CN101680886A - 筛选方法 - Google Patents
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Abstract
筛选降低细胞的细胞凋亡的分子的方法，包括：i)将候选分子与检测细胞组合；和ii)确定相对于对照在所述分子的存在下所述检测细胞的存活上的变化。在一种实施方式中，在步骤i)和ii)之前或之间将检测细胞用细胞凋亡诱导剂处理。在一种实施方式中，所述处理试剂降低Bcl－2蛋白家族促存活成员，例如Bcl－XL或Mcl1的水平和/或活性。在另一实施方式中，Bcl－2家族的至少一种促存活成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中降低。在某些实施方式中，这不依赖于候选分子或细胞凋亡促进剂的任何效应。通过降低在检测细胞中的一种或多种促存活Bcl－2蛋白家族成员的水平和/或活性，所述细胞尤其经受由Bak或Bax或Bak和Bax介导的细胞凋亡，除非其由候选分子援救。
Description
技术领域
1本发明涉及细胞凋亡和蛋白质的Bcl-2家族。具体地，本发明涉及筛选调控细胞存活和/或细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性的分子的方法。
背景技术
2本说明书中作者引用的出版物的参考书目集中于说明书的末尾。
3本说明书对任何之前出版物(或从其衍生的信息)，或任何已知的事物的引用，不是并且也不应该看作是之前出版物(或从其衍生的信息)，或公知常识的已知事物形式为本说明书所涉及到的努力方面的承认或供认或任何形式的暗示。
4多细胞有机体的存活依赖于各种细胞类型的正确和协调功能。发育的起始阶段，有机体的活力依赖于细胞在各种组织中的选择和分化。在后来的阶段，有机体的维持需要特定的细胞适应性。例如，血液细胞不断地从血液前体(hematologic precursor)更新。淋巴细胞或生殖细胞应答于即时需要显示快速的增殖。另一方面，神经细胞显示受限的更新能力，许多神经元在个体的一生中存活和持续。对于各种细胞类型，细胞数量的控制为细胞增殖和细胞死亡间平衡的结果。
5细胞死亡的一种过程为细胞凋亡。细胞凋亡，或程序化细胞死亡，为有机体处置受损的、不想要的或不需要的细胞的正常方法。然而有时，例如当有机体患病时，身体一种或更多细胞类型的细胞凋亡速率受影响。例如，导致过多或过少细胞自杀的细胞凋亡的异常调节，可能是人类中此类各种疾病例如癌症、AIDS、阿耳茨海默氏病和类风湿性关节炎的原因。
6在过去的20年里细胞凋亡的分子调节已被详细地表征，并且已经发现通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases))来实施。调节细胞凋亡的一种主要途径为Bcl-2蛋白家族途径，其在调节发育上的程序化和胁迫诱导的细胞死亡上发挥中心作用。该家族的一个亚类，包括蛋白质Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1，Al和Bcl-B，促进细胞存活。这些蛋白维持细胞的存活直到它们的活性通过直接结合促凋亡家族成员，例如蛋白Bim，Bad或Bid来降低或中和。促存活蛋白的该精密生化作用是有争议的，尽管它们可能控制第二类促凋亡家族成员(多结构域蛋白Bax和Bak)的作用。这些蛋白在可能通过破坏细胞内膜例如线粒体外膜来介导细胞凋亡上，发挥关键作用，从而参与促凋亡(pro-apoptogenic)因子例如细胞色素c释放入细胞质以促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，所述细胞色素c正常的被隔离在细胞器内。
7由于过量和受损的细胞凋亡表征许多疾病或不需要的状况，存在对于调控细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的分子的需要。
发明内容
8本说明书中的各实施方式加以必要的修正后适用于每一其它实施方式，除非另外指出。
9因此，在一个方面本发明提供筛选调节细胞的细胞凋亡的分子的方法，包括：
i)将所述分子与所述细胞组合(combining)；
ii)鉴定所述细胞的Bcl-2家族蛋白的调节；
其中Bcl-2家族蛋白的调节指示所述分子调节所述细胞的细胞凋亡。在优选的实施方式中，所述分子降低细胞凋亡。
10在另一方面本发明提供筛选调节细胞的Bcl-2家族蛋白的分子的方法，包括
i)将所述分子与所述细胞组合；
ii)鉴定所述细胞的细胞凋亡是否受调节；
其中所述细胞凋亡的调节指示所述分子调节Bcl-2家族蛋白。在优选的实施方式中，所述分子降低细胞凋亡。
11在又一方面，本发明提供筛选降低细胞的细胞凋亡的分子的方法，包括：
i)将候选分子与检测细胞组合；和
ii)确定相对于对照在所述分子的存在下所述检测细胞的存活上的变化。
12在某些实施方式中本发明的方法在步骤i)和ii)之前或之间还包括处理细胞以诱导细胞凋亡的步骤。所述细胞可以用降低Bcl-2蛋白家族的促存活(pro-survival)成员，例如Bcl-xL和/或Mcl-1的水平和/或活性的试剂来处理。在某些实施方式中所述细胞用降低或增强Bcl-2家族的促凋亡活(pro-apoptotic)成员，例如Bak和/或Bax的水平和/或活性的试剂来处理。
13在某些实施方式中，Bcl-2家族的至少一种促存活成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中降低。选自Bcl-xL，Bcl-2，Bcl-w，Mcl-1，Al和Bcl-B的Bcl-2家族的1至6个成员的水平和/或活性可以在步骤i)的细胞中降低。Bcl-xL和/或Mcl-1的水平和/或活性可以被降低。在某些实施方式中Bcl-2蛋白家族的至少一种促凋亡成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中降低，例如Bak和/或Bax的水平和/或活性可以降低。在某些实施方式中细胞凋亡诱导剂使用本领域已知的方法靶向Bcl-2家族成员的基因、RNA或蛋白质。
14在某些实施方式中Mcl-1和Bak的水平和/或活性降低。在其它实施方式中Mcl-1和Bax的水平和/或活性降低。在某些实施方式中Mcl-1和Bak的水平和/或活性增强。在其它实施方式中Mcl-1和Bax的水平和/或活性增强。这样，所述细胞可以用试剂遗传上改性或处理，由此至少一种促存活或促凋亡分子的水平和/或活性不依赖于候选分子或细胞凋亡诱导剂的作用被改性。在某些实施方式中，该步骤增强所述检测细胞的敏感性，以用于鉴定细胞存活剂(cell survivalagent)。
15在某些实施方式中，所述分子为激动剂。在其它实施方式中所述分子为拮抗剂。在某些实施方式中，所述分子为Bak或Bax，或Bak以及Bax的拮抗剂。
16在某些实施方式中细胞凋亡增加。在其它实施方式中细胞凋亡降低。
17在某些实施方式中所述方法发生于体外。在其它实施方式中所述方法发生于体内。
18在某些实施方式中，所述细胞为成纤维细胞、髓样细胞或淋巴样细胞。
19在某些实施方式中，所述方法包括筛选增强哺乳动物细胞的存活、寿命或活力(viability)的分子。在示例性的实施方式中所述方法包括：(i)将所述分子与细胞组合；(ii)使所述细胞与在所述细胞中拮抗促存活的Bcl-2家族分子和诱导细胞凋亡的一种或多种试剂接触；(iii)确定相对于对照在所述分子的存在下细胞的存活(活力、寿命、半衰期)上的变化；和(iv)选择增强细胞存活(活力、半衰期)的分子。在某些实施方式中，所述方法还包括将来自(iv)的所选分子与靶哺乳动物细胞组合，来确定相对于对照在所述分子的存在下所述细胞的细胞存活(活力、半衰期)上的变化。
20为了促进筛选，在某些实施方式中，将细胞例如通过降低一种或多种促存活Bcl-2家族成员的水平或活性来改性以增强其对细胞凋亡诱导剂的敏感性。在其它实施方式中，将细胞通过基因阻断来改性以缺乏一种或多种促存活Bcl-2家族成员。在示例性的实施方式中，所述细胞为来自多细胞生物的Mcl-1缺陷细胞，所述试剂为Bcl-xL拮抗剂。在又一实施方式中，所述方法包括鉴定细胞中Bcl-2家族蛋白的调节。
21在另一实施方式中，细胞检测用于鉴定保持血小板活力的化合物。
22该主题方法包括在要测试的化合物存在下使对细胞凋亡诱导剂敏感的细胞孵育，然后使所述细胞与细胞凋亡诱导剂接触，并确定未经受细胞凋亡的活细胞的存在。在某些实施方式中，所述细胞对Bcl-2家族的一个或多个成员(包括，例如Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1和Al)的拮抗剂敏感，所述拮抗剂例如BH3结构域模拟试剂(BH3 domainmimicking agents)。在其它实施方式中，所述细胞对Bcl-xL或Mcl-1拮抗剂敏感。在另一实施方式中所述Bcl-xL拮抗剂为ABT-737。
23在某些实施方式中，所述细胞为成纤维细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角质形成细胞、间皮细胞、生殖细胞、肌细胞或成纤维细胞例如鼠胚成纤维细胞(MEFs)。在某些实施方式中，哺乳动物细胞为髓样细胞、淋巴样细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞或祖细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角质形成细胞、黑素细胞、间皮细胞、生殖细胞、肌细胞、成纤维细胞、转化和细胞、癌细胞。
24在优选的实施方式中，所述细胞为其中Mcl-1或Bcl-xL的水平或活性部分或全部下调的，通过本领域已知方法产生的细胞。在某些实施方式中，Mcl-1或Bcl-xL水平使用化学、遗传或基因沉默(RNAi)方法下调。例如，Mcl-1水平可以使用CDK抑制剂(例如R-roscovitine)或蛋白质合成抑制剂(例如环己酰胺)。遗传策略包括形成功能等位基因的损失，其通过全部或部分基因的缺失或通过将外源DNA插入基因或通过来自外源启动子的转基因的表达导致。还可以使用条件突变技术。基因沉默提供用于抑制基因功能的方便方法。Mcl-1反义寡核苷酸描述于例如国际公开No.WO 2006/099667，在此将其全文引入。Bcl-xL水平或活性使用ABT-737或等效的BH3结构域模拟试剂方便地降低。
25这样，在某些实施方式中，本发明提供鉴定维持细胞活力的化合物的方法，包括使在要测试的化合物存在下孵育对Bcl-xL或Mcl-1拮抗剂敏感的细胞，然后使所述细胞与Bcl-xL或Mcl-1拮抗剂接触，并确定指示该化合物能够阻断Bcl-xL或Mcl-1拮抗剂-诱导细胞死亡和保持细胞活力的活细胞的存在。本发明的一个实施方式描述于实施例2。在另一实施方式中，Bcl-xL拮抗剂为ABT-737或其类似物。在某些实施方式中，对Bcl-xL拮抗剂敏感的细胞是Mcl-1缺陷的。在其它实施方式中，对Mcl-1拮抗剂敏感的细胞是Bcl-xL缺陷的。然后测试通过起始筛选鉴定的化合物来确定它们作用于哪种目标。例如，在Mcl-1空、Bax-空的细胞和Mcl-1空、Bak-空的细胞中测试化合物以确定化合物通过Bax或Bak，或其它促凋亡分子或另外的下游目标起作用。如果需要，然后以此方式测试进一步的下游目标。
26因此，在某些实施方式中，该主题方法包括将所述分子与在一种或多种Bcl-2家族成员上缺陷的细胞组合，所述Bcl-2家族成员选自Bcl-xL，Bcl-2，Bcl-w，Mcl-1，Al(Bfl-1)，Bcl-B，Bak，Bax，Bok(Mtd)，Bad，Bid，Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，Puma，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。
27在某些实施方式中，该方法还包括将所述分子与细胞组合，并确定相对于对照在所述分子的存在下所述细胞的存活上的变化。在优选的实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在示例性的实施方式中，所述细胞选自髓样细胞、淋巴样细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞或祖细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角质形成细胞、黑素细胞、间皮细胞、生殖细胞、肌细胞、成纤维细胞、转化的细胞和癌细胞。在另一实施方式中，哺乳动物细胞为在细胞凋亡介导的疾病或状况中遭受增强的细胞凋亡的细胞。
28在示例性但非限制性的实施方式中，抗细胞凋亡剂为在本文公开的细胞筛选中鉴定的试剂。本发明提供了本文鉴定的抗细胞凋亡分子在制备治疗特征在于削弱的或不想要的细胞凋亡的包括本文所示的疾病和状况的药物中的用途。在示例性但非限制性的实施方式中，该试剂选自图4中所示的皮质类固醇分子之一或包括图4中所示的通式结构。如本文所述，在实施例3和图4中，这些试剂在暴露到细胞凋亡诱导量的Bcl-xL拮抗剂下的哺乳动物细胞方面强烈地抑制杀死。
附图说明
29图1显示通过Bcl-2蛋白家族控制细胞存活的图。Bax和Bak为细胞凋亡的关键介质。在健康细胞中，它们被促存活Bcl-2蛋白，即Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1和Al限制。受损信号使促存活蛋白失活从而释放Bax和Bak引起细胞死亡。
30图2显示在成纤维细胞中细胞凋亡信号传导的图。(A)在野生型鼠胚成纤维细胞(MEFs)中，促凋亡Bak正常地被Bcl-xL和Mcl-1限制。用BH3模拟化合物ABT-737使Bcl-xL失活不引起细胞死亡，除非Mcl-1也失活。(B)在Mcl-1的组成性缺失的情况下MEFs将对ABT-737高度敏感。
31图3显示筛选策略。在Mcl-1-缺陷性细胞中，ABT-737有效地杀死。通过将此类细胞与多样性文库分子一起预孵育，就能够抑制ABT-737诱导的杀死的分子进行筛选。此类分子还可用于阻断ABT-737的作用或直接阻断细胞死亡介质，Bax和Bak的作用。
32图4为在受试的细胞筛选中就增强细胞活力、存活或寿命的试剂鉴定出的试剂的结构表示。
具体实施方式
33详细地描述本发明之前，将理解这不是将其限定到特定的示例性方法、制剂或组分，并当然可以变化。还理解本文所用的术语仅旨在描述本发明的具体实施方式，不旨在受限制，其将仅受附带的权利要求限制。
34本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在上文或是下文，将通过引用将其全文引入。然而，引用本文提及的出版物旨在描述和公开在出版物中报道并可能与本发明一同使用的策略和试剂。绝不是将其看作是本发明不早于借助于在先发明的此类公开的供认。
35此外，除非另外指出，本发明的实施使用传统的分子生物学、细胞生物学和细胞培养，本领域技能内的技术。此类技术对技术工作者而言是已知的，并在文献中充分地解释。参见，例如Sambrook et al.(eds)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press；1989；Hames et al.(eds)，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，1985；Gait(ed)，Oligonucleotide Synthesis，Oxford IRL Press，1984；Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th Edition，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，USA；Alberts et al.，Molecular Biology of the Cell，4th ed.，New York and London：Garland Science，c2002；Lodish et al.，Molecular Cell Biology″，4th ed.，New York：W.H.Freeman & Co.，c2000。
36必须指出，如在该说明书中所用，单数形式″a″，″an″和″the″包括复数方面，除非上下文明确地指出例外。这样，例如，提到″a分子″包括单个分子，以及两个或多个分子，提到″a细胞″包括单个细胞以及两个或多个细胞。″a蛋白质″包括单一蛋白，或两种或多种蛋白，等等。
37贯穿说明书，单词″包括(comprise)″及该单词的变体，例如″包括(comprising)″和″包括(comprises)″是指″包括但不限于″，并且不旨在排除其它添加物、组分、成分或步骤。″由......组成″是指包括并限制到短语″由......组成″后的所有事物。这样，短语″由......组成″表示所列要素是必需的或强制性的，并且不可以存在其它要素。″基本上由......组成″是指包括该短语后列举的每一要素，但限制到不影响或有助于所列举要素的描述中指出的活性或作用的其它要素。这样，短语″基本上由......组成″是指所列要素是必需的或强制性的，但是其它组分是任选的，并且依赖于它们影响所列要素的活性或作用可以存在或不存在。
38除非另外定义，本文所用所有科技术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。尽管所有与本文所述类似或等效的任何材料和方法可用于实施或测试本发明，现在描述优选的材料和方法。
39本发明基于以下发现：筛选调节细胞的细胞凋亡的分子可以鉴定调节蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性的分子。相反地，筛选调节蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性的分子可以鉴定调节细胞凋亡的分子。
40在某些实施方式中本发明涉及蛋白质的Bcl-2家族。Bcl-2为它们产生的哺乳动物基因和蛋白质的家族的原型。Bcl-2家族控制线粒体外膜渗透(MOMP)，并且可以是促凋亡(Bax，Bak和Bok等等)或促存活(包括Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-w)。Bcl-2家族中存在超过20种蛋白，将其分为三组。通常，组1成员为促存活的，而组2和3是促凋亡的。Bcl-2家族的成员共有四个同源性特征结构域的一个或多个，名称为Bcl-2同源(BH)结构域，命名为BH1，BH2，BH3和BH4。Bcl-2家族具有由被两性螺旋环绕的中心疏水性螺旋组成的通式结构。该家族的许多成员具有跨膜结构域。Bcl-2家族的作用位点大都位于线粒体外膜。线粒体内是如果释放则激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)的凋亡形成因子(apoptogenic factors)(细胞色素c，Smac/DIABLO，Omi)。依赖于其功能，一旦激活，Bcl-2蛋白促进这些因子的释放，或保持它们隐蔽于线粒体。Bcl-2调节MOMP的确切机理尚未阐明，但相信多结构域的促凋亡Bcl-2蛋白可以直接激活MOMP，这是个被抗凋亡Bcl-2蛋白的结合抑制的过程。相反，仅含BH3区域的促凋亡Bcl-2蛋白(BH3-only pro-apoptotic Bcl-2 protein)通过抗凋亡Bcl-2蛋白的结合间接激活MOMP，释放多结构域的促凋亡Bcl-2蛋白来激活MOMP。
41Bcl-2家族的促凋亡成员包括Bak，Bok(Mtd)，Bax，Bad，Bid，Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，Puma，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。促存活成员包括Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Bcl-w，Bcl-B和Al(在人类中为Bfl-1)。Bcl-2能够以Bcl-2α或Bcl-2β两种可选的剪切形式(他们的区别仅在于羧基末端的不同)出现。
42在某些实施方式中本发明涉及细胞凋亡。″细胞凋亡″，也被称为程序化细胞死亡，其是以有组织的方式导致细胞自杀的信号传导途径。几种因子和受体对细胞凋亡途径是特异的。最终结果是细胞收缩、在其表面产生气泡，以及其核酸遭受断裂。在多细胞生物中，细胞凋亡受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导，其通过裂解在细胞质和细胞核中的特定蛋白触发细胞死亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以失活前体或前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的形式存在于所有细胞，所述失活前体或前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶通常通过其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，产生蛋白裂解性的级联反应(caspase cascade)。
43在某些实施方式中细胞凋亡为Bak和/或Bax介导的。
44通过本发明方法筛选的分子可以为包括由化学键保持在一起的两个或更多原子的任何分子。该分子可为药物、小或大的化学分子、蛋白质(例如抗体)或其衍生物、包括改性肽例如限制性肽(constrained peptide)或折叠体(foldamer)的肽、脂质、碳水化合物、或核酸分子，包括反义或其它基因沉默分子、或其模拟物(mimetic)。该分子可为天然发生或非天然发生的分子，并且可以位于天然产生的文库、化学产生的文库、组合文库、噬菌体展示文库、或基于体外翻译的文库。
45当该分子为″药物″时，是指诱导所需的药理学效应的化学分子，并且包括活性剂本身以及活性剂的药学上可接受的和药学上活性的盐、酯、酰胺、前药、对应异构体、代谢物和类似物。
46当该分子为″小或大的化学分子″时，是指小或大的天然或合成源的有机或无机分子。″小分子″具有约500道尔顿以下的分子量。大分子具有500道尔顿以上的分子量。
47当该分子为″蛋白质″时，是指通过肽键连接的氨基酸的聚合物，其可由两条或多条肽链组成。术语″衍生物″包括具有一个或多个氨基酸残基被天然发生的20种标准氨基酸或其合成氨基酸同系物取代的蛋白质或肽。合成氨基酸同系物包括任何其它氨基酸残基的D-和L-型两种，无论在蛋白中发现、在天然或合成产生的中发现。此类同系物的实例包括4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4氨基丁酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。
48如本文所用，天然氨基酸残基为在蛋白质中通常发现的20种氨基酸残基(即丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸和缬氨酸)，并且包括此类氨基酸的D-和L-型两种。
49蛋白质可以为抗体，因为本领域已知特异结合蛋白质或肽的抗体可以充当蛋白质或肽的拮抗剂或激动剂。这样，与蛋白质的Bcl-2家族成员特异结合的抗体可以调节细胞凋亡。术语″抗体″以最广义使用，并且特别但不限制的包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们与蛋白质的Bcl-2家族成员特异性结合。一些抗体具有细胞内传递的能力，例如软骨鱼衍生的抗体。这些描述于例如国际专利申请No.WO 2005/118629。
50与特定蛋白或肽或在特定蛋白或肽上的表位″特异性结合″或″对其特异″的抗体是指与该特定蛋白、肽、或在特定蛋白或肽上的表位结合，而基本上不与任何其它蛋白、肽或表位结合的抗体。
51当该分子为″脂质″时，是指任何组的脂肪或脂肪类化合物，包括甾醇类、脂肪酸和许多其它物质、蜡、磷脂、脑苷脂，相关和衍生的化合物。
52当该分子为″碳水化合物″时，是指由其上连接有规定比(2∶1)的氢和氧原子的成链或成环的碳原子组成的有机化合物。碳水化合物从包含3至7个碳原子的简单糖至非常复杂的聚合物而变化。
53当该分子为″核酸分子″时，是指双链或单链核酸分子，包括例如以下的核酸分子：正义和反义DNA(gDNA，cDNA)、RNA(正义RNA，反义RNA，mRNA，tRNA，rRNA，小干扰RNAs(siRNAs)、微RNAs(miRNAs)、核仁小分子RNAs(snRNAs)、核酶、适配子、DNA酶，或其它核糖核酸酶型复合物。
54反义核酸分子已经显示为基因或其相关的基因产物功能的有效和特异的抑制剂。这样，反义分子可以调节细胞中蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性。反义分子具有与另一核酸分子(例如编码Bcl-2蛋白家族成员的核酸分子)的序列互补的序列。
55还涉及适配子。DNA和RNA适配子可以在各种应用中取代单克隆抗体。它们为通过除了经典的Watson-Crick碱基配对之外的相互作用，对非核酸或核酸分子具有特异结合亲和性的核酸分子。适配子描述于例如美国专利Nos.5475096，5270163，5589332，5589332和5741679。
56当该分子为″模拟物″时，其包括碳水化合物、核酸或蛋白质或肽模拟物，并且旨在指具有允许该物质充当功能类似物的构型特征的物质。肽模拟物可以为包含模拟蛋白质二级结构的要素的分子的肽(Johnson et al.，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology andPharmacy，Pezzuto et al.，eds Chapman and Hall，New York，1993)。肽模拟物可以通过筛选随机肽文库例如用于模拟Bcl-2多肽的功能活性的肽分子的噬菌体展示或组合文库来鉴定。作为选择，可以使用模拟设计、合成和测试。通过蛋白质的碳水化合物和脂质的识别在许多生物系统是重要的事件，基于能够干扰特异的识别过程的碳水化合物和/或脂质模拟物的化学治疗开发是快速发展的新兴领域。核酸模拟物包括例如包含N3′--P5′氨基磷酸酯核苷酸间键合的RNA类似物，其取代天然发生的RNA O3′--P5′磷酸二酯。酶模拟物包括催化性的抗体或其编码序列，其可以也是人源化的。
57通过本发明鉴定的分子可以调节细胞凋亡。如本文所用术语″调节″是指改变或调整。这样细胞的细胞凋亡速率可以改变或调整。细胞凋亡的速率可以增加或降低。即，细胞的寿命可以增大或减少。作为选择或另外，蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性可以受调节，并且可以增加或降低。即，Bcl-2家族成员的水平和/或活性可以增大或减少。
58该分子可以直接或间接调节细胞凋亡和/或Bcl-2家族成员的水平和/或活性。例如，该分子可以与Bcl-2蛋白家族的成员结合。作为选择，该分子可以与另一分子结合，所述另一分子反过来与Bcl-2蛋白家族的成员结合。例如，该分子可以通过与ABT-737结合间接调节细胞凋亡和/或Bcl-2蛋白家族成员的水平和/或活性。小分子ABT-737为拮抗促存活Bcl-xL的BH3模拟药物。其选择性地靶向Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-w，但不靶向其它促存活蛋白Mcl-1或Al。作为选择，该分子可以通过与来自Bcl-2蛋白家族的另一下游分子，例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶结合来调节细胞凋亡。
59该分子可为Bcl-2蛋白家族成员的激动剂或拮抗剂。如本文所用术语″激动剂″是指提高不同分子的活性的分子。术语″拮抗剂″是指抵制另一分子作用的分子。这样，该分子可以上调或下调细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性。
60通过本发明方法鉴定出的分子可以通常在保持或维持细胞活力、特别是哺乳动物细胞活力，例如在治疗或预防细胞凋亡介导的疾病或不想要的状况上具有用途，所述细胞凋亡介导的疾病或不想要的状况包括血细胞减少症、炎性疾病、自体免疫疾病、破坏性骨障碍(destructive bone disorder)、增殖障碍、感染疾病、变性疾病、与细胞死亡有关的疾病、食用酒精过量摄入疾病(excess dietaryalcohol intake disease)、病毒介导的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨关节炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、葛瑞夫茲氏病(Grave′s disease)、自体免疫性胃炎、糖尿病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性中性粒细胞减少、血小板减少症、慢性活动性肝炎、重症肌无力、发炎性肠道疾病、克罗恩氏病、牛皮癣、特应性皮炎、疤痕、移植物抗宿主病、器官移植排斥、骨质疏松症、白血病和相关疾病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤相关骨疾病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、转移性黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、出血性休克、败血症、败血性休克、灼伤、志贺氏菌病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿病(Huntington′s disease)、朊病毒疾病、脑缺血、癫痫症、心肌病、局部缺血、急性和慢性心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、动脉硬化症、冠状动脉旁路移植、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、HIV-相关脑炎、老化、秃头症、中风引起的神经损伤、溃疡性结肠炎、外伤性脑损伤、脊髓损伤、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其它形式的病毒性肝炎、药物(例如扑热息痛)诱导的肝疾病、黄热病、登革热、日本脑炎、肝疾病、酒精性肝炎、肾病、多囊肾疾病、幽门螺杆菌相关的胃和十二指肠溃疡疾病、HIV感染、肺结核、脑膜炎、以及与冠状动脉旁路移植相关的治疗并发症。本发明的一种实施方式涉及其中测试的细胞为哺乳动物细胞受试者的方法，以增强细胞凋亡介导的疾病例如上文所述的那些中的细胞凋亡。
61更具体地，通过本发明方法鉴定出的分子可以用于保持器官活力，例如肾、心脏瓣膜、肺、肝、皮肤、角膜、静脉和其它血管、骨、腱和肌肉骨骼组织、胰脏、肠等。在某些实施方式中，如此鉴定的分子用于延长患者中或血库贮存中的血小板存活，以及治疗或预防心肌梗塞、再灌注损伤、栓塞性中风以最小化神经组织的损失，防止高剂量的化疗和全身辐射后的内脏毒性(粘膜炎)、肝炎和其它形式的肝衰竭、导致组织损失的炎性疾病例如类风湿性关节炎、贫血、中性粒细胞减少、由于生殖活力损失引起的不育、由于黑素细胞(用于头发着色的细胞)的损失引起的早熟。本发明的一个实施方式涉及其中测试的细胞为哺乳动物细胞受试者的方法，以增强细胞凋亡介导的疾病例如上文所述的那些中的细胞凋亡。
62用于鉴定蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性和/或细胞凋亡的调节的细胞，以及要处理或其寿命保持或增强的细胞，可以为包括Bcl-2蛋白家族的一种或多种成员的任何细胞，即多细胞生物的任何细胞。在优选的实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。该细胞可以来自任何多细胞生物，因为蛋白质Bcl-2家族成员或其同源物发现于例如线虫(C.elegans)、小鼠和人类的有机体中。这样，所述细胞可以来自人类或对于人类有经济重要性和/或社会重要性的哺乳动物，例如除了人类之外的肉食动物(例如猫和狗)、猪(swine)(猪(pigs)，肉猪(hogs)和野猪)、反刍动物(例如牛，公牛，羊，长颈鹿，鹿，山羊，野牛和骆驼)、马和鸟，包括濒危的、保持在动物园的各种鸟、和家禽，更具体地，驯养的家禽(fowl)例如家禽(poultry)，例如火鸡、小鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也有经济学重要性。该术语不表示特定的年龄。这样，来自成熟和新生有机体的细胞都包括。
63该细胞可以为具有细胞核的任何细胞，包括但不限于成纤维细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角质形成细胞、间皮细胞和肌细胞。作为选择，该细胞可以是无核的，即没有细胞核，因此没有DNA。无核细胞的实例为血小板(凝血细胞)。在某些实施方式中，所述细胞不是血小板细胞。
64在某些实施方式中，所述细胞在Bcl-2蛋白家族的一种或多种促存活成员上有缺陷。在其它实施方式中所述细胞在Bcl-2蛋白家族的一种或多种促凋亡成员上有缺陷。在某些实施方式中所述细胞为Mcl-1缺陷性细胞。
65在本文公开方法的某些实施方式中所用的″检测″细胞可为与用该方法鉴定出的分子治疗学上或预防学上处理的细胞相同的细胞或不同的细胞。细胞包括提到多种细胞，例如在组织或器官或其部分中发现的那些。在某些实施方式中，所述细胞为在细胞凋亡介导的疾病或状况中遭受增强的细胞凋亡的细胞，所述细胞凋亡介导的疾病或状况例如血细胞减少症、炎性疾病、自体免疫疾病、破坏性骨障碍、增殖障碍、感染疾病、变性疾病、与细胞死亡有关的疾病、食用酒精过量摄入疾病、病毒介导的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨关节炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、葛瑞夫茲氏病(Grave′sdisease)、自体免疫性胃炎、糖尿病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性中性粒细胞减少、血小板减少症、慢性活动性肝炎、重症肌无力、发炎性肠道疾病、克罗恩氏病、牛皮癣、特应性皮炎、疤痕、移植物抗宿主病、器官移植排斥、骨质疏松症、白血病和相关疾病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤相关骨疾病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、转移性黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、出血性休克、败血症、败血性休克、灼伤、志贺氏菌病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿病(Huntington′s disease)、朊病毒疾病、脑缺血、癫痫症、心肌病、局部缺血、急性和慢性心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、动脉硬化症、冠状动脉旁路移植、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、HIV-相关脑炎、老化、秃头症、中风引起的神经损伤、溃疡性结肠炎、外伤性脑损伤、脊髓损伤、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其它形式的病毒性肝炎、药物(例如扑热息痛)诱导的肝疾病、黄热病、登革热、日本脑炎、肝疾病、酒精性肝炎、肾病、多囊肾疾病、幽门螺杆菌相关的胃和十二指肠溃疡疾病、HIV感染、肺结核、脑膜炎、以及与冠状动脉旁路移植相关的治疗并发症。在这些疾病中受影响的细胞也在该方法中测试。
66在蛋白质上缺陷的细胞可以由本领域已知的方法产生。例如称为″基因阻断″的技术通过用突变的等位基因取代该基因来选择性地使另外正常细胞中的基因失活。已经开发出有力的方法用于实现在有机体例如酵母和小鼠的细胞中的基因阻断(也被称为基因敲除)。这些方法依赖于同源性重组的过程，其中序列相似性的区域交换DNA片段。″同源性重组″是指两个核酸分子在同源核酸序列的位点处的核酸区域的交换。插入细胞的外源DNA能够通过交换片段阻断任何与其具有至少部分同源性的基因。如果已知其核苷酸序列，可以靶向特定的基因。
67在某些实施方式中，外源DNA可以位于靶构建体。靶构建体为人工构建的基因材料的片段，其可转移到所选细胞。靶构建体可以与宿主细胞的基因组在增强或抑制(部分或全部地)特定基因的表达的位置处整合。
68靶构建体可以使用本领域已知的标准方法产生。例如，如Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2001；Ausubel(ed)，Current Protocols in MolecularBiology，5th Edition，John Wiley & Sons，Inc，NY，2002中所述。
69靶构建体的开发便于将其导入要用于本发明方法的细胞。用于将靶构建体导入宿主细胞的各种技术，无论体内或体外，在本领域是已知的，并且包括但不限于显微注射、病毒介导的转移和电穿孔。
70为了调节细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性，将所述分子与细胞在体外或在体内组合。所述分子与所述细胞的组合可以通过本领域已知的任何方法实现。在某些实施方式中所述细胞已经从有机体中分离，并且所述分子与所述细胞的组合发生于体外。在其它实施方式中，所述细胞尚未从有机体中分离，所述分子与所述细胞的组合发生于体内。所述分子可以与所述细胞直接组合，即直接应用于所述细胞。作为选择，所述分子可以与所述细胞间接组合，例如通过将所述分子注射入有机体的血流，然后其将所述分子运载到所述细胞。
71细胞检测可以用于鉴定调节细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性的分子。此类方法包括将在测试分子的存在下对细胞凋亡-诱导分子敏感的细胞孵育，确定未经历细胞凋亡的活细胞的存在。如果所述分子调节Bcl-2蛋白家族成员的水平和/或活性，这可以通过确定细胞是否经历细胞凋亡来鉴定。作为选择，如果所述分子调节所述细胞的细胞凋亡，这可以通过确定蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性来鉴定。
72已经设计许多不同方法来检测细胞凋亡，例如活细胞染料(vitalcellular dyes)(曙红，台盼蓝，Alamar Blue)、TUNEL(末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTPNick-End Labeling))分析、ISEL(原位末端标记)、用于在细胞群或在个体细胞中检测DNA片段化的DNA梯度分析、测定原生质质膜改变的膜联蛋白-V染色、细胞凋亡相关蛋白例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(通过测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性或激活)、Bcl-2家族蛋白、p53、Fas和FADD的检测。这些对本领域技术人员而言是已知的技术。
73类似地，本领域技术人员已知许多方法用于检测Bcl-2蛋白家族成员的水平和/或活性。例如，蛋白质可以通过例如色谱技术从细胞中纯化，并且与从未经过本发明方法的细胞中纯化的蛋白比较。
74在某些实施方式中，细胞凋亡诱导剂为化疗剂。在其它实施方式中，试剂为BH3模拟试剂，包括肽(参见例如，Cosulich et al，CurrentBiology，7：913-920，1997；Diaz et al，J.Biol.Chem.，272：11350-11355，1997；Holinger et al，J.Biol.Chem.，274：13298-13304，1999；Ottilie et al，Journal of BiologicalChemistry，272：30866-30872，1997；Schimmer et al.，Cell DeathDiffer.，8：725-733，2001；Shangary，Biochemistry，41：9485-9495，2002；Wang et al，Cancer Research，60：1498-1502，2000b)；限制性肽(参见例如，Walensky et al，Science，305：1466-1470，2004 &WO 2004/058804，通过参考将其全文引入)；折叠体(参见例如Sadowsky，J.Am.Chem.Soc，127(34)：11966-11968，2005)；小有机化合物例如：抗霉素A(例如Tzung et al，Nat.Cell.Biol.，3：183-191，2001)；BH3I(例如Degterev et al，Nat.Cell.Biol.，3：173-182，2001)；替曲卡星(Tetrocarcin)A(例如Nakashima etal，Cancer Research，60：1229-1235，2000)；多酚包括棉子酚(例如Kitada et al，J.Med.Chem.，46：4259-4264，2003)；阿朴棉子酚(例如Becattini，2004)；HA14-1(例如Wang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：7124-7129，2000a)；化合物6(例如Enyedyet al，J.Med.Chem.，44：4313-4324，2001)；ABT-737(例如Oltersdorf et al，Nature，435：677-681，2005)；三联苯类化合物(例如Yin，J.Am.Chem.Soc，127(15)：5463-5468，2005)；公开于WO 2006/002474充当α螺旋模拟物的苯甲酰脲(Benzoylurea)化合物，在此通过参考将其全文引入；和苯并噻唑衍生物，如例如公开于2006年4月6日提交的USSN 60/789982，在此通过参考将其全文引入。
75现在仅通过参考以下的非限制性实施例进一步描述本发明。然而应该理解，以下实施例仅是示例性的，不应该以任何方式看作是上述本发明的普遍性的限制。
实施例1
筛选细胞凋亡和/或蛋白质的Bcl-2家族成员的水平和/或活性的调节剂
76蛋白质的Bcl-2家族在确定细胞活或死上起重要作用。尽管关于该系统的某些具体方面存在争议，关键的细胞死亡介质Bax和Bak(图1)一直受促存活蛋白(Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1，Al)控制，直到它们的活性通常通过拮抗性的仅含BH3区域的蛋白(BH3-onlyprotein)，或在血小板的情况下通过降解和破坏Bcl-xL被损害(compromised)。在该情况下，Bax/Bak自由地起作用除非受促存活Bcl-2类蛋白限制。
77在一个实施方式中，如图2所示，选择或产生其中Bcl-xL对于Bak是关键控制的细胞。这样，就甚至当Bcl-xL失活时也抑制细胞死亡的那些筛选小分子。该情况使用缺乏Mcl-1的鼠胚成纤维细胞，Mcl-1为Bak的其它控制。在Mcl-1-空的细胞中，在Bak上唯一的制动(brake)是Bcl-xL，其可被充当Bcl-xL的有效抑制剂的化合物ABT-737废止。就能够阻断Mcl-1缺陷性鼠胚成纤维细胞(MEF)的ABT-737诱导的杀死而筛选化合物文库(图3)。
78在一非限制性实施例中，将Mcl-1-空的MEFs在平底96-孔板上铺平板。12-24h后，将文库化合物以0.1，1和10μM的终浓度加入，并孵育2h，然后添加ABT-737(100nM)或载体(ca rrier vehicle)。24h后使用Alamar Blue染料给细胞活力打分，并在4h读取。如以下表1所示，在不存在文库化合物或ABT-737下的细胞活力充当阳性对照。在无文库化合物和ABT-737存在下的细胞活力的缺失充当阴性对照。惰性化合物显示ABT-737不存在下的正常细胞活力。细胞毒性化合物显示存在文库化合物但不存在ABT-737下的降低的细胞活力。阳性命中(Positive hits)显示ABT-737和文库化合物存在下的细胞活力，而阴性化合物显示文库化合物和ABT-737存在下的降低的细胞活力。阳性命中在几种独立的细胞系和在培养物中的血小板上测试。在某些实施方式中，该化合物通过阻断细胞摄入ABT-737或抑制细胞中ABT-737的作用起作用。在其它实施方式中，该化合物通过直接抑制Bak，Bax，Bak和Bax，或间接抑制这些分子或细胞凋亡效应子分子起作用，所述细胞凋亡效应子分子在Bak或Bax的下游起作用。该方法还实施在改性的具有Bcl-2家族基因的小鼠上，所述Bcl-2家族基因改性以进一步使筛选敏感和检测各阳性试剂的分子目标。
实施例2
Mcl-1空的MEF细胞的检测
1.导入
79在Mcl-1(-/-)细胞中通过化合物ABT-737诱导细胞凋亡。该细胞可以通过通常的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂qVD-OPH从该效应中获救。该检测旨在发现与qVD-OPH具有可比较效应的其它化合物。
80Rinkenberger等(Genes and Development，14：23-27，2000)描述了Mcl-1缺陷性小鼠的产生。Opferman等(Nature，426：671-676，2003)描述了Mcl-1条件性敲除小鼠的产生，以及Opferman等(Science，307：1101-1104，2005)描述了它们的进一步特征。这里产生的小鼠类似地条件性靶向mcl-1基因，van Delft等(Cancer Cell，10：389-399，2006)和Lin等(Oncogene，26：3972-3979，2007)描述了Mcl-1缺陷的细胞如何对ABT-737非常敏感。Chen等(CancerResearch，67(2)：782-791，2007)显示Mcl-1-空的成纤维细胞对ABT-737，细胞筛选的基础非常敏感。
81总之，细胞在第1天分开以使它们在第2天具有60-80％的汇合(confluency)。在第2天，将细胞以确保它们在检测的第4天不汇合的密度接种到检测板。在转移到37℃之前将检测板在室温下孵育20-60分钟，以使边缘效应最小化。处出于同样的理由，在孵育器中检测板不在相互的顶部堆叠。在第三天将细胞首先用qVD或用WEHI文库化合物处理。在文库化合物的存在下将细胞孵育2小时，然后用ABT-737处理。在第4天，将细胞在CellTitre-BlueTMCell ViabilityAssay的存在下孵育4小时。该产物包含刃天青(resaruzin)，其由活细胞代谢成试卤灵(resorufin)。4小时后，测定试卤灵的水平。作为选择，在优选的实施方式中，细胞在CellTitre-GloTM Cell ViabilityAssay的存在下孵育4小时。该产物通过荧光素酶依赖性发光输出测定在细胞培养物中的ATP水平作为细胞活力的直接相关(directcorrelate)。
2.试剂、消耗品和仪器
82Mcl-1(-/-)鼠胚成纤维细胞(MEFs)生长于Iwaki 75cm2组织培养瓶(cat # 3123-075)中。MEFs生长于由以下构成的培养基中：
·89％DME Kelso
·10％热灭活的胎牛血清(FCS)(Hyclone cat # SH30396.03)
·1％10mM天冬酰胺(Fluka cat #11149)
·将275μl 1∶2000的2-巯基乙醇的稀释液添加到500ml终体积的培养基(Sigma cat #M7522；稀释于磷酸盐缓冲生理盐水)
83培养基贮存在4℃下，在37℃下使用。
84使用培养基、磷酸盐缓冲生理盐水和胰岛素(Sigma)培养和收获MEFs。所有试剂贮存在4℃下，在37℃下使用。
85对于检测，将细胞接种在仅包含1％FCS的培养基中。其由以下构成：
·98％DME
·10％热灭活的胎牛血清(FCS)(Hyclone cat #SH30396.03)
·1％10mM天冬酰胺(Fluka cat #11149)
·将275μl 1∶2000的2-巯基乙醇的稀释液添加到500ml终体积(Sigma cat #M7522；稀释于磷酸盐缓冲生理盐水)
86Assays在具有平的透明底部的Corning 384孔组织培养级黑色板(DKSH Australia P/L cat #3712)上接种(seeded out)。化合物在Matrical 384-孔50μl V型底部的板(cat #MP101-2-PP)上补充。使用来自Beckman Coulter的箔密封(foil seals)(cat #538619)来将化合物板密封过夜贮存。
87分析级DMSO用于化合物制备和滴定(Merck cat#1.02952.2500)。台盼蓝溶液(0.4％)用于细胞计数(Sigma T8154)。CellTitre-BlueTMCell Viability Assay源自Promega(cat #G8081)，在-20℃贮存，在37℃下使用。商业上获自Promega(cat #G7572)的CellTitre-GloTM，在-20℃贮存，在37℃下使用。qVD-OPH通用的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂用作阳性对照(MP Biomedicals cat.#OPH109)。
88Multidrop 384(ThermoLabsystems)用于将细胞接种检测板，添加CellTitre-BlueTM活力试剂至细胞。Zymark Sciclone ALH3000系统用于控制和化合物添加。Wallac EnVision板读出器(Perkin Elmer)用于测定λex535nm/λem590nm的荧光。
3.方法
3.1第一天-分开(splitting)
89将培养基吸除细胞，然后将它们用10mls温的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤。吸除该磷酸盐缓冲生理盐水，将2ml胰蛋白酶添加至瓶。将该瓶置于37℃下直到细胞解离。培养基(～6ml)用于将胰蛋白酶和细胞洗涤到瓶的底部。全部体积转移到50ml离心管，在250xg下离心3分钟。吸除上清液，使团(pellet)再悬浮于4ml包含10％FCS的培养基。将1毫升该细胞悬浮液添加到干净的包含19ml含有10％FCS的培养基的75cm2瓶，从而进行1∶4的分开。依赖于接下来几天检测所需的细胞数目，使剩下的细胞悬浮液在其它75cm2瓶中。
90用于第2天的检测板用条形码标记。
3.2第2天-接种检测板和制备对照板
91重复第1天的策略直到细胞成团时，吸除上清液。将团再悬浮于10mls 1％FCS培养基。使用800μl水、100μl细胞悬浮液和100μl台盼蓝溶液在1.5ml管中制备1∶10稀释液。将细胞旋转，然后使用血球计计数。计算在所需体积中需要达到2x104细胞ml-1(1000细胞每孔每50μl培养基)密度的稀释液，并且稀释在包含1％FCS的培养基中进行。
92Multidrop系统用于将细胞接种到检测板的所有384个孔。设立该系统以将50μl细胞悬浮液递送到各孔。使用无菌盒式头(cassettehead)，并且使用前将其用无菌蒸馏水彻底地冲洗。检测板置于室温下60分钟，然后在37℃/5％CO2下放置过夜。板是不堆叠的。
93将qVD-OPH和ABT-737板放置在基质化合物(Matrical compound)板中。qVD以12.5mM的原液浓度下使用(细胞中的终浓度25μM)。10μl该原液置于柱23和24的孔I-P。在所有剩下的孔中，分配10μl的DMSO。ABT-737以10mM的原液浓度下使用，并且在化合物板中以10μM使用(细胞中终浓度20nM)。这样进行1∶1000的稀释，然后将10μl分配入384孔基质板的所有孔，除了孔23A-D，24A-D，23I-L和24I-L。DMSO(10μl)分配到这16个孔。另外，将10μl该原液置于柱20，21和22的孔I-N。在所有剩下的孔中，分配10μl的DMSO。WEHI-0113992以10mM的原液浓度下使用，并且在化合物板中以5μM使用(细胞中终浓度10nM)。这样进行1∶1000的稀释，然后将10μl分配入384孔基质板的所有孔，除了孔C20，D20，E20，I20，J20，K20，C21，D21，E21，I21，J21，K21，C22，D22，E22，I22，J22，K22。DMSO(10μl)分配到这16个孔。将两块板用箔密封，在12℃下贮存过夜。
3.3第3天-处理细胞
941.将文库板从冷藏柜移出，使用前使其在室温下解冻30-60分钟。
952.设立Zymark系统。打开HEPA过滤单元，检查pintool(搅拌头)以确保其是干净和未加载的，用吸墨纸、乙醇和DMSO如下所示建立平台(deck)：
963.将qVD-OPH添加至细胞。为此，将PVD-OPH板置于平台(参见简图1)上，使板的Al角面向EnVision计算机位于的空间的角。使检测板置于FT(front Twister)的堆栈(stack)1中。
97在Zymark桌面PC上打开Clara Execution Manager。通过点击″Initialize″按钮将所有组分初始化。一旦初始化完成，从Applications Chain窗口移除所有旧应用，以指定的顺序添加以下应用(对于每一应用您需要输入运行的数目，即要处理的检测板的数目)：
1.Control Addition
2.Control Addition Restack
3.Pintool Unload
98一旦这些就位，并确定(Okayed)，出现Material Initialization屏幕，并且确定。然后引出Zymark Stack Storage系统窗口之一，访问configuration菜单。选择″New″，然后选择″Control Addition″并确定。再次访问configuration菜单，对于″Control AdditionRestack″程序重复该过程。
99一旦这完成，点击Clara上的″Run″按钮来开始运行。运行结束时在堆栈中剩下检测板，从Zymark平台中除去qVD-OPH板。
1004.然后开始文库化合物添加。化合物板置于BT(Back Twister)的堆栈1中，使Al面向MiniTrak。从Clara中的Applications Chain中移除旧应用，以以下顺序添加新应用，就各应用输入运行的数目：
1.Pintool Addition Corning
2.Pintool Unload
101一旦这完成，将其确定(Okayed)，检查和确定MaterialInitialization窗口。然后引出Zymark Stack Storage窗口之一，访问configuration菜单。选择″New″，然后选择″Pintool AdditionCorning″和确定。
102一旦这完成，点击Clara上的″Run″按钮来开始运行。
103运行结束时将检测板再次盖住，返回37℃/5％CO2 2小时的剩余时间(从向第一块检测板添加化合物开始计时-通常对于20板运行约30分钟)。将文库板再次盖住，返回冷冻贮存。
1047.2小时孵育结束时，进行ABT-737添加。将qVD板置于平台上，使板的Al角面向EnVision计算机位于的空间的角。使检测板置于FT(front Twister)的堆栈1中。
105在Zymark桌面PC上打开Clara Execution Manager。通过点击″Initialize″按钮将所有组分初始化。一旦初始化完成，从Applications Chain窗口移除所有旧应用，以指定的顺序添加以下应用(对于每一应用输入运行的数目，即要处理的检测板的数目)：
1.Control Addition
2.Control Addition Restack
3.Pintool Unload
106一旦这些就位，并确定(Okayed)，出现Material Initialization屏幕，并且确定。然后引出Zymark Stack Storage系统窗口之一，访问configuration菜单。选择″New″，然后选择″Control Addition″并确定。再次访问configuration菜单，对于″Control AdditionRestack″程序重复该过程。
107一旦这完成，点击Clara上的″Run″按钮来开始运行。运行结束时将检测板再次盖住，返回37℃/5％CO2，将ABT-737板从Zymark平台中移除。
1088.关闭HEPA过滤器，将DMSO和乙醇贮液器排空，洗涤，按照以下策略清洁Pintool(搅拌头)：
-浸入10x VP洗涤液，在VP洗涤液中静置5分钟；吸干(blot)
-浸入10x MQ水；吸干
-浸入10x 100％乙醇；吸干
3.4第4天-活力分析
109根据制造商说明书通过使CellTitre-GloTMSubstrate与CellTitre-GloTMBuffer重组来制备CellTitre-GloTM溶液，并在使用后将其贮存在-80℃下。将板从孵育器移除，使其在室温下平衡15分钟。使用Multidrop在使用MiniTrak每孔除去25μl细胞培养基后，将25μl稀释的CellTitre-GloTM添加到检测板各孔。在Envision上使用发光策略读数前，将板在板振荡器上混合15分钟。
110将CellTitre-BlueTM加热到37℃，然后使用Multidrop将10μl添加到检测板的各孔。加载到EnVision板读出器前使板返回37℃4小时。进行活力测定，然后将数据输入ACTIVITYbase(IDBS)用于分析。
111对于CellTitre-GloTM，使用以下公式计算抑制百分比：
x＝样品化合物处理后获得的CPS
μ-＝阴性对照获得的CPS(柱24)
μ+＝阳性对照获得的CPS(柱23)
112使用四参数逻辑拟合法(XLFit 4 eqn #205)，通过数据的非线性最小二乘拟合获得IC50值。
y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))。
113检测结果的质量通过确定各检测板的Z′因子来监测，其中对于结果Z′≥0.5认为是可靠的(robust)(Zhang et al.，J.Biomol.Screening，4：67-73，1999)
预期的EC50s
在1％FCS中：
ABT-737 EC50～0.004-0.008μM
114如果对于在1％FCS条件下生长的ABT-737-处理的Mcl(-/-)细胞，计算的EC50右移至＞0.04μM，丢弃MEFs，用低传代数的新解冻的细胞补充。
实施例3
在受试者筛选中鉴定皮质类固醇
115使用在实施例2中所述的策略筛选已知化合物的文库。初步分析的结果指示几种符合以下结构式的为皮质类固醇类的活性分子：
式1
A＝H或F，B＝H，CH3，F或OH
R＝H或C2-C6酰基
R1＝H，OH或OC2-C6酰基
R2＝H，Me或R1和R2形成二氧戊环
116具体地，这些试剂(参见图4)能够通过ABT-737显著地抑制Mcl-1空的MEF细胞的杀死。因此，这些试剂适于在增强或延长血小板活力、寿命或存活的本发明中使用。此外，该试剂在延长或保存细胞寿命的治疗干扰上找到广阔应用。
实施例4
用于测试新的抗细胞凋亡化合物的策略
杀死检测(NB：所有试验在10％FCS存在下完成)
死亡刺激物：ABT-737或依托泊甙(Etoposide)
对于所有粘附细胞(adherent cells)(例如mcl-1-/-MEFs)
117第1天 在500mL培养基(FMA)中接种(Plate out)12,000细胞/24孔。
118第2天 除去培养基。一式三份地添加WEHI抗细胞凋亡化合物(4倍连续稀释液-最高终浓度40mM每500mL)。孵育2小时。
向各孔添加50mL ABT-737至终浓度40nM或50mL依托泊甙至终浓度2mM。
孵育24小时。
119第3天 收获细胞，用在FACS缓冲液中5mg/mL的碘化丙啶染色。通过FACs分析-FLH-3通道确定细胞活力。
对于悬浮细胞(例如Jurkats，FDC-Pls)
120第1天 在100mL培养基(对于Jurkats为HT-RPMI；对于FDC-Pls为DME+10％FCS+IL3)中接种(Plate out)20,000细胞/96孔。
121第2天 一式三份地添加WEHI抗细胞凋亡化合物(4倍连续稀释液-最高终浓度40mM每100mL)。孵育2小时。
向各孔添加20mL依托泊甙，对于FDC-Pls至终浓度2mM，对于Jurkats至10mM。
孵育24小时。
122第3天 收获细胞，用在FACS缓冲液中5mg/mL的碘化丙啶染色。通过FACs分析-FLH-3通道确定细胞活力。
死亡刺激物：生长因子撤回
对于生长因子依赖性悬浮细胞(例如FDC-Pls)
123第1天 在100mL培养基(DME+10％FCS)中接种20,000细胞/96孔。接种前，首先用DME+10％FCS洗涤细胞2次以除去IL-3。
124第2天 一式三份地添加WEHI抗细胞凋亡化合物(4倍连续稀释液-最高终浓度40mM每100mL)。孵育2小时。
孵育24小时。
125第3天 收获细胞，用在FACS缓冲液中5mg/mL的碘化丙啶染色。通过FACs分析-FLH-3通道确定细胞活力。
126本领域技术人员将意识到除了具体描述的那些外本文描述的本发明容许变化和改进。应该理解本发明包括所有此类变化和改进。本发明还包括所有在说明书中参考或指出的步骤、特征、组合物和化合物，无论单独或全体，以及任何和所有任何两种或多种所述步骤或特征的组合。
表1
| ABT-737 | 文库化合物 | 细胞活力 | 注释 |
| - | - | ++ | ″阳性对照″ |
| + | - | - | ″阴性对照″ |
| - | + | ++ | 惰性化合物 |
| - | + | - | 细胞毒性化合物 |
| + | + | ++ | 阳性命中 |
| + | + | - | 阴性 |
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Claims (29)
1.筛选降低细胞的细胞凋亡的分子的方法，包括：
i)将候选分子与检测细胞组合；和
ii)鉴定所述检测细胞的Bcl-2家族蛋白的调节，
其中所述Bcl-2家族蛋白的调节指示所述分子调节所述细胞的细胞凋亡。
2.筛选调节细胞的Bcl-2家族蛋白的分子的方法，包括：
i)将候选分子与检测细胞组合；和
ii)鉴定所述检测细胞的细胞凋亡是否降低，
其中所述细胞凋亡的调节指示所述分子调节Bcl-2家族蛋白。
3.筛选降低细胞的细胞凋亡的分子的方法，包括：
i)将候选分子与检测细胞组合；和
ii)确定相对于对照在所述分子的存在下所述检测细胞的存活上的变化。
4.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，在步骤i)和ii)之前或之间还包括处理所述检测细胞以诱导细胞凋亡的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述处理使用降低Bcl-2蛋白家族促存活成员的水平和/或活性的试剂。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述处理使用降低Bcl-XL和/或Mcl-1的水平和/或活性的试剂。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述处理使用增强Bcl-2蛋白家族促凋亡成员的水平和/或活性的试剂。
8.根据权利要求4或权利要求7所述的方法，其中所述处理使用增强Bak或Bax或者Bak和Bax的水平和/或活性的试剂。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中Bcl-2家族的至少一种促存活成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中降低。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中选自Bcl-XL、Bcl-2，Bcl-w、Mcl-1、Al(Bfl-1)和Bcl-B的Bcl-2家族的1至6种成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中降低。
11.根据权利要求10所述的方法，其中Bcl-XL和/或Mcl-1的水平和/或活性降低。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中Bcl-2蛋白家族的至少一种促凋亡成员的水平和/或活性在步骤i)的细胞中增强。
13.根据权利要求12所述的方法，其中Bak或Bax或者Bak和Bax的水平和/或活性增强。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中Mcl-1和Bax的水平和/或活性在步骤i)的细胞中改变.
15.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中Mcl-1和Bak的水平和/或活性在步骤i)的细胞中改变。
16.根据权利要求9所述的方法，其中将所述检测细胞改性以增强其对细胞凋亡诱导剂的敏感性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中将所述细胞遗传上改性以降低Bcl-2家族的至少一种促存活成员的水平或活性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞为Mcl-1缺陷性细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述处理使用降低Bcl-XL的水平或活性的试剂。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述处理试剂为BH3结构域模拟试剂。
21.根据权利要求1至20任一项所述的方法，其中所述候选分子为激动剂。
22.根据权利要求1至20任一项所述的方法，其中所述候选分子为拮抗剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述分子为Bak或Bax或Bak和Bax的拮抗剂。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为小分子、抑制性RNA、抗体、适配子、肽、拟肽或限制性肽。
25.根据权利要求1、2或3所述的方法，还包括：
iii)将所述分子与在一种或多种Bcl-2家族成员上缺陷的细胞组合，所述Bcl-2家族成员选自Bcl-XL，Bcl-2，Bcl-w，Mcl-1，Al(Bfl-1)，Bcl-B，Bak，Bax，Bok(Mtd)，Bad，Bid，Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，Puma，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。
26.根据权利要求1至25任一项所述的方法，还包括：
iii)将所述分子与细胞组合，确定相对于对照在所述分子的存在下所述细胞的存活上的变化。
27.根据权利要求1至26任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为髓样细胞、淋巴样细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞或祖细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角质形成细胞、黑素细胞、间皮细胞、生殖细胞、肌细胞、成纤维细胞、转化的细胞、癌细胞。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为在细胞凋亡介导的疾病或状况中遭受增强的细胞凋亡的细胞。
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