferencias sin relleno, 101) en ovejas merinas.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en la hipótesis anteriormente expuesta de que el paso de la moxidectina a la leche podría estar mediado por un transporte activo, en el que podrían estar implicadas proteínas transportadoras del tipo ABC, probablemente la BCRP. De acuerdo con ello, el grupo de los inventores pensó que la secreción láctea de moxidectina podría ser modulada en rumiantes mediante la administración de flavonoides, compuestos presentes de forma natural tanto en la alimentación de los animales como de los seres humanos, que tienen la ventaja adicional de que están ampliamente reconocidos como inocuos y que para muchos de ellos se conocen, incluso, efectos beneficiosos para la salud. Presentan la particularidad de que pueden ellos mismos aparecer en la leche, lo cual incumple la propiedad que van Herwaarden AE y Schinkel mencionaban como obviamente preferible para cualquier compuesto inhibidor de la BCRP que se pretendiera utilizar para modular la transferencia no deseada de fármacos a leche, es decir, que el propio inhibidor no resultara él mismo transferido a leche, pero las características de inocuidad de los flavonoides han permitido dar un giro al abordaje propuesto por dicho autores y plantearse la inhibición del transporte del fármaco moxidectina a la leche mediante compuestos que pueden a su vez ser transferidos a la propia leche, pues su presencia en la misma no supone ningún riesgo potencial para sus posibles consumidores.

Tal como se demuestra en el ejemplo que se describen más adelante, los estudios realizados concretamente con el flavonoide quercitina, coadministrada con moxidectina, muestran una clara interacción entre la moxidectina y la quercitina. Al administrar a ovejas merinas en período de lactación moxidectina junto con quercitina, los resultados mostraron que la excreción a leche de moxidectina en los animales tratados con quercitina fue significativamente menor al compararla con el grupo control. La quercitina, flavonoide presente comúnmente en el forraje de rumiantes, disminuye la excreción de moxidectina a leche.

Si, como parecen indicar los datos, hay uno o más transportadores de tipo ABC, probablemente la BCRP, implicadas en el transporte activo de la moxidectina, cualquier otro flavonoide que tenga capacidad de interaccionar con esta proteína debería ser capaz de modular también la excreción a leche de la moxidectina. Así, es esperable que la genisteína y la daidzeína, conocidos inhibidores de la BCRP, funcionen también en el mismo senti-
do.

También es de esperar que, si el efecto observado se debe a una inhibición del transporte activo mediado por dicha proteína, no sea necesario que la administración del fármaco y del flavonoide sean estrictamente simultáneas, sino que podría producirse en cualquier momento comprendido dentro del tiempo de espera necesario para que la concentración en leche del fármaco o de sus residuos disminuya hasta alcanzar los límites admisibles por la legislación para el consumo humano de dicha leche. Cualquiera que fuera el momento en el que el flavonoide se administrara, tendría un efecto de disminuir la transferencia hacia la leche del fármaco aún presente en el plasma del animal, facilitando la disminución de los tiempos de espera. Por ello, el término "administración concomitante" debe entenderse que abarca no sólo la administración del flavonoide de forma simultánea con el fármaco o inmediatamente antes o después de la administración de éste, sino que abarca también su acepción de "aquello que actúa conjuntamente con otra cosa", de manera que la administración del flavonoide horas después de la administración del fármaco estaría incluida también dentro de la definición de la "administración concomitante", especialmente cuando se produzca dentro del período comprendido entre la administración del fármaco y el momento en el que se alcanza la concentración máxima del mismo en la leche, Tmax.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "excreción", "secreción" y "transferencia", en relación con la moxidectina y la leche, hacen todos ellos referencia al paso de la moxidectina a la leche, es decir, al conjunto de procesos por los que la moxidectina presente en el plasma pasa a la leche, independientemente de si se están implicados un transporte activo, pasivo o ambos. Por "modulación" de dicha excreción, secreción o transferencia debe entenderse la disminución de las mismas, con el resultado de que la concentración del fármaco en la leche es
menor.

Tal como sucede con las ovejas, la excreción de moxidectina en leche de vaca también es alta, lo que hace sospechar igualmente que también hay un transporte activo implicado en dicha excreción. Los datos que demuestran que hay abundante expresión de BCRP en glándula mamaria de vaca sugieren que esta proteína podría estar también implicada en el transporte de la moxidectina a leche en estos animales. Ello hace pensar que los resultados obtenidos en ovejas son extrapolables a los que se obtendrían en vacas, por lo que la presente invención, en la que se proporciona el uso de flavonoides para la modular la excreción de moxidectina en leche, sería también aplicable a estos animales y, probablemente, a cualquier rumiante.

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Adicionalmente, la estrecha similitud entre las milbemicinas, entre las que se incluye la moxidectina, y las lactonas macrocíclicas del grupo de las avermectinas (entre las que merece destacar la ivermectina, la selamectina y la doramectina), hace esperable que el uso de los flavonoides para disminuir la excreción de fármacos a leche sea igualmente aplicable a fármacos del grupo de las avermectinas. Es por ello que el uso de flavonoides para disminuir la excreción de avermectinas están incluido también dentro del alcance de la invención.

La invención se explicará ahora con más detalle mediante los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuación.

Ejemplo

- Ejemplo 1

Disminución de la transferencia de moxidectina a leche de oveja mediante quercitina Planteamiento experimental: animales y diseño experimental

El planteamiento experimental detallado tuvo como objetivo estudiar en ovejas de raza merina la secreción láctea de moxidectina utilizando el flavonoide quercitina como modulador de la secreción láctea.

- Animales: Los animales estaban alojados en las instalaciones del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de Marzanas (Torneros, León). Los animales fueron ovejas merinas lactantes que comenzaban la etapa de secado y no comieron ni bebieron durante las 72 horas que duró el estudio. El peso de los animales, en el momento de realizar el ensayo, fue de 70,3 \pm 8,72 kg.

- Diseño experimental: El diseño experimental seguido para este estudio fue el siguiente:

MOXI:

Grupo control que recibió moxidectina a una dosis de 0,2 mg/kg, a partir de una formulación comercial (Cydectin®), por vía intravenosa.

MOXI-QUER:

moxidectina 0,2 mg/kg, a partir de una formulación comercial (Cydectin®), por vía intravenosa administrada simultáneamente con quercitina (10 mg/kg), administrada por vía subcutánea.

Se utilizaron 4 animales en cada uno de los grupos experimentales.

La determinación de los pesos y la identificación de cada animal se realizó de forma similar a lo descrito en los tratamientos anteriores. Las formulaciones se administraron, a cada animal, vía intravenosa a través de la vena yugular, excepto las que contenían quercitina, que se administraron por vía subcutánea.

Las muestras de sangre se obtuvieron mediante una punción en la vena yugular opuesta al lado de la administración, recogiéndose en tubos latinizadores. Los tiempos de muestreos fueron 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 24; 36; 48; 60; y 72 horas tras la administración. La sangre se centrifugó inmediatamente a 1000g durante 10 minutos y el plasma se congeló a -20ºC hasta el momento de su análisis por cromatografía de alta resolución (HPLC).

Las muestras de leche se obtuvieron mediante ordeño manual, recogiéndose en tubos de polipropileno y vaciando la glándula mamaria en cada tiempo de muestreo mediante ordeño manual. Las muestras se congelaron a -20ºC hasta el momento del análisis, que al igual que en las muestras plasmáticas se realizo por HPLC. Los tiempos de muestreos fueron 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 24; 36; 48; 60; y 72 horas tras la administración.

Resultados

Con los datos obtenidos en plasma y leche se elaboraron las Figs. 1a y 1b, que muestran los perfiles farmacocinéticos en plasma (Fig.1a) y leche (Fig.1b) de los grupos tratados sólo con moxidectina (grupo control, MOXI) y del grupo tratado con moxidectina y quercitina (MOXI+QUER).

A continuación, en la Tabla 1, pueden encontrarse los parámetros farmacocinéticos de interés detectados calculados a partir de los datos obtenidos en plasma y leche:

- el área bajo la curva (AUC), que es el área total obtenida en la representación de la concentración del fármaco frente al tiempo y que se considera como el mejor parámetro para evaluar la "exposición" a un fármaco, pues se entiende como la cantidad de fármaco que se encuentra en un tejido o fluido procedente de un organismo (plasma, leche, orina...) en un tiempo tras la administración del mismo;

- Cmax, que es la concentración máxima detectada en el tejido o fluido biológico analizado en el tiempo de estudio;

- Tmax, que es el tiempo en el que se detecta la concentración máxima, en este caso de fármaco, parámetro que da una idea de la cinética de aparición, es decir, si los procesos que llevan a acumular la cantidad máxima de fármaco en leche son más o menos lentos;

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- t1/2, que es el tiempo medio de eliminación (también llamado vida media de eliminación) y que se relaciona con la velocidad de desaparición del fármaco de un medio determinado, en este caso plasma o leche;

- MRT, o tiempo medio de residencia del fármaco;

- AUC_{leche}/AUC_{plasma}, que es la relación entre las áreas bajo la curva correspondientes a las determinaciones en leche y las determinaciones en plasma.

Los datos obtenidos fueron los siguientes:

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TABLA 1 Parámetros farmacocinéticos de la moxidectina

Plasma
Parámetros Farmacocinéticos	MOXI	MOXI+QUER
AUC_{0-t} (ng.d/ml)	95,8 \pm 21,6	97,2 \pm 17,2
Cmax (ng/ml)	250 \pm 60	200 \pm 71
t_{1/2} (d)	1,44 \pm 0,87	2,54 \pm 2,19
MRT (d)	2,36 \pm 1,45	2,04 \pm 0,18
Leche
Parámetros Farmacocinéticos	MOXI	MOXI+QUER
AUC_{(0-t)} (ng.d/ml)	1808 \pm 187	1333 \pm 303*
Cmax (ng/ml)	1020 \pm 220	650 \pm 210
Tmax (d)	0,45 \pm 0,15	0,86 \pm 0,24
t_{1/2} (d)	1,4 \pm 0,8	1,44 \pm 0,73
MRT(d)	2,71 \pm 0,81	2,88 \pm 0,38
AUC_{leche}/AUC_{plasma}	18,9 \pm 2,7	13,3 \pm 3,44*

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Todos estos datos demuestran que la excreción a leche de moxidectina en los animales tratados con quercitina es significativamente menor al compararla con el grupo control. Los valores de Tmax en leche de 0,45 días (\sim10 horas) para los controles y de 0,86 días (\sim22 horas) muestra que es en este intervalo cuando puede verse claramente la influencia de los flavonoides. Posteriormente los residuos persisten, pero el efecto ya no es tan importante.

Los estudios realizados con quercitina coadministrada con moxidectina mostraron diferencias significativas entre los valores de AUC en leche del grupo tratado con quercitina (1333 \pm 303,3 ng.d/ml) respecto al control (1808 \pm 187,5 ng.d/ml). En este caso, los resultados muestran una clara interacción entre la moxidectina y la quercitina, observándose una disminución significativa de los ratios AUC_{leche}/AUC_{plasma} (13,3 \pm 3,45) en este grupo experimental respecto al control (18,9 \pm 2,7) (véase la Tabla 1).

Cuando se comparan los valores obtenidos con los publicados por otros autores; en relación a los valores plasmáticos, se observa que los valores de t_{1/2} (1,44 \pm 0,87 d) y MRT (2,36 \pm 1,45 d) son similares a los citados por Lifschitz y cols., (2002) (2,97 \pm 0,71 d y 2,93 \pm 1,20 d, respectivamente), aunque el valor de AUC (95,8 \pm 21,6 ng.d/ml) obtenido en el presente estudio es más bajo que el observado por estos autores (195 \pm 58,6 ng\cdotd/ml) posiblemente debido a que el estudio farmacocinético descrito en la presente memoria sólo se realizó durante 3 días y estos autores ampliaron el estudio hasta los 40 días.

En el caso de niveles de moxidectina en leche, (Tabla 1) se observa que los valores de Tmax (0,45 \pm 0,15 d) y t_{1/2} (1,4 \pm 0,8 d) obtenidos en el presente ensayo son más bajos que los obtenidos por Imperiale y cols., (2004) (3,75 \pm 2,28 d y 21,7 \pm 4,25 d, respectivamente), por el contrario, los valores de AUC (1808 \pm 187,5 ng\cdotd/ml) y Cmax (1020 \pm 220 ng/ml) observados en el presente estudio son mayores que los obtenidos por estos autores (1426 \pm 115,5 ng\cdotd/ml y 183,5 \pm 58,9 ng/ml, respectivamente). Entre ambos diseños experimentales existen diferencias: así, la vía de administración utilizada en cada estudio, para la administración de la moxidectina, es la vía intravenosa, con una farmacocinética mucho más rápida y mayores niveles, en comparación con la administración subcutánea, vía utilizada por estos autores. Sin embargo, el presente estudio sí confirma la tendencia demostrada en la bibliografía sobre la alta penetración de la moxidectina en la leche con un ratio AUC_{leche}/AUC_{plasma} de 18,9 \pm 2,7, prácticamente igual al obtenido por Imperiale y cols., (2004) que es 18,5 \pm 1,19.

Existen diferencia significativas con respecto al trabajo de Dupuy y cols. (2003), en el que se observaba la posible influencia de la quercitina en la biodisponiblidad plasmática de moxidectina, trabajo en el que se mostraba como la quercitina aumentaba los niveles plasmáticos de moxidectina. La gráfica de la Fig. 1 permite apreciar que hay pocas variaciones entre los niveles plasmáticos de moxidectina observados en cada toma de muestra entre el grupo control y el grupo al que se le administró quercitina. Este hecho es llamativo pues, si realmente el efecto de la quercitina es la inhibición del transporte mediado por transportadores como la glicoproteína P y la BCRP (que operan de forma similar en los muchos tejidos en los que se expresan, "exportan activamente", es decir, impiden la penetración hacia las células, actuando como protectores celulares), cabría esperar unos resultados similares a los obtenidos por ellos. Este hecho, sin embargo, puede quizás atribuirse a diferencias en el procedimiento experimental: si bien la dosis de quercitina suministrada es la misma, como también lo es la vía de administración (a partir de una solución de 300 mg/ml se administran por vía subcutánea 10 mg/kg), no es la misma la vía de administración de moxidectina, que ha sido endovenosa en el presente experimento para que se alcanzaran mayores niveles en plasma y asegurar una cantidad importante de moxidectina en el epitelio mamario, como tampoco es el mismo el sexo de los animales utilizados en el experimento, que eran machos en el estudio de Dupuy y cols., género que muestra una expresión del transportador BCRP significativamente mayor en el hígado de ratón macho en comparación con las hembras, hecho que condiciona los niveles plasmáticos.

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Claims (7)

1. Uso de flavonoides para disminuir la excreción de un fármaco del grupo de las avermectinas o del grupo de las milbemicinas en la leche de un animal rumiante, mediante la administración al animal de uno o más compuestos flavonoides concomitantemente con la administración del fármaco.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el fármaco cuya excreción en leche se desea disminuir es la moxidectina.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el flavonoide administrado al animal es la quercitina.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la quercitina se administra simultáneamente a la administración de la moxidectina.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la quercitina se administra por vía subcutánea.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que la dosis de quercitina administrada es de 10 mg/kg.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el animal rumiante es una oveja.