ES2262765T3 - Metodos para tamizar compuestos que modulan apoptosis, compuestos identificados por dichos metodos y uso de dichos compuestos como agentes terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Un método de tamizar polipéptidos celulares por actividad pro-apoptótica o anti-apoptótica en una célula de un tipo particular de célula; dicho método comprende a. cultivar células de dicho tipo particular de célula bajo condiciones no apoptóticas y cultivar células de dicho tipo particular de células bajo condiciones apoptóticas; y b. determinar la localización subcelular de dichos polipéptidos celulares en las celdas cultivadas; en el cual una localización de un polipéptido celular en balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones no apoptóticas y una segregación de dicho polipéptido celular de balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones apoptóticas es indicativa de que dicho polipéptido celular tiene una actividad pro- apoptótica o una anti-apoptótica en dicho tipo particular de célula.

Description

Métodos para tamizar compuestos que modulan apoptosis, compuestos identificados por dichos métodos y uso de dichos compuestos como agentes terapéuticos.

La invención se relaciona con la modulación de apoptosis en células de mamíferos. Más particularmente, la invención proporciona métodos para identificar polipéptidos novedosos pro-apoptóticos o anti-apoptóticos, métodos tamiz de compuestos que modulan apoptosis y método de detectar eventos tempranos del proceso apoptótico.

La apoptosis o muerte celular programada es un proceso activo en el cual las células inducen su autodestrucción en respuesta a señales de muerte celular específica o en ausencia de señales de supervivencia de células. Este proceso activo es esencial realmente en el desarrollo normal y homeostasis de organismos multicelulares. Es opuesto a la necrosis que es la ocurrencia de muerte celular como resultado de cambios severos perjudiciales en el medio amiente.

La apoptosis de una célula se puede caracterizar por lo menos por: -la condensación rápida de la célula con colapso del núcleo pero con preservación de membranas; o, - fisura de ADN en las regiones encadenadoras entre nucleosomas para producir fragmentos que se pueden visualizar fácilmente por medio de electroforesis de gel con agarosa como patrón de escalera característica.

Diversas patologías ocurren debido a una regulación defectuosa o aberrante de la apoptosis en las células afectadas de un organismo. Por ejemplo, los efectos que dan lugar a un nivel disminuido de apoptosis en un tejido comparado con el nivel normal requerido para mantener el estado estable del tejido pueden promover un incremento anormal en la cantidad de células en un tejido. Esto ha sido observado en cánceres diversos, donde la formación de tumores ocurre debido a que las células no están muriendo a su velocidad normal. Algunos virus de ADN como el virus Epstein-Barr, algunos virus africanos de fiebre porcina y adenovirus también inhiben o modulan apoptosis reprimiendo así la muerte de células y permitiendo a la célula huésped continuar reproduciendo el virus.

Al contrario, un defecto que da lugar a un incremento en la muerte de células en un tejido se puede asociar con desórdenes degenerativos en los que las células están muriendo a una velocidad más alta que aquella con que se regeneran. Esto se observa en varios desórdenes, tal como el SIDA, senectud y enfermedades neurodegenerativas.

Los compuestos que modulan la apoptosis positiva o negativamente pueden suministrar medios para el tratamiento o la prevención de estos desórdenes. Como consecuencia, el delineamiento de rutas apoptóticas proporciona blancos objetivos para el desarrollo de agentes terapéuticos que se pueden usar para modular la respuesta de una célula a señales apoptóticas o de supervivencia de células.

Se han hecho progresos en la identificación de moléculas extracelulares, intracelulares y de superficie celular que regulan la apoptosis. Los estudios previos se han enfocado en la identificación de señales específicas de muerte celular (tales como la pérdida de factores de crecimiento, el sistema FAS/TNF, agentes genotóxicos, glucocorticoides...), miembros de las proteasas de la familia Bcl-2 y del tipo ICE. Pero los pasos críticos en las rutas apoptóticas aún están por identificarse.

Por consiguiente, aún existe la necesidad de identificar los mecanismos celulares involucrados en las rutas apoptóticas y el blanco objetivo para el desarrollo de agentes terapéuticos que se puedan usar para modular la apoptosis celular.

Entre los diferentes agentes transductores las proteínas de la familia Bcl-2 actúan como un punto de verificación intracelular en la ruta apoptótica. La familia se divide en dos grupos funcionales (médecine/sciences 97; 13: 384-6): las proteínas que suprimen la muerte celular (miembros anti-apoptóticos tales como Bcl-2, Bcl-x_{L}, Bcl-w, Bag-1, Mcl-1, A1) y las proteínas que promueven la muerte celular (miembros pro.apoptóticos tales como Bim, Nix, Hzk, Bax, Bcl-x_{S}, Bad, Bik). La familia Bcl-2 ha sido definida mediante homología de secuencia con base en motivos conservados específicos denominados regiones de homología BCL (dominios de BH1, BH2, BH3 y BH4). Los dominios BH1, BH2 y BH3 han demostrado ser importantes en la homodimerización o heterodimerización y en modular la apoptosis. Las moléculas anti-apoptóticas tienen un dominio BH4 específico.

Se ha propuesto que la relación entre miembros pro-apoptóticos y miembros anti-apoptóticos, expresada en una célula determina si esta célula responderá a una señal apoptótica. En realidad, los miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos son antagonistas unos contra otros formando heterodimeros inactivos (Oltvai et al., 1993, Cell 74: 609-619); como consecuencia, sólo el balance puede promover o prevenir que una célula sufra apoptosis.

Más recientemente, se ha mostrado que la fosforilación de proteínas Bcl-2 puede también modular su actividad. Efectivamente, las diferentes rutas anti-apoptóticas son activadas probablemente por medio de factores de crecimiento involucrando fosfatidilinositol 3 kinas (PI3K), Akt kinas y kinasas activadas con Ras. En particular, la proteína pro-apoptótica Bad (Regulador de Muerte Celular Asociada Bcl-X_{L}/Bcl-2, Downward, 1999, Nature Cell Biol 1: 33-35) se vuelve fosforilatada por estimulación de células con IL-3 y NGF, dando lugar a una asociación con proteína 14-3-3 (Hsu et al., 1997, Mol Endocrinol 11: 1858-1867). Se propuso que tal interacción facilite la circulación de Bad fosforilatado de la membrana de la mitocondria hacia los compartimientos citosólicos, secuestrándolo allí y previniendo así otra interacción con otros miembros Bcl-2 anti-apoptóticos (US Pat No. 5,856,445). Se mostró además que la asociación de la proteína 14-3-3 con Bad depende de la fosforilación de serina 155 de Bad (WO 0110888, ApoptosisTechnology Inc., 2001). Los resultados divulgados en la presente invención indican que algunas proteínas pro- o anti-apoptóticas, especialmente de la familia Bcl-2, se regulan a través de una localización subcelular recientemente identificada que está en balsas lipídicas (lipid rafts) formadas en la membrana plasmática. Esta observación ofrece un camino al mecanismo general novedoso de regulación de apoptosis celular que puede jugar un rol en la regulación de moléculas pro- o anti-apoptóticas en respuesta a las señales de muerte celular o de supervivencia celular.

La localización de proteínas en compartimientos subcelulares distintos, incluyendo membranas, es un evento crítico en rutas celulares múltiples. Las membranas plasmáticas de muchos tipos de células contienen microdominios a los que comúnmente se refieren como balsas (rafts) lipídicas, que son bioquímicamente distintos de la mayoría de las membranas plasmáticas (Brown y London, 1998, Annu Rev Cell Dev Biol 14: 111-136). Estos dominios consisten en conjuntos dinámicos de esfingolípidos y colesterol. Más específicamente, la presencia de cadenas de hidrocarburos saturados en los esfingolípidos permite que el colesterol esté estrechamente intercalado, llevando a la presencia de distintas fases ordenadas líquidas y de esta manera a una capa doble más fluida de lípido. Las balsas de lípidos se pueden aislar mediante fraccionamiento subcelular y centrifugación con gradiente de densidad de acuerdo con los métodos en Hacki et al. (Oncogene 2000 19: 2286-2295) y Millan et al. (Eur J Immunol 1998 28: 2675-3684). También se pueden visualizar en células intactas mediante microscopía confocal usando, por ejemplo, la subunidad B de toxina de cólera (CTx) fluorescentemente marcada, la cual enlaza al gangliosido GM1 (Harder et al., 1998, J Cell Biol 141: 929-942). Un elemento clave de las balsas lipídicas es que ellas pueden incluir o excluir proteínas en grados que varían. WO 01/48236 divulga métodos para identificar agentes que modulan la actividad de kinasa C theta de proteína y el uso farmacéutico de tales agentes; se encontró que dichos agentes inhiben el enlace de PKC-\Theta con balsas de lípidos en grados que varían.

En las células T, un número de proteínas involucradas en la transducción de la señal, tales como IcK, Lat, se copurifican con balsas de lípidos aisladas sobre gradiente de sacarosa. El desbaratamiento de la integridad de las balsas mediante una variedad de métodos inhibe eventos de activación temprana, sosteniendo un rol crítico para estos dominios en el ingreso para señalizar y, así mismo, en la transducción de señal desde los receptores de superficie celular. Por ejemplo, se mostró que el lípido de éter antitumoral 1-O-octadecil-2-O-metil-rac-glicero-3-fosfocolina (ET-18-OCH3; edelfosina) acciona la apoptosis mediante la circulación de Fas a las balsas de lípido y la asimilación posterior de Fas por parte de las balsas de lípidos (Gajate and Mollinedo, Blood, 2001, 98: 3860-3863).

La presente invención resulta del descubrimiento de un mecanismo novedoso de regulación celular de la actividad de moléculas pro- o anti-apoptóticas en una célula mediante la circulación de estas moléculas hacia balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas tales como condiciones de proliferación o condiciones donde las células no se dividen.

Efectivamente, los inventores han encontrado, de manera sorprendente, que la interacción de una proteína pro-apoptótica, tal como la proteína Bad, con balsas (rafts), es un proceso activo regulado por citoquinas o factores de crecimiento. Ellos también han mostrado que la segregación de esta molécula a partir de balsas en células privadas de citoquina o de factor de crecimiento está involucrada en la inducción de apoptosis y asociada con la desorganización de balsas.

Así, la invención proporciona métodos para identificar polipéptidos celulares que tienen actividad pro-apoptótica o anti-apoptótica en un tipo de célula particular.

La invención también proporciona medios de tamiz o investigación de compuestos que modulan la apoptosis que interfieren con el mecanismo recientemente identificado de regulación de apoptosis. Con respecto a esto, los compuestos candidatos pueden, adicional o alternativamente, interferir desbaratando o reconstituyendo balsas lipídicas en una célula que normalmente produce polipéptidos pro- o anti apoptóticos localizados en balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas. De acuerdo con otra realización, los compuestos candidatos pueden, adicional o alternativamente, interferir mediante segregación de polipéptidos pro- o anti-apoptóticos desde las balsas lipídicas.

La invención también proporciona un compuesto capaz de asociación moduladora de un polipéptido pro- o anti-apoptótico con balsas lipídicas.

La invención también proporciona un compuesto capaz de una transferencia modulatoria de un polipéptido pro- o anti-apoptótico entre una balsa lipídica y otra localización celular.

La invención también proporciona el uso de compuestos capaces de modular la formación de balsas lipídicas o de modular la circulación de proteínas pro- o anti-apoptóticas en balsas en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de desórdenes inducidos por o asociados a una regulación defectuosa de la muerte celular así como de patologías específicas en las que la muerte de células infectadas o desregladas puedan ser por lo menos parte de una terapia.

Entre las varias ventajas de los métodos presentes, se debe notar que el estado apoptótico o no apoptótico de una célula se puede determinar de acuerdo con los métodos presentes en un período relativamente corto de tiempo analizando la organización de balsas lipídicas. En particular, no existe la necesidad de cuantificar la expresión específica del gen. Los métodos de la invención son así apropiados particularmente para tamizaje (screening) con alto rendimiento de compuestos que modulan apoptosis.

Además, la invención proporciona métodos para detectar de manera temprana eventos del proceso apoptótico en una célula.

Un primer objeto de la invención es un método de tamizar polipéptidos celulares por actividad pro-apoptótica o antiapoptótica en una célula de un tipo particular de célula; dicho método comprende:

a.

cultivar células de dicho tipo particular de célula en condiciones no apoptóticas y cultivar células de de dicho tipo particular de células en condiciones apoptóticas; y

b.

determinar localización subcelular de dichos polipéptidos celulares en las células cultivadas de mamíferos;

en el cual una localización de un polipéptido celular en balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones no apoptóticas y una segregación de dicho polipéptido celular a partir de balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones apoptóticas es indicativa de la actividad pro-apoptótica o anti-apoptótica de dicho polipéptido celular en dicho tipo particular de célula.

En una realización articular, dichas células cultivadas son células de mamíferos.

En una realización preferida, las células cultivadas bajo condiciones no apoptóticas son cultivadas bajo condiciones de proliferación. De acuerdo con los métodos de la invención, se considera que las células se cultivan "bajo condiciones no apoptóticas" cuando la proporción de células que sufren el proceso apoptótico en el cultivo celular es relativamente estable en el tiempo y no representa más del 10%, preferiblemente, más del 1% de la población total de células (dependiendo del tipo de célula).

En una realización preferida, las condiciones no apoptóticas son condiciones de proliferación.

Al contrario, se considera que las células a ser cultivadas "bajo condiciones apoptóticas" cuando la proporción de las células que sufren el proceso apoptótico aumenta de manera dramática en un tiempo para alcanzar, después de cierto período, especialmente por cerca de 24 horas, a partir de la privación del factor de crecimiento o proliferación o mediante el uso de un factor apoptótico, más del 50% de la población total de células.

Las células que han pasado por el proceso apoptótico se pueden caracterizar, por ejemplo, mediante rompimiento específico de ADN nuclear que se pueda visualizar sobre electroforesis de gel de sacarosa.

Como se usa aquí, el término "polipéptido celular" se refiere a cualquier polipéptido que se produzca en una célula por expresión de genes. Puede ser un polipéptido naturalmente codificado es dicha célula, especialmente por un gen nativo, o un polipéptido codificado no naturalmente en dicha célula, queriendo decir que la codificación genética de dicho polipéptido o una secuencia de codificación derivada de dicho gen identificado ha sido recombinada en el genoma de la célula para obtener expresión. Puede ser una forma mutada de un polipéptido de ocurrencia natural y más específicamente una forma mutada en la que la mutación está involucrada en localización anormal subcelular de dicho polipéptido bajo condiciones de crecimiento proliferante.

Como se usa aquí, el término "balsas lipídicas" se refiere a conjuntos de esfingolípidos y colesterol en membranas de plasma que forman microdominios con distintas fases líquidas ordenadas; dichos microdominios retienen establemente estructuras específicas tales como gangliosidos o polipéptidos tales como Lck. Las balsas lipídicas pueden aislarse bioquímicamente mediante fraccionamiento subcelular y ultracentrifugación con gradiente de densidad de acuerdo con los métodos descritos en Hacki et al. (Oncogene 2000 19: 2286-2295) y Millan et al. (Eur J Immunol 1998 28: 2675-3684) y en los ejemplos de abajo. También se pueden visualizar en células intactas mediante microscopía confocal usando, por ejemplo, la subunidad B de la toxina de cólera (CTx) etiquetada de manera fluorescente, la cual se enlaza a gangliosidos GM1 que se acumulan en balsas lipídicas (Harder et al., 1998, J Cell Biol 141: 929-942). Más específicamente, la localización subcelular de un polipéptido particular en balsas lipídicas se determina por inmunofluorescencia doble que usa un marcador etiquetado para detectar balsas lipídicas y otro marcador etiquetado para detectar el polipéptido a localizar. También se puede determinar analizando la presencia de dicho polipéptido en fracciones subcelulares que contienen balsas lipídicas.

En una realización particular, el método de la invención es apropiado para tamizar un polipéptido cuya estructura es conocida pero cuya función es desconocida para una actividad pro- o anti-apoptótica en un tipo particular de célula. En particular, aquella persona versada en el arte puede usar el método de la invención para tamizar polipéptidos sospechosos de estar involucrados en regulación de apoptosis de acuerdo con características específicas tales como dominios estructurales específicos. El tamizaje de polipéptidos celulares no se limita, sin embargo, necesariamente a polipéptidos celulares de estructura conocida.

Varias proteínas pro-apoptóticas han sido identificadas hasta ahora, aunque el patrón de expresión de estas proteínas puede variar dependiendo del tipo de célula. El método de tamiz es útil también al determinar si un polipéptido celular putativo, conocido por ser pro- o anti-apoptótico en un cierto tipo de célula está involucrado en la modulación de apoptosis en otro tipo de célula.

En una realización particular, los polipéptidos tamizados pertenecen a la familia Bcl-2. Tal como se mencionó arriba, los miembros de la familia Bcl-2 se caracterizan por homología de secuencia basada en motivos conservados específicos denominados regiones de homología BCL (dominios de BH1, BH2, BH3 y BH4). Por consiguiente, su localización subcelular se puede determinar mediante el uso de una molécula que reconozca específicamente un dominio BH. Tales moléculas abarcan por ejemplo anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales que reconozcan específicamente un dominio BH.

Un ejemplo de una molécula que interactúa con motivo BH3 en PP1a (Ayllon, et al. 2000. EMBO J.; 19: 2237-2246). Ejemplos de moléculas que interactúan con motivo BH4 se revisan en Admas, J.M. and Cory, S. (1998, Science, 281, 1322). En una realización particular, una molécula que reconoce específicamente un dominio BH4 se usa para tamizar preferiblemente moléculas anti-apoptóticas. En otra realización particular, una molécula que reconoce específicamente un dominio BH3 se usa para tamizar moléculas pro- o anti-apoptóticas. Una combinación de moléculas que reconocen los dominios diferentes BH se pueden usar también, por ejemplo para tamizar moléculas pro-apoptóticas que tienen sólo el dominio BH3.

El método de la invención también es apropiado para tamizar polipéptidos novedosos de a familia Bcl-2 cuya estructura y función son desconocidos por lo menos en parte pero que pueden aislarse fácilmente usando reconocimiento molecular de su(s) dominio(s) BH. Como resultado, en una realización preferida, dichos polipéptidos celulares tamizados se aíslan primero de las balsas lipídicas aisladas bioquímicamente de dichas células de mamífero cultivadas en condiciones de proliferación mediante el uso de una molécula que reconozca un dominio BH. Más específicamente, los polipéptidos presentes en las balsas lipídicas aisladas se pueden separar sobre un gel y analizarse mediante análisis de Western Blot usando un anticuerpo que reconoce un dominio BH o mediante métodos similares de análisis proteínico. Los polipéptidos reconocidos por un domino BH se puede aislar y los anticuerpos que reconocen cada polipéptido aislado se pueden producir de acuerdo con métodos usuales bien conocidos en el arte. La localización subcelular de uno o más de los polipéptidos aislados se determina entonces de acuerdo con el método de la invención usando tales anticuerpos específicos para tamizar actividad apoptótica.

Las proteínas que se asocian con balsas lipídicas pueden tener un dominio de transmembrana o haber sufrido modificaciones post-translacionales tales como miristoilación. En otra realización específica, dichos polipéptidos celulares tamizados se aíslan además mediante el uso de una molécula que reconoce específicamente un polipéptido miristoilatado.

En una realización preferida, el método se lleva a cabo para tamizar polipéptidos celulares de un tipo de célula caracterizado por la producción de proteína Bad, es decir, del tipo de célula Bad+. De acuerdo con otra realización preferida, las células son características del sistema inmune y más preferiblemente son líneas de células T.

Efectivamente, se muestra en los ejemplos de abajo que la proteína pro-apoptótica Bad es secuestrada en balsas lipídicas de células T estimuladas por IL-4 y segrega a partir de balsas en células T privadas de IL-4.

Más específicamente, se muestra en el ejemplo que Bad puede ser co-purificado con balsas lipídicas mediante fraccionamiento subcelular y ultracentrifugación de gradiente de densidad a partir de células bajo condiciones no apoptóticas, especialmente bajo condiciones de proliferación. Estos resultados indican que Bad está fuertemente asociado con balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones no apoptóticas tales como condiciones de proliferación.

Los polipéptidos celulares que interactúan físicamente con proteína Bad en balsas lipídicas aisladas de células Bad+ constituyen así polipéptidos putativos preferidos para tamizar actividad pro- o anti-apoptótica. Por consiguiente, en una realización preferida, los polipéptidos celulares tamizados se aíslan de balsas lipídicas aisladas de células Bad+ cultivadas bajo condiciones de proliferación y se seleccionan entre los polipéptidos que interactúan físicamente con la proteína Bad.

Naturalmente, la invención también abarca a los polipéptidos celulares recientemente identificados que tienen actividad pro- o anti-apoptótica y su uso en proporcionar medios para modular apoptosis en células tales como las de los mamíferos que expresan estos polipéptidos.

Otro objeto de la invención es suministrar un método de tamizar compuestos por su capacidad de modular apoptosis en células, que producen polipéptidos pro- o anti-apoptóticos localizados en balsas lipídicas cuando dichas células se cultivan bajo condiciones no apoptóticas; dicho método comprende:

a)

cultivar dichas células en un medio de crecimiento que mantiene condiciones no apoptóticas;

b)

contactar dichas células cultivadas con un compuesto cultivado;

c)

determinar el nivel de uno o varios polipéptidos pro- o anti-apoptóticos asociados con balsas lipídicas;

d)

seleccionar el compuesto que interfiere con la asociación de uno o varios polipéptidos con balsas lipídicas; dicho compuesto tiene la capacidad de modular apoptosis.

Un compuesto interfiere con la asociación de un polipéptido pro- o anti-apoptótico cuando modifica dicha asociación, inclusive cuando altera la naturaleza química y/o física de dicha asociación o cuando suministra o influencia la segregación de polipéptidos pro- o anti-apoptóticos de las balsas lipídicas o cuando previene dicha asociación o también cuando actúa sobre y especialmente promueve el desbaratamiento de balsas lipídicas o más generalmente altera la constitución de balsas lipídicas. La invención además se relaciona con un método de tamizar compuestos por su capacidad de promover apoptosis en células; dicho método comprende

a)

cultivar células en un medio de crecimiento manteniendo condiciones no apoptóticas; en donde dichas células producen una proteína pro-apoptótica que se localiza en balsas lipídicas bajo condiciones no apoptóticas de dichas células;

b)

contactar dichas células cultivadas con un compuesto candidato; y

c)

determinar la ausencia o la presencia de balsas lipídicas en dichas células cultivadas;

d)

en caso de presencia de balsas lipídicas, determinar opcionalmente el nivel de proteína pro-apoptótica localizada en las balsas lipídicas, en donde la ausencia de balsas lipídicas en la membrana plasmática de células incubadas con dicho compuesto candidato, o si se determina, el nivel reducido de proteína pro-apoptótica en las balsas es indicativo de que dicho compuesto promueve la apoptosis.

La invención también se refiere a un método de tamizar compuestos por su capacidad de inhibir o prevenir apoptosis de células; dicho método comprende:

a) cultivar células en un medio de crecimiento para mantener condiciones no apoptóticas, en donde dichas células producen una proteína pro-apoptótica que se localiza en balsas lipídicas bajo condiciones no apoptóticas;

b) contactar dichas células con un compuesto candidato;

c) cultivar células bajo condiciones apoptóticas; y

d) determinar la ausencia o la presencia de balsas lipídicas;

e) en el caso de presencia de balsas lipídicas, determinar opcionalmente el nivel de proteína pro-apoptótica localizada en las balsas lipídicas, en donde la presencia de balsas lipídicas en las membranas plasmáticas de células incubadas con dicho compuesto candidato y opcionalmente el nivel mantenido de proteína pro-apoptótica en las balsas es indicativo de que dicho compuesto candidato inhibe o previene apoptosis.

En una realización preferida, las células se cultivan en un medio de crecimiento que comprende por lo menos una citoquina o un factor de crecimiento necesario para mantener condiciones de crecimiento de proliferación y el paso c) del método comprende privar las células de dicha citoquina o factor de crecimiento necesario para mantener condiciones de crecimiento de proliferación.

Como se usa aquí, el término "compuesto" se refiere a compuestos químicos inorgánicos u orgánicos o biológicos, bien sean naturales (aislados) o sintéticos, y especialmente abarca ácidos nucleicos, proteínas, polipéptidos, péptidos, glicopéptidos, lípidos, lipoproteínas y carbohidratos.

Cualesquiera células en las que las proteínas pro- o anti-apoptóticas puedan circular en balsas lipídicas se pueden usar en los métodos de la invención. En una realización preferida de los métodos de la invención, las células son células de mamíferos.

Las células de mamíferos que se usan en los métodos de tamizar compuestos pueden ser cualesquiera células de mamíferos cuya supervivencia celular se pueda controlar mediante una citoquina específica o factor de crecimiento. En realizaciones preferidas de los métodos de arriba, las células cultivadas de mamíferos se seleccionan entre aquellos que producen la proteína Bad como una proteína pro-apoptótica. Más específicamente, se seleccionan células preferidas de mamíferos que producen una proteína Bad entre células características del sistema inmune y más preferiblemente entre células T.

Tal como se usa aquí, el término "citoquina o factor de crecimiento" se refiere a cualquier molécula que necesariamente debe estar presente en un medio de crecimiento para prevenir un proceso apoptótico de una célula cultivada y/o para promover proliferación celular. Citoquinas conocidas incluyen cualquier interleuquina. Factores de crecimiento conocidos incluyen a los factores de crecimiento fibroblastos, bFGF, aFGF, FGF6, los factores de crecimiento hepatocitos HGF/SF, el factor de crecimiento de epidermis, EGF y otros factores de crecimiento caracterizados tales como IGF-_1, PDGF, LIF, VEGF, SCF, TGFb, TNFa, NGF, BMP, neuregulina, trombopoyetina y hormona de crecimiento. Factores de crecimiento de acuerdo con la invención pueden incluir también progestágenos y derivados de ellos (progesterona), estrógenos y derivados de ellos (estradiol), andrógenos 8testosterona), corticoides minerales y derivados de ellos (aldosterona), hormonas LH, LH-RH, FSH y TSH, T3, T4 y ácido retinoidico, calcitonina E2 y F2/alfaprostaglandinas. También se pueden usar glucocorticoides (naturales o hemisintéticas, es decir, hidrocortisona, dexametasona, prednisolona o triamcinolona).

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Las características celulares del sistema inmune se pueden cultivar de manera ventajosa bajo simulación con una interleuquina para mantener condiciones de crecimiento proliferantes. En particular en este contexto se puede usar interleuquina IL-4, IL-2 o IL-9 o mezclas de las mismas.

Sin embargo, cualquier modelo de apoptosis disponible se puede usar para seleccionar el tipo de célula y los factores para condiciones no apoptóticas, tales como el factor de crecimiento o citoquina usados en los métodos. Como se ha usado aquí, el término "modelo de apoptosis" comprende cualquier enseñanza que proporcione una manera de controlar apoptosis celular de un tipo específico de célula mediante el uso de factores específicos para condiciones no apoptóticas tales como una citoquina específica o factor de crecimiento o una mezcla de los mismos. Tales modelos de apoptosis son por ejemplo el control de líneas de células T estimuladas con IL-4, IL-3 y progenitor hematopoyetico, PC12 y CRH (hormona de liberación de corticotropina), HN9.10.

Un compuesto candidato puede modular apoptosis bloqueando o previniendo la asociación de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico con balsas lipídicas. En este contexto, ya no se observa en las células incubadas con el compuesto la localización subcelular de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico en balsas lipídicas en comparación con las células no incubadas con el compuesto; o por lo menos se reduce significativamente la localización subcelular de las balsas lipídicas de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico en comparación con las células no incubadas con el
compuesto.

Otro objeto de la invención es suministrar compuestos capaces de modular la asociación de polipéptido pro- o anti-apoptótico con balsas lipídicas.

Algunos de estos compuestos pueden modular apoptosis previniendo la asociación de un polipéptido pro- o anti-apoptótico con balsas lipídicas, promoviendo la segregación de un polipéptido pro- o anti-apoptótico de balsas lipídicas o promoviendo el desbaratamiento de balsas lipídicas.

Algunos de estos compuestos pueden modular apoptosis previniendo la segregación de un polipéptido pro- o anti-apoptótico de balsas lipídicas, promoviendo la asociación de un polipéptido pro- o anti-apoptótico con balsas lipídicas o promoviendo la constitución de balsas lipídicas.

Otro objeto de la invención es suministrar compuestos capaces de modular la transferencia de un polipéptido pro- o anti-apoptótico entre una balsa lipídica y otra localización celular.

Algunos de estos compuestos pueden modular apoptosis previniendo la transferencia de un polipéptido pro- o anti-apoptótico desde una localización cellular, diferente de una balsa lipídica, a una balsa lipídica o desde una balsa lipídica a otra localización celular.

Algunos de estos compuestos pueden modular apoptosis promoviendo la transferencia de un polipéptido pro- o anti-apoptótico desde una localización celular, diferente de una balsa lipídica, a una balsa lipídica o desde una balsa lipídica a otra localización celular.

En una realización preferida, los compuestos de la invención que modulan apoptosis son capaces de modular la asociación de una proteína apoptótica de familia Bcl-2, especialmente Bad, con balsas lipídicas o transferencia de dicha proteína entre balsas lipídicas y otra localización celular.

Algunos de dichos compuestos pueden promover apoptosis en una célula productora de Bad previniendo asociación de Bad con balsas lipídicas, promoviendo segregación de Bad de balsas lipídicas o promoviendo desbaratamiento de balsas lipídicas.

Algunos de dichos compuestos pueden inhibir apoptosis en una célula productora de Bad promoviendo asociación de Bad con balsas lipídicas, previniendo segregación de Bad de balsas lipídicas o promoviendo constitución de balsas lipídicas.

En una realización particular, un compuesto de la invención puede inhibir apoptosis de una célula productora de Bad previniendo transferencia de Bad a mitocondrias después de la segregación de Bad de las balsas lipídicas. Tal compuesto puede interactuar con Bad por medio de un motivo similar a los motivos de balsas lipídicas que permiten asociación de Bad con las balsas lipídicas.

La localización subcelular de balsas lipídicas de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico se puede cuantificar mediante cualesquiera métodos de análisis cuantitativo, disponibles en el arte. Una reducción significativa de localización subcelular de balsas lipídicas se observa cuando el nivel de polipéptido pro- o anti-apoptótico se reduce a por lo menos el 50%, preferiblemente 90% en células incubadas con el compuesto candidato o en comparación con las células no incubadas con el compuesto candidato.

Un compuesto candidato puede modular apoptosis bloqueando o previniendo la segregación de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico de balsas lipídicas. En este contexto, la localización subcelular de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico en balsas lipídicas de células cultivadas en condiciones que promueven segregación de proteína pro- o anti-apoptótica (por ejemplo, condiciones apoptóticas para proteínas pro-apoptóticas) se sigue observando en células incubadas con el compuesto en comparación con células no incubadas con el compuesto y la localización subcelular de balsas lipídicas de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico se mantiene significativamente en comparación con las células no incubadas con el compuesto.

La localización subcelular de balsas lipídicas de dicho polipéptido pro- o anti-apoptótico se puede cuantificar mediante cualesquiera métodos de análisis cuantitativo, disponibles en el arte. Se observa una permanencia significativa cuando el nivel de polipéptido pro- o anti-apoptótico se mantiene hasta por lo menos un 50%, preferiblemente 90% en las células incubadas con el compuesto candidato o en comparación con las células no incubadas con el compuesto candidato.

Por "determinar la ausencia de balsas lipídicas" se entiende que las balsas lipídicas en las células incubadas con el compuesto candidato no son detectadas, o por lo menos, se detectan como vestigios o se detectan a un nivel significativamente reducido (es decir, mínimo 20% menos) con los métodos divulgados en la presente invención en comparación con un cultivo de células no incubadas con el compuesto candidato en calidad de control. La proporción de balsas lipídicas en una célula puede compararse entre los cultivos de células usando cualesquiera métodos de análisis cuantitativo, disponibles en el arte. Una reducción significativa de balsas lipídicas se observa cuando su proporción se reduce desde 20% hasta preferiblemente 50% y preferiblemente 90% en células incubadas con el compuesto candidato para el control. Por ejemplo, mediante análisis microscópico confocal, el perfil de florescencia se puede cuantificar mediante análisis de imagen de células incubada con el compuesto candidato y células no incubadas con el compuesto candidato.

De manera similar, por "determinar la presencia de balsas lipídicas" se entiende que las balsas lipídicas en células incubadas con el compuesto candidato se detectan en substancialmente la misma cantidad en comparación con un cultivo de células no incubadas con el compuesto candidato en calidad de control.

Métodos para aislar balsas lipídicas han sido descritos abajo. Mas específicamente, es posible aislar balsas lipídicas de células de mamíferos, mediante fraccionamiento de células sobre gradiente de sacarosa y fracciones subcelulares de inmunoblotting (inmunodetección específica) con marcadores específicos para balsas para identificar balsas que contienen fracciones subcelulares. La presencia o ausencia de balsas lipídicas se pude determinar así en una realización específica mediante los pasos siguientes

i) recuperar las células cultivadas incubadas con dicho compuesto y resuspender dichas células en un búfer apropiado para fraccionamiento subcelular, tal como un búfer de sacarosa con gradiente;

ii) ultracentrifugar las células fraccionadas;

iii) recuperar la fracción subcelular que debería contener balsas lipídicas; y

iv) determinar si la fracción subcelular recuperada contiene gangliosido y/o molécula(s) asociada(s) de balsa lipídica.

Tal como se usa aquí, "la fracción subcelular que debería contener balsas lipídicas" es la fracción subcelular que corresponde a los organelos encintados del gradiente que contiene balsas lipídicas en un gradiente obtenido con células cultivadas en condiciones no apoptóticas. Naturalmente, en condiciones no apoptóticas, la fracción celular correspondiente contendrá muchas menos balsas lipídicas.

Las balsas lipídicas y la localización subcelular de balsas lipídicas de polipéptidos pro- o anti-apoptóticos pueden visualizarse directamente en células intactas mediante microscopía confocal usando un marcador molecular que se enlaza específicamente con una molécula asociada con balsa o un gangliosido.

Tales marcadores moleculares preferidos son, por ejemplo, la subunidad B de toxina de cólera (CTx) que reconoce específicamente gangliosido GM1, anticuerpo anti-Bad o anticuerpo anti-Lck. Más generalmente, cualquier anticuerpo dirigido a cualquier polipéptido celular identificado recientemente de acuerdo con el método de la invención tal como se describió arriba se puede usar como un marcador molecular específico para balsa.

La invención también concierne a los compuestos identificados mediante métodos de screening o tamizado.

Tales compuestos identificados mediante los métodos de arriba de la invención son útiles para la prevención y/o tratamiento de desórdenes inducidos o asociados con una regulación defectuosa de la muerte celular o de patologías específicas donde la muerte de células infectadas o desregladas puede ser por lo menos parte de una terapia.

La invención además proporciona un uso de un compuesto capaz de modular formación de balsas lipídicas en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inducidos por o asociados con una regulación defectuoso de muerte celular.

En una realización preferida, dicha regulación defectuosa afecta células que producen proteína Bad, más preferiblemente, células del sistema inmune y más preferiblemente células T.

Cuando dicha regulación defectuosa de muerte celular da lugar a una disminución anormal de muerte celular, el compuesto usado es preferiblemente un compuesto capaz de desbaratar balsas lipídicas, promoviendo de esa manera apoptosis. Tales compuestos son, por ejemplo, metil-b-ciclodextrina o filipina. Ejemplos de desórdenes que dan lugar a una disminución anormal de muerte celular son las enfermedades de cáncer y especialmente cánceres linfoproliferativos, enfermedades infecciosas y especialmente enfermedades virales, enfermedades inflamatorias o enfermedades autoinmunes.

A la inversa, cuando la regulación defectuosa de apotosis da lugar a una disminución anormal de muerte celular, los compuestos usados son preferiblemente un compuesto capaz de reconstituir balsas lipídicas en la membrana plasmática de células, tal como edelfosina previniendo de esa manera apoptosis. Ejemplos de desórdenes que dan lugar a una disminución anormal de muerte celular son enfermedades asociadas a la senectud, enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, muerte celular isquémica, curación de heridas o SIDA.

La invención proporciona nuevos medios para detectar eventos tempranos del proceso apoptótico. En particular, la invención permite identificar el estado apoptótico de una célula determinando la presencia o la ausencia de balsas lipídicas. Por consiguiente, otro objeto de la invención es un método in Vitro para la detección de una regulación defectuosa de apoptosis, en una muestra de células de un individuo; dicho método comprende determinar la presencia o la ausencia de balsas lipídicas en dichas células, en el cual la ausencia de de dichas balsas lipídicas es indicativa de una regulación defectuosa de apoptosis.

Ejemplos de métodos para determinar la presencia o la ausencia de balsas lipídicas en células ya han sido descritos arriba. En una realización preferida, la presencia o ausencia de balsas lipídicas se determina detectando la presencia o la ausencia de una proteína pro-apoptótica o anti-apoptótica que se sepa que está localizada en balsas lipídicas bajo condiciones de crecimiento proliferativas, tal como la proteína Bad, o cualquier otra proteína, y especialmente un polipéptido celular identificado de acuerdo con el método de la invención expuesta arriba.

En una realización específica, dichas células aisladas son células características del sistema inmune de un individuo afectado por una enfermedad linfoproliferativa.

Naturalmente, la invención también concierne un uso de un compuesto apropiado para detectar la presencia de balsas lipídicas en el método in vitro de detección descrito arriba.

Ejemplos de un compuesto apropiado para detectar la presencia de balsas lipídicas es un compuesto que reconoce específicamente proteína Bad, proteína Lck o gangliosido GM1. En una realización específica, dicho compuesto usado en el método in Vitro de detección se selecciona entre la subunidad B de toxina de cólera (CTx), anticuerpo anti-Bad y anticuerpo anti-Lck.

Leyendas para las figuras

Figura 1

Efecto de IL-4 sobre la asociación de Bad con proteína 14-3-3

Fueron inmunoprecipitados extractos citoplásmicos de 10x10^{6} células estimuladas con IL-4 o privadas de IL-4 con anticuerpos anti-Bad o anticuerpos anti-Raf y blotted con anti-14-3-3, anti-Raf y anti-Bad. Se usaron extractos totales (T lane) como control positivo de 14-3-3 y expresión de balsa. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes.

Figura 2

Localización subcelular de Bad en células estimuladas con IL-4 o privadas con IL-4

A) Análisis inmunoblot de anti-bad, anti-Lck (balsas), CTx-Biotina (gangliosido GM1, balsas), anticaspasa 3 (citosol), anti-calnexina (retículo endoplasmático, ER) y anti-citocromo C (mitocondria) de fracciones subcelulares de células estimuladas con IL-4 o privadas de IL-4. Las fracciones (1 a 4) fueron preparadas por ultracentrifugación con gradiente de sacarosa y ensayadas para su pureza usando anticuerpos contra mitocondria, balsas, ER y citosol. No se muestra la fracción nuclear en el blot (fracción 5). La proteína cargada por pozo en cada fracción de gradiente corresponde a aquella de 5x10^{6}. Extractos totales, 30 \mug de proteína. Resultados similares se obtuvieron en tres experimentos independientes.

B) Células estimuladas con IL-4 o privadas de IL-4 fueron extraídos con Triton X-100 y fraccionado en gradiente de flotación Optiprep. Las fracciones se recogieron de la cima hasta el fondo de gradiente y analizado por blot occidental. Sólo se muestran las primeras proteínas (I) insolubles y la última fracción, proteínas solubles. Resultados similares se obtuvieron en dos experimentos independientes.

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Figura 3

Localización de balsas de Bad en células estimuladas con IL-4

A) las células estimuladas con IL-4 o privadas de IL-4 se tinturó con CTx-FITC y ya sea con anticuerpos anti-Lck o anti-Bad como se indica, seguido de anticuerpo secundario etiquetado Cy3 y analizado mediante microscopía confocal. Resultados similares se obtuvieron en tres experimentos independientes. Las secciones confocal muestran fluorescencia en verde (FITC) y roja (Cy3). B) las células estimuladas con IL-4 o privadas de IL-4 fueron tinturadas con anticuerpos anti-Bad y anti-mitocondria, seguido de anticuerpos secundarios etiquetados FITC y Cy3 y analizadas como arriba. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.

Figura 4

Tratamiento de metil-b-ciclodextrina (M-b-CD) rompe la asociación de Bad con balsas e induce apoptosis

A) Células estimuladas con IL-4 fueron muertas de inanición con suero por 30 minutos y luego tratadas con o sin 10 mM de M-b-CD por 30 minutos a 37°C antes de incubación con CTx-FITC y anticuerpos anti-Bad o anti-Lck, seguido de anticuerpo secundario etiquetado Cy3. Luego las células se analizaron mediante microscopía confocal. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Las secciones singulares confocales muestran fluorescencia verde (FITC) y roja (Cy3). B) las células estimuladas con IL-4 fueron muertas de inanición con suero por 30 minutos y luego tratadas con o sin 10 mM de M-b-CD por 30 minutos a 37°, luego lavadas y transferidas a medio completo suplementado con IL-4. En diferentes momentos fue medida la apoptosis. La subregión G1 de la escala de fluorescencia se usó para determinar el porcentaje de células presentes en el paso inicial de apoptosis. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Barras blancas, células de control; barras grises, células tratadas con M-b-CD.

Figura 5

Efecto de IL-4 sobre la fosforilación de serina de Bad

A) se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos de células estimuladas por IL-4 o privadas de IL-4 con anticuerpo anti-Bad y manchados (blotted) con serine anti-Bad 136, 112 y 155. En calidad de control interno, el blot se desarrolló con anti-Bad. El control positivo para fosforilación de serine 112 y 136, células estimuladas con IL-2; control positivo para fosforilación de serine 155 de Bad, células de COS transfectadas de Bad (C). B) el blot occidental (técnica de Western Blot) de la figura 2A se probó con el anticuerpo anti-Bad serine 136. Se muestra el peso molecular de las proteínas correspondientes.

Ejemplos 1. Materiales y métodos 1.1 Células, linfoquinas y reactivos

TS1\alpha\beta es una línea de célula T de murina que se puede propagar independientemente en IL-2, IL-4 o IL-9. Las células fueron cultivadas en RPMI-1640 como se describió previamente (Pitton et al., 1993, Cytokine 5, 362-371). Murine rIL-4 o sobrenadante de una sub-línea HeLa transfectada con PKCTIL-4.neo fue usada como una fuente de murina IL-4. La subunidad B de toxina de cólera (CTx) etiquetada con FITC de isotiocianato fluoresceína, CTx-Biotina y metil-\beta-ciclodextrina (M-\beta-CD) fueron obtenidos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los anticuerpos secundarios conjugados Cy3 y Cy2 fueron adquiridos de Molecular Probes (Eugene, OR). El suero anti-mitocondria (mito 2813; hidrogenasa de piruvato) fue un regalo del Doctor A. Serrano (CNB, Madrid, España).

1.2 Inmunoprecipitación y western blot

Se estimularon células (1x10^{7}) con IL-4 y se privaron de IL-4 y se lisaron por 20 minutos a 4°C en búfer de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Nonidet P-40, 137 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 10% de mezcla de glicerol e inhibidor de proteasa). Los lisados se inmuprecipitaron con el anticuerpo correspondiente (Calbiochem Transduction Laboratory). Se adicionó proteína A-Sefarosa por 1 hora a 4°C y, después de lavar, se separaron los inmunoprecipitados mediante SDS-PAGE. De manera alternativa, se lisaron células en búfer de muestra de Laemmli y los extractos de proteína se separaron mediante SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, bloqueados con 5% de leche seca sin grasa en salmuera tamponada de Tris (TBS, 20 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM de NaCl) e incubados con anticuerpo primario en TBS/0.5% de leche seca no grasa. Las membranas se lavaron con 0,05% de Tween 20 en TBS y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado de PO. Después de lavar, se desarrollaron proteínas usando el sistema ECL.

1.3 Análisis de ciclo celular

Un total de 2x10^{5} de células estimuladas con IL-4 tratadas con o sin M-\beta-CD se lavaron, resuspendieron en PBS, permeabilizaron con 0,1% de Nonidet P-40 y tinturadas con 50 \mug/ml de yoduro de propidio (PI). En diferentes momentos, se analizaron muestras usando un citómetro de flujo EpicsXL (Coulter, Hialeah, FL). La apoptosis fue medida como el porcentaje de células en la subregión G1 de la escala de fluorescencia que tiene un contenido hipodiploide de DNA. El ciclo celular también se analizó mediante tintura de annexina. Un total de 2x10^{3} células fueron lavadas con PBS helado diluido en búfer enlazante helado y tinturado con annexina y yoduro de propidio. Las muestras se mantuvieron sobre hielo por 10 minutos en la oscuridad y luego analizado por citometría de flujo.

1.4 Fraccionamiento subcelular

El fraccionamiento subcelular se llevó a cabo como se escribió previamente (Hacki et al., 2000, Oncogene 19, 2286-2295; Millan y Alonso, 1998, Eur. J. Immunol. 28, 3675-3684). Brevemente, células estimuladas por IL-4 y privadas de IL-4 se lavaron en PBS y luego se resuspendieron por 2 minutos en búfer de extracción STE (10 mM de Hepes pH 7.4, 1 mM de EDTA, 0.25 mM de sacarosa, 2 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml leupeptina, 1 mM PMSF, 1 \mug/ml pepstatin). El extracto fue inspeccionado bajo el microscopio y más de 95% de células fueron lisadas. Los homogenizados se aplicaron a una sacarosa de gradiente lineal (0,73 a 1,9 M) y ultracentrifugados a 20.000 g durante la noche. Las organelas cintadas se recuperaron mediante jeringa, se diluyeron con un volumen igual de 10 mM de búfer de Hepes y sedimentados a la velocidad apropiada para las respectivas organelas. La pureza de las organelas se determinó mediante Western blot usando anticuerpos contra marcadores específicos: anti-citocromo C para mitocondria, anti-Lck y CTx-biotina para balsas, anti-calnexin para retículo endoplásmico (ER) y anti-caspasa 3 para citosol. Para preparación de citosol, el homogenizado se precentrifugó a 750 g por 10 minutos para retirar los núcleos y células no rotas, seguido por una centrifugación a 100.000 g por 1 h para quitar las membranas.

1.5 Etiquetado de CTx-FITC

Células estimuladas con IL-4 o privadas IL-4 se fijaron con 1% de paraformaldehído por 5 minutos sobre hielo, permeabilizadas y luego incubadas con CTx-FITC (20 minutos, 6 \mug/ml) y anticuerpo anti-Bad por 1 h en PBS-BSA. El anticuerpo secundario etiquetado Cy3 fue adicionado e incubado por 1 h. Finalmente, y después de varios pasos de lavado, se incubaron con metanol a -20°C por 10 minutos, montados con medio de Vectashield, y analizado mediante microscopia confocal. El programa usado para cuantificación de muestras fue Leica TSC NT versión 1.5.451 (Leica, Lasertechnik, Heidelberg, Germany).

1.6 Agotamiento de colesterol

Células estimuladas con IL-4 privadas de suero se trataron por 30 minutos a 37°C con 10 mM M-b-CD, se lavaron y luego incubaron con CTx-FITC y anticuerpos anti-Bad o ant-Lck, como arriba. Se adicionó anticuerpo secundario y se incubó por 1 hora. Finalmente, se incubaron células con metanol a 20°C por 10 minutos y se montaron como se describió arriba.

1.7 Flotación de triton x-100

Células estimuladas con o privadas de IL-4 fueron lisadas en búfer de TXNE (50 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0.2% de Triton X-100) que contiene mezcla de inhibidor de proteasa. Se aislaron membranas insolubles detergentes mediante ultracentrifugación (17,000 g, 4 h, 4°C) en gradiente de 30-35% de Optiprep como se describió previamente (Mañes et al., 1999, EMBO J. 18, 6211-6220).

1.8 Aislamiento de mitocondrias y fracción S-100

Se aislaron mitocondrias usando una modificación del método descrito por Yang et al., 1997, Science 275: 1129. Brevemente, 20x10^{6} células se estimularon con o se privaron de IL-4, se cosecharon y lavaron con PBS frío al hielo. La perla celular se suspendió en 5 volúmenes de búfer A helado (20 Mm HEPES-KOH (pH 7.5), 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 0.1 mM de PMSF y 250 mM de sacarosa) complementada con inhibidores de proteasa. Las células se rompieron en un homogenizador Dounce (Kontes, Vineland, NJ), se centrifugaron los núcleos (1.000 g, 10 minutos, 4°C) y el sobrenadante fue además centrifugado (1.000 g 15 minutos, 4°C). La perla o tableta mitocondrial resultante fue resuspendida en búfer A y almacenada a -80°C. El sobrenadante fue centrifugado (100,000 g, 1 h, 4°C) y la fracción resultante de S-100 fue almacenada a -80°C.

2. Resultados 2.1 Asociados de Bad con balsas lipídicas en células estimuladas con IL-4

Se ha mostrado que después de la estimulación con IL-3, Bad se vuelve fosforilatada, resultando en asociación con proteína 14-3-3. Más recientemente, se ha mostrado que IL-2 induce una fosforilación de Bad, pero no asociación con proteína 14-3-3 (Ayllón et al., 2001, J. Immunol. 166, 7345-7352). La figura 1 muestra que ni la estimulación con IL-4 ni la privación de IL-4 da lugar a asociación de Bad con proteína 14-3-3. Como control interno, se muestra la interacción de Raf y la proteína 14-3-3 (figura 1).

La distribución subcelular de Bad en células estimuladas con o privadas de IL-4 ha sido analizada. Las células estimuladas con o privadas de IL-4 fueron lisadas y fraccionadas sobre gradiente de sacarosa. Para validar el protocolo de gradiente, las fracciones (1 a 4) se inmunodetectaron (immunoblotted) con marcadores para balsas (Lck y gangliosido GM1), mitocondrias (citocromo C), retículo endoplásmico (calnexina) y citosol (caspase 3). No se muestra la fracción nuclear (fracción 5) en el blot porque no hay localización de Bad en el núcleo. Se detectaron Rafts mediante western blot en la fracción 1 usando anticuerpo anto-Lck y CTx-Biotina, que reconoce gangliosido GM1 (figura 2A). La mayor parte de Bad se encontró en balsas (fracción 1), aunque una pequeña fracción también estaba presente en mitocondrias (fracción 4), citosol y retículo endoplásmico (fracción 2). Como control interno, se observó Bad en extractos totales de células estimuladas con IL-4. Finalmente, se ha observado que la fracción de Bad, secuestrada en balsas lipídicas, se defosforilata.

Se ha reportado previamente que Bcl-2 se expresa en células estimuladas con IL-2 y Bcl-XL en células cultivadas con IL-4 (Gómez, J. et al, 1998, Oncogene 17: 1235). Cuando las células mantenidas con IL-4 se privan de linfoquina, ellas sufren apoptosis. Tan pronto pasaron 4 horas después de la privación de IL-4, \approx9% de las células eran apoptóticas, alcanzando 40% a las 24 horas, mientras las células de control estimuladas con IL-4 no mostraron un nivel significativo de apoptosis.

La privación de IL-4 induce desorganización de balsas (fracción 1) que no se detectan usando ni anticuerpo anti-Lck ni CTx-Biotina. El marcador de mitocondrias, que también contiene otras estructuras celulares con densidad similar, se observa en la fracción 4 y la mayor parte de la caspasa 3 se divide, dada una nueva proteína de peso molecular. Más interesante, Bad es casi indetectable en citosol y las balsas sólo se observan en la fracción 4, que corresponde a mitocondrias y a estructuras celulares con densidad similar (Figura 2A). Este resultado sugiere de manera fuerte una asociación dependiente de IL-4 de Bad con balsas y translocación o circulación las mitocondrias después de la privación de IL-4. Las balsas se aislaron también mediante gradiente de flotación de Triton X-100. Como se muestra en la figura 2B, Bad y Lck se detectan en la fracción insoluble detergente (I) de células estimuladas con IL-4, lo que corresponde a balsas lipídicas. En células privadas de IL-4, Bad y Lck se detectan en la fracción correspondiente a proteínas solubles (S). Se ha observado que la miristoilación post-translacional apunta Bad a las balsas (no se muestran los datos).

La localización subcelular de Bad se analizó también en fracciones mitocondriales y citosólicas de células estimuladas con o privadas de IL-4. Bad se detectó en la fracción mitocondrial de células estimuladas con IL-4. La cantidad de Bad asociada con mitocondrias se aumentó con la privación de IL-4. Se detectaron los vestigios de Bad en la fracción citosólica de células estimuladas con o privadas de IL-4. La molécula anti-apoptótica Bcl-xL se detectó débilmente en la fracción mitocondrial de células estimuladas con IL-4, aumentando después de la privación de IL-4. En calidad de control interno, se probó el blot con anti-caspasa 3 (marcador citosólico), anti-mitocondria Mito 2813 (dehidrogenasa de piruvato, marcador de mitocondria) y anti-calnexina para mostrar la falta de contaminación de retículo endoplásmico en la preparación mitocondrial. Extractos totales (últimas T) se usaron como un control positivo de la expresión de calnexina. Finalmente, fue explorada la asociación de Bad con algunos miembros de la familia Bcl-2. Se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación de proteínas citoplásmicas bajo condiciones de estimulación con o privación de IL-4 usando anticuerpos específicos. Bad fue detectado mediante western blot en inmunoprecipitados de anti-Bcl-XL de células estimuladas con IL-4 disminuyéndose durante el período analizado de inanición. La prueba de la membrana con anticuerpos anti-Bcl-XL mostró niveles similares en todas las condiciones analizadas.

La asociación de Bad con balsas en células estimuladas con IL-4 también se analizó en células intactas mediante microscopía confocal (figura 3A). Se incubaron células estimuladas por o privadas de IL-4 con la subunidad B de toxina de cólera (CTx-FITC) de marcador de balsa antes de etiquetar secundariamente con anticuerpo anti-BAd o anti-Lck. El análisis de inmunofluorescencia doble con anti-Bad y CTx-FITC mostró localización de balsa de Bad en la superficie de células estimuladas con IL-4. En marcado contraste, se observó una desorganización de balsas en células privadas de IL-4 y en consecuencia ninguna localización de balsas de Bad en células privadas de IL-4 (figura 3A). Se usó doble análisis de inmunofluorescencia con anti-Lck y CTx-FITC como un control positivo de localización de Lck en balsas de membrana de células estimuladas con IL-4. No se detectó Lck asociado con balsas en células privadas de IL-4 (figura 3A).

El perfil de co-localización de fluorescencia verde y roja se analizó usando el software de cuantificación de Leica (TCS NT; Leica, Rockleigh, NJ). Se observó un alto número de picos de co-localización verde y roja en la membrana de células estimuladas con IL-4 tinturadas con CTx-Lck o CTx-Bad. Al contrario, se redujo fuertemente el nivel de co-localización de fluorescencia verde y roja en células privadas de IL-4.

Este resultado sugiere que Bad se localiza preferentemente en balsas lipídicas en células estimuladas con IL-4 y segrega a partir de membrana de plasma en células privadas de IL-4.

Se observaron resultados similares de co-localización de Bad con balsas lípidas usando timocitos de ratones recién aislados.

También se analizó la asociación de Bad con mitocondrias en células privadas de IL-4 en células intactas mediante microscopía confocal (figura 3B). El análisis de inmunofluorescencia doble con anticuerpos anti-Bad y anti-mitocondria muestra una asociación débil de Bad con mitocondria en células estimuladas con IL-4 mientras existe una alta fracción de Bad asociado con mitocondrias en células privadas de IL-4 (Fig 3B). Esta separación de Bad de las balsas se correlaciona con su translocación a mitocondrias en células privadas de IL-4, como se muestra por el fraccionamiento celular y microscopía confocal (figuras 2A y 2B).

El perfil de co-localización de fluorescencia verde y roja también se analizó usan software de cuantificación (Leica) y mostró picos de colocalización verde y roja en células estimuladas por IL-4 tinturadas con anti-Bad y antimitocondria Abs. El nivel de colocalización de ambas fluorescencias se incrementó fuertemente en células privadas de IL-4.

2.2 Asociación de Bad con balsas lípidas se requiere para prevención de apoptosis

El agotamiento de colesterol celular imparte la habilidad de asociación de proteínas ancladas en glicosil fosfatidilinositol (GPI) con balsas lipídicas. Para examinar si existe un requerimiento similar de colesterol para la asociación de Bad con balsas, se trataron células estimuladas con IL-4 por 30 minutos con o sin 10 mM de metil-\beta-ciclodextrina (M-\beta-CD) en medio libre de suero para agotar colesterol celular. Las células se incubaron luego con CTx-FITC y etiquetadas con anticuerpos anti-bad o anti-Lck. El agotamiento de suero solo desbarata o rompe débilmente la asociación de Lck o Bad con balsas lipídicas (figura 4A). Sin embargo, el tratamiento de M-\beta-CD causa un severo desbaratamiento de formación de balsa y asociación de Lck y Bad con balsas en células estimuladas con IL-4 (figura 4A). Este resultado indica que el desbaratamiento de formación de balsa por el agotamiento de colesterol induce segregación de Bad y Lck de balsas en células en células estimuladas con IL-4.

Dado que la exclusión de Bad de las balsas también fue observada en células apoptóticas privadas de IL-4 (figura 3A), se analizó si la asociación de Bad con balsas y su integridad era necesaria para prevención de apoptosis. Para este propósito, las células estimuladas con IL-4 se trataron por 30 minutos con o sin M-\beta-Cd en un medio libre de suero, luego se lavaron, se resuspendieron en medio completo suplementado con IL-4 y se analizaron para inducción de apoptosis en diferentes momentos (figura 4B). Las células tratadas con M-\beta-CD mostraron un nivel más fuerte de apoptosis comparadas con células de control no tratadas, alcanzando el nivel más alto 5 horas después del tratamiento con M-b-CD. A ocho horas del tratamiento, las cantidades de células apoptóticas detectadas en células tratadas y no tratadas eran similares debido a la adición de suero restaura la composición lipídica de la membrana.

Este resultado sugiere que la segregación de Bad de las balsas está involucrada en la inducción de apoptosis. Fueron además analizadas modificaciones post-translacionales de Bad tales como fosforilación y su rol en la localización de Bad en balsas o mitocondrias. La figura 5A muestra que IL-4 induce fosforilación de serina 136 de Bad, pero no serina 112 y 155. Por otra parte, la privación de IL-4 induce a defosforilación de serina 136 de Bad. Dado que IL-4 induce fosforilación de serina 136 de Bad, fue re-ensayado el western blot de la figura 2A con anticuerpo anti-bad de serina 136. La figura 5B muestra que mientras la mayor parte de Bad se localiza en balsas en células estimuladas con IL-4, sólo la fracción citosólica débil de Bad es serina 136 fosforilatada. En células privadas de IL-4 se observan vestigios o trazas de fosforilación de serina 136 en citosol y mitocondrias. Este resultado sugiere que Bad defosforilatado se secuestra en balsas y que la privación de IL-4 induce segregación y translocación o circulación a mitocondrias.

Localización subcelular de Bad permite descubrir cómo la función de Bad se puede regular mediante interacción dinámica con balsas lipídicas o mitocondrias. La distribución y función distintas de Bad se relaciona directamente con la estimulación con o privación de IL-4 de las células.

Estos datos muestran que la proteína 14-3-3 no controla el rol pro-apoptótico de Bad, contrario a los reportes previos. Con bases en este resultado, se analizó la distribución subcelular de Bad en células estimuladas con, o privadas de, IL-4. Estos resultados muestran que se pueden separar diferentes fracciones de membrana de plasma usando ultracentrifugación por gradiente de fraccionamiento subcelular con sacarosa debido a que los marcadores de balsa se resolvieron con éxito de los marcadores de no balsas. Balsas y mitocondrias se aislaron también por gradiente de flotación de Triton X-100 y centrifugaciones diferenciales, respectivamente. Existen precedentes para asociación de balsa reversible como se ha mostrado siguiendo el movimiento de moléculas lipídicas de fluorescencia simple (Schutz et al., 2000, EMBO J. 19, 892-901). Adicionalmente, después de activación mediante enlazamiento de ligando, el factor de crecimiento epidermal migra fuera de las balsas hacia la membrana de plasma en masa (Mineo et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 30636-30643). La asociación de proteínas con balsas lipídicas se puede modular porque algunas proteínas se pueden excluir de balsas mediante asociación con otras proteínas (Field et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9201-9205). La asociación de Bad con balsas se puede involucrar en pasos que llevan a desactivación de Bad, porque las balsas no constituyen el sitio final de activación. La privación de IL-4 induce a segregación de Bad de las balsas. Este resultado sugiere un procesos apoptótico de dos pasos: primero, la segregación de Bad de las balsas, que dispara la apoptosis; y segundo, la desorganización de balsas lipídicas durante el proceso apoptótico. Esto se sugiere fuertemente por resultados que muestran que el desbaratamiento de balsas ricas en colesterol previene asociación de Bad e induce apoptosis en células tratadas con M-\beta-CD estimuladas con IL-4. La adición de suero de feto de ternera a un medio suplementado con IL-4 restaura los componentes lipídicos de la membrana de plasma, previniendo la progresión de apoptosis.

La localización de proteínas en distintas fracciones subcelular es un paso esencial en múltiples rutas de señalización, que incluye apoptosis. De acuerdo con esto, se ha mostrado que algunas moléculas señaladoras se secuestran en balsas. El agotamiento de colesterol desbarata balsas lipídicas y modula la actividad de múltiples rutas señalizadotas en linfocitos T (Kabouridis et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30, 954-963). Estos resultados sugieren fuertemente que en la ausencia de asociación de Bad con la proteína 14-3-3, Bad se secuestra en balsas, evitando un rol pro-apoptótico y la asociación con sus pares. La segregación inducida por privación de Bad de IL-4 de las balsas se correlaciona con la translocación o circulación hacia mitocondrias y la inducción de apoptosis. La restricción de interacciones intermoleculares mediante secuestro en balsas lipídicas se ha descrito para la cadena a de ka IL-2R, evitando su asociación con las cadenas b y g de la IL-2R (Marmor, M; and M. Julius, 2001, Blood 98:_1489). Es interesante notar que en las células estimuladas con IL-4, la mayor parte de Bad celular se localiza en balsas en una condición defosforilatada mientras que la fracción citosólica débil es serina 136 fosforilatada. Estos resultados muestran por primera vez el secuestro de una proteína pro-apoptótica hacia las balsas lipídicas como un mecanismo que controla la disponibilidad de dicha proteína pro-apoptótica.

Claims (38)

1. Un método de tamizar polipéptidos celulares por actividad pro-apoptótica o anti-apoptótica en una célula de un tipo particular de célula; dicho método comprende

a. cultivar células de dicho tipo particular de célula bajo condiciones no apoptóticas y cultivar células de dicho tipo particular de células bajo condiciones apoptóticas; y

b. determinar la localización subcelular de dichos polipéptidos celulares en las celdas cultivadas;

en el cual una localización de un polipéptido celular en balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones no apoptóticas y una segregación de dicho polipéptido celular de balsas lipídicas en células cultivadas bajo condiciones apoptóticas es indicativa de que dicho polipéptido celular tiene una actividad pro-apoptótica o una anti-apoptótica en dicho tipo particular de célula.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual dichos polipéptidos celulares tamizados pertenecen a la familia Bcl-2 y su localización subcelular se determina por el uso de una molécula que reconoce específicamente un dominio BH.

3. El método de la reivindicación 2 en el cual dichos polipéptidos celulares tamizados se aíslan de balsas lipídicas aisladas bioquímicamente de dichas células cultivadas en condiciones no apoptóticas mediante el uso de una molécula que reconoce específicamente un dominio BH.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el cual dichos polipéptidos celulares tamizados se aíslan además mediante el uso de una molécula que reconoce específicamente un polipéptido miristoilado.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, en el cual dicho tipo de células se caracteriza por la producción de proteína Bad (tipo de célula Bad+), se compone preferentemente de células del sistema inmune y más preferentemente de líneas de células T.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual dichos polipéptidos celulares tamizados se aíslan de balsas lipídicas aisladas bioquímicamente de dichas células cultivadas en condiciones no apoptóticas y se seleccionan entre los polipéptidos celulares que interactúan físicamente con la proteína Bad.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el cual dicho dominio BH es el dominio BH4.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el cual dicho dominio BH es el dominio BH3.

9. Un método de tamizar compuestos por su capacidad de modular apoptosis en células que producen polipéptidos pro- o anti-apoptóticos que se localizan en balsas lipídicas cuando dichas células se cultivan en condiciones no apoptóticas; dicho método comprende:

a. cultivar dichas células en un medio de crecimiento para mantener condiciones no apoptóticas;

b. contactar dichas células cultivadas con un compuesto candidato;

c. determinar el nivel de uno o varios polipéptidos pro- o anti-apoptóticas asociados con balsas lipídicas; y

d. seleccionar el compuesto que interfiere con la asociación de uno o varios polipéptidos pro- o anti-apoptóticos con balsas lipídicas, teniendo dicho compuesto la capacidad de modular apoptosis.

10. Un método de tamizar compuestos por su capacidad de promover apoptosis en células, comprendiendo dicho método

a. cultivar células de mamífero en un medio de crecimiento para mantener condiciones no apoptóticas; en el cual dichas células producen una proteína pro-apoptótica que se localiza en balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas de dichas células.

b. contactar dichas células cultivadas con un compuesto candidato; y

c. determinar la ausencia o la presencia de balsas lipídicas en dichas células cultivadas;

d. en caso de presencia de balsas lipídicas, determinar opcionalmente el nivel de proteína pro-apoptótica localizada en las balsas lipídicas, en el cual la ausencia de balsas lipídicas en la membrana de plasma de células incubadas con dicho compuesto candidato o, si se determina, el nivel reducido de proteína pro-apoptótica en las balsas es indicativa de que dicho compuesto promueve apoptosis.

11. Un método de tamizar compuestos por su capacidad de inhibir o prevenir apoptosis de células, comprendiendo dicho método

a. cultivar células en un medio de crecimiento para mantener condiciones no apoptóticas; donde dichas células producen una proteína pro-apoptótica que se localiza en balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas;

b. contactar dichas células con un compuesto candidato;

c. cultivar células en condiciones apoptóticas;

d. determinar la ausencia o la presencia de balsas lipídicas;

e. en el caso de presencia de balsas lipídicas, determinar opcionalmente el nivel de proteína pro-apoptótica localizada en las balsas lipídicas; donde la presencia de balsas lipídicas en las membranas de plasma de las células incubadas con dicho compuesto candidato y, opcionalmente, el nivel mantenido de proteína pro-apoptótica en las balsas son indicativos de que dicho compuesto candidato inhibe o previene apoptosis.

12. El método de acuerdo con las reivindicaciones 9, 10 u 11, en donde una proteína pro-apoptótica localizada en balsas lipídicas en condiciones de proliferación es la proteína Bad.

13. El método de la reivindicación 12, en el cual dichas células que producen una proteína Bad son células características del sistema inmune, preferiblemente células T.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el cual la presencia o la ausencia de balsas lipídicas se visualiza mediante microscopía confocal.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el cual la presencia o ausencia de balsas lipídicas se determina mediante los siguientes pasos

i) recuperar las células cultivadas incubadas con dicho compuesto candidato y resuspender dichas células en un búfer apropiado para fraccionamiento subcelular, tal como búfer de sacarosa con gradiente;

ii) ultracentrifugar las células fraccionadas, y

iii) recuperar la fracción subcelular que debe contener balsas lipídicas;

iv) determinar si la fracción subcelular recuperada contiene gangliosido y/o molécula(s) asociada(s) con balsa lipídica.

16. El método de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15, en el cual la presencia o la ausencia de balsas lipídicas se determina mediante el uso de un marcador que reconoce específicamente gangliosido o una molécula asociada con balsa.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual dicho marcador se selecciona entre la subunidad B de la toxina de cólera (CTx), anticuerpo anti-Bad o anticuerpo anti-Lck.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el cual dichas células son células de mamíferos.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual dichas condiciones no apoptóticas son condiciones de proliferación.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 ó 15 a 18 y 19, en el cual dicho medio de crecimiento comprende por lo menos una citoquina o un factor de crecimiento necesario para mantener condiciones de crecimiento de proliferación.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11, 17 o 20, en el cual las condiciones apoptóticas del paso c) se obtienen privando a las células de dicha citoquina o factor de crecimiento.

22. El método de la reivindicación 20, en el cual una citoquina o factor de crecimiento necesario para mantener condiciones de crecimiento de proliferación es una interleuquina, seleccionada preferentemente entre IL-4, IL-2 o IL-9 o una mezcla de las mismas.

23. Un uso de un compuesto capaz de reconstituir balsas lipídicas en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inducidos por, o asociados con, una regulación defectuosa de muerte celular que da lugar a un incremento anormal de muerte celular o de una patología específica en la que la muerte celular puede ser por lo menos una parte de la terapia.

24. El uso de la reivindicación 23, en el cual dicha regulación defectuosa afecta células que producen proteína Bad.

25. El uso de la reivindicación 24, en el cual dicha regulación defectuosa afecta células del sistema inmune.

26. El uso de la reivindicación 23, en el cual una patología que da lugar a un incremento anormal de muerte celular es una enfermedad asociada con la senectud, enfermedad neurodegenerativa Alzheimer, SIDA, muerte celular isquémica o curación de heridas.

27. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 23 y 26, en el cual un compuesto capaz de reconstituir balsas lipídicas es edelfosina.

28. Un método in vitro para la detección de una regulación defectuosa de apoptosis, en una muestra de células de un individuo, comprendiendo dicho método determinar la presencia o la ausencia de balsas lipídicas en dichas células, donde la ausencia de dichas balsas lipídicas es indicativa de una regulación defectuosa de apoptosis.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el cual dichas células son células del sistema inmune de un individuo afectado por una enfermedad linfoproliferativa.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29, en el cual la presencia o ausencia de balsas lipídicas se determina detectando la presencia o ausencia de una proteína pro-apoptótica o anti-apoptótica que se conoce está localizada en balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas de células.

31. El método de la reivindicación 30, en el cual se conoce que una proteína pro-apoptótica está localizada en balsas lipídicas en condiciones no apoptóticas es una proteína Bad.

32. Un uso de un compuesto apropiado para detectar la presencia de balsas lipídicas en el método de detección in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 hasta 31.

33. El uso de la reivindicación 32, en el cual un compuesto apropiado para detectar la presencia de balsas lipídicas es un compuesto que reconoce específicamente proteína Bad, proteína Lck o gangliosido GM1.

34. El uso de la reivindicación 33, en el cual dicho compuesto se selecciona entre la subunidad B de toxina de cólera (CTx), anticuerpo antiBad y anticuerpo anti-Lck.

35. Un uso de un compuesto capaza de modular una localización de balsas de proteína de la familia Bcl-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inducidos por, o asociados con, una regulación defectuosa de muerte celular o de cualquier patología específica en la cual la muerte celular puede ser por lo menos una parte de la terapia.

36. El uso de la reivindicación 35, en el cual dicho compuesto promueve segregación de una proteína de la familia Bcl-2 de balsas lipídicas.

37. El uso de la reivindicación 35, en el cual dicho compuesto promueve localización de una proteína de la familia Bcl-2 en balsas lipídicas.

38. Un método in vitro para la detección de una regulación defectuosa de apoptosis en una muestra de células de un individuo, comprendiendo dicho método determinar la presencia o la ausencia de balsas lipídicas en dichas células, en donde la presencia de un gran número de balsas lipídicas en comparación con células normales es indicativa de una regulación defectuosa de apoptosis.