ES2256729T3 - Metalocenos bifuncionalizados, utilizacion para el marcaje de moleculas biologicas. - Google Patents
Metalocenos bifuncionalizados, utilizacion para el marcaje de moleculas biologicas.Info
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Abstract
Metaloceno bifuncionalizado de la fórmula general (I): (I) en la cual, - Me, representa un metal de transición, elegido, de una forma preferente, entre Fe, Ru y Os, - Y y Z, idénticas, se eligen entre ¿(CH2)n-O-, ¿(CH2)-O¿[(CH2)2-O]p-, y ¿(CH2)q-CONH-(CH2)r-O-, ó bien, - Y, es ¿(CH2)s-NH-, y Z, es ¿(CH2)t-COO-, - n, es número entero, comprendido entre 3 y 6, - p, es número entero, comprendido entre 1 y 4, - q, es número entero, comprendido entre 0 y 2, - r, es número entero, comprendido entre 0 y 2, - s, es número entero, comprendido entre 2 y 5, - t, es número entero, comprendido entre 3 y 6, - R y R¿, representan átomos de hidrógeno, o son grupos protectores, utilizados en la síntesis de los oligonucleótidos y de los péptidos, en el bien entendido que, por lo menos una de las R ó R¿, es un grupo protector utilizado en la síntesis de los oligonucleótidos y de los péptidos y que, R y R¿, son tal y como de define abajo, a continuación: (i) cuando Z e Y, se eligen entre ¿(CH2)n-O-, ¿(CH2)-O¿[(CH2)2-O]p-, y ¿(CH2)q-CONH-(CH2)r-O-, entonces R y R¿, son grupos protectores utilizados en la síntesis de los oligonucleótidos y, R, es un grupo susceptible de poder dejar un grupo hidroxilo libre, después de la desprotección, de una forma proferente, un grupo fotolábil, el monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo, el acetilo, ó el trifluoroacetilo y, R¿, es un grupo fosforado, susceptible de poder reaccionar con un grupo hidroxilo libre, de una forma preferente, un grupo fosfodiéster, fosforamidita ó H-fosfonato, y (ii) cuando Y, es ¿(CH2)s-NH-, y Z, es ¿(CH2)t-COO-, entonces R, es un grupo protector utilizado en la síntesis de los péptidos y representa un grupo protector de las aminas, de una forma preferente, el 9-fluoreniloxicarbonilo, el tert.- butoxicarbonilo, o el benciloxicarbonilo y, R¿, representa un átomo de hidrógeno.
Description
Metalocenos bifuncionalizados, utilización para
el marcaje de moléculas biológicas.
La presente invención, se refiere al sector de
marcaje, especialmente, de moléculas biológicas de interés, tales
como los oligonucleótidos y los péptidos. De una forma más
particular, la invención, tiene por objeto nuevos metalocenos
bifuncionalizados, su procedimiento de obtención, su utilización
para el marcaje de oligonucleótidos o de péptidos, los
oligonucleótidos o péptidos de esta forma obtenidos, así como un
soporte para la síntesis soportada, funcionalizada mediante, por lo
menos, un metaloceno de la invención.
Los metalocenos, son conocidos, como marcadores
de oligonucleótidos, especialmente, para la detección de fragmentos
de ADN o de ARN.
Así, por ejemplo, la patente estadounidense US
6.211.356, describe la utilización de un metaloceno monofuncional,
el cual presenta la función fosforamidita, para conferir, después
del acoplamiento, una señal al ADN y/o al ARN, el cual será
entonces detectable, con la ayuda de un microscopio electrónico. La
adición del metaloceno al oligonucleótido, se efectúa de forma
manual, y únicamente, al final de la cadena.
El solicitante de la patente estadounidense US
6.232.062, describe conjugados de
oligonucleótido-ferroceno, como sondas
electroquímicas, para detectar una hibridación. Los citados
conjugados, se obtienen mediante la síntesis soportada, a partir de
una uridina modificada por un ferroceno, y utilizada como sintón.
Los dos sintones descritos, son una uridina
3'-fosforamidita, que tiene un ferroceno en la
posición 5, y una uridina 3'-fosforamidita, que
tiene un ferroceno en la posición 2'. La producción de
oligonucleótidos marcados por un ferroceno, con la ayuda de esta
técnica, tiene como inconveniente un coste elevado, debido al hecho
de la utilización de un nucleósido modificado por un ferroceno,
como sintón (monómero compatible con la síntesis), cuya elaboración
es compleja.
Se conocen, gracias a C. J. Yu et al. (J.
Org. Chem. 2001, 66, 2937 - 2942), fosforamiditas químicamente
modificadas, las cuales comportan un sustituyente de ferroceno, en
la posición 2' de la ribosa. Estas fosforamiditas, permiten el
sintetizar oligonucleótidos que comportan ferrocenos en diversas
posiciones, pero, las síntesis de estas fosforamiditas, recurren a
técnicas de síntesis, con protección y desprotección de funciones
aminas del heterociclo y de oras funciones OH libres y que
necesitan que se proceda en unas condiciones que permitan conservar
la selectividad de la sustitución.
Los documentos de solicitudes de patentes
internacionales WO 00/31 750 y WO 01/81 446, describen ferrocenos
bifuncionalizados, en calidad de sonda electrónicamente observable,
ferrocenos éstos que se injertan a un polipirrol, por una parte, y
a un oligonucleótido, por otra parte. El acoplamiento del ferroceno
al oligonucleótido, se realiza entre el éster activado
(N-hidroxiftalimida) del ferroceno, y la terminación
NH_{2} del oligonucleótido ya sintetizado. Este acoplamiento,
tiene por inconveniente, el hecho de que no es compatible con la
síntesis automatizada de los oligonucleótidos, y que, éste, carece
de selectividad (reacciones parásitas sobre las aminas de las
bases).
La síntesis soportada de conjugados de
metaloceno/oligonucléotido ó de metaloceno/péptido con los
metalocenos utilizados en el arte anterior de la técnica
especializada, es fastidioso, debido al hecho de que, éste,
necesita de un nucleótido modificado por un ferroceno, y, a
continuación, del sintón fosforamidita correspondiente. Además, el
acoplamiento de metaloceno sobre oligonucleótidos o péptidos, no es
siempre selectivo, de tal forma que, éste, no puede automatizarse
sobre las síntesis actuales existentes en el comercio.
El solicitante, ha descubierto ahora nuevos
metalocenos bifuncionalizados, los cuales permiten paliar los
inconvenientes debidos a los metalocenos correspondientes al arte de
la técnica anterior, los cuales, permiten, a saber:
- una síntesis automatizada de los conjugados de
metaloceno/oligunucleótido, o de metaloceno/péptido,
- un acoplamiento selectivo entre el metaloceno y
el oligonucleótido o el metaloceno y el péptido, y
- un mejoramiento de los costes de producción de
los citados conjugados, debido al hecho de que, el sintón
utilizado, es el metaloceno, como tal, y no en forma de nucleósido
modificado por un metaloceno.
- Así, de este modo, la presente invención, tiene
por objeto metalocenos de la fórmula (I):
en la
cual,
- Me, representa un metal de transición, elegido,
de una forma preferente, entre Fe, Ru y Os,
- Y y Z, idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
ó bien,
- Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-,
- n, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- p, es número entero, comprendido entre 1 y
4,
- q, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- r, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- s, es número entero, comprendido entre 2 y
5,
- t, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- R y R', representan átomos de hidrógeno, o son
grupos protectores, utilizados en la síntesis de los
oligonucleótidos y de los péptidos, y son tal y como de define
abajo, a continuación:
(i) cuando Z e Y, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p},
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
R, es un grupo susceptible de poder dejar un grupo hidroxilo libre,
después de la desprotección, de una forma proferente, un grupo
fotolábil, el monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el
tert.-butildimetilsililo, el acetilo, ó el trifluoroacetilo y, R',
es un grupo fosforado, susceptible de poder reaccionar con un grupo
hidroxilo libre, de una forma preferente, un grupo fosfodiéster,
fosforamidita ó H-fosfonato, y
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-, R, representa un
grupo protector de las aminas, de una forma preferente, el
9-fluoreniloxicarbonilo, el
tert.-butoxi-carbonilo, o el benciloxicarbonilo y,
R', representa un átomo de hidrógeno.
Otro objeto de la presente invención, consiste en
un procedimiento para la preparación de un metaloceno de la
invención, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende las
etapas siguientes:
(i) cuando, Z e Y, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
- una etapa de protección de unos de los grupos
hidroxilo de un compuesto de la fórmula general (II)
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
Me, es tal y como se ha definido precedentemente,
arriba,
Y' y Z', idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
-(CH_{2})_{2}-, y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-,
n, q y r, son tal y como se definen precedentemente, arriba y, p',
es un número entero comprendido entre 0 y 3,
mediante fijación de un grupo susceptible de
dejar un grupo hidroxilo libre, después de desprotección, elegido,
de una forma preferente, entre un grupo fotolábil, el
monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo,
el acetilo y el trifluoroacetilo, y
- una etapa de condensación, sobre el otro grupo
hidroxilo que se ha dejado libre, de un grupo fosforado,
susceptible de reaccionar con un grupo hidroxilo libre, elegido, de
una forma preferible, entre los grupos fosfodiéster, fosforamidita
y H-fosfonato; y
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-:
- una etapa de protección del grupo NH_{2}, de
un compuesto de fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
- Me, es tal y como se ha definido
precedentemente, arriba,
- Y'', es (CH_{2})_{s}- y
- Z'', es (CH_{2})_{t}-,
- s, y t, siendo tal y como se han definido
precedentemente, arriba,
mediante fijación de un grupo susceptible de
poder dejar una función amina libre, después de desprotección,
elegida, de una forma preferente, entre el
9-fluoreniloxicarbonilo, el tributoxicarbonilo y el
benciloxicarbonilo.
Otro objeto de la presente invención, consiste en
un procedimiento de marcaje:
- de un oligonucleótido, mediante un metaloceno
bifuncionalizado, de fórmula (I), en el cual, Y y Z, idénticas, se
eligen entre -(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
que comprende la sustitución de uno o varios sintones de
nucleótidos, mediante uno o varios de los citados metalocenos de
fórmula (I), en el ciclo de síntesis del citado oligonucleótido,
y
- de un péptido, mediante un metaloceno
bifuncionalizado de la fórmula (I), en la cual, Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-, que comprende la
sustitución de uno de varios sintones de aminoácidos, mediante uno
o varios metalocenos de la fórmula (I), en el ciclo se síntesis del
citado polipéptido,
así como los oligonucleótidos y los péptidos de
esta forma marcados.
Otro objeto de la presente invención, consiste en
un soporte de síntesis de oligonucleótidos, o de péptidos,
funcionalizados en la superficie, mediante, por lo menos, un
metaloceno de la fórmula (I), de la invención, respectivamente.
Antes de proceder a detallar la invención, se
definirán, a continuación, ciertos términos utilizados en la
descripción y en las reivindicaciones.
El término "oligonucleótido", designa un
encadenamiento de por lo menos 2 nucleótidos (desoxirribonucleótidos
o ribonucleótidos, o los dos), naturales o modificados,
susceptibles de poderse hibridar, en las condiciones apropiadas de
hibridación, con un oligonucleótido, por lo menos parcialmente
complementario. Por nucleósido, se entiende un compuesto orgánico,
consistente en una base purina o pirimidina, ligada a una osa
(ribosa o desoxirribosa). Por nucleótido, se entiende un compuesto
orgánico, consistente en una base purina o pirimidina, ligada a una
osa (ribosa o desoxirribosa), y a un grupo fosfato. Por nucleótido
modificado, se entiende, por ejemplo, un nucleótido que comporta
una base modificada y/o que comporta una modificación, al nivel del
enlace internucleotídico y/o al nivel del esqueleto. A título de
ejemplo de base modificada, se pueden citar la inosina, la
metil-5-desoxicitidina, la
dimetilamino-5-desoxiuridina, la
diamino-2,5-purina y la
bromo-5-deoxicitidina. Para
ilustrar un enlace internucleotídico modificado, se pueden mencionar
enlaces fosforotioato, N-alquilfosforoamidato,
alquil-fosfonato y alquilfosfotriéster. Los
alfa-oligonucleótidos, tales como los que se
describen en la solicitud de patente francesa
FR-A-2 607 507, y las PNA que hacen
el objeto del artículo de M. Eghom et al., J. Am. Chem. Soc.
(1992), 114, 1895 - 1897, son ejemplos de oligonucleótidos
constituidos por nucleótidos, cuyo esqueleto, se encuentra
modificado.
El término "péptido", significa,
principalmente, cualquier tipo de encadenamiento de por lo menos dos
aminoácidos, tales como las proteínas, los fragmentos de proteínas,
oligopéptidos que se han extraído, separado, aislado o sintetizado,
como un péptido obtenido mediante síntesis química, o mediante
expresión en un organismo recombinante. Se incluyen, también, todos
los péptidos, en la secuencia, de los cuales, uno o varios
aminoácidos de la serie 1, se encuentran reemplazados mediante uno
o varios aminoácidos de la serie D, y vice-versa;
todo péptido, en donde, por lo menos, uno de los enlaces
CO-NH, se reemplaza por una enlace
NH-CO, conservándose, la quiralidad de cada residuo
aminociclo, tanto si se encuentre implicado como si no se encuentra
implicado, en uno o varios de los citados enlaces
CO-NH, o bien invirtiéndose, con relación a los
residuos aminoacilo, que constituyen un péptido de referencia (o
inmunorretroides); y todo mimótopo.
Para ilustrar las diversas clases de los péptidos
concernidos, se pueden mencionar las hormonas adrenocorticotrópicas,
o sus fragmentos, los análogos de angiotensina y sus inhibidores,
los péptidos natriuréticos, la bradiquinina y sus derivados
peptídicos, los péptidos quimiotácticos, la dinorfina y sus
derivados, las endorfinas y sus derivados, la encefalinas y sus
derivados, los inhibidores de enzima, los fragmentos de fibronectina
y sus derivados, los péptidos gastrointestinales, los péptidos
epioides, la oxitocina, la vasopresina, la vasotocina y sus
derivados, las proteínas-quinasas.
Los metalocenos de la presente invención, son de
utilidad como sintón, para la preparación de derivados de haptanos,
o de cualesquiera otras moléculas que pueden sintetizarse.
De una forma particular, los metalocenos de la
invención, son de utilidad en la síntesis soportada de los
oligonucleótidos y de los péptidos. Éstos permiten el marcaje de
oligonucleótidos o de péptidos sintetizados, de una forma muy
selectiva, debido a las dos funciones particulares que éstos poseen,
a saber, dos funciones hidroxilo, tales como las que se muestran en
la fórmula (II), para la síntesis soportada de los oligonucleótidos,
o bien una función amina, y una función ácido, tales como las que
se muestran en la fórmula (III), para la síntesis soportada de los
péptidos.
En el caso de la síntesis soportada de los
oligonucleótidos, los brazos espaciadores funcionalizados Y y Z,
tales como se indican en la fórmula (I), poseen, cada uno de ellos,
una función oxi, que proporciona una función hidroxilo, después de
la desprotección e, Y y Z, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-.
Según una forma de realización de la invención, Y
y Z son, cada una de ellas,
-(CH_{2})_{n}-O-, siendo n igual a 2.
Según otra forma de realización de la invención,
Y y Z son, cada una de ellas,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
siendo p igual a 2.
En el caso de la síntesis soportada de los
péptidos, los brazos espaciadores funcionalizados Y y Z, tal y como
se indican en la fórmula (I), poseen, o bien ya sea una función
amida que proporciona una función amina después de la
desprotección, o bien ya sea una función ácido, y se eligen entre
-(CH_{2})_{s}-NH- y
(CH_{2})_{t}-COO-, en el bien entendido
de que, Y y Z, no pueden ser idénticas.
Según una forma de realización de la invención,
s, es igual a 3 y t, es igual a 4.
El metal de transición Me, utilizado en los
metalocenos de fórmula (I) de la invención, puede ser todo metal de
transición. De una forma preferente, éste, se elige entre Fe, Ru y
Os.
Según un modo de realización de la invención, Me,
es el hierro.
Los grupos protectores utilizados en la síntesis
de los oligonucleótidos y los péptidos, son todo grupo clásicamente
conocido por parte de la persona especializada en este arte de la
técnica. Éstos se describen, por ejemplo, en Solid Phase Shyntesis,
A practical Guide, - Síntesis de fase sólida, una guía práctica -,
Steven A. Kates, Fernando Albericio, Ed Maral Dekker, 2000.
En el caso de un metaloceno de la invención, de
utilidad como sintón, en la síntesis de los oligonucleótidos, uno
de los grupos protectores, debe ser un grupo fosforado capaz de
reaccionar con un hidroxilo libre en 5' ó 3n 3', del nucleótido
precedente, en la medida en que, el metaloceno de la invención, se
emplace después de un nucleótido, bien ya sea con un hidroxilo
desprotegido del metaloceno precedente, en la medida en que, el
oligonucleótido comporte varios metalocenos a continuación, o bien
ya sea con un hidroxilo libre, de otro compuesto químico que pueda
servir, por ejemplo, de brazo espaciador, tal como el poli(óxido de
etileno). Los ejemplos de tales tipos de grupos protectores
fosforados, comprenden los grupos fosfodiéster, fosforamidita y
H-fosfonato, así como sus derivados.
El otro grupo protector del metaloceno, debe ser
capaz de dejar un grupo hidroxilo libre, después de la
desprotección, para reaccionar, o bien ya sea con un fósforo
reactivo (fosfodiéster, fosforamidita, H-fosfonato)
del núcleo siguiente, en la medida en que, el metaloceno, se
encuentre emplazado antes de un nucleótido, o bien ya sea un
fósforo reactivo del metaloceno siguiente, en la medida en que, por
lo menos, dos metalocenos, se sigan. A título de ejemplo de este
tipo de grupo protector, se pueden citar los grupos fotolábiles, el
monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo,
el acetilo y el trifluroacetilo.
A título de ejemplos de grupo fotolábil, se
pueden citar el 6-nitroveratrilo,
6-nitropiperonilo, el
metil-6-nitroveratrilo, el
nitroveratrilcarbonilo, el
metil-6-nitropiperonilo, el
nitrobencilo, el nitrobenciloxicarbonilo, el dimetildimetoxibencilo,
el dimetildimetoxibenciloxi-carbonilo, el
5-bromo-7-nitroindolinilo,
el
hidroxi-\alpha-metilcinamonilo,
la 2-oximetilen-antraquinona, y el
perinilmetoxicarbonilo.
\newpage
Los ejemplos de grupo protector de aminas,
comprenden el 9-fluoreniloxicarbonilo, el
tert.-butoxicarbonilo y el benciloxicarbonilo.
Un metaloceno bifuncionalizado de la fórmula
general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
- Me, representa un metal de transición, elegido,
de una forma preferente, entre Fe, Ru y Os,
- Y y Z, idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
ó bien,
- Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-,
- n, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- p, es número entero, comprendido entre 1 y
4,
- q, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- r, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- s, es número entero, comprendido entre 2 y
5,
- t, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- R y R', representan átomos de hidrógeno, o son
grupos protectores, utilizados en la síntesis de los
oligonucleótidos y de los péptidos, en el bien entendido que, por lo
menos una de las R ó R', es un grupo protector utilizado en la
síntesis de los oligonucleótidos y de los péptidos y que, R y R',
son tal y como de define abajo, a continuación:
(i) cuando Z e Y, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
entonces R y R', son grupos protectores utilizados en la síntesis
de los oligonucleótidos y, R, es un grupo susceptible de poder dejar
un grupo hidroxilo libre, después de la desprotección, de una forma
proferente, un grupo fotolábil, el monometoxitritilo, el
dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo, el acetilo, ó el
trifluoroacetilo y, R', es un grupo fosforado, susceptible de poder
reaccionar con un grupo hidroxilo libre, de una forma preferente, un
grupo fosfodiéster, fosforamidita ó H-fosfonato,
y
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-, entonces R, es un
grupo protector utilizado en la síntesis de los péptidos y
representa un grupo protector de las aminas, de una forma
preferente, el 9-fluoreniloxicarbonilo, el
tert.-butoxicarbonilo, o el benciloxicarbonilo y, R', representa un
átomo de hidrógeno.
Los metalocenos de la presente invención, se
preparan mediante un procedimiento que necesita una o dos etapas,
que permitan la obtención de los grupos protectores deseados, sobre
los brazos espaciadores funcionalizados apropiados.
Así, de este modo, la presente invención, tiene
igualmente por objeto un procedimiento para la preparación de un
metaloceno de la invención, caracterizado por el hecho de que, éste,
comprende las etapas siguientes:
(i) cuando, Z e Y, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
\newpage
- una etapa de protección de unos de los grupos
hidroxilo de un compuesto de la fórmula general (II)
en la
cual,
Me, es tal y como se ha definido precedentemente,
arriba,
Y' y Z', idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
-(CH_{2})_{2}-, y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-,
n, q y r, son tal y como se definen precedentemente, arriba y, p',
es un número entero comprendido entre 0 y 3,
mediante fijación de un grupo susceptible de
dejar un grupo hidroxilo libre, después de desprotección, elegido,
de una forma preferente, entre un grupo fotolábil, el
monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo,
el acetilo y el trifluoroacetilo, y
- una etapa de condensación, sobre el otro grupo
hidroxilo que se ha dejado libre, de un grupo fosforado,
susceptible de reaccionar con un grupo hidroxilo libre, elegido, de
una forma preferible, entre los grupos fosfodiéster, fosforamidita
y H-fosfonato; y
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-:
- una etapa de protección del grupo NH_{2}, de
un compuesto de fórmula general (III):
en la
cual,
- Me, es tal y como se ha definido
precedentemente, arriba,
- Y'', es (CH_{2})_{s}- y
- Z'', es (CH_{2})_{t}-,
- s, y t, siendo tal y como se han definido
precedentemente, arriba,
mediante fijación de un grupo susceptible de
poder dejar una función amina libre, después de desprotección,
elegida, de una forma preferente, entre el
9-fluoreniloxicarbonilo, el tributoxicarbonilo y el
benciloxicarbonilo.
La etapa de protección de uno de los grupos
hidroxilo de un compuesto de fórmula general (II), mediante un
grupo protector, capaz de dejar un grupo hidroxilo libre, después de
desprotección, tal como un grupo fotolábil, el monometoxitritilo, el
dimetoxitritilo, el tert.-butil-dimetilsililo, el
acetilo y el trifluoroacetilo, se efectúa en las condiciones, bien
conocidas por parte de la persona especializada en el arte de la
técnica, tales como las que se describen en Current Protocols in
Nucleic Acid Chemistry, - Protocolos actuales en la química de los
ácidos nucleicos-, (Volumen 1), John Wiley & Sons, Inc., NY
1999.
Del mismo modo, la etapa de condensación, sobre
el otro grupo hidroxilo dejado libre, del compuesto de la fórmula
(II), de un grupo protector fosforado, tal como un grupo
fosfodiéster, fosforamidita ó H-fosfonato, se
efectúa en condiciones que son bien conocidas, por parte de la
persona especializada en el arte de la técnica, tales como las que
se describen en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, -
Protocolos actuales en la química de los ácidos nucleicos -,
(Volumen 1), John Wiley & Sons, Inc., NY 1999, y en Protocols
for Oligonucleotides and Analogs, Shyntesis and Properties -,
Protocolos para oligonucleótidos y análogos, Síntesis y propiedades
- Ed. Sudhir Agrawal, Methodes in Molecular Biology, Humana Presse,
1993.
Los compuestos de la fórmula (II),
particularmente definidos, posteriormente, a continuación, son
nuevos compuestos que constituyen otro objeto de la presente
invención, y se eligen entre los
bis(hidroxi)metalocenos de la fórmula general
(II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
- Me, es un metal de transición, elegido, de una
forma preferente, entre Fe, Ru y Os,
- Y' y Z', idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})_{2},
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-,
- n, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- p, es número entero, comprendido entre 0 y
3,
- q, es número entero, comprendido entre 0 y 2,
y
- r, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
en el bien entendido que, cuando Me, es Fe ó Ru,
y que, Y' y Z', son -(CH_{2})_{n}-, entonces, n, es 5
y, cuando Me es Fe y, y que Y' y Z', son
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})-,
entonces, p' es 0.
Según una forma de realización preferida, los
compuestos de la fórmula (II), poseen por lo menos una de las
características siguientes:
Me, es hierro, y
Y' y Z', son, cada una de ellas,
-(CH_{2})_{n}-, siendo n igual a 3, ó bien, Y' y Z', son,
cada una de ellas,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})_{2}-,
siendo p' igual a 0.
Los compuestos de la fórmula (II), pueden
obtenerse de diferentes formas, según la naturaleza del brazo
espaciador Y' y Z'.
Para obtener un metaloceno con
-(CH_{2})_{n}-, como brazos espaciadores, se procede a
injertar funciones aldehído, sobre un metaloceno y, a continuación,
se hace reaccionar el compuesto de esta forma obtenido, con un
dietilfofonoalquilato de etilo apropiado, para obtener un
1,1'-bis[(2-etiloxicarbonil)alcenil]metaloceno
y, a continuación, se efectúan dos etapas de reducción, para
reducir, por una parte, el doble enlace y, a continuación, para
liberar el alcohol primario, tal y como se indica abajo, a
continuación:
en donde, Et, es etilo y, n', se
encuentra comprendida entre 2 y
4.
Para obtener un metaloceno con
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p-1}-(CH_{2})_{2}-,
como brazo espaciador, se procede a funcionalizar los grupos
hidroxilo de un
bis(hidroximetil)-metaloceno, en grupos
2-cloroetil(poli(óxido de etileno)
apropiados, en presencia de una base, tal como NaOH y, a
continuación, se procede a convertir el radical cloro en yodo, y,
después, en hidróxido, tal y como se indica abajo, a
continuación:
en donde, Ts, es tosilo y p', es un
número entero, comprendido entre 0 y
3.
Para obtener un metaloceno como brazo espaciador,
se procede a tratar un
1,1'-(N-hidroxiftalimidocarbonilalquil)-metaloceno
apropiado, tal y como se obtiene según el modo de operativo
descrito en el documento de patente internacional WO 01/81 446,
mediante la trifluoroacetoxialquilamina apropiada y, a continuación,
se procede a convertir el trifluoroacetoxi en hidroxilo, tal y como
se indica abajo, a continuación:
en donde, q y r, son tal y como se
han definido anteriormente,
arriba.
El compuesto (III), puede producirse según el
modo operativo siguiente:
Se procede a hacer reaccionar un
1-tert.-butoxicarbonilaminoalquil-1'-yodometaloceno
apropiado 1, con un yoduro organometálico 2 y, a continuación, al
final del tratamiento, la función ácido, se libera, para
proporcionar el compuesto (III), tal y como se indica abajo, a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde, s y t, son tal y como se
han descrito anteriormente,
arriba.
El compuesto 2, puede en sí mismo obtenerse según
la síntesis siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El compuesto 1, puede obtenerse mediante la
reacción de un 1,1'-yodometaloceno 3, con un yoduro
organometálico 4, de la forma siguiente:
tal y como se describe
en:
a) "Comprenhensive organic Synthesis", -
Síntesis orgánica comprensiva -, volumen 3, Barry M. Trost and Ian
Fleming,
b) "Paladium Reagents and catalysts" -
Reactivos y catalizadores de paladio, - Julio Tsuji Wiley &
Sons, 1995.
El yoduro organometálico 4, puede en sí mismo
obtenerse a partir de un yoduro de alquilamino, en 2 etapas, de la
forma siguiente:
En donde, s, es tal y como se ha descrito
precedentemente, arriba,
tal y como se describe en "Protective groups in
Organic Chemistry", - Grupos protectores en química orgánica -,
Greene - Wuts, Tercera edición, Wiley Interscience.
Finalmente, el
1,1'-yodometaloceno 3, puede en sí mismo obtenerse
según el modo operativo siguiente, tal y como se describe en el
artículo de D. Guillaneux, H. B. Kagan, J. Org. Chem. 1995, 60, 2502
- 2505.
\vskip1.000000\baselineskip
Los metalocenos de la fórmula (I) de esta forma
obtenidos, pueden entonces utilizarse para el marcaje,
especialmente, para el marcaje de moléculas biológicas de interés,
tales como los oligonucleótidos y lo péptidos, durante el curso de
su síntesis soportada.
Así, de este modo, otro objeto de la presente
invención, consiste en un procedimiento de marcaje de un
oligonucleótido o de un péptido, mediante un metaloceno
bifuncionalizado de fórmula (I), de la invención, procedimiento
éste, el cual comprende la sustitución de uno o de varios sintones
de nucleótidos o de aminoácidos, mediante uno o varios de los
citados metalocenos de fórmula (I), en el ciclo de síntesis, del
citado oligonucleótido o del citado péptido.
En el caso de la síntesis de los
oligonucleótidos, se utilizan uno o varios metalocenos de la fórmula
(I), en la cual, Z e Y, idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p},
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-.
En el caso de la síntesis de los péptidos, se
utilizan uno o varios metalocenos de la fórmula (I), en la cual, Y,
es -(CH_{2})_{n}-NH- y, Z, es
(CH_{2})_{t},-COO-.
La sustitución de los sintones de nucleótidos o
de los aminoácidos, mediante los metalocenos de la invención, puede
realizarse sobre los sintetizadores actuales, en cualquier posición
de la cadena, no siendo importante cual sea ésta posición. Según
una forma de realización de la invención, la sustitución, cumple,
por lo menos, con una de las condiciones siguientes:
- ésta se efectúa en las posiciones 3' ó 5', en
el caso de los oligonucleótidos, o en las extremidades
C-terminal, ó N-terminal, en el caso
de los péptidos, y
- hay, por lo menos, dos sustituciones
consecutivas.
La sustitución, puede ponerse fácilmente en
ejecución, por parte de la persona experimentada en el arte de la
técnica especializada, debido al hecho de que, ésta, consiste
únicamente en reemplazar un nucléotido o un aminoácido, mediante un
metaloceno de la invención.
Así, por ejemplo, en el caso del ciclo de
condensación fosforamidita, tal y como se representa en el esquema
1 que se presenta abajo, a continuación, uno de los nucleótidos de
esta cadena, o varios, puede o pueden reemplazarse por uno o por
varios metalocenos de la fórmula (I), en la cual, uno de los grupos
protectores R ó R', es una fosforamidita.
Esquema
1
Según otro ejemplo, en el caso del ciclo en serie
"H-fosfonato", tal y como se representa sobre
el esquema 2 que se presenta abajo, a continuación, uno cualquiera
de los nucleótidos de este ciclo, puede o pueden reemplazarse por
uno por varios metalocenos de la fórmula (I), en la cual, uno de los
grupos protectores R ó R', es un H-fosfonato.
Esquema
2
Ciclo en serie
"H-fosfonato"
Al mismo tiempo, según otro ejemplo, en el caso
del ciclo de condensación, "fosfotriéster", tal y como se
representa en el esquema 3 que se facilita abajo, a continuación,
uno cualquiera de los nucleótidos de este ciclo, o varios, puede o
pueden reemplazarse por uno por varios metalocenos de la fórmula
(I), en la cual, uno de los grupos protectores R ó R', es un
fosfodiéster.
Esquema
1
Ciclo de condensación
fosfodiéster
Del mismo modo, la persona experimentada en el
arte especializado de la técnica, podrá remplazar fácilmente uno o
varios aminoácidos, por uno o varios metalocenos de la presente
invención, durante el curso de la síntesis de péptidos conocidas,
tales como la síntesis según la química del BOC
(tert.-butoxicarbonilo) ó FMOC
(9-fluorenil-carbonilo).
Los oligonucleótidos y péptidos tales como los
marcados mediante los metalocenos de la invención, son nuevos, y
constituyen otro objeto de la invención.
Tal y como precedentemente, los oligonucleótidos,
se marcan con uno o varios metalocenos procedentes de la fórmula
(I), en la cual, Y y Z, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
y los péptidos, se marcan con uno o con varios metalocenos,
procedentes de metalocenos de la fórmula (I), en la cual, Y, es
-(CH_{2})_{s}NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-. Los metalocenos de la
fórmula II de la invención, se integran en los esquemas de
oligonucleótidos, de tal forma que se reemplacen, desde un punto de
vista químico, los nucleósidos, en las citadas secuencias. De una
forma similar, los metalocenos de la fórmula III, se integran en las
secuencias de los péptidos, de tal forma que se reemplacen, desde un
punto de vista químico, los aminoácidos, en las citadas
secuencias.
Según una forma preferida de realización, los
oligonucleótidos o péptidos de la invención, comportan, por lo
menos, un metaloceno de la invención, en las posiciones 3' ó 5', o
bien en las extremidades C-terminales o
N-terminales, respectivamente.
En el caso en donde se pretende obtener un
oligonucleótido marcado en la posición 3', se puede utilizar un
soporte sólido, sobre el cual, se injerta por lo menos un metaloceno
de la invención, mediante reacción covalente de una de sus
extremidades funcionalizadas. Este complejo
soporte-metaloceno(s), consiste en otro
objeto de la invención.
A título de soporte, se puede utilizar el soporte
que se facilita abajo, a continuación, LCAA-CPG (del
inglés, Long Chain alkylamine controlled Pore Glass - Vidrio poroso
controlado por alquilaminas de cadena larga), el cual se utiliza,
de una forma clásica, en la síntesis oligonucleotídica.
El injerto del metaloceno o de los metalocenos de
la invención, sobre el soporte, puede efectuarse, por ejemplo, según
el siguiente modo operativo:
en donde, Dmtr, es el
dimetoxitritilo, DMAP, es la dimetilaminopiridina y, DCC, es la
diciclohexilcarbodiimida, tal y como se describe en Matteuci &
Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3185 -
3191.
La presente invención, se comprenderá de una
forma mejor, con la ayuda de los ejemplos que se facilitan a
continuación, los cuales hacen referencia a la figura 1, anexada,
que representa el perfil HPLC, de un oligonucléotido de la
invención, que presenta un ferroceno de la invención, en la posición
3', y se facilitan únicamente a título ilustrativo, y no a título
limitativo.
Se procedió a tratar 1 g (5,37 mmol) de
ferroceno, disuelto en 12 ml de éter etílico anhidro, con 7,2 ml
(11,56 mmol) de nBuLi (solución 1,6 M en hexano), y mediante la
adición de 1,74 ml (11,56 mmol) de
N,N,N'N'-tetrametiletilendiamina. Se dejó la
reacción bajo atmósfera de argón y bajo régimen de agitación,
durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a la temperatura
ambiente. Se añadieron 1,33 ml (17,20 mmol) de DMF, a una
temperatura de -78ºC. Después de un tiempo de 2 horas bajo régimen
de agitación, a una temperatura de -78ºC, se procedió a hidrolizar
la mezcla reactiva (15 ml de agua). Se procedió a extraer la fase
acuosa, con diclorometano (3 x 15 ml). Se secó la fase orgánica
resultante, sobre MgSO_{4} y, a continuación, ésta se concentró.
Se procedió a purificar el residuo, sobre gel de sílice, con una
mezcla de pentano - acetato de etilo (50 : 50).
Se obtuvieron 0,62 (2,56 mmol, 48%), del
compuesto I, en forma de una pasta de color marrón.
RMN^{1}H (CDCl_{3}): 4,62 (d, J = 9 Hz, 4H,
H_{2}H_{2}-H_{2'}H_{3'}); 4,83 (d, J = 8,7
Hz, 4H, H_{1}H_{4}-H_{1'}H_{4'}); 9,89 (m,
2H, 2CHO).
RMN^{13}C: (CDCl_{3}): 70,9 (C_{2}C_{5});
74,20 (C_{3}C_{4}); 80,4 (C_{1}); 192,9 (C_{6}).
SM: 185 (60); 243 (M^{\cdot +}, 95).
En un matraz de tres bocas, de 50 ml de
capacidad, equipado con un refrigerante y bajo atmósfera de argón,
se introdujeron 0,094 g (4,08 mmol) de sodio, y 25 ml de etanol
absoluto. Después del consumo total del sodio, se procedió a
enfriar la solución, a una temperatura de 0ºC y, a continuación, se
introdujeron 0,809 ml (4,08 mmol) de dietilfosfonoacetato de etilo,
y 0,470 g (1,94 mmol) de ferroceno
1,1'-carboxialdehído 1, previamente disuelto en 10
ml de etanol absoluto.
Después de retornar a la temperatura ambiente y
evaporación, se procedió a purificar el residuo, sobre gel de
sílice, con una mezcla de ciclohexano - acetato de etilo (95 :
5).
Se obtuvieron 0,560 g (1,46 mmol, 75%), del
compuesto 2, bajo la forma de cristales de color rojo.
RMN^{1}H (CDCl_{3}): 1,26 (t, J = 7,12 Hz,
6H, H_{9}H_{10}H_{11}-H_{9'}
H_{8'}H_{11'}); 4,15 (q, J = 7,14 Hz y J =7,11 Hz, 4H,
H_{7}H_{8}-H_{7'}H_{8'}); 4,31 (m, 4H,
H_{2}H_{3}-H_{2'}H_{3'}); 4,38 (m, 4H,
H_{1}H_{4}-H_{1'}H_{4'}); 5,91 (d, J = 15,80
Hz, 2H, H_{6}-H_{6'}); 7,33 (d, J= 15,79 Hz,
2H, H_{5}-H_{5'}).
RMN^{13}C: (CDCl_{3}): 14,2 (C_{10}); 60,1
(C_{9}); 69,7 (C_{2}C_{5}); 72,2 (C_{3}C_{4}); 77,9
(C_{1}); 116,2 (C_{7}); 143,7(C_{6}); 166,9
(C_{8}).
SM: 282(M^{\cdot +}, 85).
En un matraz de 100 ml de capacidad, se
introdujeron 0,400 g (1,05 mmol) del compuesto 2, 0,100 g (0,94
mmol) de paladio sobre carbono (Pd/C, al 10%), y 40 ml de acetato de
etilo. La solución, se desgasificó cuidadosamente mediante burbujeo
de un flujo de argón (durante un transcurso de tiempo de
aproximadamente 30 minutos). Se procedió a hacer burbujear, de una
forma cuidadosa, el hidrógeno contenido en un matraz de globo, hasta
la saturación de la solución. Se procedió a disponer un matraz de
globo, llenado con hidrógeno, por debajo del montaje. Se procedió,
a continuación, a agitar la mezcla reactiva, de una forma vigorosa,
durante un tiempo de 48 a 72 horas.
Después de proceder a la filtración y
concentración, se obtuvieron 0,400 g (1,03 mmol, 99%) del compuesto
3, en forma de un aceite de color naranja.
RMN^{1}H (CDCl_{3}): 1,19 (t, J = 7,15 y J =
7,12 Hz, 6H,
H_{11}H_{12}H_{13}-H_{11'}H_{12'}H_{13'});
2,43 (m, 4H, H_{7}H_{8}-H_{7'}H_{8'}); 2,57
(m, 4H, H_{5}H_{6}-H_{5'}H_{6'}); 3,64 (s,
8H,
H_{1}H_{2}H_{3}H_{4}-H_{1'}H_{2'}H_{3'}H_{4'});
4,06 (q, J = 7,13 y J = 7,15 Hz, 4H,
H_{9}H_{10}-H_{9'}H_{10'}).
En un matraz de tres bocas, provisto de un
refrigerante, en régimen de agitación, y bajo atmósfera de argón, se
introdujeron 0,140 g (3,70 mmol) de AlLiH_{4}. Con la ayuda de una
jeringa, se procedió añadir 7 ml de éter etílico anhidro. Se
procedió a añadir, por procedimiento de goteo (gota a gota), 1,43 g
(3,70 mmol) de éster 3, disuelto en 9,5 ml de éter etílico anhidro,
de tal forma que se mantuviera un reflujo constante. La mezcla,
adquirió un aspecto viscoso, necesitando la adición de 15 ml de THF
rigurosamente anhidro, con el fin de facilitar la solubilización de
los compuestos. Se procedió a controlar la reacción, mediante CCM
(elución: ciclohexano - acetato de etilo (80 : 20). Al cabo de un
tiempo de 40 minutos de agitación, se descompuso el exceso del
litinado, mediante la adición lenta de agua (15 ml), procediendo, al
mismo tiempo, a mantener el régimen de agitación. Se observó la
formación de un precipitado blanco de litina. Después de la
filtración, se extrajo la fase acuosa, con éter etílico (2 x 25
ml). Se procedió a combinar las fases orgánicas, éstas se secaron
sobre MgSO_{4} y, a continuación, se concentraron.
Se recogieron 0,810 g (2,68 mmol, 72%) del
compuesto 4, en forma de un aceite amarillo.
RMN^{1}H (CDCl_{3}): 1,54 (m, 4H,
H_{7}H_{8}-H_{7'}H_{8'}); 2,12 (t, J = 7,81
y J = 7,08 Hz, 4H,
H_{5}H_{6}-H_{5'}H_{6'}); 3,43 (t, J = 6,12
Hz, H_{9}H_{10}-H_{9'}H_{10'}); 3,89 (m,
8H,
H_{1}H_{2}H_{3}H_{4}-H_{1'}H_{2'}H_{3'}H_{4'}).
RMN^{13}C: (CDCl_{3}): 25,7 (C_{6}); 3,41
(C_{7}); 62,3 (C_{8}); 69,0 (C_{2}C_{5}); 64,4
(C_{3}C_{4}); 70,3 (C_{1'}C_{2'}C_{3'}C_{4'}C_{5'}),
89,1 (C_{1}).
SM: 161 (21); 179 (40; 302(M^{\cdot +},
100).
En un matraz de 25 ml de capacidad, se
introdujeron, de una forma sucesiva, 200 mg (0,662 mmol) de
1,1'-hidroxipropilferroceno 4 y 16 mg (0,132 mmol)
de DMAP. Después de 2 coevaporaciones sucesivas mediante 50 ml de
piridina anhidra, se recogió el aceite obtenido, con 5 ml de
piridina anhidra. Se añadieron 247 mg (0,728 mmol) de cloruro de
4,4'-dimetoxitritilo y 115 \mul (0,662 mmol) de
N,N'-etildiisopropilamina. Se dejó la mezcla
reactiva bajo régimen de agitación, a la temperatura ambiente, bajo
reflujo de nitrógeno. Se siguió el avance de la reacción, mediante
CCM (elución: diclorometano - metanol - TEA, 89 : 10 : 1). Después
de proceder a elución, las placas, se revelaron sistemáticamente en
una mezcla de etanol - ácido sulfúrico. Después de un tiempo de 4
horas en régimen de agitación, a la temperatura ambiente, se
añadieron 2 ml de metanol, a la mezcla reactiva, con objeto de
neutralizar el cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo que
no hubiera reaccionado. Después de proceder a la concentración, a
la mitad, se recogió el residuo, con diclorometano (25 ml), éste se
lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y, a
continuación, con agua (5 x 25 ml). Después de proceder al secado
sobre MgSO_{4} y a la concentración, se hizo
co-evaporar el producto bruto, mediante 2 x 10 ml de
tolueno y, a continuación, éste se dejó bajo la acción de vacío,
durante toda una noche. Se procedió a purificar la mezcla, sobre
gel de sílice (previamente neutralizado mediante TEA), con mezclas
de diclorometano -etanol, de polaridad creciente:
Se aislaron 304 mg (76%) del compuesto
mononitrilado 5. Éste último, se presenta en forma de un aceite de
color anaranjado.
RMN^{1}H (acetona D6): 1,64 - 1,72 (m, 2H,
H_{7'}H_{8'}); 175 - 186 (m, 2H, H_{7}H_{8}); 2,38 - 2,53
(m, 4H, H_{5}H_{6}-H_{5'}H_{6'}); 3,08 -
3,14 (t, 2H, H_{9}H_{10}); 3,52 - 3,58 (t, 2H,
H_{9'}H_{10'}); 3,78, 3,79 (2s, 6H, -OCH_{3}); 3,95 - 3,98 (m,
8 H,
H_{1}H_{2}H_{3}H_{4}-H_{1'}H_{2'}H_{3'}H_{4'});
6,82 7,68 (m, 13 H, Ar).
En un matraz de 25 ml de capacidad, se
introdujeron, de una forma sucesiva, 255 mg (0,42 mmol) del
compuesto ferroceno ODMT 5 y 7 mg (0,05 mmol) de DMAP. Después de
las co-evaporaciones sucesivas mediante 2 x 2 ml de
piridina anhidra y 2 x 2 ml de THF anhidro, se recogió el residuo,
mediante 3 ml de THF anhidro. Se procedió a emplazar la mezcla
reactiva, bajo flujo de nitrógeno y, a continuación, se añadieron
147 \mul (0,48 mmol) de
N,N'-etildiisopropilamina, de una sola vez. A
continuación, se procedió a añadir, lentamente, con la ayuda de una
jeringa de vidrio, 140 \mul (0,46 mmol), de
2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita (la
adición, tuvo una duración de aproximadamente 10 minutos). Después
de haber procedido a la mitad de la adición, se observó la
formación de un precipitado. Después de un tiempo de 3 horas y 30
minutos de agitación, a la temperatura ambiente, se procedió a
controlar la reacción mediante CCM (elución: pentano - acetato de
etilo, 70 : 30). Al ser la fosforamidita formada muy reactiva, ésta
no siguió el tratamiento clásicamente utilizado. Se procedió a
concentrar el producto bruto a la mitad. La columna de sílice
(bastante corta), se montó con una mezcla de pentano - TEA (0,5%),
para neutralizar la sílice y, a continuación, se enjuagó con pentano
puro. Después de una deposición rápida del producto bruto, el
producto, se eluyó con una mezcla de pentano - acetato de etilo (85
: 15), procediendo a presionar con argón, con objeto de acelerar la
migración, con el fin de limitar al máximo el contacto del producto
con la sílice. Después de la concentración, se obtuvieron 190 mg
(56%) de un aceite. Se procedió a emplazar el producto, bajo la
acción de vacío, durante un tiempo de 12 horas y, a continuación,
éste se conservó a una temperatura de -20ºC.
Antes de la utilización de este producto, para la
síntesis de los ODN modificados, es preferible el proceder a
verificar la eventual presencia de productos de degradación,
mediante una RMN, del fósforo, y verificar una purificación rápida
del producto, si ello se considera necesario.
RMN^{31} P (CD_{3}CN) : 148,25 (P).
La secuencia del ODN 7, es:
3'NH_{2}-C7-Fc-TGG
ATT ACT CAG GTT CCT TAT G 5'
Se procedió a introducir 17 mg de soporte
(2-dimetoxitritiloximetil-6-fluorenilmetoxicarbonilamino-hexano-1-succinoil)
- alquilamino de cadena larga - CPG 1000), funcionalizado a 59
\mumol/g (Glen Research, Sterling US) en una columna de síntesis
(Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia). Se procedió a poner en
solución, 100 mg de 6 (0,124 mmol), en 1,24 ml de acetonitrilo
anhidro (AB, Francia). Se utilizó la solución de 6, en la posición
5, de un sintetizador AB 394, según el mismo protocolo operativo que
para las fosforamiditas comerciales (A, C, G, T). Se procedió a
efectuar la síntesis del oligonucléotido 7, con el programa standard
1 \muM, en donde, la etapa de acoplamiento de las fosforamiditas,
se modificó de la forma que sigue: dos extracciones de 3,5 s de la
solución de fosforamidita (en lugar de una extracción, como en el
programa standard), intercaladas por una pausa de 15 s, seguido de
una pausa de 25 s. El rendimiento global del acoplamiento, por
ciclo, fue de un 97,5%. Después del tratamiento con la CPG, con
amoníaco acuoso 30% (55ºC, durante un tiempo de 16 horas), se
procedió a concentrar el sobrenadante, con Speed Vac. Se recogió la
torta, con 1 ml de H_{2}O, y se procedió a purificar 7, sobre
columna preparativa (Merck Lichrospher RP18E, 12 \mu, 100
\ring{A}, 300 x 75).
Se procedió a concentrar las fracciones al
rotovapor y, a continuación, se procedió a
co-evaporarlas, 4 veces, mediante H_{2}O, antes
de liofilización en un dispositivo Eppendorf. Se obtuvieron 15 DO
(unidades de absorbancia, a 260 nm) del producto puro.
La pureza del producto, se verificó mediante
análisis de HPLC, efectuado sobre una columna Waters Deltapak
C_{18} 5\mu 300 \ring{A} 3,9 x 150 mm). La figura 1,
proporciona el cromatograma obtenido a 250 nm.
Espectrometría de masa (MALDI - TOF), Voyager DE
(Perspective Biosystem):
masa teórica m/z: 7352,9, masa observada m/z :
7338,3.
Se procedió a agitar 149 mg (247 \mumol, 1 eq.)
de
1-[3-O-(p,p'-dimetoxitritil)propil]-1'-[3'-hidroxipropil]-ferroceno
5,67 mg (667 \mumol, 2,7 eq.) de anhídrido succínico y 7 mg (25
\mumol, 0,1 eq.) de
4-N,N'-dimetilaminopiridina (DMAP),
con 180 ml (1,3 mmol, 5,3 eq.) de trietilamina, en 2 ml de
diclorometano anhidro, bajo atmósfera inerte. Al cabo de 3 horas, la
mezcla de reactiva, se repartió entre bicarbonato sódico acuoso (3 x
10 ml) y diclorometano (40 ml). Se procedió a secar las fases
orgánicas, sobre sal de sulfato de sodio, éstas se filtraron, y se
hicieron evaporar y purificar sobre columna de gel de sílice
(gradiente de MeOH en C_{2}HCl_{2}), para proporcionar 160 mg
(198 \mumol, 80%) del producto deseado.
Rf (2% MeOH / CH_{2}Cl_{2}) = 0,8.
RMN ^{1}H : \delta ppm (CDCl_{3}) = 7,34
(m, 9H, DMTr); 6,82 (m, 4H, DMT_{r}), 4,12 (t, 2H, J = 6,36 Hz,
-CH_{2}OCOCH_{2}-); 3,96 (m, 8H, ferroceno), 3,79 (s, 6H,
2XOCH_{3}); 3,08 (m, 8H,
-CH_{2}-O-DMTr), 2,64 (m, 4H,
O-CO-CH_{2}-CH_{2}-COO^{-});
2,42 (m, 4H, 2xCH_{2}-ferroceno), 1,82 (m, 4H,
2X-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2-}).
(LACAA - CPG, son las siglas, en
inglés, de Long Chain Alkyl Amin-Controled Pore
Glass)
Se procedió a poner en régimen de agitación
mecánica, en 3 ml de una mezcla de piridina/diclorometano (1 : 2),
durante un tiempo de 48 horas, 40,3 mg (50 \mumol) de sal de
trietilamonio del
1-[p,p'-dimetoxitritil)propanol]-1'-(propanol
succinato)ferroceno, obtenido anteriormente, arriba, 500 mg
del soporte LCAA-CPF (500 \ring{A}), 600 mg (3
mmol) de diciclohexilcarbodiimida (DCC), 40 mg (0,32 mmol) de
dimetilaminopirridina (DMAP) y 210 \mul (1,5 mmol) de
trietilamina. Se procedió, a continuación, a filtrar las bolitas de
sílice, y se lavaron sucesivamente con piridina, diclorometano,
metanol, diclorometano, y éter (50 ml de cada uno).
Se procedió, a continuación, a enmascarar las
funciones NH_{2} residuales, haciendo reaccionar 1 ml de
anhídrido acético, en presencia de 1 ml de piridina y de 20 g de
DMPA, sobre las bolitas de CPG, durante un tiempo de 2 horas. A
continuación, se procedió a filtrar las bolitas, y éstas se
enjuagaron, sucesivamente, con diclorometano, metanol, diclorometano
y éter (25 ml de cada uno). Éstas se secaron bajo la acción de vacío
activado, hasta que, la muestra, alcanzara un peso constante.
Se estimó la funcionalización del soporte,
procediendo a dosificar el catión dimetoxitritilo liberado, después
de haber sometido un alícuoto de soporte, a un tratamiento ácido. Se
obtuvo una funcionalización de 0,1 \mumol/mg.
Claims (25)
1. Metaloceno bifuncionalizado de la fórmula
general (I):
en la
cual,
- Me, representa un metal de transición, elegido,
de una forma preferente, entre Fe, Ru y Os,
- Y y Z, idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
ó bien,
- Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-,
- n, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- p, es número entero, comprendido entre 1 y
4,
- q, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- r, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
- s, es número entero, comprendido entre 2 y
5,
- t, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- R y R', representan átomos de hidrógeno, o son
grupos protectores, utilizados en la síntesis de los
oligonucleótidos y de los péptidos, en el bien entendido que, por lo
menos una de las R ó R', es un grupo protector utilizado en la
síntesis de los oligonucleótidos y de los péptidos y que, R y R',
son tal y como de define abajo, a continuación:
(i) cuando Z e Y, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-,
entonces R y R', son grupos protectores utilizados en la síntesis
de los oligonucleótidos y, R, es un grupo susceptible de poder dejar
un grupo hidroxilo libre, después de la desprotección, de una forma
proferente, un grupo fotolábil, el monometoxitritilo, el
dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo, el acetilo, ó el
trifluoroacetilo y, R', es un grupo fosforado, susceptible de poder
reaccionar con un grupo hidroxilo libre, de una forma preferente, un
grupo fosfodiéster, fosforamidita ó H-fosfonato,
y
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-, entonces R, es un
grupo protector utilizado en la síntesis de los péptidos y
representa un grupo protector de las aminas, de una forma
preferente, el 9-fluoreniloxicarbonilo, el
tert.-butoxicarbonilo, o el benciloxicarbonilo y, R', representa un
átomo de hidrógeno.
2. Metaloceno, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, Me, es hierro.
3. Metaloceno, según una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado por el hecho de que, Y y Z, se eligen
entre -(CH_{2})_{n}-O-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-O-.
4. Metaloceno, según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado por el hecho de que, Y y Z, son, cada
una de ellas, -(CH_{2})_{n}-O-, siendo n
igual a 3.
5. Metaloceno, según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado por el hecho de que, Y y Z, son, cada
una de ellas,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
siendo p igual a 2.
6. Metaloceno, según una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado por el hecho de que, Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y, Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-.
7. Metaloceno, según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que, s, es igual a 3 y, t, es
igual a 4.
8. Procedimiento para la preparación de un
metaloceno de la fórmula (I), según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por el hecho de que,
éste, comprende las etapas siguientes:
- una etapa de protección de unos de los grupos
hidroxilo de un compuesto de la fórmula general (II)
en la
cual,
Me, es tal y como se ha definido en las
reivindicaciones precedentes,
Y' y Z', idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p}-,
-(CH_{2})_{2}-, y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-,
n, q y r, son tal y como se definen en las reivindicaciones
precedentes, y, p', es un número entero comprendido entre 0 y
3,
mediante fijación de un grupo susceptible de
dejar un grupo hidroxilo libre, después de desprotección, elegido,
de una forma preferente, entre un grupo fotolábil, el
monometoxitritilo, el dimetoxitritilo, el tert.-butildimetilsililo,
el acetilo y el trifluoroacetilo, y
- una etapa de condensación, sobre el otro grupo
hidroxilo que se ha dejado libre, de un grupo fosforado,
susceptible de reaccionar con un grupo hidroxilo libre, elegido, de
una forma preferible, entre los grupos fosfodiéster, fosforamidita
y H-fosfonato.
9. Procedimiento de preparación de un metaloceno
de la fórmula (I), según una de las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una de las
etapas siguientes:
(ii) cuando Y, es
-(CH_{2})_{s}-NH-, y Z, es
-(CH_{2})_{t}-COO-:
- una etapa de protección del grupo NH_{2}, de
un compuesto de fórmula general (III):
en la
cual,
- Me, es tal y como se ha definido en las
reivindicaciones precedentes,
- Y'', es (CH_{2})_{s}- y
- Z'', es (CH_{2})_{t}-,
- s, y t, siendo tal y como se han definido en
las reivindicaciones precedentes,
mediante fijación de un grupo susceptible de
poder dejar una función amina libre, después de desprotección,
elegida, de una forma preferente, entre el
9-fluoreniloxicarbonilo, el tributoxicarbonilo y el
benciloxicarbonilo.
\newpage
10. Bis(hidroxi)metalocenos de la
fórmula general (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
- Me, es un metal de transición, elegido, de una
forma preferente, entre Fe, Ru y Os,
- Y' y Z', idénticas, se eligen entre
-(CH_{2})_{n}-,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})_{2},
y
-(CH_{2})_{q}-CONH-(CH_{2})_{r}-,
- n, es número entero, comprendido entre 3 y
6,
- p, es número entero, comprendido entre 0 y
3,
- q, es número entero, comprendido entre 0 y 2,
y
- r, es número entero, comprendido entre 0 y
2,
en el bien entendido que, cuando Me, es Fe ó Ru,
y que, Y y Z, son -(CH_{2})_{n}-, entonces, n, es 5 y,
cuando Me es Fe y, y que Y' y Z', son
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})-,
entonces, p' es 0.
11. Bis(hidroxi)metaloceno, según
la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que, Me,
es hierro.
12. Bis(hidroxi)metaloceno, según
la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que Y' y
Z', son, cada una de ellas, -(CH_{2})_{n}-, siendo n
igual a 3,
13. Bis(hidroxi)metaloceno, según
una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por el
hecho de que, Y' y Z', son, cada una de ellas,
-(CH_{2})-O-[(CH_{2})_{2}-O]_{p'}-(CH_{2})_{2}-,
siendo p' igual a 0.
14. Procedimiento de marcaje de un
oligunucleótido, mediante un metaloceno bifuncionalizado de la
fórmula (I), según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5,
caracterizado por el hecho de que, éste, comprende la
sustitución de uno o de varios sintones de nucleótidos, mediante uno
o varios de los citados metalocenos de la fórmula (I), en la cual, R
y R', son grupos protectores utilizados en la síntesis de los
oligonucleótidos, en el ciclo de la síntesis del citado
oligonucleótido.
15. Procedimiento, según la reivindicación 14,
caracterizado por el hecho de que, la sustitución, se
efectúa en las posiciones 3' ó 5', procediendo a reemplazar los
primeros nucleótidos, o los últimos nucleótidos,
respectivamente,
16. Procedimiento de marcaje de un péptido,
mediante un metaloceno bifuncionalizado de la fórmula (I), según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado por
el hecho de que, éste, comprende la sustitución de uno o de varios
sintones de aminoácidos, mediante uno o varios de los citados
metalocenos de la fórmula (I), en la cual, R, representa un grupo
protector de las aminas y, R', representa un átomo de hidrógeno, en
el ciclo de la síntesis del citado péptido.
17. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado por el hecho de que, la sustitución, se
efectúa sobre las extremidades C-terminal ó
N-terminal, reemplazando los primeros aminoácidos o
los últimos aminoácidos, respectivamente.
18. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, caracterizado por el hecho de que
se efectúan, por los menos, dos sustituciones consecutivas.
19. Oligonucleótidos marcados,
caracterizados por el hecho de que, éstos, son susceptible de
poderse obtener mediante el procedimiento de marcaje según una
cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
20. Oligonucleótidos marcados,
caracterizados por el hecho de que, por lo menos uno de los
nucleósidos que los constituyen, se sustituye por un
bis(hidroxi)metaloceno de la fórmula general (II),
según una de las reivindicaciones 10 a 13.
21. Oligonucleótidos marcados, según una de las
reivindicaciones 19 ó 20, caracterizados por el hecho de
que, éstos, comportan, por lo menos, un
bis(hidroxi)metaloceno de la fórmula general (II), en
la posición 3' ó 5'.
22. Péptidos marcados, caracterizados por
el hecho de que, éstos, son susceptibles de poderse obtener
mediante el procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18.
23. Péptidos marcados, caracterizados por
el hecho de que, por lo menos uno de los aminoácidos que los
constituyen, se encuentra sustituido por un metaloceno
bifuncionalizado de la fórmula (III), tal y como se define en la
reivindicación 9.
24. Péptidos, según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 ó 23, caracterizados por el hecho de que,
éstos, comportan por lo menos un metaloceno bifuncionalizado de la
fórmula (III), en las extremidades C-terminales ó
N-terminales.
25. Soporte de síntesis de oligonucleótidos,
caracterizado por el hecho de que, por lo menos un metaloceno
de la fórmula (I), según una de las reivindicaciones 1 a 7 se
injerta sobre el citado soporte, mediante reacción covalente de una
de sus extremidades funcionalizadas.
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