ES2265199A1 - Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. - Google Patents
Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2265199A1 ES2265199A1 ES200301386A ES200301386A ES2265199A1 ES 2265199 A1 ES2265199 A1 ES 2265199A1 ES 200301386 A ES200301386 A ES 200301386A ES 200301386 A ES200301386 A ES 200301386A ES 2265199 A1 ES2265199 A1 ES 2265199A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- isolated
- characteristic
- cell population
- expresses
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a métodos para el aislamiento de células madre adultas, células aisladas por éstos métodos y aplicaciones de éstas. En concreto, la invención se refiere a células madre adultas aisladas, derivadas de condrocitos desdiferenciados, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a una serie de linajes celulares, así como a los marcadores específicos presentes en estas células, como pueden ser los antígenos de superficie celular. Los usos para dichas células incluyen su utilización en terapia celular así como en la búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos.
Description
Células madre adultas multipotentes procedentes
de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a métodos para
el aislamiento de células madre adultas, células aisladas por éstos
métodos y aplicaciones de éstas. En concreto, la invención se
refiere a células madre adultas aisladas, derivadas de condrocitos
desdiferenciados, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a una
serie de linajes celulares, así como a los marcadores específicos
presentes en estas células, como pueden ser los antígenos de
superficie celular. Los usos para dichas células incluyen su
utilización en terapia celular así como en la búsqueda y desarrollo
de nuevos fármacos.
El trasplante de órganos y tejidos proporciona
una serie de tratamientos prometedores para diversas patologías,
convirtiendo a las terapias regenerativas en el objetivo central de
investigación de muchos campos de la biomedicina. No obstante,
existen dos problemas importantes asociados al trasplante de órganos
y tejidos. El primero y mayor de ellos es la escasez de donantes.
Así, por ejemplo, en EE.UU, únicamente se dispone de un 5% de los
órganos que se requieren para trasplantes (Evans et al.,
1992).
En segundo lugar, existe el problema de la
incompatibilidad potencial del tejido trasplantado con el sistema
inmune del receptor. Dicha incompatibilidad hace que el órgano o
tejido trasplantado sea reconocido como un elemento extraño por el
sistema inmune del receptor lo que obliga a administrar al paciente
trasplantado fármacos inmunosupresores durante el resto de su vida,
implicando un coste elevado tanto físico como económico. Una
posible solución a la escasez de donantes de órganos y tejidos
podría ser el uso de órganos o tejidos animales, proceso denominado
xenotrasplante. Sin embargo, este enfoque empeora el problema del
rechazo y contribuye a que haya riesgos serios de transmisión de
patógenos animales a humanos (Patience et al., 1997; Wilson
et al., 1998).
Actualmente, el desarrollo de la tecnología en
el campo de las células madre ha hecho que éstas sean consideradas
como una prometedora fuente de órganos y tejidos para aquellos
tipos de patologías en las que sea necesario el trasplante de
órganos o tejidos. Teóricamente, las células madre pueden sufrir
divisiones celulares destinadas a su
auto-mantenimiento durante un tiempo ilimitado para
originar células fenotípica y genotípicamente idénticas. Además,
tienen la capacidad de diferenciar a uno o varios tipos celulares
concretos ante ciertas señales o estímulos.
La generación de órganos y tejidos a partir de
las propias células madre de un paciente o a partir de células
heterólogas inmunocompatibles de tal forma que el sistema inmune
del receptor no las reconozca como extrañas, permite una serie de
ventajas asociadas que solventan el problema que acarrean la escasez
de donantes y el riesgo de rechazo. El uso de células madre para la
regeneración de órganos y tejidos constituye una terapia
alternativa prometedora para diversas patologías humanas,
incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades
neurodegenerativas, rechazo inmunológico, enfermedades cardiacas y
desórdenes de la piel (ver patentes US 5.811.094, 5.958.767,
6.328.960, 6.379.953, 6.497.875).
Aparte de las aplicaciones en terapia celular,
las células madre presentan muchas otras potenciales aplicaciones
relacionadas con las tecnologías biomédicas que pueden ayudar a
facilitar actividades de investigación y desarrollo
biofarmacéuticos. Una de estas aplicaciones radica en el desarrollo
de modelos celulares de enfermedades humanas y animales, que pueden
ayudar a mejorar sustancialmente la rapidez y eficacia de los
procesos de búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos. Actualmente,
la forma comúnmente usada de medir la actividad biológica de un
nuevo compuesto antes de entrar en ensayos clínicos es mediante
incompletas técnicas bioquímicas o modelos animales costosos e
inadecuados. Las células madre pueden ser una fuente potencial de
cantidades virtualmente ilimitadas de células, tanto
indiferenciadas como diferenciadas, para la realización de ensayos
in vitro dirigidos a la búsqueda y desarrollo de nuevos
compuestos terapéuticos (Patente US 6.294.346), así como a
determinar su actividad, metabolismo y toxicidad. El desarrollo de
tales ensayos, en especial de sistemas de escrutinio de alto
rendimiento (high-throughput screening, HTS),
ayudará a reducir tiempo y dinero a la hora de desarrollar
compuestos con actividad terapéutica, permitirá prescindir en gran
medida del uso de animales de experimentación y también contribuirá
a que haya una menor exposición por parte de los pacientes a los
efectos adversos de los compuestos durante los ensayos clínicos.
Además, la disponibilidad de un surtido de diversos tipos celulares
de varios individuos permitiría un mayor entendimiento de los
efectos de un compuesto potencialmente terapéutico sobre un
individuo concreto, llegando a un desarrollo completo del campo de
la farmacogenómica, donde la actividad de un compuesto se
correlacionaría con la estructura genética de un individuo. Las
células madre y su progenie diferenciada tienen también un gran
valor en el proceso de búsqueda y caracterización de nuevos genes
involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos,
incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular y los procesos
neoplásicos (Phillips et al., 2000;
Ramalho-Santos et al., 2002; Ivanova et
al., 2002).Ya han sido descritos sistemas de expresión de genes
para su utilización en combinación con sistemas HTS basadas en
células (Jayawickreme y Kost, 1997).
Según el origen de las células madre podemos
diferenciar entre células madre embrionarias (células ES) y células
madre adultas. Las células ES proceden de la masa celular interna
de los blastocistos y tienen como característica principal el hecho
de ser pluripotenciales, lo que significa que pueden dar lugar a
cualquier tejido adulto derivado de las tres capas embrionarias
(Evans y Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998; Patente US
6.200.806). Las células madre adultas son células parcialmente
comprometidas presentes en tejidos adultos, las cuales pueden
permanecer décadas en el cuerpo humano, aunque con el paso del
tiempo comienzan a escasear (Fuchs y Segre, 2002).
A pesar de la alta pluripotencialidad de las
células ES, las terapias basadas en el uso de células madre adultas
presentan una serie de ventajas sobre aquellas basadas en células
ES. En primer lugar, resulta complicado controlar las condiciones
de cultivo de las células ES sin inducir su diferenciación (Thomson
et al. 1998), lo que eleva el coste económico y el trabajo
necesarios para el uso de este tipo de células. Es más, las células
ES deben pasar a través de varios estadios intermedios antes de
convertirse en el tipo celular concreto necesario para tratar una
patología en particular, proceso controlado por compuestos
químicamente complejos. Además, existe una fuerte controversia con
relación a las células ES debido a la extendida creencia que la
vida humana comienza con la fertilización, de tal forma que el
consentimiento informado firmado por los donantes no elimina el
estigma ético que implica la utilización de embriones en
investigación. Aparte, hay que considerar una serie de problemas
relacionados con la seguridad del uso terapéutico de las células
ES, debido a que células madre indiferenciadas procedentes de tejido
embrionario presentan altas probabilidades de producir un tipo de
tumores denominados teratocarcinomas (Evans y Kaufman, 1981).
Por último, las células derivadas de células ES
son normalmente objeto de rechazo por parte del sistema
inmunológico debido a que el perfil inmunológico de tales células
difiere del correspondiente al receptor. Aunque este problema
podría ser abordado mediante la utilización de un proceso denominado
"clonación terapéutica", en el cual se pueden obtener células
ES autólogas transfiriendo el núcleo de una célula somática de un
paciente al ovocito de una mujer donante, esta técnica no ha sido
desarrollada todavía en humanos y presenta serios problemas éticos
y legales (la clonación humana es ilegal en muchos países). Otra
solución podría ser la generación de líneas celulares
"universales" que posean una compatibilidad inmune
generalizada, pero a día de hoy no existe ninguna tecnología que
permita obtener dichas células.
Por el contrario, las células madre adultas no
son rechazadas por el sistema inmune si han sido obtenidas por
trasplante autólogo. Además el hecho de que estén parcialmente
comprometidas reduce el número de etapas de diferenciación
necesarias para generar células especializadas. Aparte, el uso de
este tipo de células no está asociado a ningún tipo de
controversia ética o legal. Además, aunque este tipo de células
presente una menor potencialidad de diferenciación que las células
ES, la mayoría de ellas son realmente multipotentes (Joshi y Enver,
2002) lo que significa que pueden diferenciarse a más de un tipo
de tejido. Lo que esto sugiere es que, en caso de obtener una fuente
conveniente de células madre adultas, podríamos llegar a
proporcionar diferentes tipos celulares capaces de cubrir
múltiples aplicaciones terapéuticas distintas.
Sin embargo, una desventaja importante del uso
de las células madre adultas radica en su escasez, lo que hace que
cualquier proceso para la obtención y aislamiento de este tipo de
células sea difícil y costoso. Un problema añadido radica en que la
mayoría de las actuales fuentes de obtención de células madre están
contaminadas con otros tipos celulares, complicando esto el proceso
de identificación, aislamiento y caracterización de las
poblaciones de células madre pensadas para ser utilizadas con fines
terapéuticos u otros usos.
Actualmente, las mejores fuentes de células
madre adultas son: medula ósea (Spangrude et al., 1988;
Osawa et al., 1996; Bhatia et al., 1997;
Fridenshtein, 1982; Prockop, 1997; Pittenger et al., 1999;
Patente US 5.486.359), sangre periférica (Barr y Mcbride, 1982;
Russell y Hunter, 1994), cordón umbilical (Broxmeyer et al.,
1989), tejido neural (McKay, 1997; Johansson et al., 1999;
Doetsch et al., 1999; Gage, 2000), tejido adiposo (Zuk
et al., 2001; Zuk et al., 2002; solicitud de patente
WO 03/022988), córnea (Daniels, et al., 2001), piel (Watt,
2001; Toma et al., 2001), epitelio gastrointestinal
(Marshman et al., 2002), músculo (Grounds et al.,
1992), hígado (Forbes et al., 2003) y pulpa dental (Gronthos
et al., 2000; Miura et al., 2003). Sin embargo, hasta
la fecha de hoy ninguna de estas fuentes ha sido capaz de
proporcionar células madre adultas que cumplan todos y cada uno de
los siguientes requisitos: multipotencialidad, ensayos
reproducibles, ausencia de contaminación y perfecta
caracterización.
Recientemente, se ha aislado un nuevo tipo de
célula madre de mamífero denominado "Multipotent Adult Progenitor
Cell" (MAPC) a partir de medula ósea y otros tejidos (Reyes
et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et
al., 2002b; solicitud de patente WO 01/11011). Este tipo de
célula madre parece ser la progenitora de las llamadas células
madre mesenquimales, y muestra una gran multipotencialidad. Sin
embargo su aislamiento y cultivo conlleva un proceso largo y
costoso en el que se han de incluir grandes cantidades de diversos
factores de crecimiento.
Por lo tanto, existe la necesidad de conseguir
una fuente fácilmente disponible de células madre adultas
multipotentes. En particular, células que puedan ser fácilmente
aisladas de un sujeto vivo sin que esto implique riesgos o molestias
significativas, sin que el coste del aislamiento y cultivo sea
elevado, y con una contaminación mínima por otros tipos
celulares.
El cartílago es un tejido compuesto de un único
elemento celular, condrocitos, y de una matriz extracelular (ECM)
que rodea a los condrocitos. Gracias a esta simple estructura y
composición celular, el cartílago podría ser una prometedora fuente
potencial de células madre, en caso de que estas células pudiesen
ser identificadas y caracterizadas. Además, la extracción de tejido
cartilaginoso se realiza usando un procedimiento poco invasivo en
comparación con otros procedimientos (p.ej. extracción de medula
ósea) y poco contaminado en comparación con otros procedimientos
(p.ej. extracción de tejido adiposo) y sin repercusiones serias
para el paciente.
El cartílago articular adulto es avascular,
alinfático, aneural y se nutre a partir del líquido sinovial
(Mankin y Brandt, 1984). Las únicas células presentes en el
cartílago articular son los condrocitos, responsables de su
síntesis, mantenimiento y renovación de la ECM, que a su vez está
fundamentalmente compuesta por una red de fibras de colágeno
altamente hidratadas insertadas en un gel de proteoglicanos cargados
(Maroudas, 1979). La digestión de la ECM usando colagenasa permite
el aislamiento de los condrocitos que subsiguientemente pueden ser
crecidos y expandidos in vitro (Mitrovic et al.,
1979).
Es conocido que el cultivo en monocapa de
cartílago articular conduce de forma invariable a su
desdiferenciación, proceso durante el cual las células recuperan su
habilidad para dividirse, pierden su fenotipo redondeado y dejan de
producir colágeno de los tipos II, IX y XI para producir los tipos
I, III y V (Mayne et al., 1976; von der Mark et al.,
1977; Benya et al., 1977; Benya et al., 1978; Benya y
Mimni, 1979; Benya y Shafter, 1982; Finer et al., 1985;
Elima et al., 1989). Algunos autores han demostrado que
condrocitos desdiferenciados de origen embrionario (Hegert et
al., 2002) o adulto (Tallheden et al., 2003) podrían
diferenciarse in vitro a varios tipos celulares
mesenquimales, pero todavía nadie ha aislado y caracterizado en
detalle una población definida de células madre aisladas de
cartílago articular ni demostrado su multipotencialidad.
La presente invención proporciona una población
de células madre multipotentes adultas procedentes de cartílago de
mamífero, preferiblemente de cartílago articular humano, aisladas y
caracterizadas en detalle demostrando además su multipotencialidad.
Esta y otras realizaciones de la invención se harán aparentes a
través de la descripción, Figuras y Ejemplos que siguen.
Un primer aspecto de la invención consiste en
proporcionar una población aislada de células madre multipotentes
derivadas de condrocitos desdiferenciados, perfectamente
caracterizada y libre de otros tipos celulares. Preferiblemente,
dichos condrocitos se obtienen de cartílago articular humano
mediante artroscopia, la cual es un procedimiento médico rutinario
que conlleva un riesgo y grado de incomodidad mínimos para el
paciente.
Un segundo aspecto de la presente invención
consiste en la obtención in vitro, a partir de dichas
células madre multipotentes derivadas de condrocitos
desdiferenciados, de poblaciones celulares diferenciadas a diversos
linajes, incluyendo pero sin limitarse a los linajes mesenquimales
y neurales.
Un tercer aspecto de la invención consiste en
proporcionar una población celular transgénica, derivada de dichas
células aisladas previamente mencionadas, por modificación de su
genoma.
Un cuarto aspecto de la invención consiste en
utilizar las células aisladas anteriormente mencionadas para la
preparación de composiciones farmacéuticas que pueden emplearse en
la reparación de tejidos y órganos. Dichas composiciones
farmacéuticas constituyen un aspecto adicional de la presente
invención.
Un quinto aspecto de la invención consiste en
utilizar las células aisladas anteriormente mencionadas para la
evaluación de la actividad biológica de distintos agentes in
vitro e in vivo.
Otros aspectos de la presente invención
resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la
descripción de la invención.
La Figura 1 es una fotomicrografía de contraste
de fases de las células madre de la presente invención.
La Figura 2A muestra histogramas de
inmunocitometría de fluorescencia correspondientes a marcadores de
superficie positivos en las células madre de la presente invención.
Los histogramas rellenos en negro corresponden al marcaje con el
anticuerpo específico, mientras que los vacíos corresponden a la
tinción con el control de isoti-
po.
po.
La Figura 2B muestra histogramas de
inmunocitometría de fluorescencia correspondientes a marcadores de
superficie negativos en las células madre de la presente invención.
Los histogramas rellenos en negro corresponden al marcaje con el
anticuerpo específico, mientras que los vacíos corresponden a la
tinción con el control de isotipo.
La Figura 3A es una fotomicrografía de contraste
de fases de las células madre de la presente invención
diferenciadas in vitro hacia fenotipo óseo. Las células
diferenciadas se han teñido con Alizarin Red para detectar la matriz
de fosfato cálcico secretada por las células diferenciadas.
La Figura 3B es una fotomicrografía de contraste
de fases claro de las células madre de la presente invención sin
diferenciar, teñidas de la misma forma que las células
diferenciadas de la Figura 3A.
La Figura 4A es una fotomicrografía de contraste
de fases de las células madre de la presente invención
diferenciadas in vitro hacia fenotipo muscular. Las células
diferenciadas se han teñido con un anticuerpo específico para la
cadena pesada de la miosina, un antígeno específico de músculo.
La Figura 4B es una fotomicrografía de campo
claro de las células madre de la presente invención sin
diferenciar, teñidas de la misma forma que las células
diferenciadas de la Figura 4A.
La Figura 5A muestra dos fotomicrografías de
inmunofluorescencia de las células madre de la presente invención
diferenciadas in vitro hacia fenotipo neuronal. Las células
diferenciadas se han teñido con un anticuerpo específico para
NF200, un antígeno específico de neuronas.
La Figura 5B muestra dos fotomicrografías de
inmunofluorescencia de las células madre de la presente invención
diferenciadas in vitro hacia fenotipo neuronal. Las células
diferenciadas se han teñido con un anticuerpo específico para TuJ1,
un antígeno específico de neuronas.
La Figura 6 es una representación gráfica del
número de clones aislados de las células madre de la presente
invención capaces de diferenciarse a tres tejidos mesodérmicos
distintos (AOC; adiposo=A; óseo=O; cartílago=C), a dos de ellos
(AO, AC, OC), sólo a uno (A, O, C), o a ninguno (-).
La Figura 7A es una fotomicrografía de
fluorescencia de las células madre de la presente invención
transducidas con un vector retroviral que codifica la proteína
verde fluorescente (GFP).
La Figura 7B muestra un histograma de citometría
de fluorescencia que cuantifica la fluorescencia de las células
transducidas retroviralmente de la Figura 7A.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una población aislada de células madre multipotentes,
derivada de condrocitos desdiferenciados de mamífero, caracterizada
en detalle y libre de otros tipos celulares. Preferentemente, la
población celular aislada objeto de la invención procede del tejido
cartilaginoso de un primate, preferiblemente de un humano.
Normalmente, la célula objeto de la invención procederá de
cartílago articular humano y, en particular, de tejido cartilaginoso
procedente de la articulación de la rodilla. Las células madre y
derivados de éstas en la presente invención podrán ser usadas para
diversas aplicaciones, entre las que se incluyen: terapias basadas
en el trasplante autólogo y alogénico, desarrollo de modelos de
enfermedad, desarrollo de ensayos de búsqueda de genes y en la
búsqueda y desarrollo de fármacos.
En una realización particular, la invención
proporciona una célula madre adulta multipotente, procedente de
condrocitos desdiferenciados de mamífero, caracterizada por ser
positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD9, CD13,
CD29, CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD54, CD55, CD58, CD59,
CD90, CD95, CD105, CD106, CD 166, HLA-I y
beta2-microglobulina.
En una realización preferida de la invención, se
proporciona una célula madre adulta multipotente aislada derivada
de condrocitos desdiferenciados de mamífero, caracterizada por el
siguiente fenotipo: positiva para los marcadores CD9, CD13, CD29,
CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90,
CD95, CD 105, CD 106, CD 166, HLA-I y
beta2-microglobulina; negativa para los marcadores
CD 10, CD 11b, CD 14, CD 15, CD 16, CD 18, CD 19, CD28, CD31, CD34,
CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD51, CD56, CD61, CD62E, CD62L,
CD62P, CD71, CD102, CD 104, CD 117, CD 133,
HLA-II.
Poblaciones celulares aisladas constituidas por,
o que comprenden, dichas células madre adultas multipotentes
aisladas procedentes de condrocitos desdiferenciados de mamífero,
constituyen realizaciones particulares de la presente
invención.
La célula madre multipotente aislada objeto de
la presente invención se obtiene a partir de condrocitos adultos
desdiferenciados aislados de biopsias de cartílago procedentes de
sujetos vivos. En una realización preferida de la invención, el
tejido cartilaginoso se aísla de un sujeto humano. En humanos, la
fuente preferida de tejido cartilaginoso radica en la articulación
de la rodilla, siendo el método preferido de recolección de
cartílago la toma de biopsia mediante artroscopia a partir de los
márgenes del cóndilo femoral. Si las células de la presente
invención van a ser trasplantadas en un sujeto humano, es
preferible que el tejido cartilaginoso sea aislado de ese mismo
sujeto para poder realizar un trasplante autólogo.
Los condrocitos pueden ser aislados a partir de
una biopsia de cartílago usando diversos métodos conocidos por los
expertos en la materia. Normalmente se utiliza la digestión
enzimática con colagenasa (Mitrovic et al., 1979). En el
Ejemplo 1 de la presente invención se detalla el procedimiento de
aislamiento de células madre multipotentes a partir de condrocitos
desdiferenciados humanos obtenidos de cartílago articular de
rodilla.
Las células multipotentes derivadas de
condrocitos desdiferenciados pueden ser caracterizadas para
identificar las proteínas intracelulares y/o de superficie, genes,
y/o otros marcadores indicadores de su estado indiferenciado.
Métodos utilizados para la caracterización incluyen, pero no se
limitan a: inmunocitometría (ver Ejemplo 2), análisis
inmunocitoquímico, análisis por northern blot,
RT-PCR, análisis de expresión génica en
microarrays, estudios proteómicos y análisis por differential
display.
En otra realización de la invención, las células
madre adultas multipotentes de la presente invención son inducidas
a diferenciarse in vitro a células que expresen al menos una
característica propia de una célula especializada. Tales tipos
celulares parcial o totalmente diferenciados incluyen, pero no se
limitan a linajes celulares propios de los siguientes tejidos y
órganos: cartílago, hueso, grasa, músculo, tejido nervioso, piel,
hígado y páncreas, por ejemplo, condrocitos, osteocitos, adipocitos,
miocitos, cardiomiocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos,
células epiteliales, hepatocitos, células pancreáticas, etc. Los
métodos que se pueden usar para inducir la diferenciación de las
células madre de la presente invención a diversos tipos celulares
concretos son conocidos por los expertos en la materia y algunos de
ellos se explican en detalle en los Ejemplos de la patente.
Las células diferenciadas total o parcialmente
son caracterizadas mediante la identificación de proteínas de
superficie y/o intracelulares, genes, y otros marcadores
indicativos de diferenciación de las células madre de la presente
invención a diversos linajes. Métodos utilizados para la
caracterización incluyen, pero no se limitan a los siguientes:
inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por
northern biot, RT-PCR, análisis de expresión
génica en microchips, estudios proteómicos y análisis por
differential display.
En otro aspecto de la invención, las células
madre de la presente invención, o células derivadas de las mismas,
son modificadas genéticamente de forma estable o transitoria para
que expresen genes exógenos o repriman la expresión de genes
endógenos. Por tanto, la invención proporciona una población celular
transgénica aislada, derivada de las células madre adultas
multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados de
mamífero proporcionadas por esta invención, cuyo genoma ha sido
modificado por inserción de DNA aislado preseleccionado, por
sustitución de un segmento del genoma celular con DNA aislado
preseleccionado o por inactivación de al menos una porción del
genoma celular. De acuerdo con este aspecto de la invención, las
células aisladas se ponen en contacto con un vector de
transferencia génica, el cual comprende un ácido nucleico que
incluye una secuencia genética heteróloga recombinante, de tal
manera que el ácido nucleico es introducido en la célula bajo las
condiciones apropiadas para que dicha secuencia sea expresada en el
interior de la célula. El vector de transferencia génica puede ser
viral o no viral. Existen numerosos vectores virales y no virales
para introducir DNA exógeno dentro de las células madre que son
bien conocidos para aquellos expertos en la materia (Mulligan,
1993; Robbins et al., 1997; Bierhuizen et al., 1997).
Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización
de la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes:
vectores adenovirales (Kozarsky y Wilson, 1993), vectores
adenoasociados (Muzyczka, 1992), vectores retrovirales (Tabin et
al., 1982), vectores lentivirales (Naldini et al., 1996),
vectores alfavirales (Huang, 1996), vectores herpesvirales
(Carpenter y Stevens, 1996) y vectores derivados de coronavirus
(Ortego et al., 2002). Vectores de tipo no viral apropiados
para poner en práctica esta realización de la invención incluyen,
pero no están limitados a los siguientes: DNA desnudo (Wolff et
al., 1990), gene gun (Johnston et al., 1988), liposomas
(Felgner et al., 1987), poliaminas (Boussif et al.,
1995), péptidos (Wyman et al., 1997), dendrímeros (Tang
et al., 1996), glicopolímeros catiónicos (Roche et
al., 2003), complejos liposoma-policatión (Tsai
et al., 1996), proteínas (Fisher y Wilson, 1997) y sistemas
de transferencia génica mediados por receptor (Cotten et
al., 1990). La secuencia genética heteróloga recombinante está
normalmente incluida en un casete de expresión, que consta de una
secuencia codificante asociada operativamente a un promotor u otras
secuencias en cis que permitan su expresión. La secuencia
codificante puede codificar una proteína o puede codificar RNA
biológicamente activo, como puede ser RNA antisentido (Spampinato
et al., 1992), una ribozima (Leavitt et al., 1994) o
siRNA (Qin et al., 2003). En una realización preferida, las
células madre de la presente invención son modificadas
genéticamente para expresar un gen potencialmente terapéutico.
Las células madre de la presente invención, sin
modificar o genéticamente modificadas, así como aquellas células
derivadas de las anteriores que expresen al menos una
característica propia de una célula especializada, estando éstas
sin modificar o genéticamente modificadas, pueden ser utilizadas
para preparar composiciones farmacéuticas. En la preparación de
dichas composiciones farmacéuticas, las células de la presente
invención se pueden utilizar solas o dentro de composiciones
biológicamente compatibles, las cuales pueden incluir, pero no están
limitadas a: factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas,
proteínas de la matriz extracelular, fármacos y polímeros
sintéticos. Por tanto, en una realización particular de esta
invención, se proporciona una composición farmacéutica que
comprende una población de células madre proporcionada por la
presente invención, sin modificar o genéticamente modificadas, o
que expresen al menos una característica propia de una célula
especializada, sin modificar o genéticamente modificadas, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización
particular, dicha composición farmacéutica pude contener, además,
factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, proteínas de la
matriz extracelular, fármacos y/o polímeros sintéticos. En una
realización preferida de la invención, las composiciones
farmacéuticas preparadas a partir de las células de la presente
invención tienen la forma de una estructura tridimensional en la
cual las células y otros posibles componentes se hallan incluidos
dentro de una matriz sintética tridimensional biocompatible.
Alternativamente, dichas composiciones farmacéuticas son del tipo
micropartícula, microesfera, nanoparticula o nanoesfera.
Los implantes anteriormente descritos pueden ser
utilizados en procedimientos de trasplante autólogo y alogénico.
Estos procedimientos de trasplante pueden ser llevados a cabo
administrando los implantes a un paciente de diversas formas. Las
formas de administración preferidas incluyen pero no están limitadas
a: parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica,
epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular,
intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial,
intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal,
subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches
transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante la
administración de un supositorio, percutanea, espray nasal,
implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión
o vía catéter.
En una realización preferida de la invención, el
lugar de trasplante es el cartílago, y la característica deseada o
fenotipo es el condroblástico. En una segunda realización preferida
de la invención, el lugar de trasplante es el hueso, y la
característica deseada o fenotipo es el osteoblástico. En una
tercera realización preferida de la invención, el lugar de
trasplante es el músculo esquelético, y la característica deseada o
fenotipo es el mioblástico. En una cuarta realización preferida de
la invención, el lugar de trasplante es el músculo cardiaco, y la
característica deseada o fenotipo es el cardiomioblástico. En una
quinta realización preferida de la invención, el lugar de trasplante
es el sistema nervioso periférico, y la característica deseada o
fenotipo es el glial. En una sexta realización preferida de la
invención, el lugar de trasplante es el sistema nervioso central, y
la característica deseada o fenotipo es el neuronal. En una séptima
realización preferida de la invención, el lugar de trasplante es la
piel, y la característica deseada o fenotipo es el epitelial. En
una octava realización preferida de la invención, el lugar de
trasplante es el hígado, y la característica deseada o fenotipo es
el hepatocítico. En una novena realización preferida de la
invención, el lugar de trasplante es el hígado, y la característica
deseada o fenotipo es el de célula pancreática. En una décima
realización preferida de la invención, el lugar de trasplante es el
páncreas, y la característica deseada o fenotipo es el de célula
pancreática.
El uso terapéutico preferido de las células
descritas en la presente invención pretende ser el tratamiento de
enfermedades degenerativas, traumáticas, genéticas, infecciosas o
neoplásicas humanas que resulten en un daño o disfunción de tejidos
u órganos que incluyan, pero no estén limitados a: fístulas,
úlceras, lesiones del cartílago, lesiones óseas, lesiones
musculares, desórdenes musculares (incluyendo, pero sin estar
limitados a distrofia muscular), enfermedades óseas (incluyendo,
pero sin estar limitadas a osteogénesis imperfecta), lesiones
miocárdicas, desórdenes neurodegenerativos (incluyendo, pero sin
estar limitados a: enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Huntington y enfermedad de Alzheimer), lesiones espinales, daño
nervioso, lesiones vasculares, lesiones de la piel, daño hepático y
diabetes. Realizaciones preferidas de las células modificadas
genéticamente de la invención incluyen, pero no se limitan a:
terapia de sustitución enzimática, sustitución de células y tejidos
dañados, corrección de mutaciones genéticas deletéreas, terapia
antiangiogénica, terapia proangiogénica, terapia antiinflamatoria,
liberación de compuestos bioactivos y liberación de agentes
antitumorales.
Por tanto, en una realización particular, la
invención se relaciona con el uso de una población de células madre
proporcionada por la presente invención, sin modificar o
genéticamente modificadas, o que expresen al menos una
característica propia de una célula especializada, sin modificar o
genéticamente modificadas, para preparar una composición
farmacéutica para el tratamiento de lesiones, enfermedades
degenerativas y genéticas de cartílago, hueso, músculo, corazón,
sistema nervioso central y periférico, piel, hígado y páncreas. A
modo ilustrativo, dicha población celular aislada proporcionada por
esta invención puede ser utilizada para preparar una composición
farmacéutica adecuada para el tratamiento de lesiones del
cartílago, o de lesiones óseas, o de lesiones musculares, o de
lesiones cardíacas, o de lesiones del sistema nervioso periférico,
o de lesiones del sistema nervioso central, o de lesiones de la
piel, o de lesiones hepáticas, o de lesiones pancreáticas, así como
para el tratamiento de enfermedades degenerativas del cartílago, o
enfermedades degenerativas del tejido óseo, o enfermedades
degenerativas del tejido muscular, o enfermedades degenerativas del
corazón, o enfermedades degenerativas del sistema nervioso
periférico, o enfermedades degenerativas del sistema nervioso
central, o enfermedades degenerativas de la piel, o enfermedades
degenerativas hepáticas, o enfermedades degenerativas del páncreas,
o bien para el tratamiento de enfermedades genéticas del cartílago,
o de enfermedades genéticas del tejido óseo, o de enfermedades
genéticas del tejido muscular, o de enfermedades genéticas del
corazón, o de enfermedades genéticas del sistema nervioso
periférico, o de enfermedades genéticas del sistema nervioso
central, o de enfermedades genéticas de la piel, o de enfermedades
genéticas del hígado, o de enfermedades genéticas del páncreas.
La presencia en el sujeto, al que se le ha
realizado el trasplante, de células diferenciadas procedentes de
las células madre aisladas multipotentes de la presente invención,
podría ser detectada mediante diversas técnicas entre las que se
incluyen pero no se limitan a: imagen in vivo, análisis por
citometría de flujo, análisis por PCR, análisis por southern
blot y estudios inmunohistoquímicos.
En otro aspecto de la invención, las células
madre de la presente invención, con o sin modificaciones genéticas,
así como las células derivadas de las anteriores que expresen al
menos una característica propia de una célula especializada, con o
sin modificaciones genéticas, pueden ser aplicadas al desarrollo de
ensayos in vitro e in vivo con los siguientes
propósitos industriales: búsqueda de fármacos, estudios
farmacológicos, estudios toxicológicos, estudios farmacogenómicos y
estudios genéticos. Tales ensayos pueden ser utilizados para la
identificación y/o caracterización de una multitud de dianas
biológicas, compuestos bioactivos o agentes farmacológicos.
Las células madre de la presente invención
proporcionan un sistema único en el cual las células pueden
diferenciarse para dar lugar a linajes específicos del mismo
individuo. Además, las células de la presente invención proporcionan
una fuente de células en cultivo a partir de una potencial variedad
de individuos genéticamente diversos que pueden responder de
distinta manera a diversos agentes biológicos y farmacológicos. Al
comparar las respuestas de las células procedentes de una población
estadísticamente significativa de individuos se pueden determinar
los efectos de los agentes biológicos o farmacológicos ensayados
sobre el tipo celular concreto. A diferencia de la mayoría de los
cultivos primarios, las células de la presente invención se pueden
mantener en cultivo y de esta forma se pueden estudiar según vaya
transcurriendo el tiempo. Por lo tanto, múltiples cultivos
celulares del mismo o distintos individuos pueden ser tratados con
el agente de interés para determinar si existen diferencias en el
efecto que tiene dicho agente en ciertos tipos de células con el
mismo perfil genético o, alternativamente, en tipos celulares
similares procedentes de individuos genéticamente distintos.
La utilización de las células madre de la
presente invención en un sistema de escrutinio de alto rendimiento
(high-throughput screening) permite analizar
una amplia gama de agentes biológicos y farmacológicos, así como
bibliotecas combinatoriales de los mismos, de una forma efectiva
en cuanto a tiempo y dinero, para de esta forma elucidar sus
efectos en las células humanas. Dichos agentes incluyen, pero no
están limitados a: péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas,
factores de crecimiento, hormonas, partículas virales,
antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos,
agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones
farmacéuticas y preparados de vacunas.
En el campo de la farmacogenómica, se pueden
usar las células madre de la presente invención aisladas de una
población estadísticamente significativa de individuos para
proporcionar un sistema ideal para identificar polimorfismos
asociados con respuestas positivas o negativas a un abanico de
sustancias. La información obtenida de estos estudios puede tener
amplias repercusiones en el tratamiento de enfermedades infecciosas,
cáncer y diversas enfermedades metabólicas.
El método in vitro que permite utilizar
las células madre de la presente invención para evaluar la
respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a
bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, comprende lo
siguiente:
- a)
- aislar las células proporcionadas por la presente invención a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de los mismos;
- b)
- diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto;
- c)
- expandir las células en cultivo;
- d)
- diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto;
- e)
- poner en contacto el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con una biblioteca combinatoria) de dichos agentes; y
- f)
- evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del cultivo.
Alternativamente, para la puesta en práctica de
dicho método, pueden utilizarse células madre proporcionadas por la
presente invención, opcionalmente modificadas genéticamente, o bien
células que expresen al menos una característica propia de una
célula especializada, opcionalmente modificadas genéticamente.
En el método anteriormente descrito, los agentes
biológicos o farmacológicos que pueden evaluarse incluyen, aunque
sin limitarse exclusivamente a ellos, péptidos, anticuerpos,
citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, partículas
virales, hormonas, fármacos, por ejemplo, antibióticos, agentes
quimioterapéuticos, agentes citotóxicos, composiciones
farmacéuticas, preparados vacunales, proteínas de la matriz
extracelular, polímeros sintéticos, compuestos inhibitorios,
mutágenos, aditivos alimentarios, etc.
El método in vivo que permite utilizar
las células madre de la presente invención para evaluar la
respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a
bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, comprende lo
siguiente:
- a)
- aislar las células de la presente invención a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de los mismos;
- b)
- diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto;
- c)
- expandir las células en cultivo;
- d)
- diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto;
- e)
- implantar las células, solas o dentro de composiciones biológicamente compatibles, en un modelo de animal experimental;
- f)
- administrar a los animales injertados uno o más agentes biológicos o farmacológicos; y
- g)
- evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células implantadas.
Alternativamente, para la puesta en práctica de
dicho método, pueden utilizarse células madre proporcionadas por la
presente invención, opcionalmente modificadas genéticamente, o bien
células que expresen al menos una característica propia de una
célula especializada, opcionalmente modificadas genéticamente.
En el método anteriormente descrito, el animal
experimental puede ser, pero no está limitado a, una cepa de ratón
inmunodeficiente. En el mismo método, las composiciones
biológicamente compatibles pueden incluir, de forma no limitante,
los siguientes tipos de sustancias: péptidos, anticuerpos,
citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, partículas
virales, hormonas, fármacos, por ejemplo, antibióticos, agentes
quimioterapéuticos, agentes citotóxicos, composiciones
farmacéuticas, preparados vacunales, proteínas de la matriz
extracelular, polímeros sintéticos, compuestos inhibitorios,
mutágenos, aditivos alimentarios, etc.. En una realización
preferida de la invención, las células son implantadas en el animal
experimental incluidas en una matriz sintética tridimensional
biocompatible. En otra realización de la invención, las células se
introducen en el animal incluidas en una estructura del tipo
micropartícula, microesfera, nanoparticula o nanoesfera. Las formas
de implantación preferidas de dichas células, composiciones y
estructuras en el animal experimental incluyen pero no están
limitadas a las siguientes: parenteral, intraperitoneal,
intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal,
intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional,
intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal,
intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica,
mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral,
mediante la administración de un supositorio, percutanea, espray
nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de
infusión o vía catéter.
A continuación, los Ejemplos describen en un
mayor detalle ciertas realizaciones de la presente invención.
Los siguientes Ejemplos se presentan para
ilustrar pero no limitan la presente invención.
Se comienza obteniendo mediante procedimiento
artroscópico una biopsia de cartílago de los márgenes externos del
cóndilo femoral. El tamaño de dicha biopsia puede ser variable, en
función de la estructura de la articulación, la edad del paciente y
el criterio del cirujano, pero normalmente no es inferior a 4
cm^{2}. La biopsia se recoge en una solución salina estéril y se
mantiene a 4ºC hasta el momento del procesamiento, que no debe ser
posterior a las 48 horas de la toma de la muestra.
La biopsia de cartílago se suspende en 1
mililitro de medio de cultivo basal estéril (DMEM, Medio esencial
mínimo modificado por Dulbecco), conteniendo
L-Glutamina 2 mM, antibióticos y un 1% de suero
fetal bovino (FBS). El suero también puede ser de origen humano,
preferiblemente de origen autólogo. A continuación, el cartílago se
tritura utilizando unas tijeras quirúrgicas bajo condiciones
asépticas. Los fragmentos de cartílago resultantes se adicionan a
una suspensión conteniendo un 0,1% de colagenasa en el mismo medio
que se utilizó para la trituración, y la suspensión celular
resultante se incuba durante al menos 4 horas a 37ºC con agitación
suave. Después, se filtra la suspensión celular resultante a través
de una malla estéril de 40 micrómetros y posteriormente se
centrifuga la suspensión filtrada a 500 g durante 5 minutos. El
sedimento celular resultante se resuspende en medio de cultivo y se
cultiva a una densidad aproximada de 20.000 células/cm^{2} en
frascos para el cultivo de tejidos. Normalmente, el medio de
cultivo está compuesto de un medio basal como puede ser el DMEM,
L-Glutamina 2 mM, 10% FBS y antibióticos (Choi
et al., 1980; Webber y Sokoloff, 1981). Otra posibilidad es
usar suero humano procedente de una fuente autóloga, en vez de
suero bovino. Otra posibilidad radica en usar un medio de cultivo
definido, que contenga un medio basal como DMEM, RPMI, F12 o una
combinación de los mismos, L-Glutamina 2 mM,
antibióticos, y un medio suplementario que incluya, pero sin
limitarse únicamente a esto, lo siguiente: insulina, transferrina,
selenio, albúmina y ácido linoleico (Kato et al., 1980;
Schwartz y Sugumaran, 1982; Jennings et al., 1983; Adolphe
et al., 1984; Quarto et al., 1997; Patente US
6.150.163).
Posteriormente, las células se cultivan en un
incubador a 37ºC con un 5% de CO_{2} y un 95% de humedad. Después
de cuatro días en cultivo, se retira el medio, se eliminan las
células no adheridas mediante lavado con tampón fosfato salino (PBS)
y se añade medio fresco. Después de otros cuatro días, se vuelven a
lavar las células y se desprenden incubándolas con una solución que
contenga un 0,25% de tripsina y un 0,02% de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético). Se centrifugan las células despegadas
para precipitarlas y se cultivan a una densidad de 5.000
células/cm^{2} en frascos de cultivo nuevos. Se mantienen las
células en cultivo en monocapa en un estado de subconfluencia
mediante su desprendimiento y recultivo a 5.000 células/cm^{2}.
Las células adheridas resultantes son células madre aisladas
multipotentes que pueden mantenerse desdiferenciadas en las
condiciones de cultivo descritas anteriormente. La Figura 1 muestra
una fotomicrografía de dichas células, tras 15 días en cultivo.
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados son recogidas mediante digestión suave con
tripsina, lavadas con PBS e incubadas durante 30 minutos a 4ºC con
uno de los siguientes anticuerpos marcados con FITC ó PE: CD9,
CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31,
CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e,
CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L,
CD62P, CD71, CD90, CD95, CD102, CD 104, CD 105, CD 106, CD 117, CD
13 3, CD 166, HLA-I, HLA-II y beta2-
microglobulina.
Las células marcadas se lavan y se analizan
inmediatamente usando un citómetro Epics-XL
(Coulter). Como controles, se utilizaron células teñidas con
anticuerpos inespecíficos de los correspondientes isotipos marcados
con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE). La Figura 2A muestra
los histogramas que indican un marcaje positivo de las células,
mientras que la Figura 2B muestra los histogramas que indican la
ausencia del antígeno correspondiente.
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados se siembran a una densidad de 20.000
células/cm^{2} en medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS,
L-Glutamina 2 mM y antibiótico). A las 12 horas se
reemplaza el medio de cultivo por medio inductor de osteogénesis
(Jaiswal et al., 1997) compuesto por:
- -
- \alpha MEM
- -
- 20% FBS
- -
- Penicilina/streptomicina
- -
- L-Glutamina 2 mM
- -
- Dexametasona 0,01 \muM
- -
- Acido ascórbico 0,2 mM
- -
- \beta-Glicerofosfato 10 mM
A los 14 días se puede observar que hay
depósitos mineralizados de fosfato cálcico, lo que indica la
presencia de nódulos óseos. Tales nódulos se detectan mediante una
tinción con Alizarin Red (Standford et al., 1995) como se
detalla a continuación: se elimina el medio y lavar con PBS; se
fijan las muestras con Etanol 70% durante 1 hora a 4ºC; se tiñe la
muestra con 1 ml de Alizarin Red 40 mM pH 4,1 y se elimina el
colorante a los 5 minutos con abundante agua. La Figura 3A muestra
el resultado obtenido tras la tinción de las células diferenciadas,
mientras que la Figura 3B muestra el resultado de la tinción de las
células sin diferenciar.
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados se siembran a una densidad de 10.000
células/cm^{2} en medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS,
L-Glutamina 2 mM y antibiótico). Tras 12 horas, se
reemplaza el medio de cultivo por medio inductor de miogénesis
(Wakitani et al., 1995), compuesto por:
- -
- DMEM
- -
- 2% FBS
- -
- Penicilina/estreptomicina
- -
- L-Glutamina 2 mM
- -
- Ascorbato-2-fosfato 0,1 mM
- -
- Dexametasona 0,01 \muM
- -
- ITS+1 (Sigma-Aldrich)
- -
- 5-Azacitidina 3 \muM
Tras 24 horas, se remplaza el medio por medio de
cultivo estándar, y se mantienen las células en cultivo durante
2-3 semanas, cambiando el medio dos veces por
semana. Tras ese tiempo, las células adquieren un fenotipo alargado,
forman estructuras fibrilares y pueden observarse algunas fusiones
celulares. Para detectar el fenotipo de mioblasto, las células
obtenidas se fijan con paraformaldehído (PFA) al 4% y se incuban
con un anticuerpo frente a la cadena pesada de la miosina, que es un
antígeno específico de músculo. La Figura 4A muestra el resultado
obtenido tras la tinción de las células diferenciadas, mientras que
la Figura 4B muestra el resultado de la tinción de las células sin
diferenciar.
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados se siembran a baja densidad en medio de cultivo
estándar (DMEM, 10% FBS, L-Glutamina 2 mM y
antibiótico) suplementado con 10 ng/ml bFGF y se incuba durante
24-36 horas de modo que se alcanza una alta
confluencia celular. A continuación se lava y se añade medio
neuroinductor (Black y Woodbury, 2001), compuesto por:
- -
- \alpha MEM
- -
- BHA 200 \muM
- -
- Penicilina/streptomicina
- -
- L-Glutamina 2 mM
- -
- Foskolina 10 \muM
- -
- 2% DMSO
- -
- Hidrocortisona 1 \muM
- -
- Insulina 5 \mug/ml
- -
- CIK 25 mM
- -
- Ácido Vaiproico 2 mM
A las pocas horas de la inducción se puede
observar un cambio morfológico en el que las células adquieren un
cuerpo celular redondeado y muy refringente, y unas prolongaciones
que se asemejan a los axones y las dendritas de las células
nerviosas. Tras 3 días, las células obtenidas se fijan con PFA al 4%
y se incuban con anticuerpos frente a los antígenos específicos de
neuronas NF-200 y TuJ1. Mediante este procedimiento
se observa un 30% de células positivas para NF-200
(Figura 5A) y un 75% de células positivas para TuJ1 (Figura
5B).
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados se siembran en placas de 96 pocillos a razón de
una célula por pocillo, aplicando el método de dilución límite, en
medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS,
L-Glutamina 2 mM y antibiótico). A las 2 horas se
confirma mediante observación al microscopio la presencia de una
sola célula en cada pocillo y se descartan aquellos pocillos en los
que haya más de una o ninguna célula. Los cultivos se dejan
evolucionar hasta que se alcanza una confluencia celular alta,
realizando cambios de medio de cultivo 2 veces por semana. Los
clones se van subcultivando en una superficie mayor a medida que se
va alcanzando una confluencia celular alta. La eficiencia de
clonaje está comprendida entre un 50-60%. No se
aprecian diferencias morfológicas entre los diferentes clones
obtenidos. Una vez expandidos los clones, se lleva a cabo con los
mismos diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica.
1. Diferenciación osteogénica. Se lleva a cabo
como se describe en el Ejemplo 3.
2. Diferenciación adipogénica. Las células madre
derivadas de condrocitos desdiferenciados se siembran a una
densidad de 20.000 células/cm^{2} en medio de cultivo estándar
(DMEM, 10% FBS, L-Glutamina 2 mM y antibiótico). A
las 12 horas se añade el medio inductor de adipogénesis (Pittenger
et al., 1999) compuesto por:
- -
- \alpha MEM
- -
- 20% FBS
- -
- Penicilina/streptomicina
- -
- L-Glutamina 2 mM
- -
- Hidrocortisona 0,5 \muM
- -
- IBMX 0,5 mM
- -
- Indometacina 60 \muM
A los 14 días de la diferenciación se puede
observar que hay vacuolas lipídicas citoplasmicas, características
de células adiposas. Tales vacuolas se detectan mediante una
tinción con Red Oil (Ramírez-Zacarías et al.,
1992) como se detalla a continuación: tras eliminar el medio y
lavar con PBS, se fijan las muestras con formalina de 30 a 60
minutos a temperatura ambiente; se lava con agua; se incuba con
isopropanol al 60% durante 3 minutos; se elimina el isopropanol y
se añade la solución Red Oil dejándola 5 minutos, tras los que se
elimina lavando con abundante
agua.
agua.
3. Diferenciación condrogénica. Se parte de 5 x
10^{5} células, que se sedimentan mediante centrifugación a 400 g
x 5 minutos en un tubo cónico de polipropileno. A continuación se
incuban en 2 ml de medio de cultivo estándar (DMEM, 10% suero fetal
bovino, L-Glutamina 2 mM y antibiótico) y a las 24
horas se puede ver como se ha formado una estructura a modo de
esfera compacta que ya no está adherida a la base del tubo. Se
mantiene así en cultivo, realizando una sustitución del medio 2
veces por semana. A las 2 semanas, tras realizar un lavado con PBS,
se fijan los agregados celulares con una solución de
paraformaldehido al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente.
Después se procede a su inclusión en parafina. Los bloques con las
muestras incluidas se cortan a un grosor de 4 \mum con un
microtomo. Para poner de manifiesto la presencia de proteoglicanos
propios de este tipo de tejido se realiza una tinción con Alcian
Blue (Lev et al., 1964) como se detalla a continuación: las
muestras son desparafinadas e hidratadas y teñidas con una solución
de Alcian Blue preparada en ácido clorhídrico 0,1 N durante 30
minutos; después se vuelven a deshidratar y se montan con un medio
resinoso. Como resultado del proceso se pueden visualizar los
proteoglicanos sulfatados teñidos de azul. Además se realizó
inmunofluorescencia contra la molécula de colágeno tipo II, que es
expresada por las células condrocíticas siendo uno de los
principales componentes de la matriz extracelular del
cartílago.
El resultado del experimento demuestra que un
porcentaje muy alto (33%) de los clones obtenidos son multipotentes
(ver Figura 6).
Las células madre derivadas de condrocitos
desdiferenciados se plaquean a 15.000 células/cm^{2} y se incuban
a 37ºC durante 6 h con una preparación de partículas retrovirales
empaquetadas con envuelta anfotrópica codificando la proteína verde
fluorescente (GFP). Después de la infección, las células son
lavadas con tampón fosfato y mantenidas en el medio de cultivo
habitual. Tras 48 h, la expresión de GFP puede ser analizada
mediante microscopía de fluorescencia (ver Figura 7A) o mediante
citometría de flujo (ver Figura 7B).
\vskip1.000000\baselineskip
- US 6.150.163
- McPherson et al.
- US 5.811.094
- Binette et al.
- US 5.958.767
- Kim et al.
- US 6.328.960
- Klyushnenkova et al.
- US 6.379.953
- Bruder et al.
- US 6.497.875
- Sorrell et al.
- US 6.294.346
- Reinolds et al.
- US 6.200.806
- Thomson et al.
- US 5.486.359
- Haynesworth et al.
- WO 03/022988
- Futrell et al.
- WO 01/11011
- Reyes et al.
\newpage
Adolphe, M. et al. (1984)
Exp Cell Res 155: 527-536.
Barr, R.D. y McBride, J.A.
(1982) Br J Haematol 51: 181-187.
Benya, P.D. y Nimni, M.E.
(1979) Arch Biochem Biophys 192:
327-335.
Benya, P.D. et al. (1977)
Biochemistry 16: 865-872.
Benya, P.D. et al. (1978)
Cell 15: 1313-1321.
Benya, P.D. y Shaffer, J.D.
(1982) Cell 30: 215-224.
Bhatia, M. et al. (1997)
Proc Natl Acad Sci USA 94: 5320-5325.
Bierhuizen, M.F. et al.
(1997) Biochem Biophys Res Commun 234:
371-375.
Black, I.B. y Woodbury, D.
(2001) Blood Cells Mol Dis 27(3):
632-636.
Boussif, O. et al. (1995)
Proc Natl Acad Sci USA 92: 7297-7301.
Broxmeyer, H.E. et al.
(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:
3828-3832.
Carpenter, D.E. y Stevens, J.G.
(1996) Hum Gene Ther 7:
1447-1454.
Choi, Y.C. et al. (1980)
Connect Tissue Res 7: 105-112.
Cotten, M. et al. (1990)
Proc Natl Acad Sci USA 87: 4033-4037.
Daniels, J.T. et al. (2001)
Wound Repair Regen 9: 483-494.
Doetsch, F. et al. (1999)
Cell 97: 703-716.
Elima, K. y Vuorio, E.
(1989) FEBS Lett 258: 195-198.
Evans, M.J. y Kaufman, M.H.
(1981) Nature 292: 154-156.
Evans et al. (1992) J Am
Med Assoc 267: 239-246
Felgner, P.L. et al. (1987)
Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413- 7417.
Finer, M.H. et al. (1985)
Mol Cell Biol 5: 1415-1424.
Fisher, K.J. y Wilson, J.M.
(1997) Biochem J 321 (Pt 1):
49-58.
Forbes, S. et al. (2002)
J Pathol 197: 510-518.
Fridenshtein, A. (1982) Arkh
Patol 44: 3-11.
Fuchs, E. y Segre, J.A.
(2000) Cell 100: 143-155.
Gage, F.H. (2000) Science
287: 1433-1438.
Gronthos, S. et al. (2000)
Proc Natl Acad Sci USA 97: 13625- 13630.
Grounds, M.D. et al. (1992)
Cell Tissue Res 267: 99-104.
Hegert, C. et al. (2002)
J Cell Sci 115: 4617-4628.
Huang, H.V. (1996) Curr Opin
Biotechnol 7: 531-535.
Ivanova, N.B. et al. (2002)
Science 298: 601-604.
Jaiswal, N., et al. (1997)
J Cell Biochem 64: 295-312.
Jayawickreme, C.K. y Kost, T.A.
(1997) Curr Opin Biotechnol 8:
629-634.
Jennings, S.D. y Ham, R.G.
(1983) Cell Biol Int Rep 7:
149-159.
Jiang, Y. et al. (2002)
Nature 418: 41-49.
Jiang, Y. et al. (2002)
Exp Hematol 30: 896-904.
Johansson, C.B. et al.
(1999) Cell 96: 25-34.
Johnston, S.A. et al.
(1988) Science 240: 1538-1541.
Joshi, C.V. y Enver, T.
(2002) Curr Opin Cell Biol 14:
749-755.
Kato, Y. et al. (1980)
Exp Cell Res 125: 167-174.
Kozarsky, K.F. y Wilson, J.M.
(1993) Curr Opin Genet Dev 3:
499-503.
Leavitt, M.C. et al. (1994)
Hum Gene Ther 5: 1115-1120.
Lev, R., et al. (1964) J
Histochem Cytochem 12:309.
Mankin, H.J. y Brandt, K.D.
(1984) en "Osteoarthritis" ed. Moskowitz, et
al., WB Saunders, Filadelfia, pp. 43-79.
Maroudas, N.G. (1979) J Theor
Biol 79: 101-116.
Marshman, E. et al. (2002)
Bioessays 24: 91-98.
Mayne, R. et al. (1976)
Proc Natl Acad Sci USA 73: 1674-1678.
McKay, R. (1997) Science
276: 66-71.
Mitrovic, D. et al. (1979)
J Rheumatol 6: 124-130.
Miura, M. et al. (2003)
Proc Natl Acad Sci USA 100: 5807-5812.
Mulligan, R.C. (1993)
Science 260: 926-932.
Muzyczka, N. (1992) Curr Top
Microbiol Immunol 158: 97-129.
Naldini, L. et al. (1996)
Science 272: 263-267.
Ortego, J. et al. (2002)
J Virol 76: 11518-11529.
Osawa, M. et al. (1996)
Science 273: 242-245.
Patience, C. et al. (1997)
Nat Med 3: 282-286.
Phillips, R.L. et al.
(2000) Science 288: 1635-1640.
Pittenger, M.F. et al.
(1999) Science 284: 143-147.
Prockop, D.J. (1997)
Science 276: 71-74.
Qin, X.F. et al. (2003)
Proc Natl Acad Sci USA 100: 183-188.
Quarto, R. et al. (1995)
Calcif Tissue Int 56: 123-129.
Ramalho-Santos, M. et
al. (2002) Science 298:
597-600.
Ramirez-Zacarias, J.L.
et al. (1992) Histochemistry 97:
493-497.
Reyes, M. y Verfaillie, C.M.
(2001) Ann NY Acad Sci 938: 231-233;
discussion 233-235.
Robbins, P.B. et al. (1997)
J Virol 71: 9466-9474.
Roche, A.C. et al. (2003)
Cell Mol Life Sci 60: 288-297.
Russell, N.H. y Hunter, A.E.
(1994) Bone Marrow Transplant 13:
353-355.
Schwartz, E.R. y Sugumaran, G.
(1982) In Vitro 18: 254-260.
Spampinato, S. et al.
(1992) Pharmacol Res 25 Suppl
1:51-52.
Spangrude, G.J. et al.
(1988) Science 241: 58-62.
Stanford, C.M. et al.
(1995) J Biol Chem 270: 9420-9428.
Tabin, C.J. et al. (1982)
Mol Cell Biol 2: 426-436.
Tallheden, T. et al. (2003)
J Bone Joint Surg Am 85-A Suppl 2:
93-100.
Tang, M.X. et al. (1996)
Bioconjug Chem 7: 703-714.
Thomson, J.A. et al. (1998)
Science 282: 1145-1147.
Toma, J.G. et al. (2001)
Nat Cell Biol 3: 778-784.
Tsai, J.T. et al. (2002)
Biotechnol Appl Biochem 36: 13-20.
Von der Mark, K. et al.
(1977) Nature 267: 531-532.
Wakitani S. et al. (1995)
Muscle Nerve 18: 1417-1426.
Watt, F.M. (2001) Curr Opin
Genet Dev 11: 410-417.
Webber, R.J. y Sokoloff, L.
(1981) Growth 45: 252-268.
Wilson, C.A. et al. (1998)
J Virol 72: 3082-3087.
Wolff, J.A. et al. (1990)
Science 247: 1465-1468.
Wyman, T.B. et al. (1997)
Biochemistry 36: 3008-3017.
Zuk, P.A. et al. (2002)
Mol Biol Cell 13: 4279-4295.
Zuk, P.A. et al. (2001)
Tissue Eng 7: 211-228.
Claims (21)
1. Población aislada de células madre adultas
multipotentes, procedentes de condrocitos desdiferenciados de
cartílago articular de mamífero, caracterizada por:
- a.
- ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD9, CD 13, CD29, CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90, CD95, CD105, CD106, CD166, HLA-I y beta2-microglobulina, y
- b.
- ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD51, CD56, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD71, CD102, CD104, CD117, CD133 y HLA-II.
2. Población aislada de células madre adultas
multipotentes, según la reivindicación 1, caracterizada
porque las células son de origen humano.
3. Población celular aislada, derivada de una
población aislada de células madre adultas multipotentes según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada
porque expresa, al menos, una característica propia de una célula
especializada.
4. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un condrocito.
5. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un osteocito.
6. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un adipocito.
7. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un miocito.
8. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un cardiomiocito.
9. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de una neurona.
10. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un astrocito.
11. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un oligodendrocito.
12. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de una célula epitelial.
13. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de un hepatocito.
14. Población celular aislada, según la
reivindicación 3, caracterizada porque expresa, al menos,
una característica propia de una célula pancreática.
15. Uso de una población celular aislada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para preparar una
composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones,
enfermedades degenerativas y genéticas de: cartílago, hueso,
músculo, corazón, sistema nervioso central y periférico, piel,
hígado y páncreas.
16. Una composición farmacéutica que comprende
una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Composición farmacéutica según la
reivindicación 16, que comprende, además, un componente adicional
seleccionado entre factores de crecimiento, citoquinas,
quimioquinas, proteínas de la matriz extracelular, fármacos,
polímeros sintéticos y sus mezclas.
18. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 ó 17, en la que dichas células y,
opcionalmente, dicho componente adicional, están incluidas en una
matriz sintética tridimensional biocompatible.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, en la que dicha estructura tridimensional
biocompatible es del tipo micropartícula, microesfera,
nanopartícula o nanoesfera.
20. Uso de una población celular aislada, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, a partir de un individuo
o de una población estadísticamente significativa de los mismos,
diferenciando opcionalmente las células aisladas a un tipo celular
concreto, para evaluar in vitro la respuesta celular a
agentes biológicos o farmacológicos, o a bibliotecas de dichos
agentes.
21. Uso de una población aislado, según la
reivindicación 20, donde dichos agentes biológicos o farmacológicos
comprenden péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas,
factores de crecimiento, partículas virales, hormonas,
antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos,
agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios,
composiciones farmacéuticas y preparados vacunales.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301386A ES2265199B1 (es) | 2003-06-12 | 2003-06-12 | Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. |
| EP04742080A EP1632563A1 (en) | 2003-06-12 | 2004-06-09 | Cartilage-derived stem cells and applications thereof |
| CA002528679A CA2528679A1 (en) | 2003-06-12 | 2004-06-09 | Cartilage-derived stem cells and applications thereof |
| US10/560,354 US20060239980A1 (en) | 2003-06-12 | 2004-06-09 | Cartilage-derived stem cells and applications thereof |
| PCT/ES2004/070041 WO2004111208A1 (es) | 2003-06-12 | 2004-06-09 | Celulas madres derivadas de cartilago y sus aplicaciones |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301386A ES2265199B1 (es) | 2003-06-12 | 2003-06-12 | Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2265199A1 true ES2265199A1 (es) | 2007-02-01 |
| ES2265199B1 ES2265199B1 (es) | 2008-02-01 |
Family
ID=33547858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200301386A Withdrawn - After Issue ES2265199B1 (es) | 2003-06-12 | 2003-06-12 | Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060239980A1 (es) |
| EP (1) | EP1632563A1 (es) |
| CA (1) | CA2528679A1 (es) |
| ES (1) | ES2265199B1 (es) |
| WO (1) | WO2004111208A1 (es) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITRM20030376A1 (it) * | 2003-07-31 | 2005-02-01 | Univ Roma | Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia. |
| EP1758981A4 (en) | 2004-05-28 | 2013-01-16 | Wafergen Inc | APPARATUS AND METHODS FOR PERFORMING MULTIPLEX ANALYZES |
| ES2313805B1 (es) * | 2004-10-04 | 2009-12-23 | Cellerix, S.L. | Identificacion y aislamiento de celulas multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral. |
| US20060045872A1 (en) | 2004-08-25 | 2006-03-02 | Universidad Autonoma De Madrid Ciudad Universitaria de Cantoblanco | Use of adipose tissue-derived stromal stem cells in treating fistula |
| US11660317B2 (en) | 2004-11-08 | 2023-05-30 | The Johns Hopkins University | Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy |
| EP1764117A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-21 | Zimmer GmbH | Implant for the repair of a cartilage defect and method for manufacturing the implant |
| ES2589311T5 (es) | 2005-09-23 | 2020-02-14 | Tigenix S A U | Poblaciones de células que tienen actividad inmunorreguladora, método de aislamiento y usos |
| KR101240487B1 (ko) * | 2006-11-09 | 2013-03-08 | 더 존스 홉킨스 유니버시티 | 성체 포유동물 심근세포의 심장 줄기 세포로의 역분화 |
| GB0702401D0 (en) | 2007-02-08 | 2007-03-21 | Univ Cardiff | Connective tissue repair |
| US8563307B2 (en) * | 2009-02-24 | 2013-10-22 | James Wang | Treatment of immunosuppression-related disorders |
| US8323972B2 (en) | 2009-09-30 | 2012-12-04 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Mammary artery derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration |
| US9845457B2 (en) | 2010-04-30 | 2017-12-19 | Cedars-Sinai Medical Center | Maintenance of genomic stability in cultured stem cells |
| US9249392B2 (en) | 2010-04-30 | 2016-02-02 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells |
| US8679474B2 (en) | 2010-08-04 | 2014-03-25 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells |
| TWI614340B (zh) | 2011-09-28 | 2018-02-11 | 幹細胞生物科技股份有限公司 | 體幹細胞及其製備方法 |
| EP2861238A4 (en) | 2012-06-05 | 2016-03-16 | Capricor Inc | OPTIMIZED METHODS FOR GENERATING CARDIAC STEM CELLS FROM CARDIAC TISSUE AND THEIR USE IN CARDIAC THERAPY |
| EP2882445B1 (en) | 2012-08-13 | 2019-04-24 | Cedars-Sinai Medical Center | Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration |
| JP5856029B2 (ja) * | 2012-08-31 | 2016-02-09 | 阿部 博幸 | 間葉系幹細胞を未分化増殖させる方法、および間葉系幹細胞を濃縮する方法 |
| EP2900808B1 (en) | 2012-09-28 | 2019-04-03 | Scripps Health | Methods of differentiating stem cells into chondrocytes |
| WO2014070797A1 (en) * | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Scripps Health | Methods of producing pluripotent stem cells from chondrocytes |
| JP6324395B2 (ja) | 2012-10-29 | 2018-05-16 | スクリップス ヘルス | 軟骨細胞を移植する方法 |
| TWI687519B (zh) | 2012-12-06 | 2020-03-11 | 美商幹細胞生物科技股份有限公司 | Ｌｇｒ５＋體幹細胞 |
| EP2746769A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Stembios Technologies, Inc. | Method for evaluating effect of action on subject based on stem celldynamics |
| AU2015327812B2 (en) | 2014-10-03 | 2021-04-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy |
| EP3220929A4 (en) * | 2014-11-19 | 2018-06-27 | Stembios Technologies, Inc. | Somatic stem cells for treating bone defects |
| DK3259602T3 (da) | 2015-02-20 | 2021-02-15 | Takara Bio Usa Inc | Fremgangsmåde til hurtig nøjagtig dispensering, visualisering og analyse af enkeltceller |
| WO2017123662A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction |
| GB201604304D0 (en) | 2016-03-14 | 2016-04-27 | Tigenix S A U | Adipose tissue-derived stromal stem cells for use in treating refractory complex perianal fistulas in crohn's disease |
| US11351200B2 (en) | 2016-06-03 | 2022-06-07 | Cedars-Sinai Medical Center | CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias |
| US11460405B2 (en) | 2016-07-21 | 2022-10-04 | Takara Bio Usa, Inc. | Multi-Z imaging and dispensing with multi-well devices |
| WO2018057542A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders |
| AU2018255346B2 (en) | 2017-04-19 | 2024-05-02 | Capricor Inc | Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy |
| WO2019126068A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001011011A2 (en) * | 1999-08-05 | 2001-02-15 | Mcl Llc | Multipotent adult stem cells and methods for isolation |
| WO2002010348A2 (en) * | 2000-07-29 | 2002-02-07 | Smith & Nephew Plc | Tissue implant for cartilage repair |
-
2003
- 2003-06-12 ES ES200301386A patent/ES2265199B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2004
- 2004-06-09 US US10/560,354 patent/US20060239980A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-09 CA CA002528679A patent/CA2528679A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-09 EP EP04742080A patent/EP1632563A1/en not_active Withdrawn
- 2004-06-09 WO PCT/ES2004/070041 patent/WO2004111208A1/es active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001011011A2 (en) * | 1999-08-05 | 2001-02-15 | Mcl Llc | Multipotent adult stem cells and methods for isolation |
| WO2002010348A2 (en) * | 2000-07-29 | 2002-02-07 | Smith & Nephew Plc | Tissue implant for cartilage repair |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20060239980A1 (en) | 2006-10-26 |
| WO2004111208A1 (es) | 2004-12-23 |
| EP1632563A1 (en) | 2006-03-08 |
| CA2528679A1 (en) | 2004-12-23 |
| ES2265199B1 (es) | 2008-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2265199B1 (es) | Celulas madre adultas multipotentes procedentes de condrocitos desdiferenciados y sus aplicaciones. | |
| ES2535042T3 (es) | Identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral | |
| Nery et al. | Human mesenchymal stem cells: from immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications | |
| Asumda et al. | Age-related changes in rat bone-marrow mesenchymal stem cell plasticity | |
| Shiota et al. | Isolation and characterization of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with myogenic and neuronal properties | |
| ES2287447T3 (es) | Metodos de aislamiento y expansion del cultivo de celulas troncales/madre mesenquimatosas a partir de sangre del cordon umbilical, y metodo de diferenciacion de celulas troncales/madre mesenquimatosas derivadas de sangre del cordon umbilical en diversos tejidos mesenquimatosos. | |
| US7534606B2 (en) | Placental stem cell and methods thereof | |
| ES2870567T3 (es) | Células madre procedentes de una capa trofoblástica coriónica pura y terapia celular que comprende las mismas | |
| US20110312091A1 (en) | Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof | |
| KR100871984B1 (ko) | 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제 | |
| US7781211B2 (en) | Isolation of multi-lineage stem cells | |
| US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
| WO2007010858A1 (ja) | 骨格筋組織由来の単一細胞よりクローン化した多能性幹細胞 | |
| CN105814196A (zh) | 终末分化的神经元谱系的获得方法及其用途 | |
| US8796020B2 (en) | Manufacturing process for fresh and frozen stem cells | |
| EP2845898B1 (en) | Method for culturing neural crest stem cells, and use thereof | |
| EP2714058B1 (en) | Method of treating the effects of stroke | |
| EP2615166B1 (en) | Equine amniotic fluid derived multipotent stem cells and a production method therefor | |
| US20080102063A1 (en) | Methods and compositions for stem cell therapies | |
| US20080299656A1 (en) | Isolation of multi-lineage stem cells | |
| Yu | Identification and characterization of cartilage progenitor cells by single cell sorting and cloning | |
| ES2345867B1 (es) | Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. | |
| ES2706376T3 (es) | Procedimiento para obtener una población de células progenitoras estrómicas | |
| Studer et al. | Neural Stem Cells and Brain Repair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC2A | Transfer of patent | ||
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20070201 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2265199B1 Country of ref document: ES |
|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20081030 |