ES2251767T3 - Receptor que fija trail. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido receptor de ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL-R) purificado, que se une al ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL), en el que el TRAIL-R está caracterizado por comprender la secuencia de aminoácidos VPANEGD.
Description
Receptor que fija TRAIL.
Una proteína conocida como ligando que induce la
apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) es un miembro de la familia
de ligandos del factor de necrosis de tumores (Wiley y otros,
Immunity, vol. 3, págs. 673-682, (1995)). El
TRAIL ha demostrado la capacidad para inducir la apoptosis de
ciertas células transformadas, incluyendo un cierto número de tipos
diferentes de células de cáncer, así como células infectadas
víricamente (Solicitud PCT WO 97/01633, y Wiley y otros, véase cita
anterior).
La identificación de la proteína(s)
receptor que se une al TRAIL se revelaría útil en el estudio
posterior de las actividades biológicas del TRAIL. Sin embargo,
antes de la presente invención, no se había informado de ningún
receptor para el TRAIL.
La presente invención está dirigida a una nueva
proteína designada como TRAIL receptor (TRAIL-R),
que se une a una proteína conocida como ligando que induce la
apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL). Se proporciona el DNA que
contiene la codificación de TRAIL-R, y los vectores
de expresión que comprenden dicho DNA. Igualmente, se proporciona un
procedimiento para la producción de polipéptidos
TRAIL-R que comprende el cultivo de células
huéspedes transformadas con un vector de expresión recombinante que
contiene la codificación de TRAIL-R, bajo
condiciones que promueven la expresión de TRAIL-R y,
a continuación, la recuperación de los polipéptidos
TRAIL-R expresados a partir del cultivo. Así mismo,
se proporcionan anticuerpos que son inmunoreactivos con
TRAIL-R.
La Figura 1 presenta la secuencia de nucleótidos
de un fragmento de DNA del TRAIL receptor humano, así como la
secuencia de aminoácidos codificada por él. Este fragmento de DNA se
describe en el Ejemplo 3.
La Figura 2 presenta los resultados del ensayo
descrito en el Ejemplo 7. En el ensayo, una proteína de fusión
TRAIL-R/Fc soluble bloqueó la apoptosis inducida por
TRAIL de células Jurkat.
La Figura 3 presenta los resultados del
experimento descrito en el Ejemplo 8. Los compuestos indicados
demostraron que inhibían la apoptosis de células que expresan el
TRAIL receptor.
Se proporciona aquí una nueva proteína designada
como TRAIL receptor (TRAIL-R). El
TRAIL-R se une a la citocina designada como ligando
que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL). Ciertos usos
del TRAIL-R proceden de esta capacidad para unirse
al TRAIL, tal como se expone aquí más adelante. El
TRAIL-R encuentra su uso en la inhibición de
actividades biológicas del TRAIL, o en la purificación del TRAIL,
por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.
La secuencia de nucleótidos de la región de
codificación de un DNA del TRAIL receptor humano se presenta en la
SEC ID NO:1. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia
de DNA de la SEC ID NO:1, se muestra en la SEC ID NO:2. Esta
información de la secuencia identifica la proteína TRAIL receptor
como un miembro de la familia de receptores, el receptor del factor
de necrosis de tumores (revisada por Smith y otros, en Cell,
vol. 76, págs. 959-962, (1994)). El dominio
extracelular contiene repeticiones ricas en cisteína; dichos motivos
se ha informado que son importantes para la unión de ligandos en
otros receptores de esta familia. El TRAIL-R
contiene un denominado "dominio muerte" en la región
citoplásmica; dichos dominios en otros ciertos receptores están
asociados con la transducción de señales apópticas. Estas y otras
características de la proteína se exponen con mayor detalle más
adelante.
La proteína TRAIL-R o fragmentos
inmunogénicos de la misma, pueden usarse como inmunógenos para
generar anticuerpos que son inmunoreactivos con ella. En una
realización de la invención, los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales.
Una proteína TRAIL-R humana se
purificó tal como se describe en el Ejemplo 1. En el Ejemplo 2, se
presenta la información de la secuencia de aminoácidos derivados a
partir de fragmentos de TRAIL-R. Una realización de
la invención está dirigida a una proteína TRAIL-R
humana purificada que es capaz de unirse al TRAIL, en la que el
TRAIL-R se caracteriza por comprender la secuencia
de aminoácidos VPANEGD (aminoácidos 327 a 333 de la SEC ID NO:2). En
otra realización, el TRAIL-R comprende
adicionalmente la secuencia
ETLRQCFDDFADLVPFDSWE
PLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLXTML (aminoácidos 336 a 3856 de la SEC ID NO:2, con un aminoácido desconocido indicado como X). Igualmente, se proporcionan fragmentos de TRAIL-R que comprenden únicamente una de estas secuencias de aminoácidos caracterizantes.
PLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLXTML (aminoácidos 336 a 3856 de la SEC ID NO:2, con un aminoácido desconocido indicado como X). Igualmente, se proporcionan fragmentos de TRAIL-R que comprenden únicamente una de estas secuencias de aminoácidos caracterizantes.
La secuencia de nucleótidos de un fragmento de
DNA de TRAIL-R, y la secuencia de aminoácidos
codificada por ella, se presentan en la Figura 1 (SEC ID NO:3 y SEC
ID NO:4); véase Ejemplo 3. La secuencia de aminoácidos presentada en
la Figura 1 tiene características de los denominados "dominios
muerte" encontrados en la región citoplásmica de otras ciertas
proteínas receptores. De dichos dominios se ha informado que están
asociados con la transducción de señales apópticas. Los dominios
muerte citoplásmicos han sido identificados en el antígeno Fas (Itoh
y Nagata, J. Biol. Chem., vol. 268, pág. 10932, (1993)), en
el receptor tipo I del TNF (Tartaglia y otros, Cell, vol. 74,
pág. 845, (1993)), en DR3 (Chinnaiyan y otros, Science, vol.
274, págs. 990-992, (1996)), y en
CAR-1 (Brojatsch y otros, Cell, vol. 87,
págs. 845-855, (1996)). El papel de estos dominios
muerte en la iniciación de cascadas de señalamiento apóptico
intracelular se expone adicionalmente más adelante.
La SEC ID NO:1 presenta la secuencia de
nucleótido de la región de codificación de un DNA de TRAIL receptor
humano, incluyendo un codón de iniciación (ATG) y un codón de
terminación (TAA). La secuencia de aminoácido codificada por el DNA
de la SEC ID NO:1 se presenta en la SEC ID NO:2. El fragmento
representado en la Figura 1 corresponde a la región del
TRAIL-R que se presenta como los aminoácidos 336 a
386 en la SEC ID NO:2.
La proteína TRAIL-R de la SEC ID
NO:2 incluye una región hidrófoba N-terminal que
funciona como un péptido señal, seguida de un dominio extracelular,
una región transmembrana que comprende los aminoácidos 211 a 231, y
un dominio citoplásmico C-terminal. El análisis
mediante ordenador predice que el péptido señal corresponde a los
restos 1 a 51 de la SEC ID NO:2. De acuerdo con ello, la escisión
del péptido señal proporcionaría una proteína madura que comprende
los aminoácidos 52 a 440 de la SEC ID NO:2. El peso molecular
calculado para una proteína madura que contiene los restos 52 a 440
de la SEC ID NO:2 es aproximadamente de 43 kilodaltons. Los sitios
de escisión de peptidasa señal predecidos mediante ordenador los más
probablemente a continuación (en orden descendente), se producen
después de los aminoácidos 50 y 58 de la SEC ID NO:2.
En otra realización de la invención, el resto
N-terminal de una proteína TRAIL-R
madura es el resto isoleucina en la posición 56 de la SEC ID NO:2.
Las secuencias de varios fragmentos péptidos de digestión tríptica
de TRAIL-R se determinaron mediante una combinación
de secuenciación N-terminal y
Nano-ES MS/MS (nano electropulverización en tándem
con espectroscopía de masa). El aminoácido
N-terminal de uno de los fragmentos péptidos fue la
isoleucina en la posición 56 de la SEC ID NO:2. Puesto que este
fragmento no estuvo precedido por un sitio de escisión tripsina, el
resto 56 (ILe) puede corresponder al resto
N-terminal resultante de la escisión del péptido
señal.
Una realización adicional de la invención está
dirigida a TRAIL-R maduro que tiene el aminoácido 54
como el resto N-terminal. En una preparación de
TRAIL-R (una proteína de fusión
TRAIL-R/Fc soluble expresada en células
CV1-EBNA), el péptido señal se escindió después del
resto 53 de la SEC ID NO:2.
El técnico experto reconocerá que el peso
molecular de preparaciones particulares de la proteína
TRAIL-R puede diferir, de acuerdo con factores tales
como el grado de glucosilación. El patrón de glucosilación de una
preparación particular de TRAIL-R puede variar de
acuerdo, por ejemplo, con el tipo de células en las cuales esté
expresada la proteína. Además, una preparación dada puede incluir
múltiples especies glucosiladas diferencialmente de la proteína. Se
proporcionan aquí polipéptidos TRAIL-R con o sin una
glucosilación patrón nativa asociada. La expresión de polipéptidos
TRAIL-R en sistemas de expresión bacterianos, tal
como E. coli, proporciona moléculas no glucosiladas.
En una realización, la proteína se caracteriza
por un peso molecular comprendido dentro del intervalo de 50 a 55
kilodaltons, que es el peso molecular determinado para una
preparación de TRAIL-R humano de longitud total,
nativo. El peso molecular puede determinarse mediante
SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE).
El Ejemplo 1 presenta un procedimiento para la
purificación de una proteína TRAIL-R. Las células
Jurkat se rompieron, y el procedimiento de purificación subsiguiente
incluyó la cromatografía de afinidad (la cual usa una matriz de
cromatografía que contiene TRAIL), y HPLC de fase inversa.
Los polipéptidos TRAIL-R de la
presente invención pueden purificarse mediante cualquier
procedimiento alternativo adecuado, usando técnicas de purificación
de proteínas conocidas. En un procedimiento alternativo, la matriz
de cromatografía comprende, en su lugar, un anticuerpo que se une al
TRAIL-R. Otros tipos de células que expresan el
TRAIL-R (p. ej., las células PS-1
descritas en el Ejemplo 2) pueden ser substituidas por las células
Jurkat. Las células pueden ser rotas por cualquiera de las numerosas
técnicas conocidas, incluyendo el ciclo
congelación-descongelación, tratamiento por
ultrasonidos, rotura mecánica, o mediante el uso de agentes de
lisado de células.
El grado deseado de pureza depende del uso a que
se destine la proteína. Un grado relativamente alto de pureza es
deseable cuando la proteína se usa, por ejemplo, para ser
administrada in vivo. De manera ventajosa, los polipéptidos
TRAIL-R se purifican de manera tal que ninguna banda
de proteína que correspondan a otras proteínas (no
TRAIL-R) sean detectables durante el análisis
mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE). Un técnico experto en el campo
pertinente reconocerá que mediante SDS-PAGE pueden
visualizarse múltiples bandas correspondientes a la proteína
TRAIL-R, debido a la glucosilación diferencial, al
tratamiento post-tradución diferencial, y
similares. Lo más preferiblemente, la TRAIL-R se
purifica hasta una homogeneidad substancial, tal como se indica
mediante una banda de proteína única durante el análisis mediante
SDS-PAGE. La banda de proteína puede visualizarse
mediante teñido con plata, teñido con azul Coomassie, o (si la
proteína está radiomarcada) mediante autoradiografía.
La presente invención abarca a
TRAIL-R en varias formas, incluyendo aquellas que se
producen de manera natural o que se producen a través de diversas
técnicas tales como procedimientos que implican la tecnología de DNA
recombinante. Dichas formas de TRAIL-R incluyen,
pero sin limitarse a ellas, fragmentos, derivados, variantes, y
oligómeros de TRAIL-R, así como proteínas de fusión
que contienen TRAIL-R o fragmentos del mismo, tal
como se establece en las reivindicaciones.
El TRAIL-R puede modificarse para
crear derivados del mismo, mediante la formación de conjugados
covalentes o agregados con otras partes químicas, tales como grupos
glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los
derivados covalentes de TRAIL-R pueden prepararse
mediante el ligamiento de partes químicas a grupos funcionales sobre
las cadenas laterales de aminoácidos del TRAIL-R o
en los N-terminales o C-terminales
de un polipéptido TRAIL-R. Los conjugados que
comprenden agentes de diagnóstico (detectables) o terapéuticos
unidos al TRAIL-R se contemplan aquí, tal como se
expone con mayor detalle más adelante.
Otros derivados de TRAIL-R dentro
del alcance de esta invención, incluyen conjugados covalentes o
agregados de polipéptidos TRAIL-R con otras
proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivo
recombinante como fusiones N-terminales o
C-terminales. Los ejemplos de proteínas de fusión se
exponen más adelante en relación con oligómeros
TRAIL-R. Además, las proteínas de fusión que
contienen TRAIL-R pueden comprender péptidos
agregados para facilitar la purificación e identificación del
TRAIL-R. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo,
poly-Hys o los péptidos de identificación
antigénicos descritos en la Patente de EE.UU. No. 5.011.912, y en
Hopp y otros, Bio/Tecnology, vol. 6, pág. 1204, (1988). Uno
de dichos péptidos es el péptido Flag^{R},
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,
el cual es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido
reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, lo que
permite el rápido ensayo y la fácil purificación de la proteína
recombinante expresada. Un hibridoma múrido designado como 4E11
produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido Flag^{R} en
presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, tal como se
describe en la Patente de EE.UU. 5.011.912. La línea de células de
hibridoma 4E11 ha sido depositada en el American Type Culture
Collection bajo el número de registro HB 9259. Los anticuerpos
monoclonales que se unen al péptido Flag^{R} se encuentran
disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems
Division, New Haven, Connecticut.
En la presente invención, se proporcionan tanto
las formas unida a la membrana de la célula como la soluble
(secretada) de TRAIL-R. El TRAIL-R
soluble puede identificarse (y distinguirse de las contrapartes
unidas a la membrana no soluble) mediante la separación de las
células intactas que expresan un polipéptido TRAIL-R
a partir del medio de cultivo, p. ej., mediante centrifugación, y
ensayo del medio (sobrenadante) para determinar la presencia de la
proteína deseada. La presencia de TRAIL-R en el
medio indica que la proteína ha sido secretada a partir de las
células y, de acuerdo con ello, es una forma soluble de la proteína
deseada.
Las formas solubles de las proteínas receptores
carecen, típicamente, de la región transmembrana que causaría la
retención de la proteína sobre la superficie de la célula. En una
realización de la invención, un polipéptido TRIAL-R
soluble comprende el dominio extracelular de la proteína. Un
polipéptido TRIAL-R soluble puede incluir el dominio
citoplásmico, o una porción del mismo, siempre y cuando que el
polipéptido haya sido secretado a partir de la célula en la cual se
ha producido. Un ejemplo de un TRAIL-R soluble es un
TRAIL-R humano soluble que comprende los aminoácidos
52 a 210 de la SEC ID NO:2. Otros polipéptidos
TRAIL-R solubles incluyen, pero sin limitarse a
ellos, polipéptidos que comprenden los aminoácidos x a 210 de la SEC
ID NO:2, en donde x es un número entero desde 51 hasta 59.
Las formas solubles de TRAIL-R
poseen ciertas ventajas sobre la forma unida a la membrana de la
proteína. La purificación de la proteína a partir de células
huéspedes recombinantes se faclita, dado que las proteínas solubles
son secretadas a partir de las células. Además, las proteínas
solubles son generalmente más adecuadas para ciertas aplicaciones,
p. ej., para administración intravenosa.
En la presente invención, se proporcionan
fragmentos de TRAIL-R. Dichos fragmentos pueden
prepararse mediante cualquiera de entre un cierto número de técnicas
convencionales. Los fragmentos péptidos deseados pueden ser
sintetizados químicamente. Una alternativa implica la generación de
fragmentos de TRAIL-R mediante digestión enzimática,
p. ej., mediante tratamiento de la proteína con una enzima conocida
para la escisión de proteínas en sitios definidos mediante restos de
aminoácidos particulares. Otra técnica adecuada aún, implica el
aislamiento y amplificación de un fragmento de DNA que contiene la
codificación de un fragmento polipéptido deseado, mediante la
reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que
definen las terminaciones deseadas del fragmento de DNA se usan como
los cebadores 5' y 3' en la PCR.
Los ejemplos de fragmentos son los establecidos
en las reivindicaciones. Los fragmentos derivados a partir del
dominio citoplásmico encuentran su utilidad en estudios de la
transducción de la señal mediada por TRAIL-R, y en
la regulación de procesos celulares asociados con la transducción de
señales biológicas. Igualmente, los fragmentos de polipéptido
TRAIL-R pueden usarse como inmunógenos, en la
generación de anticuerpos. Las realizaciones particulares están
dirigidas a fragmentos del polipéptido TRAIL-R que
retienen la capacidad para unirse a TRAIL. Un fragmento de este tipo
puede ser un polipéptido TRAIL-R soluble, tal como
se describe más adelante.
En la presente invención, se proporcionan las
variantes que se producen de manera natural de la proteína
TRAIL-R de la SEC ID NO:2. Dichas variantes
incluyen, por ejemplo, proteínas que resultan de episodios de corte
y empalme de mRNA alternos, o de la escisión proteolítica de la
proteína TRAIL-R. El corte y emplame alterno de mRNA
puede producir, por ejemplo, una proteína TRAIL-R
truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble que
se produce de manera natural de la proteína. Las variaciones
atribuibles a la proteolísis incluyen, por ejemplo, diferencias en
los N- o C-terminales durante la expresión en
diferentes tipos de células huéspedes, debido a la separación
proteolítica a partir de uno o más aminoácidos terminales de la
proteína TRAIL-R (generalmente a partir de
1-5 aminoácidos terminales). Las proteínas
TRAIL-R en las cuales las diferencias en la
secuencia de aminoácidos son atribuibles a polimorfismo genético
(variación alélica entre individuos que producen la proteína) son
igualmente contempladas en la presente invención.
El técnica experto reconocerá igualmente que la
posición(es) en la cual se escinde el péptido señal puede
diferir de la predecida por el programa de ordenador, y puede variar
de acuerdo con factores tales como el tipo de células huéspedes
usadas en la expresión de un polipéptido TRAIL-R
recombinante. Una preparación de proteína puede incluir una mezcla
de moléculas de proteína que tengan aminoácidos
N-terminal diferentes, resultantes de la escisión
del péptido señal en más de un sitio. Tal como se ha expuesto
anteriormente, las realizaciones particulares de proteínas
TRAIL-R maduras proporcionadas aquí, incluyen, pero
sin limitarse a ellas, proteínas que tienen el resto en la posición
51, 52, 54, 56, ó 59 de la SEC ID NO:2, como el aminoácido
N-terminal.
Con respecto a la exposición aquí de varios
dominios de la proteína TRAIL-R, el técnico experto
reconocerá que los límites anteriormente descritos de dichas
regiones de la proteína son aproximados. Como ilustración de ello,
los límites de la región transmembrana (los cuales pueden predecirse
usando programadas de ordenador disponible para tal fin) pueden
diferir de los descritos anteriormente. De acuerdo con ello, se
contemplan aquí los polipéptidos TRAIL-R solubles en
los cuales el C-terminal del domino extracelular
difiere del resto así identificado anteriormente.
Las sondas basadas en la secuencia de DNA humano
de la SEC ID NO:3 o la SEC ID NO:1, pueden usarse para rastrear
bibliotecas de cDNA derivadas a partir de otras especies de
mamíferos, usando técnicas de hibridación de entrecruzamiento de
especies convencionales.
Las secuencias de DNA de TRAIL-R
pueden variar de las secuencias nativas aquí descritas. Debido a la
conocida degeneración del código genético, en el que más de un codón
puede contener la codificación del mismo aminoácido, una secuencia
de DNA puede variar de la mostrada en la SEC ID NO:1 y además
contener el código de una proteína TRAIL-R que tenga
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. Dichas variantes de
secuencias de DNA pueden provenir de mutaciones silenciosas (p. ej.,
producidas durante amplificación por PCR), o pueden ser el producto
de la mutagénesis deliberada de una secuencia nativa. De acuerdo con
ello, entre las secuencias de DNA aquí proporcionadas se encuentran
secuencias TRAIL-R nativas (p. ej., cDNA que
comprende la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID NO:1)
y DNA que está degenerado como un resultado del código genético con
respecto a una secuencia de DNA de TRAIL-R
nativa.
Entre los polipéptidos TRAIL-R
aquí descritos, se encuentran variantes de polipéptidos
TRAIL-R nativos que retienen una actividad biológica
de un TRAIL-R nativo. Dichas variantes incluyen
polipéptidos que son substancialmente homólogos a
TRAIL-R nativos, pero que tienen una secuencia de
aminoácidos diferente de la de un TRAIL-R nativo
debido a una o más deleciones, inserciones o substituciones. Las
realizaciones particulares incluyen, pero sin limitarse a ellas,
polipéptidos TRAIL-R que comprenden desde una hasta
diez deleciones, inserciones o substituciones de restos de
aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia
TRAIL-R nativa. Los DNAs que contienen la
codificación de los TRAIL-R aquí descritos, incluyen
variantes que difieren de una secuencia de DNA de
TRAIL-R nativo, debido a una o más deleciones,
inserciones o substituciones, pero que contienen el código de un
polipéptido TRAIL-R biológicamente activo. Una
actividad biológica del TRAIL-R es la capacidad para
unirse a TRAIL.
En la presente invención, se describen moléculas
de ácido nucléico capaces de hibridación al DNA de la SEC ID NO:1 o
la SEC ID NO:2, bajo condiciones moderadamente restrictivas o
altamente restrictivas, y las cuales contiene el código de un
TRAIL-R biológicamente activo. Dichos ácidos
nucléicos de hibridación incluyen, pero sin limitarse a ellos,
secuencias de DNA variantes y DNA derivado a partir de especies no
humanas, p. ej., mamíferos no humanos.
Las condiciones moderadamente restrictivas
incluyen condiciones descritas, por ejemplo, por Sambrook y otros,
en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. I,
págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989). Las condiciones para una restricción moderada, tal
son definidas por Sambrook y otros, incluyen el uso de una solución
de prelavado de 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y
condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5X SSC, durante
una noche. Las condiciones altamente restrictivas incluyen
temperaturas más altas de hibridación y lavado. Una realización de
la invención está dirigida a secuencias de DNA que se hibridan al
DNA de las SEC ID NOS:1 ó 3 bajo condiciones altamente restrictivas,
en donde dichas condiciones incluyen la hibridación a 68ºC seguido
de lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 63-68ºC.
En las realizaciones particulares de la
invención, un polipéptido TRAIL-R variante difiere
en la secuencia de aminoácidos de un TRAIL-R nativo,
pero es substancialmente equivalente a un TRAIL-R
nativo en cuanto a una actividad biológica. Un ejemplo es un
TRAIL-R variante que se une a TRAIL con
esencialmente la misma afinidad de unión que lo hace un
TRAIL-R nativo. La afinidad de unión puede medirse
mediante procedimientos convencionales, p. ej., tales como los
descritos en la Patente de EE.UU. No. 5.512.457.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden
comprender substitución(es) conservadora(s), lo que
significa que uno o más restos de aminoácidos de un
TRAIL-R nativo está reemplazado por un resto
diferente, pero que el TRAIL-R substituido de manera
conservadora retiene una actividad biológica deseada de la proteína
nativa (p. ej., la capacidad de unirse a TRAIL). Un aminoácido dado
puede ser reemplazado por un resto que tenga características
fisicoquímicas similares. Los ejemplos de substituciones
conservadoras incluyen la substitución de un resto alifático por
otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o substituciones de un
resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y
Asn. Otras substituciones conservadoras, p. ej., que implican
substituciones de regiones enteras que tienen características de
hidrofobicidad similares, son bien conocidas.
En otro ejemplo de variantes, las secuencias que
tienen la codificación de restos Cys que no son esenciales para la
actividad biológica, pueden alterarse para dar lugar a que los
restos Cys sean eliminados o reemplazados por otros aminoácidos,
previniendo la formación de puentes disulfuro intramoleculares
incorrectos durante la renaturalización. Ciertos receptores de la
familia TNF-R contienen motivos repetidos ricos en
cisteína en sus dominios extracelulares (Marsters y otros, J.
Biol. Chem., vol. 267, págs. 5747-5750, (1992)).
Estas repeticiones se estima que son importantes para la unión de
ligandos. Con el fin de ilustrarlas, Marsters y otros, véase cita
anterior, han informado que los polipéptidos tipo I del
TNF-R soluble que carecen de una de las repeticiones
muestran una reducción de diez veces en la afinidad de unión por el
TNF\alpha y el TNF\beta; la deleción de la segunda repetición da
como resultado una pérdida completa de unión detectable de los
ligandos. El TRAIL-R humano de la SEC ID NO:2
contiene dos de dichas repeticiones ricas en cisteína, incluyendo el
primero los restos 94 a 137, e incluyendo el segundo los restos 138
a 178. Los restos de cisteína dentro de estos dominios ricos en
cisteína permanecen de manera ventajosa inalterados en los
TRAIL-R variantes, cuando se desea la retención de
la actividad de unión del TRAIL.
Con el fin de potenciar la expresión en sistemas
de levadura en los cuales está presente la actividad KEX2 proteasa,
se prepararon otras variantes mediante la modificación de restos
aminoácidos dibásicos adyacentes. La EP 212.914 describe el uso de
mutagénesis específica del sitio para inactivar sitios de
tratamiento de KEX2 proteasa en una proteína. Los sitios de
tratamiento de KEX2 proteasa son inactivados mediante la deleción,
adición o substitución de restos para alterar pares
Arg-Arg, Arg-Lys, y
Lys-Arg con el fin de eliminar la incidencia de
estos restos básicos adyacentes. El TRAIL-R humano
maduro contiene dichos pares de restos básicos adyacentes en los
aminoácidos 72-73, 154-155,
322-323, 323-324, y
359-360 de la SEC ID NO:2. Las parejas
Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a
la escisión mediante KEX2, y la conversión de
Arg-Lys o Lys-Arg a
Lys-Lys, representa una vía conservadora y preferida
para la inactivación de sitios KEX2.
Los polipéptidos TRAIL-R,
incluyendo las variantes y fragmentos de los mismos, pueden
ensayarse para determinar su actividad biológica en cualquier ensayo
adecuado. La capacidad de un polipéptido TRAIL-R
para unirse a TRAIL, puede confirmarse en ensayos de unión
convencionales, ejemplos de los cuales se describen aquí más
adelante.
La presente invención proporciona igualmente
vectores de expresión y clonación recombinantes que contienen el DNA
de TRAIL-R, así como la célula huésped que contiene
los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden
el DNA de TRAIL-R pueden usarse para preparar
polipéptidos TRAIL-R codificados por el DNA. Un
procedimiento para la producción de polipéptidos
TRAIL-R comprende el cultivo de células huéspedes
transformadas con un vector de expresión recombinante que contiene
la codificación de TRAIL-R, bajo condiciones que
promueven la expresión de TRAIL-R y, a continuación,
la recuperación de los polipéptidos TRAIL-R a partir
del cultivo. El técnico experto reconocerá que el procedimiento para
la purificación del TRAIL-R expresado variará de
acuerdo con factores tales como el tipo de células huéspedes usadas,
y de si el TRAIL-R es una forma unida a la membrana
o si es una forma soluble que está secretada a partir de la célula
huésped.
Puede usarse cualquier sistema de expresión
adecuado. Los vectores incluyen un DNA que contiene la codificación
de un polipéptido TRAIL-R, ligado de manera
operativa a secuencias de nucleótidos reguladores de la
transcripción o la traducción, tales como las derivadas a partir de
un gen mamífero, microbiano, vírico, o de insecto. Los ejemplos de
secuencias reguladoras incluyen promotores de transcripción,
operadores, o potenciadores, un sitio de unión ribosómico mRNA, y
secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de
la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están
ligadas de manera operativa cuando la secuencia reguladora se
refiere funcionalmente a la secuencia de DNA de
TRAIL-R. De acuerdo con ello, una secuencia de
nucleótido promotor está ligada de manera operativa a una secuencia
de DNA de TRAIL-R si la secuencia de nucleótido
promotor controla la transcripción de la secuencia de DNA de
TRAIL-R. Generalmente, dentro del vector de
expresión se incorpora un origen de replicación que confiere la
capacidad para replicarse en las células huéspedes deseadas, y un
gen de selección mediante el cual se identifican los
transformantes.
Además, dentro de los vectores de expresión puede
incorporarse una secuencia que contiene la codificación de un
péptido señal apropiado (nativo u homólogo). Una secuencia de DNA
para un péptido señal (conductor secretor) puede fusionarse en el
marco de lectura de la secuencia de TRAIL-R, de
manera tal que el TRAIL-R es inicialmente traducido
como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un
péptido señal que es funcional en la células huéspedes deseadas
promueve la secreción extracelular del polipéptido
TRAIL-R. El péptido señal se escinde del polipéptido
TRAIL durante la secreción del TRAIL-R a partir de
la célula.
Las células huéspedes adecuadas para la expresión
de polipéptidos TRAIL-R incluyen procariotas,
levadura o células eucarióticas superiores. Generalmente, las
células de mamífero o de insecto son las preferidas para uso como
células huéspedes. Los vectores de expresión y clonación apropiados
para uso con células huéspedes bacterianas, fúngicas, de levadura y
de mamífero, se describen, por ejemplo, por Pouwels y otros, en
Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York,
(1985). Igualmente, podrían usarse sistemas de traducción libres de
célula para producir polipéptidos TRAIL-R usando
RNAs derivados a partir de constructos de DNA aquí descritos.
Las procariotas incluyen organismos gram
negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o
Bacilli. Las células huéspedes procarióticas adecuadas para
transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium, y otras diversas especies dentro de los
géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una
célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido
TRAIL-R puede incluir un resto metionina
N-terminal para facilitar la expresión del
polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met
N-terminal puede ser escindida a partir del
polipéptido TRAIL-R recombinante expresado.
Los vectores de expresión para uso en células
procarióticas comprenden, generalmente, uno o más genes marcadores
seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotípico
es, por ejemplo, un gen que contiene la codificación de una proteína
que confiere resistencia a antibióticos o que suministra una
exigencia autotrófica. Los ejemplos de vectores de expresión útiles
para células procarióticas incluyen los derivados a partir de
plásmidos disponibles comercialmente tal como el vector de clonación
pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a la
ampicilina y tetraciclina y, de esta forma, proporciona medios
simples para la identificación de células transformadas. Dentro del
vector pBR322 están insertadas un promotor apropiado y una secuencia
de DNA de TRAIL-R. Otros vectores disponibles
comercialmente incluyen, por ejemplo, el pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y el pGEM1 (Promega
Biotec, Madison, WI, USA).
Las secuencias promotoras comúnmente usadas para
vectores de expresión de células huéspedes procarióticas
recombinantes incluyen \beta-lactamasa
(penicilinasa), sistema promotor lactosa (Chang y otros,
Nature, vol. 275, pág. 615, (1978); y Goeddel y otros,
Nature, vol. 281, pág. 544, (1979)), sistema promotor
triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucl. Acids Res., vol. 8,
pág. 4057, (1980); y EP-A-36776) y
el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 112, (1982)). Un
sistema de expresión de célula huésped procariótica particularmente
útil usa un fago \lambda del promotor P_{L} y una secuencia
represora termolábil cI857ts. Los vectores plásmidos disponibles del
American Type Culture Collection que incorporan derivados del fago
\lambda del promotor P_{L}, incluyen el plásmido pHUB2
(residente en la cepa JMB9 de E. coli, ATCC 38092) y el
pPLc28 (residente en RR1 de E. coli, ATCC 53082).
Como alternativa, el TRAIL-R
puede expresarse en células huéspedes de levadura, preferiblemente a
partir del género Saccharomyces (p. ej., S.
cerevisiae). Igualmente, pueden usarse otros géneros de
levadura, tal como Pichia o Kluyveromyces. Los
vectores de levadura frecuentemente contienen una secuencia de
origen de replicación procedente de un plásmido de levadura de 2
\mu, una secuencia replicante autónomamente (ARS), una región
promotor, secuencias para poliadenilación, secuencia para
terminación de transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las
secuencias promotoras adecuadas para vectores de levaduras incluyen,
entre otras, promotores para metalotioneina,
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J.
Biol. Chem., vol. 255, pág. 2073, (1980)) u otras enzimas
glucolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg., vol. 7, pág.
149, (1968); y Holland y otros, Biochem., vol. 17, pág. 4900,
(1978)), tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfo-glucosa isomerasa, y
glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la
expresión en levaduras se describen adicionalmente por Hitzeman en
la EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2
reprimible mediante glucosa descrito por Russell y otros (J.
Biol. Chem., vol. 258, pág. 2674, (1982)) y Beier y otros
(Nature, vol. 300, pág. 724, (1982)). Los vectores lanzadera
replicables tanto en levadura como en E. coli pueden
construirse mediante la inserción de secuencias de DNA procedentes
de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen
Amp^{r} y origen de replicación) dentro de los vectores de
levadura anteriormente descri-
tos.
tos.
La secuencia conductora factor \alpha de
levadura puede usarse para dirigir la secreción del polipéptido
TRAIL-R. La secuencia conductora factor \alpha se
inserta, frecuentemente, entre la secuencia promotor y la secuencia
del gen estructural. Véase, p. ej., Kurjan y otros, Cell,
vol. 30, pág. 933, (1982) y Bitter y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, vol. 81, pág. 5330, (1984). Otras secuencias
conductoras adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos
recombinantes a partir de huéspedes de levadura son conocidas por
los expertos en la técnica. Una secuencia conductora puede
modificarse cerca de su extremo 3' con el fin de contener uno o más
sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia
conductora al gen estructural.
Los protocolos de transformación de levadura son
conocidos por los expertos en la técnica. Uno de dichos protocolos
es el descrito por Hinnen y otros, en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 75, pág. 1929, (1978). El protocolo de Hinnen y otros,
selecciona para transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en
el que el medio selectivo está formado por base de nitrógeno de
levadura al 0,67%, ácidos casamino al 0,5%, glucosa al 2%, 10
\mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.
Las células huéspedes de levadura transformadas
mediante vectores que contienen una secuencia promotor ADH2 pueden
desarrollarse para la inducción de la expresión en un medio
"rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que comprende
extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1%,
suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo.
La desrepresión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la
glucosa del medio.
Los sistemas de cultivo de células huéspedes de
mamíferos o insectos pueden usarse, igualmente, para expresar
polipéptidos TRAIL-R recombinantes. Los sistemas de
Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células
de insectos han sido revisados por Luckow y Summers, en
Bio/Technology, vol. 6, pág. 47, (1988). Igualmente, pueden
usarse líneas de células establecidas de origen mamífero. Los
ejemplos de líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas
incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono
(ATCC CRL 1651) (Gluzman y otros, Cell, vol. 23, pág. 175,
(1981)), células L, células C127 (ATCC CCL 163), células de ovario
de hamster chino (CHO), células HeLa, y líneas de células BHK (ATCC
CRL 10), y la línea de células CV1/EBNA derivada a partir de la
línea de células de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70),
tal como ha sido descrita por McMahan y otros (EMBO J., vol.
10, pág. 2821, (1991).
Las secuencias de control de transcripción y de
traducción para vectores de expresión de células huéspedes de
mamíferos pueden escindirse a partir de genomas víricos. Las
secuencias promotoras y las secuencias potenciadoras comúnmente
usadas derivan a partir del virus Polyoma, Adenovirus 2, Virus
símico 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA
derivadas a partir del genoma del virus SV40, por ejemplo, el origen
SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, corte y empalme, y
sitios de poliadenilación, pueden usarse para proporcionar otros
elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen
estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores
temprano y tardío víricos son particularmente útiles dado que ambos
son fácilmente obtenidos a partir de un genoma vírico en forma de un
fragmento, el cual, puede contener, igualmente, un origen de
replicación vírico (Fiers y otros, Nature, vol. 273, pág.
113, (1978)). Igualmente, pueden usarse fragmentos SV40 más grandes
o más pequeños, siempre y cuando esté incluida la secuencia de
aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia
el sitio Bgl I localizada en el origen de replicación vírico
SV40.
Los vectores de expresión para uso en células
huéspedes de mamíferos pueden construirse, por ejemplo, tal como ha
sido descrito por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol., vol. 3,
pág. 280, (1983)). Un sistema útil para la expresión de alto nivel
estable de cDNAs de mamíferos en células epiteliales mamarias
múridas C127, puede construirse substancialmente tal como ha sido
descrito por Cosman y otros (Mol. Immunol., vol. 23, pág.
935, (1986)). Un vector de alta expresión, el PMLSV N1/N4, descrito
por Cosman y otros, en Nature, vol. 312, pág. 768, (1984), ha
sido depositado como ATCC 39890. En la
EP-A-0367566 y en WO 91/18982, se
describen vectores de expresión de mamíferos adicionales. Como una
alternativa, el vector puede derivar a partir de un retrovirus. La
sobreexpresión de TRAIL-R de longitud total ha dado
como resultado el ampollamiento de la membrana y la condensación
nuclear de células CV-1/EBNA transfectadas, lo que
indica que el mecanismo de la muerte celular fue la apoptosis. Para
células huéspedes en las cuales se produce dicha apoptosis mediada
por TRAIL-R, puede incluir en el sistema de
expresión un inhibidor adecuado de la apoptosis.
Para inhibir la apoptosis inducida por
TRAIL-R de células huéspedes que expresan
TRAIL-R recombinante, las células pueden
co-transfectarse con un vector de expresión que
contenga la codificación de un polipéptido que funcione como un
inhibidor de la apoptosis. Los vectores de expresión que contienen
la codificación de dichos polipéptidos pueden prepararse mediante
procedimientos convencionales. Otra vía implica la adición de un
inhibidor de la apoptosis al medio de cultivo. En los Ejemplos 6 y 8
se ilustra el uso de poxvirus CrmA, baculovirus P35, un fragmento
C-terminal de FADD, y el derivado tripéptido
zVAD-fmk, para reducir la muerte de células
huéspedes.
El zVAD-fmk
(benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometil-cetona)
es un compuesto con base tripéptida, disponible de Enzyme System
Products, Dublin, California. Tal como se ilustra en el Ejemplo 8,
el zVAD-fmk puede agregarse al medio en el cual se
han cultivado las células que expresan TRAIL-R. La
proteína derivada de la viruela del ganado vacuno de 38 kilodaltons
designada posteriormente como CrmA, ha sido descrita por Pickup y
otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, págs.
7698-7702, (1986)). La información de la secuencia
para CrmA se presenta en la Figura 4 de Pickup y otros, véase cita
anterior. Una vía para la producción y purificación de la proteína
CrmA ha sido descrita por Ray y otros (Cell, vol. 69, págs.
597-604, (1992)).
Una proteína de 35 kilodaltons codificada por el
virus polihedrosis nuclear Autographa californica, ha sido
descrito por Friesen y Miller (J. Virol., vol. 61, págs.
2264-2272, (1987)). La información de la secuencia
para esta proteína, designada aquí como baculovirus p35, se presenta
en la Figura 5 de Friesen y Miller, véase cita anterior.
La proteína citoplásmica que contiene el dominio
muerte FADD (también conocido como MORT1), ha sido descrita por
Boldin y otros (J. Biol. Chem., vol. 270, págs.
7795-7798, (1995)). Se ha informado que FADD se
asocia, directamente o indirectamente, con el dominio muerte
citoplásmico de ciertos receptores que median en la apoptosis
(Boldin y otros, Cell, vol. 85, págs.
803-815, (Junio 1996); Hsu y otros, Cell,
vol. 84, págs. 299-308, (1996)).
En una realización de la presente invención, los
polipéptidos FADD truncados que incluyen el dominio muerte
(localizado en la porción C-terminal de la
proteína), pero que carecen de la región N-terminal
a la cual se la ha atribuido las funciones efectoras de la
apoptosis, se usan para reducir la apoptosis. El uso de polipéptidos
mutantes con deleción de FADD, truncados en el
N-terminal, para inhibir la muerte de las células
que expresan otros receptores que inducen la apoptosis, ha sido
descrito por Hsu y otros (Cell, vol. 84, págs.
299-308, (1996)).
Esta vía se ilustra en el Ejemplo 8, el cual usa
un polipéptido negativo FADD-dominante
(FADD-DN) adecuado, que tiene una secuencia de
aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 117 a 245 de la
secuencia de aminoácidos MORT1 presentada por Boldin y otros (J.
Biol. Chem., vol. 270, págs. 7795-7798, (1995)).
En el Ejemplo 8, las células se co-transfectaron con
un vector de expresión que contiene la codificación de
TRAIL-R, y con un vector de expresión que contiene
la codificación del péptido Flag^{R} anteriormente descrito,
fusionado al N-terminal del polipéptido
FADD-DN.
Sin desear teorizar, una posible explicación es
que los fragmentos C-terminales de FADD se asocian
con el dominio muerte intracelular del receptor, pero carece de la
porción N-terminal de la proteína que es necesaria
para efectuar la apoptosis (Hsu y otros, Cell, vol. 84, págs.
299-308, (Junio 1996); Boldin y otros, Cell,
vol. 85, págs. 803-815, (Junio 1996)). De acuerdo
con ello, el FADD truncado puede bloquear la asociación del FADD de
longitud total, endógeno, con el dominio muerte del receptor;
consecuentemente, está inhibida la apoptosis que se iniciaría
mediante dicho FADD endógeno.
Otros inhibidores de la apoptosis útiles en
sistemas de expresión de la presente invención, pueden identificarse
en procedimientos de ensayo convencionales. Uno de dichos ensayos,
en el cual los compuestos se ensayan para determinar la capacidad
para reducir la apoptosis de las células que expresan
TRAIL-R, se encuentra descrito en el Ejemplo 8.
El poxvirus CrmA, el baculovirus P35, y el
zVAD-fmk son inhibidores caspasa víricos. Otros
inhibidores caspasa pueden ensayarse para determinar la capacidad
para reducir la muerte de células mediada por
TRAIL-R.
El uso de CrmA, de baculovirus p35, y ciertos
péptidos derivados (incluyendo el zVAD-fmk), como
inhibidores de la apoptosis en células/sistemas particulares, ha
sido expuesto por Sarin y otros (J. Exp. Med., vol. 184,
págs. 2445-2450, (Diciembre 1996)). El papel de las
proteasas de la familia de la enzima que convierte la
interleuquina-1\beta (ICE) en las cascadas de
transducción de la señal que conducen a la muerte programada de
células, y el uso de inhibidores de dichas proteasas para bloquear
la apoptosis, ha sido expuesta por Sarin y otros, véase cita
anterior, y Muzio y otros, (Cell, vol. 85, págs.
817-827, (1996)).
Generalmente, los inhibidores de la apoptosis no
necesitan ser usados para la expresión de polipéptidos
TRAIL-R que carecen del dominio citoplásmico (es
decir, que carecen de la región de la proteína implicada en la
trasducción de la señal). De acuerdo con ello, los sistemas de
expresión para la producción de polipéptidos TRAIL-R
solubles que comprenden únicamente el dominio extracelular (o un
fragmento del mismo), no necesitan incluir uno de los inhibidores de
la apoptosis anteriormente descritos.
Con respecto a los péptidos señal que pueden
usarse en la producción de TRAIL-R, el péptido señal
nativo de TRAIL-R puede ser reemplazado, si se
desea, por un péptido señal heterólogo o una secuencia conductora.
La selección del péptido señal o conductor depende de factores tales
como el tipo de células huéspedes en las cuales ha de producirse el
TRAIL-R recombinante. Como ilustración, los ejemplos
de péptidos señal heterólogos que son funcionales en las células
huéspedes de mamífero, incluyen la secuencia señal para la
interleuquina-7 (IL-7) descrita en
la Patente de EE.UU. 4.965.195, la secuencia señal para el receptor
de interleuquina-2 descrita por Cosman y otros,
(Nature, vol. 312, pág. 768, (1984)); el péptido señal
receptor de interleuquina-4 descrito en la EP
367.566; el péptido señal del receptor de
interleuquina-1 del tipo I descrito en la Patente de
EE.UU. 4.968.607; y el péptido señal del receptor de
interleuquina-1 del tipo II descrito en la EP
460.846.
Abarcados por la presente invención, se
encuentran oligómeros que contienen polipéptidos
TRAIL-R. Los oligómeros TRAIL-R
pueden estar en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros
superiores, ligados covalentemente o ligados no covalentemente.
Una realización de la invención está dirigida a
oligómeros que comprenden polipéptidos TRAIL-R
múltiples unidos a través de interacciones covalentes o no
covalentes entre partes péptidas fusionadas a los polipéptidos
TRAIL-R. Dichos péptidos pueden ser ligadores
péptidos(espaciadores) o péptidos que tienen la propiedad de
promover la oligomerización. Los cerradores de leucina y ciertos
polipéptidos derivados a partir de anticuerpos se encuentran entre
los péptidos que pueden promover la oligomerización de polipéptidos
TRAIL-R unidos a ellos, tal como se describe con
mayor detalle más adelante.
En realizaciones particulares, los oligómeros
comprenden desde dos hasta cuatro polipéptidos
TRAIL-R. Las partes TRAIL-R del
oligómero pueden ser polipéptidos solubles, tal como se ha descrito
anteriormente.
Como una alternativa, un oligómero
TRAIL-R se prepara usando polipéptidos derivados a
partir de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión
que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a
diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos
(incluyendo el domino Fc) ha sido descrita, p. ej., por Ashkenazi y
otros (PNAS USA, vol. 88, pág. 10533, (1991); Byrn y otros
(Nature, vol. 346, pág. 677, (1990); y Hollenbaugh y
Aruffo("Construcción de proteínas de fusión de inmunoglobulina"
en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, págs.
10.19.1-10.19.11, (1992)).
Una realización de la presente invención está
dirigida a un dímero TRAIL-R que comprende dos
proteínas de fusión creadas mediante la fusión de
TRAIL-R a la región Fc de un anticuerpo. Una fusión
de un gen que contiene la codificación de la proteína de fusión
TRAIL-R/Fc está insertado dentro de un vector de
expresión apropiado. Las proteínas de fusión
TRAIL-R/Fc están expresadas en células huéspedes
transformadas con el vector de expresión recombinante, y más
predispuestas a ensamblar moléculas anticuerpo, con lo cual se
forman uniones disulfuro intercadena entre las partes Fc para
proporcionar TRAIL-R divalente.
Lo que se proporcionan aquí, son proteínas de
fusión que comprenden un polipéptido TRAIL-R
fusionado a un polipéptido Fc derivado a partir de un anticuerpo.
Igualmente, se proporciona el DNA que contiene la codificación de
dichas proteínas de fusión, así como dímeros que contienen dos
proteínas de fusión unidas a través de enlaces disulfuro entre
partes Fc de los mismos. El término "polipéptido Fc" tal como
aquí se usa, incluye formas nativas y muteínas de polipéptidos
derivados a partir de la región Fc de un anticuerpo. Igualmente, se
incluyen las formas truncadas de dichos polipéptidos conteniendo la
región bisagra que promueve la dimerización.
Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la
Solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena sencilla que
se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta
la C-terminal nativa de la región Fc de un
anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil, es la muteína Fc
descrita en la Patente de EE.UU. 5.457.035 y por Baum y otros
(EMBO J., vol. 13, págs. 3992-4001, (1994)).
La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la
secuencia Fc nativa presentada en WO 93/10151, excepto que el
aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha
sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de
Gly a Ala. La muteína muestra afinidad reducida por los receptores
Fc.
En otras realizaciones, el
TRAIL-R puede substituirse por la porción variable
de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo. Si las proteínas de
fusión se hacen tanto con cadenas ligeras como pesadas de un
anticuerpo, es posible formar un oligómero TRAIL-R
con tantas como cuatro regiones extracelulares
TRAIL-R.
Como alternativa, el oligómero es una proteína de
fusión que comprende múltiples polipéptidos TRAIL-R,
con o sin ligadores péptidos (péptidos espaciadores). Entre los
ligadores péptidos adecuados se encuentran los descritos en las
Patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233. Una secuencia de DNA que
contiene la codificación de un ligador péptido deseado puede
insertarse entre, y dentro del mismo marco de lectura, las
secuencias de DNA que contienen la codificación de
TRAIL-R, usando cualquier técnica convencional
adecuada. Por ejemplo, un oligonucleótido químicamente sintetizado
que contenga la codificación del ligador puede ligarse entre
secuencias que contienen la codificación del
TRAIL-R. En realizaciones particulares, una proteína
de fusión comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos
TRAIL-R solubles, separados por ligadores
péptidos.
Otro procedimiento para la preparación de
TRAIL-R oligómero implica el uso de un cerrador
leucina. Los dominios del cerrador leucina son péptidos que
promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se han
encontrado. Los cerradores leucina fueron originalmente
identificados en diversas proteínas de unión de DNA (Landschulz y
otros, Science, vol. 240, pág. 1759, (1988)), y están desde
que se han encontrado en una diversidad de proteínas diferentes.
Entre los cerradores leucina conocidos se encuentran péptidos que se
producen de manera natural y derivados de los mismos, que se
dimerizan o trimerizan. En la Solicitud PCT WO 94/10308, se
describen ejemplos de dominios de cerradores leucina adecuados para
la producción de proteínas oligómeras solubles, y el cerrador
leucina derivado a partir de proteína D tensioactiva de pulmón (SPD)
descrita por Hoppe y otros (FEBS Letters, vol. 344, pág. 191,
(1994)). El uso de un cerrador leucina modificado que permita la
trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a él, ha
sido descrito por Fanslow y otros (Semin. Immunol., vol. 6,
págs. 267-278, (1994)). Las proteínas de fusión
recombinantes que comprenden un polipéptido TRAIL-R
soluble fusionado a un péptido cerrador leucina se expresan en
células huéspedes adecuadas, y el TRAIL-R oligómero
soluble que forman se recupera a partir del sobranadante del
cultivo.
El TRAIL-R oligómero tiene la
propiedad de sitios de unión bivalentes, trivalentes, etc., para
TRAIL. Las proteínas de fusión anteriormente descritas que
comprenden partes Fc (y los oligómeros formados a partir de ellas),
ofrecen la ventaja de una fácil purificación mediante cromatografía
de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G. Se
proporcionan aquí secuencias de DNA que contienen la codificación de
TRAIL-R oligómero, o que contienen la codificación
de proteínas de fusión útiles en la preparación de oligómeros
TRAIL-R.
Las proteínas TRAIL-R (incluyendo
fragmentos, variantes, oligómeros, y otras formas de
TRAIL-R), pueden ensayarse para determinar la
capacidad de unirse a TRAIL en cualquier ensayo adecuado, tal como
un ensayo de unión convencional. A modo de ilustración, el
TRAIL-R puede marcarse con un reactivo detectable
(p. ej., un radionúclido, cromóforo, enzima que cataliza una
reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares). El
TRAIL-R se pone en contacto con células que expresan
TRAIL. A continuación, las células se lavan para separar el
TRAIL-R marcado no unido, y la presencia del
marcador unido a la célula se determina mediante una técnica
adecuada, seleccionada de acuerdo con la naturaleza del
marcador.
Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de unión
es el siguiente. Se construyó un vector de expresión recombinante
que contenía el cDNA de TRAIL-R, p. ej., tal como ha
sido descrito en la Solicitud PCT WO 97/01633. La información del
DNA y la secuencia de aminoácidos para TRAIL humano y múrido se
presenta en la WO 97/01633. El TRAIL comprende un dominio
citoplásmico N-terminal, una región transmembrana, y
un dominio extracelular C-terminal. Las células
CV-1-EBNA-1 en
discos de 10 cm^{2} se transfectaron con el vector de expresión
recombinante. Las células
CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478)
expresan de manera constitutiva el antígeno-1
nuclear del EBV impulsado a partir del potenciador/promotor temprano
inmediato del CMV. El
CV-1-EBNA-1 se
derivó a partir de la línea de células de riñón de mono verde
africano CV-1 (ATCC CCL 70), tal como ha sido
descrito por McMahan y otros (EMBO J., vol. 10, pág. 2821,
(1991)).
Las células transfectadas se cultivaron durante
24 horas y, a continuación, las células de cada disco se cortaron y
empalmaron dentro de una placa de 24 cavidades. Después de
cultivadas durante un período adicional de 48 horas, las células
transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/cavidad) se
lavaron con BM-NFDM, que es un medio de unión (RPMI
1640 conteniendo 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de
azida sódica, Hepes 20 mM, pH 7,2), al cual se habían agregado 50
mg/ml de leche en polvo desnatada. A continuación, las células se
incubaron durante 1 hora a 37ºC con varias concentraciones de una
proteína de fusión TRAIL-R/Fc soluble. A
continuación, las células se lavaron y se incubaron con una
concentración de saturación constante de un IgG antihunano de ratón
marcado con ^{125}I en medio de unión, con agitación suave durante
1 hora a 37ºC. Después de un lavado intenso, las células se
liberaron mediante tripsinización.
El IgG antihumano de ratón usado anteriormente
está dirigido contra la región Fc de IgG humano y puede obtenerse de
Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El
anticuerpo está radioyodado usando el procedimiento estándar de
cloramina T. El anticuerpo se une a la porción Fc de cualquier
proteína TRAIL-R/Fc que se haya unido a las células.
En todos los ensayos, la unión no específica del anticuerpo marcado
con ^{125}I se ensayó en la ausencia de
TRAIL-T/Fc, así como en la presencia de
TRAIL-R/Fc y un exceso 200 molar de anticuerpo IgG
anti-humano de ratón no marcado.
El anticuerpo marcado con ^{125}I unido a las
células se cuantificó sobre un contador Packard Autogamma. Los
cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci., vol.
51, pág. 660, (1949)) se generaron sobre RS/1 (Software, Boston, MA)
trabajando sobre un ordenador Microwax.
Otro tipo de ensayo de unión adecuado es un
ensayo de unión de competencia. A modo de ilustración, la actividad
biológica de una variante de TRAIL-R puede
determinarse ensayando la capacidad de las variantes para competir
con un TRAIL-R nativo por la unión a TRAIL.
Los ensayos de unión de competencia pueden
llevarse a cabo mediante metodología convencional. Los reactivos que
pueden usarse en los ensayos de unión de competencia incluyen
TRAIL-R radiomarcado y células intactas que expresan
TRAIL (endógeno o recombinante) sobre la superficie de la célula.
Por ejemplo, un fragmento de TRAIL-R soluble
radiomarcado puede usarse para competir con una variante de
TRAIL-R soluble por la unión al TRAIL de la
superficie de la célula. En lugar de células intactas, se podría
substituir una proteína de fusión TRAIL-R/Fc soluble
unida a una fase sólida mediante la interacción de una proteína A o
Proteína G (sobre la fase sólida) con la parte Fc. Las columnas
cromatográficas que contienen la Proteína A o la Proteína G incluyen
las disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ. Otro
tipo de ensayo de unión de competencia usa TRAIL soluble
radiomarcado, tal como una proteína de fusión
TRAIL-R/Fc soluble, y células intactas que expresan
TRAIL-R. Pueden obtenerse resultados cualitativos
mediante ensayos de unión en placa autoradiográficos, en tanto que,
para generar resultados cuantitativos, pueden usarse
representaciones Scatchard (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci.,
vol. 51, pág. 660, (1949)).
Otro tipo de ensayo para determinar la actividad
biológica, implica el ensayo de un polipéptido
TRAIL-R para determinar la capacidad de bloquear la
apoptosis mediada por TRAIL de células diana, tal como, por ejemplo,
la línea de células T leucémicas humanas, conocida como células
Jurkat. La apoptosis mediada por TRAIL de la línea de células
designada como Jurkat clon E6-1 (ATCC TIB 152) ha
sido demostrada en procedimientos de ensayo descritos en la
Solicitud PCT WO 97/01633.
Los usos del TRAIL-R incluyen,
pero sin limitarse a ellos, los siguientes. Algunos de estos usos
del TRAIL-R surgen de su capacidad para unirse a
TRAIL.
El TRAIL-R se usa como un
reactivo de purificación de proteínas. Los polipéptidos
TRAIL-R pueden unirse a un material soporte sólido y
usarse para purificar proteínas TRAIL mediante cromatografía de
afinidad. En realizaciones particulares, un polipéptido
TRAIL-R (en cualquier forma de las aquí descritas
que es capaz de unirse a TRAIL), está unido a un soporte sólido
mediante procedimientos convencionales. A modo de un ejemplo, se
encuentran disponibles columnas de cromatografía que contienen
grupos funcionales que reaccionan con grupos funcionales situados
sobre las cadenas laterales de aminoácidos de las proteínas
(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Como una alternativa,
una proteína TRAIL-R/Fc está unida a columnas de
cromatografía que contienen Proteína A o Proteína G a través de
interacciones con la parte Fc.
El TRAIL-R se usa igualmente en
la medición de la actividad biológica de proteínas TRAIL en cuanto a
su afinidad de unión por TRAIL-R. De acuerdo con
ello, las proteínas TRAIL-R pueden ser usadas por
aquellos que realizan estudios de "aseguramiento de la
calidad", p. ej., para monitorizar la vida media y la estabilidad
de la proteína TRAIL bajo diferentes condiciones. A modo de
ilustración, el TRAIL-R puede usarse en un estudio
de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una
proteína TRAIL que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o
producida en tipos de células diferentes. Igualmente, el
TRAIL-R puede usarse para determinar si se retiene
la actividad biológica después de la modificación de una proteína
TRAIL (p. ej., modificación química, truncamiento, mutación, etc.).
La afinidad de unión de la proteína TRAIL modificada por
TRAIL-R se compara con la de una proteína TRAIL no
modificada con el fin de detectar cualquier impacto negativo de la
modificación sobre la actividad biológica del TRAIL. De esta forma,
puede comprobarse la actividad biológica de una proteína TRAIL antes
de usarse, por ejemplo, en un estudio de investigación.
Igualmente, el TRAIL-R se usa en
la purificación o identificación de células que expresan TRAIL sobre
la superficie de la célula. Los polipéptidos TRAIL-R
están unidos a una fase sólida tal como una matriz de columna de
cromatografía o un substrato adecuado similar. Por ejemplo, pueden
recubrirse microesferas magnéticas con TRAIL-R y
mantenerse en un recipiente de incubación mediante un campo
magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen
células que expresan TRAIL se ponen en contacto con la fase sólida
que contiene sobre ella el TRAIL-R. Las células que
expresan el TRAIL sobre la superficie de la célula se unen al
TRAIL-R fijado y, a continuación, las células no
unidas se separan mediante lavado.
Como alternativa, el TRAIL-R
puede conjugarse a una parte detectable y, a continuación, incubarse
con células para ser ensayado para determinar la expresión del
TRAIL. Después de la incubación, el TRAIL-R marcado
no unido se separa y se determina la presencia o la ausencia de la
parte detectable sobre las células.
En una alternativa adicional, se incuban mezclas
de células sospechosas de contener células TRAIL con
TRAIL-R biotinilado. Típicamente, los períodos de
incubación son de al menos una hora de duración con el fin de
asegurar la suficiente unión. A continuación, la mezcla resultante
se pasa a través de una columna empaquetada con esférulas
recubiertas con avidina, con lo cual, la alta afinidad de unión de
la biotina por la avidina proporciona la unión de las células
deseadas a las esférulas. Los procedimientos para el uso de
esférulas recubiertas con avidina son conocidos (véase, Berenson y
otros, J. Cell. Biochem., vol. 10D, pág. 239, (1986)). El
lavado para separar el material no unido, y la liberación de las
células unidas, se lleva a cabo usando métodos convencionales.
Los polipéptidos TRAIL-R se usan
igualmente como vehículos para el suministro de agentes unidos a
través de ellos a células que portan TRAIL. Las células que expresan
TRAIL incluyen las identificadas por Wiley y otros (Immunity,
vol. 3, págs. 673-682, (1995)). De acuerdo con ello,
las proteínas TRAIL-R pueden usarse para el
suministro de agentes de diagnóstico o terapéuticos a dichas células
(o a otros tipos de células que se ha encontrado que expresan TRAIL
sobre la superficie de la célula) en procedimientos in vitro
o in vivo.
Los agentes detectables (de diagnóstico) y
terapéuticos que pueden estar unidos a un polipéptido
TRAIL-R incluyen, pero sin limitarse a ellos,
toxinas, otros agentes citotóxicos, medicamentos, radionúclidos,
cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o
fluorométrica, y similares, estando el agente particular a elegir de
acuerdo con la aplicación a la que se le destine. Entre las toxinas
se encuentran la ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A
de Pseudomonas aeruginosa, proteínas de inactivación
ribosómica, micotoxinas tal como tricotecenos, y derivados y
fragmentos (p. ej., cadenas sencillas) de las mismas. Los
radionúclidos adecuados para uso en dignóstico incluyen, pero sin
limitarse a ellos, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y
^{76}Br. Los ejemplos de radionúclidos para uso terapéutico son
^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re,
^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu, y ^{67}Cu.
Dichos agentes pueden unirse al
TRAIL-R mediante cualquier procedimiento
convencional adecuado. El TRAIL-R, al ser una
proteína, comprende grupos funcionales sobre las cadenas laterales
de aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales sobre un
agente deseado para formar, por ejemplo, enlaces covalentes. Como
alternativa, la proteína o agente puede ser derivado con el fin de
generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivación
puede implicar la unión de uno de los reactivos de emparejamiento
bifuncionales disponibles para la unión de varias moléculas a
proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen
un cierto número de técnicas para el radiomarcado de proteínas. Los
metales radionúclidos pueden unirse al TRAIL-R
mediante el uso, por ejemplo, de un agente quelante bifuncional
adecuado.
Los conjugados que comprenden
TRAIL-R y un agente de diagnóstico o terapéutico
adecuado (preferiblemente ligado covalentemente) se preparan de esta
forma. Los conjugados se administran o se usan de otra forma, en una
cantidad apropiada para la aplicación particular.
El DNA y los polipéptidos TRAIL-R
de la presente invención puede usarse en el desarrollo de
tratamientos para cualquier trastorno mediado (directamente o
indirectamente) por cantidades defectuosas, o insuficientes, de
TRAIL-R. Los polipéptidos TRAIL-R
pueden administrarse a un mamífero aquejado por un trastorno de este
tipo. Como alternativa, puede adoptarse una vía de terapia de genes.
El descubrimiento aquí de secuencias de nucleótidos
TRAIL-R nativos permite la detección de genes
TRAIL-R defectuosos, y la substitución de los mismos
con genes que contienen la codificación de TRAIL-R
normal. Los genes defectuosos pueden detectarse en ensayos de
diagnóstico in vitro, y mediante la comparación de una
secuencia de nucleótidos TRAIL-R nativo aquí
descrita con la de un gen TRAIL-R derivado a partir
de una persona sospechosa de albergar un defecto en este gen.
Otro uso de la proteína de la presente invención
es una herramienta de investigación para el estudio de los efectos
biológicos que resultan de la inhibición de las interacciones del
TRAIL-R sobre diferentes tipos de células. Los
polipéptidos TRAIL-R pueden usarse igualmente en
ensayos in vitro para la detección de TRAIL o
TRAIL-R o las interacciones de los mismos.
El TRAIL-R puede usarse en la
inhibición de la actividad biológica del TRAIL, en procedimientos
in vitro o in vivo. Un polipéptido
TRAIL-R purificado puede usarse para inhibir la
unión del TRAIL al TRAIL-R de superficie de célula
endógena. De esta forma, se inhiben los efectos biológicos que
resultan de la unión de TRAIL a receptores endógenos. Pueden usarse
varias formas de TRAIL-R incluyendo, por ejemplo,
los fragmentos de TRAIL-R anteriormente descritos,
oligómeros, derivados, y variantes que sean capaces de unirse a
TRAIL. En una realización, se usa un TRAIL-R soluble
para inhibir una actividad biológica de TRAIL, p. ej., para inhibir
la apoptosis mediada por TRAIL de células particulares.
El TRAIL-R puede administrarse a
un mamífero para tratar un trastorno mediado por TRAIL. Dichos
trastornos mediados por TRAIL incluyen estados causados
(directamente o indirectamente) o exacerbados por TRAIL.
El TRAIL-R puede ser útil para el
tratamiento de microangiopatías trombóticas. Un trastorno de este
tipo es la púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) (Kwaan, H.C.,
Semin. Hematol., vol. 24, pág. 71, (1987); Thompson y otros,
Blood, vol. 80, pág. 1890, (1992)). Se han informado por los
U.S. Centers for Disease Control de crecientes tasas de mortalidad
asociadas a la TTP (Torok y otros, Am. J. Hematol., vol. 50,
pág. 84, (1995)).
El plasma procedente de pacientes afligidos con
TTP (incluyendo pacientes con VIH^{+} y VIH^{-}) induce la
apoptosis de células endoteliales humanas de origen microvascular
dérmico, pero no de origen vascular grande (Laurence y otros,
Blood, vol. 87, pág. 3245, (15 Abril, 1996)). De acuerdo con
ello, se piensa que el plasma de pacientes con TTP contiene uno o
más factores que directamente o indirectamente inducen la apoptosis.
Tal como se describe en la Solicitud PCT WO 97/ 01633 (la cual se
incorpora aquí como referencia), el TRAIL está presente en el suero
de pacientes con TTP, y puede jugar un papel en la inducción de la
apoptosis de células endoteliales microvasculares.
Otra angiopatía trombótica es el síndrome
hemolítico-urémico (HUS) (Moake, J.L.,
Lancet, vol. 343, pág. 393, (1994); Melnyk y otros, Arch.
Intern. Med., vol. 155, pág. 2077, (1995); Thompson y otros,
véase cita anterior). Una realización de la invención está dirigida
al uso del TRAIL-R para tratar el estado al cual
frecuentemente se hace referencia como de "HUS adulto" (incluso
considerando que puede afectar a niños igualmente). Un trastorno
conocido como HUS asociado con diarrea infantil difiere en cuanto a
etiología del HUS adulto.
Otros estados caracterizados por la coagulación
de vasos sanguíneos pequeños puede tratarse usando
TRAIL-R. Dichos estados incluyen, pero sin limitarse
a ellos, los siguientes. Los problemas cardíacos observados en
aproximadamente el 5-10% de pacientes con SIDA
pediátricos se estima que implican la coagulación de pequeños vasos
sanguíneos. La rotura de la microvasculatura en el corazón ha sido
informada en pacientes con esclerosis múltiple. Como un ejemplo
adicional, se contempla el tratamiento del lupus eritematoso
sistémico (SLE).
En una realización, el plasma o la sangre de un
paciente se pone en contacto con TRAIL-R ex
vivo. El TRAIL-R puede estar unido a una matriz
de cromatografía adecuada mediante procedimientos convencionales. El
plasma o la sangre del paciente fluye a través de una columna de
cromatografía que contiene TRAIL-R unido a la
matriz, antes de retornar al paciente. El receptor inmovilizado se
une al TRAIL, separando, de esta forma, la proteína TRAIL de la
sangre del paciente.
Como alternativa, el TRAIL-R
puede administrarse in vivo a un paciente aquejado de una
microangiopatía trombótica. En una realización, se administra al
paciente una forma soluble de TRAIL-R.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona TRAIL-R para el tratamiento de una
microangiopatía trombótica. Puede usarse un polipéptido
TRAIL-R en procedimientos in vivo o ex
vivo para inhibir la lesión mediada por TRAIL a (p. ej., la
apoptosis de) células endoteliales microvasculares.
El TRAIL-R puede usarse
conjuntamente con otros agentes útiles en el tratamiento de un
trastorno particular. En un estudio in vitro informado por
Laurence y otros (Blood, vol. 87, pág. 3245, (1996)), se
logró alguna reducción de apoptosis mediada por plasma con TTP de
células endoteliales microvasculares, usando un anticuerpo de
bloqueo anti-Fas, ácido aurintricarboxílico, o
plasma normal desprovisto de crioprecipitado.
De acuerdo con ello, un paciente puede tratarse
con un agente que inhibe la apoptosis, mediada por un ligando de
Fas, de células endoteliales, en combinación con un agente que
inhibe la apoptosis mediada por TRAIL-R de células
endoteliales. En una realización, se administran tanto
TRAIL-R como un anticuerpo de bloqueo
anti-Fas a un paciente aquejado por un trastorno
caracterizado por microangiopatía trombótica, tal como TTP o HUS. En
la Publicación de la Solicitud PCT número WO 95/10540, se describen
ejemplos de anticuerpos monoclonales de bloqueo dirigidos contra el
antígeno Fas (CD95).
Otra realización de la presente invención está
dirigida al uso de TRAIL-R para reducir la muerte
mediada por TRAIL de células T en pacientes infectados de VIH. El
papel de la apoptosis de la célula T en el desarrollo del SIDA ha
sido el sujeto de un cierto número de estudios (véanse, por ejemplo,
Meyaard y otros, Science, vol. 257, págs.
217-219, (1992); Groux y otros, J. Exp. Med.,
vol. 175, pág. 331, (1992); y Oyaizu y otros, en Cell Activation
and Apoptosis in HIV Infection, Andrieu y Lu, Eds., Plenum
Press, New York, págs. 101-114, (1995)). Ciertos
investigadores han estudiado el papel de la apoptosis mediada por
Fas; igualmente, se ha explorado la implicación de la enzima que
convierte la interleuquina-1\beta (ICE) (Estaquier
y otros, Blood, vol. 87, págs. 4959-4966,
(1996); Mitra y otros, Immunology, vol. 87, págs.
581-585, (1996); Katsikis y otros, J. Exp.
Med., vol. 181, págs. 2029-2036, (1995)). Es
posible que la apoptosis de la célula T se produzca a través de
multiples mecanismos.
Al menos parte de la muerte de células T
observada en pacientes con VIH^{+} se estima que está mediada por
TRAIL. Sin desear teorizar, se estima que dicha muerte de células T
mediada por TRAIL se produce a través del mecanismo conocido como
muerte de células inducida por activación (AICD).
Las células T humanas activadas son inducidas a
llevar a cabo la muerte programada de células (apoptosis) mediante
iniciación a través del complejo receptor de células CD3/T, un
proceso denominado muerte de células inducida por activación (AICD).
La AICD de células T de CD4^{+} aisladas a partir de individuos
asintomáticos infectados con VIH, ha sido ya informada (Groux y
otros, véase cita anterior). De acuerdo con ello, la AICD puede
jugar un papel en el agotamiento de células T de CD^{+} y la
progresión hacia el SIDA en individuos infectados con VIH.
La presente invención proporciona
TRAIL-R para la inhibición de la muerte de células T
mediada por TRAIL en pacientes con VIH^{+} (preferiblemente, un
polipéptido TRAIL-R soluble). En una realización, el
paciente es asintomático cuando comienza el tratamiento con
TRAIL-R. Si se desea, antes del tratamiento, pueden
extraerse células T de sangre periférica procedente de un paciente
con VIH^{+}, y ensayarse para determinar su susceptibilidad a la
muerte de células mediada por TRAIL mediante procedimientos
convencionales.
En una realización, el plasma o la sangre de un
paciente se pone en contacto con TRAIL-R ex
vivo. El TRAIL-R puede estar unido a una matriz
de cromatografía adecuada mediante procedimientos convencionales. El
plasma o la sangre del paciente fluye a través de una columna de
cromatografía que contiene TRAIL-R unido a la
matriz, antes de retornar al paciente. El TRAIL-R
inmovilizado se une al TRAIL, separando, de esta forma, la proteína
TRAIL de la sangre del paciente.
En el tratamiento de pacientes con VIH^{+}, el
TRAIL-R puede usarse en combinación con otros
inhibidores de la apoptosis de la célula T. La apoptosis mediada por
Fas ha sido igualmente implicada en la pérdida de células T en
individuos con VIH^{+} (Katsikis y otros, J. Exp. Med.,
vol. 181, págs. 2029-2036, (1995)). De acuerdo con
ello, un paciente susceptible tanto a la muerte de células T mediada
por el ligando Fas (Fas-L) como mediada por TRAIL,
puede ser tratado tanto con un agente que bloquee las interacciones
TRAIL/TRAIL-R como con un agente que bloquee las
interacciones Fas-L/Fas. Los agentes adecuados para
el bloqueo de la unión de Fas-L a Fas, incluyen,
pero sin limitarse a ellos, polipéptidos Fas solubles; formas
oligómeras de polipéptidos Fas solubles (p. ej., dímeros de
sFas/Fc); anticuerpos anti-Fas que se unen a Fas sin
transducir la señal biológica que da como resultado la apoptosis;
anticuerpos anti-Fas-L que bloquean
la unión de Fas-L a Fas; y muteínas de
Fas-L que se unen a Fas pero que no transducen la
señal biológica que da como resultado la apoptosis. Preferiblemente,
los anticuerpos usados en el procedimiento son anticuerpos
monoclonales. Los ejemplos de agentes adecuados para el bloqueo de
interacciones Fas-L/Fas, incluyendo el bloqueo de
anticuerpos monoclonales anti-Fas, se encuentran
descritos en WO 95/10540.
En la invención, se proporcionan composiciones
que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido
TRAIL-R de la presente invención, en combinación con
otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente
aceptable fisológicamente. El TRAIL-R puede
formularse de acuerdo con procedimientos conocidos usados para
preparar composiciones útiles farmacéuticamente. El
TRAIL-R puede combinarse mezclado, bien como el
único material activo o con otros materiales activos conocidos
adecuados para una indicación dada, con diluyentes aceptables
farmacéuticamente (p. ej., solución salina,
Tris-HCl, acetato, y soluciones tamponadas con
fosfato), conservantes (p. ej., timerosal, alcohol bencílico,
parabenos), emulsificadores, solubilizadores, adyuvantes y/o
vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones
farmacéuticas incluyen las descritas en el Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., (1980), Mack Publishing
Company, Easton, PA.
Además, dichas composiciones pueden contener
TRAIL-R acomplejado con polietileno glicol (PEG),
iones metálicos, o incorporado dentro de compuestos polímeros tal
como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano,
etc., o incorporado dentro de liposomas, microemulsiones, micelas,
vesículas unilamelares o multilamelares, trazas de eritrocito o
esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico,
solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y
velocidad de aclaramiento in vivo del TRAIL-R
y, de acuerdo con ello, se eligen de acuerdo con la aplicación
deseada. El TRAIL-R puede encontrar uso igualmente,
expresado sobre la superficie de una célula.
Las composiciones de la presente invención pueden
contener un polipéptido TRAIL-R en cualquiera de las
formas aquí descritas. En realizaciones particulares, la composición
comprende un polipéptido TRAIL-R soluble o un
oligómero que comprende polipéptidos TRAIL-R
solubles.
El TRAIL-R puede administrarse en
cualquier forma adecuada, p. ej., tópicamente, parenteralmente, o
mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyección,
p. ej., mediante vías subcutánea, intravenosa, o intramuscular,
incluyendo igualmente la administración localizada, p. ej., en un
sitio de enfermedad o lesión. Igualmente, se contempla la liberación
sostenida a partir de implantes. Un experto en la técnica pertinente
reconocerá que las dosificaciones adecuadas variarán, dependiendo de
factores tales como la naturaleza del trastorno a tratar, el peso
corporal del paciente, edad, y estado general, y la vía de
administración. Las dosis preliminares pueden determinarse de
acuerdo con ensayos en animales, realizándose la escalada de
dosificaciones para administración humana de acuerdo con las
prácticas aceptadas en la técnica.
Igualmente, se contemplan composiciones que
comprenden ácidos nucléicos TRAIL-R en formulaciones
aceptables fisológicamente. El DNA de TRAIL-R puede
formularse, por ejemplo, para inyección.
En la invención se proporcionan anticuerpos que
son inmunoreactivos con polipéptidos TRAIL-R. Dichos
anticuerpos se unen específicamente a TRAIL-R, en
cuanto que los anticuerpos se unen a TRAIL-R a
través de sitios de unión de antígeno del anticuerpo (en oposición a
la unión no específica).
La proteína TRAIL-R preparada tal
como se describe en el Ejemplo 1, puede usarse como un inmunógeno en
la producción de anticuerpos inmunoreactivos con ella. Como
alternativa, se usa como el inmunógeno otra forma de
TRAIL-R, tal como un fragmento o proteína de
fusión.
Los anticuerpos monoclonales y policlonales
pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Véanse, por
ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses, Kennet y otros (eds.), Plenum Press, New
York, (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y
Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY (1988). La producción de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra TRAIL-R se ilustra adicionalmente
en el Ejemplo 4.
Los fragmentos de unión de antígeno de dichos
anticuerpos, los cuales pueden producirse mediante técnicas
convencionales, se encuentran igualmente abarcados por la presente
invención. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Igualmente,
se proporcionan fragmentos de anticuerpos y derivados producidos
mediante técnicas de ingeniería genética.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención incluyen anticuerpos quiméricos, p. ej., versiones
humanizadas de anticuerpos monoclonales múridos. Dichos anticuerpos
humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, y ofrecen
la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se
administran a humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal
humanizado comprende la región variable de un anticuerpo múrido (o
justamente el sitio de unión del antígeno del mismo) y una región
constante derivada a partir de un anticuerpo humano. Como
alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender
el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo monoclonal múrido y
un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión del
antígeno) derivada a partir de un anticuerpo humano. Los
procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales
quiméricos y mediante ingeniería genética adicionales, incluyen los
descritos por Riechmann y otros (Nature, vol. 332, pág. 323,
(1988)), Liu y otros (PNAS, vol. 84, pág. 3439, (1987)),
Larrick y otros (Bio/Technology, vol. 7, pág. 934, (1989)), y
Winter y harris (TIPS, vol. 14, pág. 139, (Mayo, 1993)).
Entre los usos de los anticuerpos se encuentra el
uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos
TRAIL-R, tanto in vitro como in vivo.
Igualmente, los anticuerpos pueden usarse en la purificación de
proteínas TRAIL-R mediante cromatografía de
inmunoafinidad.
Los anticuerpos que adicionalmente pueden
bloquear la unión de TRAIL-R a TRAIL, pueden usarse
para inhibir una actividad biológica que resulta de dicha unión.
Dichos anticuerpos de bloqueo pueden identificarse usando cualquier
procedimiento de ensayo adecuado, tal como mediante el ensayo de
anticuerpos para determinar la capacidad de inhibir la unión de
TRAIL a células que expresan TRAIL-R. Los ejemplos
de dichas células son las células Jurkat y las células PS1 descritas
en el Ejemplo 2 más adelante. Como alternativa, los anticuerpos de
bloqueo pueden identificarse en ensayos para determinar la capacidad
para inhibir un efecto biológico que resulta de la unión de TRAIL a
células diana. Los anticuerpos pueden ensayarse para determinar la
capacidad, por ejemplo, para inhibir la lisis mediada por TRAIL de
células Jurkat.
Un anticuerpo de este tipo puede usarse en un
procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para
inhibir una actividad biológica mediada por TRAIL-R.
De esta forma, pueden tratarse los trastornos causados o exacerbados
(directamente o indirectamente) mediante la interacción de TRAIL con
el receptor TRAIL de superficie de células. Un procedimiento
terapéutico implica la administración in vivo de un
anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad eficaz para
inhibir una actividad biológica mediada por TRAIL. De esta forma,
pueden tratarse los trastornos causados o exacerbados mediante
TRAIL, directamente o indirectamente. Los anticuerpos monoclonales
son los generalmente preferidos para uso en dichos procedimientos
terapéuticos. En una realización, se usa un fragmento de anticuerpo
de unión de antígeno.
Un anticuerpo de bloqueo dirigido contra
TRAIL-R puede ser substituido por
TRAIL-R en el procedimiento anteriormente descrito
de tratamiento de la microangiopatía trombótica, p. ej., en el
tratamiento de TTP o HUS. El anticuerpo se administra in
vivo, con el fin de inhibir la lesión mediada por TRAIL a (p.
ej., la apoptosis de) células endolteliales microvasculares.
Los anticuerpos generados contra
TRAIL-R pueden rastrearse para determinar las
propiedades agonísticas (es decir, mimetización de ligandos). Dichos
anticuerpos, mediante la unión a TRAIL-R de
superficie de célula, inducen efectos biológicos (p. ej.,
transducción de señales biológicas) similares a los efectos
biológicos inducidos cuando TRAIL se une a TRIAL-R
de superficie de célula. Los anticuerpos agonísticos pueden usarse
para inducir apoptosis de ciertas células de cáncer o de células
infectadas víricamente, tal como ha sido informado para TRAIL. La
capacidad de TRAIL para matar células de cáncer (incluyendo, pero
sin limitarse a células de melanoma, leucemia, y linfoma) y de
células infectadas víricamente, ha sido descrita por Wiley y otros
(Immunity, vol. 3, págs. 673-682, (1995)); y
en la Solicitud PCT WO 97/01633.
En la presente invención, se proporcionan
composiciones que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra
TRAIL-R, y un diluyente, excipiente, o vehículo
aceptable fisológicamente. Los componentes adecuados de dichas
composiciones son tal como se han descrito anteriormente para
composiciones que contienen proteínas TRAIL-R.
Igualmente, se proporcionan aquí conjugados que
comprenden un agente detectable (p. ej., de diagnóstico) o
terapéutico, unido a un anticuerpo dirigido contra
TRAIL-R. Los ejemplos de dichos agentes se han
presentado anteriormente. Los conjugados encuentran su uso en
procedimientos in vitro o in vivo.
La presente invención proporciona ácidos
nucléicos TRAIL-R. Dichos ácidos nucléicos incluyen,
pero sin limitarse a ellos, DNA que contiene la codificación del
péptido descrito en el Ejemplo 2. Dichos DNAs pueden identificarse a
partir del conocimiento del código genético. Otros ácidos nucléicos
de la presente invención incluyen DNAs aislados que comprenden la
secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID NO:1 o tal como se
establece en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona ácidos
nucléicos aislados útiles en la producción de polipéptidos
TRAIL-R, p. ej., en los sistemas de expresión
recombinantes expuestos anteriormente. Dichos ácidos nucléicos
incluyen, pero sin limitarse a ellos, el DNA del
TRAIL-R humano de la SEC ID NO:1. Las moléculas de
ácido nucléico de la presente invención incluyen el DNA de
TRAIL-R tanto en la forma de
mono-hebra como de doble hebra, así como el RNA
complemento de las mismas. El DNA del TRAIL-R
incluye, por ejemplo, cDNA, DNA genómico, DNA químicamente
sintetizado, DNA amplificado mediante PCR, y combinaciones de los
mismos. El DNA genómico puede aislarse mediante técnicas
convencionales, p. ej., usando el cDNA de la SEC ID NO:1 ó 3, o un
fragmento adecuado del mismo, como una sonda.
Se proporcionan los DNAs que contienen la
codificación del TRAIL-R en cualquiera de las formas
aquí contempladas (p. ej., TRAIL-R de longitud total
o tal como se establece en las reivindicaciones). Las realizaciones
particulares de los DNAs que contienen la codificación de
TRAIL-R, incluyen un DNA que contiene la
codificación del TRAIL-R humano de longitud total de
la SEC ID NO:2 (incluyendo el péptido señal
N-terminal), y un DNA que contiene la codificación
de un TRAIL-R humano maduro de longitud total. Otras
realizaciones incluyen DNA que contiene la codificación de
TRAIL-R soluble (p. ej., conteniendo la codificación
del dominio extracelular de la proteína de la SEC ID NO:2, bien sea
con o sin el péptido señal).
Los ácidos nucléicos proporcionados aquí incluyen
DNA y RNA complementos de dichos fragmentos, conjuntamente con
formas mono-hebra y de hebra doble del DNA de
TRAIL-R.
Entre los usos de los fragmentos de ácido
nucléico TRAIL-R está el uso como sondas o
cebadores. Mediante el uso del conocimiento del código genético en
combinación con las secuencias de aminoácidos establecidas en el
Ejemplo 2, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos
degenerados. Dichos oligonucleótidos encuentran uso como cebadores,
p. ej., en reacciones de cadena de polimerasa (PCR), mediante las
cuales los fragmentos de DNA de TRAIL-R se aíslan y
amplifican.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucléicos
TRAIL-R incluyen oligonucleótidos de sentido o
antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucléico
mono-hebra (bien RNA o bien DNA), capaz de unirse a
secuencias mRNA de TRAIL-R (sentido) o DNA de
TRAIL-R (antisentido) diana. La capacidad para
derivar un oligonucleótido de sentido o antisentido, en base a una
secuencia de cDNA que contiene la codificación de una proteína dada,
ha sido descrita, por ejemplo, por Stein y Cohen (Cancer
Res., vol. 48, pág. 2659, (1988)) y por van der Krol y otros
(Bio Techniques, vol. 6, pág. 958, (1988)).
La unión de oligonucleótidos de sentido o
antisentido a secuencias de ácido nucléico diana, da como resultado
la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de
la secuencia diana por uno de entre varios medios, incluyendo la
degradación potenciada de los dúplex, la terminación prematura de la
transcripción o traducción, o por otros medios. De acuerdo con ello,
los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para bloquear la
expresión de proteínas TRAIL-R. Los oligonucleótidos
de sentido o antisentido comprenden, además, oligonucleótidos que
tienen cadenas principales fosfodiéster modificadas mediante azúcar
(u otros enlaces azúcar, tales como los descritos en WO 91/06629) y
en las que dichos enlaces azúcar son resistentes a nucleasas
endógenas. Dichos oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes
son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimática), pero retienen la especificidad de la
secuencia como para ser capaces de unirse a secuencias de
nucleótidos diana.
Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o
antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos
covalentemente a partes orgánicas, tales como los descritos en WO
90/10448, y a otras partes que incrementan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácido nucléico diana, tal como
poly-(L-lisina). Además aún, pueden estar unidos
agentes intercalantes, tal como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos, a oligonucleótidos de sentido o antisentido con
el fin de modificar las especificidades de unión del oligonucleótido
de sentido o antisentido por la secuencia de nucleótido diana.
Los oligonucleótidos de sentido o antisentido
pueden introducirse dentro de una célula que contenga la secuencia
de ácido nucléico diana, mediante cualquier procedimiento de
transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de
DNA mediada por CaPO_{4}, la electroporación, o mediante el uso de
vectores de transferencia de genes tal como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido de sentido o antisentido se inserta dentro de un
vector retrovírico adecuado. Una célula que contiene la secuencia de
ácido nucléico diana se pone en contacto con el vector retrovírico
recombinante, bien in vitro o bien ex vivo. Los
vectores retrovíricos adecuados incluyen, pero sin limitarse a
ellos, los derivados a partir del retrovirus múrido
M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado a partir de
M-MuLV), o los vectores de copia doble designados
como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641).
Igualmente, los oligonucleótidos de sentido o
antisentido pueden introducirse dentro de una célula que contenga la
secuencia de nucleótido diana, mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión de ligando, tal como la descrita en WO
91/04753. Las moléculas de unión de ligandos incluyen, pero sin
limitarse a ellas, receptores de superficie de célula, factores de
desarrollo, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a
receptores de superficie de célula. Preferiblemente, la conjugación
de la molécula de unión de ligando no interfiere substancialmente
con la capacidad de la molécula de unión de ligando para unirse a su
molécula o receptor correspondiente, o para bloquear la entrada del
oligonucleótido de sentido o antisentido, o su versión conjugada,
dentro de la célula.
Como alternativa, puede introducirse un
oligonucleótido de sentido o antisentido dentro de una célula que
contenga la secuencia de ácido nucléico diana, mediante la formación
de un complejo lípido-oligonucleótido, tal como se
describe en WO 90/10448. Preferiblemente, el complejo
lípido-oligonucleótido de sentido o antisentido se
disocia dentro de la célula mediante una lipasa endógena.
Los ejemplos siguientes se proporcionan con el
fin de ilustrar adicionalmente las realizaciones particulares de la
invención, no debiéndose considerar como limitativos del alcance de
la presente invención.
Se preparó una proteína TRAIL receptor
(TRAIL-R) humana mediante el procedimiento
siguiente. La TRAIL-R se aisló a partir de membranas
de células de células Jukat, una línea de células de leucemia T
aguda humana. Las células Jurkat se eligieron debido a que una banda
específica puede ser precipitada por afinidad a partir de células
Jurkat biotiniladas en la superficie, usando
Flag^{R}-TRAIL covalentemente acoplado a esférulas
de Affi-gel (Biorad Laboratories, Richmond, CA). La
banda precipitada tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kD.
Igualmente, se encontraba presente una banda específica menor de
aproximadamente 42 kD, posiblemente atribuida a un producto de
rotura proteolítica o a una forma menos glucosilada del
TRAIL-R.
Aproximadamente se recolectaron 50.000 millones
de células Jurkat mediante centrifugación (80 ml de gránulo de
células), se lavaron una vez con PBS y, a continuación, se
congelaron bruscamente sobre nitrógeno líquido. Las membranas de
plasma se aislaron de acuerdo con el procedimiento número tres
descrito por Maeda y otros, en Biochim. et Biophys. Acta,
vol. 73, pág. 115, (1983), con cinco modificaciones:
1. Los inhibidores de proteasa siguientes se
incluyeron en todas las soluciones a la concentraciones indicadas:
Aprotidina, 150 nM; EDTA, 5 mM; Leupeptina 1 \muM;
pA-PMSF, 20 \muM; Pefabloc, 500 \muM; Pepstatina
A, 1 \muM; PMSF, 500 \muM.
2. No se usó ditiotreitol.
3. No se usó DNAasa en la solución de
homogeneización.
4. Se usaron 1,25 ml de tampón de homogeneización
por ml de gránulo de célula.
5. La homogeneización se llevó a cabo mediante
cinco pasadas a través de un homogeneizador suave de vidrio
molido.
Después del aislamiento de las membranas de las
células, las proteínas se solubilizaron volviendo a suspender las
membranas aisladas en 50 ml de PBS que contenía octilglucósido al 1%
y en todos los inhibidores de proteasa anteriormente mencionados a
las concentraciones anteriormente indicadas. A continuación, la
solución resultante se batió repetidamente durante una incubación de
treinta minutos a 4ºC. A continuación, las solución se centrifugó a
20.000 rpm en un rotor SW28 en una ultracentrífuga Beckman
LE-80 (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA), a
4ºC durante 30 minutos, con el fin de obtener el sobrenadante (el
extracto de membrana).
La primera etapa de purificación de
TRAIL-R fuera del extracto de membrana preparado
anteriormente, fue mediante cromatografía de afinidad. En primer
lugar, el extracto de membrana se aplicó a una columna de
Affi-gel anti-Flag^{R} M2 (10 mg
de anticuerpo monoclonal M2 acoplado a 2 ml de esférulas de
Affi-gel), para absorber cualquier material de unión
no específicamente. A continuación, se aplicó el paso de flujo a una
columna de Affi-gel Flag^{R}-TRAIL
(10 mg de proteína recombinante acoplada a 1 ml de esférulas de
Affi-gel).
El soporte de Affi-gel es un
éster de N-hidroxi-succinimida de
una esférula de gel de agarosa reticulado, derivado (disponible de
Biorad Laboratories, Richmond, CA). Tal como se ha expuesto
anteriormente, el péptido Flag^{R},
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,
proporciona un epítopo unido de manera reversible mediante
anticuerpos monoclonales específicos, lo cual permite el rápido
ensayo y la fácil purificación de la proteína recombinante
expresada. El M2 es un anticuerpo monoclonal que se une a
Flag^{R}. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido
Flag^{R}, así como otros reactivos para la preparación y uso de
proteínas de fusión Flag^{R}, se encuentran disponibles de Eastman
Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven,
Connecticut. La preparación de proteínas de fusión
Flag^{R}-TRAIL (que compreden Flag^{R} fusionado
a un polipéptido TRAIL soluble), se encuentra descrita
adicionalmente en la Solicitud PCT WO 97/01633, la cual se incorpora
aquí como referencia.
La columna se lavó con 25 ml de cada uno de los
tampones siguientes, en el orden indicado:
1. PBS conteniendo octilglucósido al 1%.
2. PBS.
3. PBS conteniendo adicionalmente NaCl 200
nM.
4. PBS.
El material unido se eluyó con citrato Na 50 mM
(pH 3) en fracciones de 1 ml e inmediatamente se neutralizó con 300
\mul de Tris-HCl 1 M (pH 8,5) por fracción. La
actividad de unión del TRAIL de cada fracción se determinó mediante
un ensayo ELISA específico de TRAIL-R tal como se
describe más adelante. Las fracciones con alta actividad de unión a
TRAIL se agruparon, se llevaron a ácido trifluoroacético (TFA) al
0,1%, y posteriormente se cromatografiaron sobre una columna HPLC de
fase inversa capilar [columna capilar de silicona fundida de 500
\mum de diámetro interno X 25 cm, empaquetada con material Vydac
C_{4} (Vydac, Hesperia, CA)], usando un gradiente lineal (2% por
minuto) de desde 0% hasta 100% de acetonitrilo en agua conteniendo
TFA al 0,1%. Las fracciones que contenían alta actividad de unión a
TRAIL, se determinaron, a continuación, tal como se ha indicado
anteriormente, se agruparon, y, cuando se estimó oportuno, se
liofilizaron.
Las diluciones seriadas de muestras que contenían
TRAIL-R (en NaHCO_{3} 50 mM, llevadas a pH 9 con
NaOH), se usaron para recubrir placas de microvaloración E.I.A. de
fondo plano de 96 cavidades Linbro/Titertek (ICN Biomedicals Inc.,
Aurora, OH) en una proporción de 100 \mul/cavidad. Después de
incubación a 4ºC durante 16 horas, las cavidades se lavaron seis
veces con 200 \mul de PBS conteniendo Tween-20 al
0,05% (PBS-Tween). A continuación, la cavidades se
incubaron con Flag^{R}-TRAIL en una proporción de
1 \mug/ml en PBS-Tween con suero vacuno fetal
(FCS) al 5% durante 90 minutos (100 \mul por cavidad), seguido de
lavado tal como anteriormente. A continuación, cada cavidad se
incubó con el anticuerpo monoclonal anti-Flag^{R}
M2 en una proporción de 1 \mug/ml en PBS-Tween
conteniendo FCS al 5% durante 90 minutos (100 \mul por cavidad),
seguido de lavado tal como anteriormente. Posteriormente, las
cavidades se incubaron con un anticuerpo conjugado con peroxidasa de
rábano picante específico de anti-mIgG1 de cabra
policlonal (a una dilución de 1:5000 de la solución madre comercial
en PBS-Tween conteniendo FCS al 5%) durante 90
minutos (100 \mul por cavidad). El anticuerpo conjugado con HRP se
obtuvo de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham,
Alabama. A continuación, las cavidades se lavaron seis veces, tal
como anteriormente.
Para el desarrollo del ensayo ELISA, se agregaron
a las cavidades una mezcla de substrato [100 \mul por cavidad de
una premezcla 1:1 de Substrato de Peroxidasa TMB y de Solución B de
Peroxidasa (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)].
Después de una reacción de color suficiente, la reacción enzimática
se terminó mediante la adición de H_{2}SO_{4} 2 N (50 \mul por
cavidad). La intensidad del color (indicativa de la actividad de
unión de TRAIL) se determinó midiendo la extinción a 450 nm sobre un
lector de placa V Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
La proteína TRAIL-R aislada a
partir de células Jurkat se digerió con tripsina, usando
procedimientos convencionales. El análisis de secuencias de
aminoácidos se llevó a cabo sobre uno de los fragmentos péptidos
producidos por el digesto tríptico. Se encontró que el fragmento
contenía la secuencia siguiente, la cual corresponde a los
aminoácidos 327 a 333 de la secuencia presentada en la SEC ID NO:2:
VPANEGD.
Igualmente, se aisló la proteína
TRAIL-R a partir de células PS-1. La
PS-1 es una línea de células B humana que
espontáneamente surge después de la irradiación letal de linfocitos
de sangre periférica (PBLs) humana. La proteína
TRAIL-R se digirió con tripsina, usando
procedimientos convencionales. El análisis de la secuencia de
aminoácidos se llevó a cabo sobre fragmentos producidos a partir del
digesto tríptico. Se encontró que uno de los fragmentos contenía la
secuencia siguiente, la cual, al igual que el fragmento presentado
en (a), corresponde a los aminoácidos 327 a 333 de la secuencia
presentada en la SEC ID NO:2: VPANEGD.
Se determinó la secuencia de aminoácidos de los
fragmentos de péptidos del digesto tríptico adicional de
TRAIL-R. Se prepararon oligonucleótidos degenerados,
en base a la secuencia de aminoácidos de dos de los péptidos. Un
fragmento de DNA de TRAIL-R se aisló y amplificó
mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR), usando los
oligonucleótidos degenerados como cebadores 5' y 3'. La PCR se llevó
a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales, usando cDNA
derivado a partir de la línea de células PS-1
descrita en el Ejemplo 2, como el molde. La secuencia de nucleótido
del fragmento de DNA de TRAIL-R aislado (excluyendo
las porciones que corresponden a la parte de los cebadores), y la
secuencia de aminoácidos codificada por ellos, se presentan en la
Figura 1 (SEC ID NOS: 3 y 4). La secuencia del fragmento de DNA de
TRAIL-R entero aislado mediante PCR corresponde a
los nucleótidos 988 a 1164 de la SEC ID NO:1, la cual contiene el
código de los aminoácidos 330 a 388 de la SEC ID NO:2.
La secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO:4
porta una homología significativa con los denominados dominios
muerte encontrados en otros ciertos receptores. La región
citoplásmica de Fas y del receptor TNF tipo I contienen cada uno un
dominio muerte, que está asociado con la transducción de una señal
apoptótica (Tartaglia y otros, Cell, vol. 74, pág. 845,
(1993); Itoh y Nagata, J. Biol. Chem., vol. 268, pág. 10932,
(1993)). De acuerdo con ello, la secuencia presentada en la SEC ID
NO:4 se estima que se encuentra dentro del dominio citoplásmico de
TRAIL-R.
Una sonda derivada a partir del fragmento aislado
anterior se usó para rastrear una biblioteca cDNA (cDNA derivado de
fibroblasto de prepucio humano en el vector \lambdagt10), y se
aisló un cDNA de TRAIL-R humano. La secuencia de
nucleótidos de la región de codificación de este cDNA se presenta en
la SEC ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella se
muestra en la SEC ID NO:2.
Este ejemplo ilustra un procedimiento para la
preparación de anticuerpos monoclonales que se unen a
TRAIL-R. Los inmunógenos adecuados que pueden usarse
en la generación de dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitarse
a ellos, proteína TRAIL-R purificada o un fragmento
inmunógeno de la misma tal como el dominio extracelular, o proteínas
de fusión conteniendo TRAIL-R (p. ej., un proteína
de fusión TRAIL-R/Fc soluble).
La TRAIL-R purificada puede
usarse para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con
ella, usando técnicas convencionales tales como las descritas en la
Patente de EE.UU. 4.411.993. En resumen, se inmunizaron ratones con
inmunógeno TRAIL-R emulsificado en adyuvante de
Freund completo, y inyectaron en cantidades que variaron desde
10-100 \mug subcutáneamente o
intraperitonealmente. Diez a doce días más tarde, los animales
inmunizados se reforzaron con TRAIL-R adicional
emulsificado en adyuvante de Freund incompleto. Después de esto, los
ratones se reforzaron periódicamente de acuerdo con un esquema de
inmunización semanalmente o quincenalmente. Periódicamente se
extrajeron muestras de suero mediante sangrado
retro-orbital o corte de la punta de la cola, con el
fin de ensayar los anticuerpos TRAIL-R mediante el
ensayo de transferencia de puntos, ELISA (ensayo inmunoenzimático) o
la inhibición de la unión de TRAIL.
Después de la detección de un título de
anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les administró una
última inyección intravenosa de TRAIL-R en solución
salina. Tres a cuatro días después, los animales se sacrificaron, se
recolectaron las células de bazo, y las células de bazo se
fusionaron a una línea de células de mieloma múrido, p. ej., NS1 o,
preferiblemente, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones
generaron células de hibridoma, las cuales se sembraron en placas de
microvaloracción múltiples en un medio selectivo (hipoxantina,
aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no
fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se rastrearon mediante
ELISA para determinar su reactividad frente a
TRAIL-R mediante adaptaciones de las técnicas
descritas por Engvall y otros, en Immunochem., vol. 8, pág.
871, (1971) y en la Patente de EE.UU. 4.703.004. Una técnica de
rastreo preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita
por Beckmann y otros (J. Immunol., vol. 144, pág. 4212,
(1990)). Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse
intraperitonealmente dentro de ratones BALB/c singénicos para
producir ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpos
monoclonales anti-TRAIL-R. Como
alternativa, pueden desarrollarse células de hibridoma in
vitro en matraces o botellas giratorias mediante varias
técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de
ratón pueden purificarse mediante precipitación en sulfato de
amonio, seguido de cromatografía de exclusión de gel. Como
alternativa, puede igualmente usarse la cromatografía de afinidad
basada en la unión del anticuerpo a Proteína A o proteína G, al
igual que puede hacerse con la cromatografía de afinidad basada en
la unión a TRAIL-R.
La distribución del tejido del mRNA de
TRAIL-R se investigó mediante análisis de
transferencia Northern, tal como sigue. Una parte alícuota de una
sonda radiomarcada (la misma sonda radiomarcada usada para rastrear
la biblioteca de cDNA en el Ejemplo 3), se agregó a dos
transferencias Northern de tejidos múltiples humanos diferentes
(Clontech, Palo alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). La hibridación
se llevó a a cabo a 63ºC en formamida al 50% tal como ha sido
previamente descrita (March y otros, Nature, vol. 315, págs.
641-647, (1985)). A continuación, las transferencias
se lavaron con 2X SSC, SDS al 0,1% a 68ºC durante 30 minutos. Para
estandarizar las cargas de RNA se usó una sonda específica de
glicerol-aldehido-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH).
En todos los tejidos examinados, se encontró
presente un transcripto único de 4,4 kilobases (kb), incluyendo
bazo, timo, linfocitos de sangre periférica (PBLs), próstata,
testis, ovario, útero, placenta, y tejidos múltiples conjuntamente
con el tracto gastro-intestinal (incluyendo esófago,
estómago, duodeno, yeyuno/íleon, colon, recto, e intestino delgado).
Las células y tejidos con los niveles más altos de mRNA de
TRAIL-R son los PBLs, bazo, y ovario, tal como se
muestra comparando las hibridaciones de control con una sonda
específica de GAPDH.
El TRAIL-R humano de longitud
total se expresó y ensayó para determinar la capacidad para unirse a
TRAIL. El ensayo de unión se llevó a cabo como sigue.
En el ensayo, se usó una proteína de fusión que
comprendía un péptido cerrador de leucina fusionado al
N-terminal de un polipéptido TRAIL soluble
(LZ-TRAIL). Se preparó un constructo de expresión,
esencialmente tal como ha sido descrito para la preparación del
constructo de expresión Flag^{R}-TRAIL por Wiley y
otros (Immunity, vol. 8, págs. 673-682,
(1995)), excepto que el DNA que contiene la codificación del péptido
Flag^{R} se reemplazó por una secuencia que contenía la
codificación de un cerrador de leucina modificado que permitía la
trimerización. El constructo, en el vector de expresión pDC409,
contiene el código de una secuencia conductora derivada a partir de
citomegalovirus humano, seguido de la parte del cerrador de leucina
fusionado al N-terminal de un polipéptido TRAIL
soluble. El polipéptido TRAIL comprende los aminoácidos
95-281 de TRAIL humano (un fragmento del dominio
extracelular), tal como ha sido descrito por Wiley y otros (véase
cita anterior). El LZ-TRAIL se expresó en células
CHO, y se purificó a partir del sobrenadante del cultivo.
El vector de expresión designado como pDC409, es
un vector de expresión de mamífero derivado a partir del vector
pDC406 descrito por McMahan y otros (EMBO J., vol. 10, págs.
2821-2832, (1991)). Las características agregadas al
pDC409 (comparadas con el pDC406) incluyen sitios de restricción
únicos en el sitio de clonación múltiple (mcs); tres codones de
parada (uno en cada marco de lectura) posicionados más abajo del
mcs; y un promotor T7 polimerasa, más abajo del mcs, que facilita la
secuenciación del DNA insertado dentro del mcs.
Para la expresión de la proteína
TRAIL-R humana de longitud total, la región de
codificación entera (es decir, la secuencia de DNA presentada en la
SEC ID NO:1) se amplificó mediante la reacción de cadena de
polimerasa (PCR). El molde usado en la PCR fue el clon cDNA aislado
a partir de una biblioteca de cDNA de fibroblasto de prepucio
humano, tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. El DNA amplificado
y aislado se insertó dentro del vector de expresión pDC409, con el
fin de proporcionar un constructo designado como
pDC409-TRAIL-R.
La proteína CrmA se usó para inhibir la apoptosis
de las células huéspedes que expresan TRAIL-R
recombinante, tal como se ha expuesto anteriormente y en el Ejemplo
8. Un vector de expresión designado como pDC409-CrmA
contenía el DNA con la codificación del poxvirus CrmA en pDC409. La
proteína derivada de la viruela del ganado vacuno de 38 kilodaltons
se la designó posteriormente como CrmA tal como ha sido descrito por
Pickup y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83,
págs.7698-7702, (1986)).
Las células CV-1/EBNA se
co-transfectaron con
pDC409-TRAIL-R conjuntamente con
pDC409-CrmA o con pDC409-CrmA solo.
Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino
fetal al 10%, penicilina, estreptomicina, y glutamina. 48 horas
después de la transfección, las células fueron separadas no
enzimáticamente e incubadas con LZ-TRAIL (5
\mug/ml), un anticuerpo monoclonal anti-LZ
biotinilado (5 \mug/ml) y estreptavidina conjugada con
ficoeritrina (1:400), antes de análisis mediante escaneado de
células activado por fluorescencia (FACS). El análisis citométrico
se llevó a cabo sobre un FACscan (Beckton Dickinson, San Jose,
CA).
Las células CV-1/EBNA
co-transfectadas con vectores que contenían la
codificación TRAIL-R y CrmA, mostraron una unión
significativamente potenciada de LZ-TRAIL, comparada
con las células transfectadas con el vector que contiene la
codificación de CrmA solo.
El TRAIL-R se ensayó para
determinar la capacidad para bloquear la apoptosis inducida por
TRAIL de células Jurkat. El TRAIL-R usado en este
ensayo estaba en la forma de una proteína de fusión designada como
sTRAIL-R/Fc, la cual comprendía el dominio
extracelular de TRAIL-R humano, fusionado al
N-terminal de un polipéptido Fc derivado a partir de
IgG1 humano.
Las células
CV-1-EBNA se transfectaron con un
vector de expresión recombinante que comprendía una fusión de gen
conteniendo la codificación de la proteína
sTRAIL-R/Fc, en el vector pDC409 descrito en el
Ejemplo 6, y se cultivaron para permitir la expresión de la proteína
de fusión. La proteína de fusión sTRAIL-R/Fc se
recuperó a partir del sobrenadante del cultivo. Los procedimientos
para la fusión del DNA conteniendo la codificación de un polipéptido
Fc de IgG1 a DNA conteniendo la codificación de una proteína
heteróloga, han sido descritos por Smith y otros (Cell, vol.
73, págs. 1349-1360, (1993)); en el presente caso,
se usaron procedimientos análogos.
Una proteína de fusión designada como
TNF-R2-Fc, usada como un control,
que comprendía el dominio extracelular de la proteína receptor de
TNF conocida como TNF-R p75 o p80 (Smith y otros,
Science, vol. 248, págs. 1019-1023, (1990);
Smith y otros, Cell, vol. 76, págs. 959-962,
(1994)), se fusionó a un polipéptido Fc. En el ensayo, se usó
igualmente un anticuerpo monoclonal que es un anticuerpo de bloqueo
dirigido contra TRAIL humano.
Las células Jurkat se incubaron con
concentraciones variables o constantes de LZ-TRAIL
(la proteína de fusión LZ-TRAIL descrita en el
Ejemplo 6), en la ausencia o presencia de concentraciones variables
de sTRAIL-R-Fc,
TNF-R2-Fc, o el anticuerpo
monoclonal específico de TRAIL. La muerte de células se cuantificó
usando un ensayo de viabilidad de células MTT (MTT es el bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio),
tal como ha sido ya descrito (Mosmann, J. Immunol. Methods, vol. 65,
págs. 55-63, (1983)). Los resultados se muestran en
la Figura 2, la cual representa el por ciento de muerte de células
para células Jurkat que fueron no tratadas (\Delta) o que fueron
tratadas con concentraciones variables (\ding{115}) o constantes
(\medcirc, \medbullet, \boxempty, \blacksquare) de
LZ-TRAIL (13 ng/ml), en la ausencia (\medbullet) o
la presencia de concentraciones variables de
TRAIL-R2-Fc (\blacksquare),
TNF-R2-Fc (\boxempty), o el
anticuerpo anti-TRAIL (\medcirc). Las
concentraciones variables de todas las substancias comenzaron a 10
\mug/ml y fueron diluidas seriadamente.
El anticuerpo monoclonal
anti-TRAIL y el sTRAIL-R/Fc
bloquearon cada uno de ellos la apoptosis inducida por TRAIL en una
forma dependiente de la dosis, en tanto que con
TNF-R2-Fc no fue así. De acuerdo con
ello, el dominio extracelular de TRAIL-R es capaz de
unirse a TRAIL, y de inhibición de la apoptosis mediada por TRAIL de
células diana.
Las células CV-1/EBNA se
transfectaron, mediante el procedimiento
DEAE-dextrano, con plásmidos de expresión para
TRAIL-R
(pDC409-TRAIL-R), conjuntamente con
un exceso de tres veces el vector de expresión vacío (pDC409) en la
presencia o ausencia de z-VAD-fmk
(10 \muM; en medio de cultivo), o conjuntamente con un exceso de
tres veces el vector de expresión pDC409-CrmA,
pDC409-p35, o
pDC409-FADD-DN. Además, se
co-transfectaron conjuntamente con todas las mezclas
de DNA, 400 ng/portaobjeto de un vector de expresión para el gen
lacz de E. coli. Las células transfectadas se
cultivaron en cámaras montadas sobre portaobjetos.
El vector de expresión de mamífero pDC409, y el
vector pDC409-TRAIL-R que contiene
la codificación de la longitud total de TRAIL-R
humano, se describen en el Ejemplo 6. El derivado tripéptido
zVAD-fmk
(benciloxi-carbonil-Val-Ala-Asp-fluorometil-cetona)
se encuentra disponible de Enzyme System Products, Dublin,
California.
La proteína derivada de la viruela del ganado
vacuno de 38 kilodaltons, designada posteriormente como CrmA, ha
sido descrita por Pickup y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
vol. 83, págs. 7698-7702, (1986)). La información de
la secuencia para CrmA se presenta en la Figura 4 de Pickup y otros,
véase cita anterior.
La proteína de 35 kilodaltons codificada por el
virus polihedrosis nuclear de Autographa californica, un
baculovirus, ha sido descrito por Friesen y Miller (J.
Virol., vol. 61, págs. 2264-2272, (1987)). La
información de la secuencia para esta proteína, designada aquí como
baculovirus p35, se presenta en la Figura 5 de Friesen y Miller,
véase cita anterior.
La FADD (también designada como MORT1) ha sido
descrita por Boldin y otros (J. Biol. Chem., vol. 270, págs.
7795-7798, (1995)). La proteína denominada como
FADD-DN (FADD dominante negativo) es un fragmento
C-terminal de FADD que incluye el dominio muerte. El
DNA que contiene la codificación de FADD-DN,
fusionado a un epítopo Flag^{R} N-terminal tag
(descrito anteriormente), se insertó dentro del vector de expresión
pDC409 descrito en el Ejemplo 6, para formar el
pDC409-FADD-DN. El polipéptido
FADD-DN corresponde a los aminoácidos 117 a 245 de
la secuencia de aminoácidos MORT1 presentada por Boldin y otros,
véase cita anterior.
48 horas después de la transfección, las células
se lavaron con PBS, se fijaron con glutaraldehído y se incubaron con
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-galactopiranosido).
Las células que expresan \beta-galactosidasa se
tiñen de azul. Una disminución en el porcentaje de células teñidas
indica pérdida de expresión \beta-galactosidasa, y
está en correlación con la muerte de células que expresan la
proteína(s) co-transfectada con el gen
lacz.
Los resultados se presentan en la Figura 3, en la
que los valores trazados representan la desviación promedia y
estándar de al menos tres experimentos separados. El poxvirus CrmA,
el baculovirus p35, el FADD-DN, y el
z-VAD-fmk, reducen, cada uno de
ellos, de manera eficaz la muerte de células transfectadas que
expresan TRAIL-R.
<110> Inmunex Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor que se une a TRAIL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P21913EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 98908474.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/799,861
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-02-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/815,255
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-03-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/829,536
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-03-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/869,852
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-06-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/883,036
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-06-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1323)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(155)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Péptido Flag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
Claims (17)
1. Un polipéptido receptor de ligando que induce
la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL-R)
purificado, que se une al ligando que induce la apoptosis
relacionada con el TNF (TRAIL), en el que el TRAIL-R
está caracterizado por comprender la secuencia de aminoácidos
VPANEGD.
2. Un polipéptido TRAIL-R de la
Reivindicación 1, en el que dicho polipéptido está
caracterizado además por un peso molecular de aproximadamente
50 a 55 kilodaltons, tal como se determina mediante
SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida.
3. Un polipéptido TRAIL-R de la
Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en el dicho polipéptido está
caracterizado además por comprender la secuencia de
aminoácidos ETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLXTML.
4. Un polipéptido TRAIL-R
purificado seleccionado entre el grupo formado por:
(a) el polipéptido TRAIL-R de la
SEC ID NO:2; y
(b) un polipéptido que comprende los aminoácidos
x a 440 de la SEC ID NO:2, en donde x representa un número entero
del 51 al 59; y
(c) un polipéptido que comprende los aminoácidos
54 a 440 de la SEC ID NO:2.
5. Un polipéptido TRAIL-R, en el
dicho polipéptido es un TRAIL-R soluble que
comprende los aminoácidos x a 210 de la SEC ID NO:2, en donde x
representa un número entero del 51 al 59.
6. Un polipéptido TRAIL-R de la
Reivindicación 5, que comprende los aminoácidos 52 a 210 de la SEC
ID NO:2.
7. Un oligómero que comprende desde dos hasta
cuatro polipéptidos TRAIL-R de la Reivindicación 4,
o desde dos hasta cuatro polipéptidos TRAIL-R de la
Reivindicación 5 o la Reivindicación 6.
8. Una composición que comprende un polipéptido
TRAIL-R de la Reivindicación, 4, 5 ó 6, y un
diluyente, excipiente o vehículo aceptable fisológicamente.
9. Un DNA de TRAIL-R aislado, en
el que dicho DNA comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID
NO:3.
10. Un DNA de TRAIL-R aislado, en
el que dicho DNA contiene el código de un polipéptido seleccionado
entre el grupo formado por:
(a) el polipéptido TRAIL-R de la
SEC ID NO:2; y
(b) un polipéptido que comprende los aminoácidos
x a 440 de la SEC ID NO:2, en donde x representa un número entero
del 51 al 59; y
(c) un polipéptido que comprende los aminoácidos
54 a 440 de la SEC ID NO:2.
11. Un DNA de TRAIL-R aislado, en
el dicho DNA contiene el código de un polipéptido es un
TRAIL-R soluble que comprende los aminoácidos x a
210 de la SEC ID NO:2, en donde x representa un número entero del 51
al 59.
12. Un DNA de TRAIL-R de la
Reivindicación 11, en el que dicho DNA contiene el código de un
polipéptido que comprende los aminoácidos 52 a 210 de la SEC ID
NO:2.
13. Un vector de expresión que comprende un DNA
de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12.
14. Una célula huésped transformada con una
expresión de la Reivindicación 13.
15. Un anticuerpo que está dirigido contra un
polipéptido TRAIL-R de una cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento de unión de antígeno de dicho
anticuerpo.
16. Un anticuerpo de la Reivindicación 15, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
17. Una composición que comprende un anticuerpo
de la Reivindicación 15 o la Reivindicación 16 y un diluyente,
excipiente o vehículo aceptable fisológicamente.
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Families Citing this family (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US20020160446A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-10-31 | Holtzman Douglas A. | Novel genes encoding proteins having prognostic diagnostic preventive therapeutic and other uses |
US6313269B1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-11-06 | Smithkline Beecham Corporation | Tumor necrosis factor related receptor, TR6 |
US20040136951A1 (en) * | 1997-03-17 | 2004-07-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 |
US20050233958A1 (en) * | 1997-03-17 | 2005-10-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 |
US20080248046A1 (en) * | 1997-03-17 | 2008-10-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 |
US6872568B1 (en) | 1997-03-17 | 2005-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 antibodies |
CA2644454A1 (en) | 1997-03-17 | 1998-09-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 |
US20100152426A1 (en) * | 1997-05-15 | 2010-06-17 | Ashkenazi Avi J | Apo-2 receptor fusion proteins |
US6342369B1 (en) * | 1997-05-15 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Apo-2-receptor |
EP0981618B2 (en) * | 1997-05-15 | 2011-08-24 | Genentech, Inc. | Anti-apo-2 antibody |
JP2001514888A (ja) * | 1997-08-15 | 2001-09-18 | アイドゥン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | Trailレセプター、これをコードする核酸、およびその使用方法 |
EP1012179A2 (en) * | 1997-09-12 | 2000-06-28 | Apotech R&D S.A. | Cysteine rich receptors: trail |
US6252050B1 (en) * | 1998-06-12 | 2001-06-26 | Genentech, Inc. | Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method |
AU4561199A (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-30 | Genentech Inc. | Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method |
US20050281821A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-12-22 | Flavia Pernasetti | Method and composition for angiogenesis inhibition |
US6627199B1 (en) | 1999-07-09 | 2003-09-30 | Amgen Inc | Isolation, identification and characterization of tmst2, a novel member of the TNF-receptor supergene family |
US6951738B2 (en) | 1999-07-16 | 2005-10-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptors TR13 and TR14 |
EP1203024A4 (en) * | 1999-07-16 | 2003-02-26 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTORS TR13 AND TR14 |
WO2001010908A1 (en) | 1999-08-04 | 2001-02-15 | Amgen Inc. | Ntr3, a member of the tnf-receptor supergene family |
MXPA02001264A (es) | 1999-08-04 | 2002-07-22 | Amgen Inc | Fhm, nuevo miembro de la familia de supergenes de ligando de factor de necrosis tumoral. |
US20030134788A1 (en) * | 1999-08-12 | 2003-07-17 | Baker Kevin P. | Human tumor necrosis factor receptor TR16 |
WO2001012671A1 (en) * | 1999-08-12 | 2001-02-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor tr16 |
ATE313634T1 (de) | 1999-09-27 | 2006-01-15 | Genentech Inc | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen mittels inhibitoren von apoptose |
AU2006201322A1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-04-27 | Genentech, Inc. | Methods for making recombinant proteins using apoptosis inhibitors |
ES2267593T3 (es) | 2000-02-16 | 2007-03-16 | Genentech, Inc. | Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas. |
ES2637801T3 (es) | 2000-04-11 | 2017-10-17 | Genentech, Inc. | Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos |
TWI318983B (en) * | 2000-05-02 | 2010-01-01 | Uab Research Foundation | An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof |
US7476383B2 (en) * | 2000-05-02 | 2009-01-13 | The Uab Research Foundation | Antibody selective for DR4 and uses thereof |
US7279160B2 (en) * | 2000-05-02 | 2007-10-09 | The Uab Research Foundation | Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents |
KR100436089B1 (ko) * | 2000-07-06 | 2004-06-14 | 설대우 | 분비성 재조합 트라이머형의 트레일 단백질 생산을 위한 디엔에이 카세트, 테트라사이클린/독시사이클린-유도성아데노-관련 바이러스 벡터, 이 둘의 조합, 및 이들을이용한 유전자 치료 |
EP1303293B1 (en) | 2000-07-27 | 2008-12-03 | Genentech, Inc. | Sequential administration of cpt-11 and apo-2l polypeptide |
US20040005314A1 (en) * | 2001-07-27 | 2004-01-08 | Enrique Escandon | Apo-2l receptor agonist and cpt-11 synergism |
US20060062786A1 (en) * | 2000-11-08 | 2006-03-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
US20030228309A1 (en) * | 2000-11-08 | 2003-12-11 | Theodora Salcedo | Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
CA2426710A1 (en) * | 2000-11-08 | 2002-10-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
US20030139963A1 (en) * | 2000-12-08 | 2003-07-24 | Chickering D. Maxwell | Decision theoretic approach to targeted solicitation by maximizing expected profit increases |
US20020155109A1 (en) * | 2001-04-20 | 2002-10-24 | Lynch David H. | Bispecific antibodies that bind TRAIL-R1 and TRAIL-R2 |
KR100932577B1 (ko) * | 2001-05-18 | 2009-12-17 | 기린 홀딩스 가부시키가이샤 | 항 trail-r 항체 |
US20090226429A1 (en) * | 2001-05-25 | 2009-09-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors |
US20050214209A1 (en) * | 2001-05-25 | 2005-09-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
US7348003B2 (en) | 2001-05-25 | 2008-03-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
US7361341B2 (en) * | 2001-05-25 | 2008-04-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
MXPA03010747A (es) * | 2001-05-25 | 2004-03-02 | Human Genome Sciences Inc | Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a receptores de ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral. |
US20050129616A1 (en) * | 2001-05-25 | 2005-06-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
EP2192130A1 (en) | 2001-07-03 | 2010-06-02 | Genentech, Inc. | Human DR4 antibodies and uses thereof |
WO2003013555A1 (en) * | 2001-08-08 | 2003-02-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for amplifying expression from a cell specific promoter |
IL161051A0 (en) | 2001-10-02 | 2004-08-31 | Genentech Inc | Apo-2 ligand variants and uses thereof |
US7741285B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-06-22 | Genentech, Inc. | APO-2 ligand/trail formulations |
DK1450847T3 (da) | 2001-11-13 | 2010-12-13 | Genentech Inc | Apo2-ligand/TRAIL-formuleringer og anvendelser deraf |
US7842668B1 (en) | 2001-11-13 | 2010-11-30 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand/trail formulations |
WO2003054216A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
EP2500032A1 (en) | 2002-06-24 | 2012-09-19 | Genentech, Inc. | APO-2 ligand/trail variants and uses thereof |
ES2327409T3 (es) * | 2003-03-26 | 2009-10-29 | Apogenix Gmbh | Proteinas de fusion fc mejoradas. |
KR20060132006A (ko) * | 2004-03-23 | 2006-12-20 | 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. | 수용체 커플링제 및 이의 치료적 용도 |
DK1774037T3 (da) * | 2004-08-06 | 2011-08-15 | Genentech Inc | Analyser og fremgangsmåder, der anvender biomarkører |
ZA200701614B (en) * | 2004-08-06 | 2008-10-29 | Genentech Inc | Assays and methods using biomarkers |
KR20070050950A (ko) * | 2004-09-08 | 2007-05-16 | 제넨테크, 인크. | 사멸 수용체 리간드 및 cd20 항체의 사용 방법 |
BRPI0515604A (pt) * | 2004-09-08 | 2008-07-29 | Genentech Inc | método para o tratamento de células de cáncer e método de tratamento de uma doença imune relacionada |
JO3000B1 (ar) * | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
AU2006210838B2 (en) | 2005-02-02 | 2011-10-20 | The Uab Research Foundation | Agents and methods related to reducing resistance to apoptosis-inducing death receptor agonists |
US8029783B2 (en) | 2005-02-02 | 2011-10-04 | Genentech, Inc. | DR5 antibodies and articles of manufacture containing same |
US20060188498A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Genentech, Inc. | Methods of using death receptor agonists and EGFR inhibitors |
US20090155247A1 (en) * | 2005-02-18 | 2009-06-18 | Ashkenazi Avi J | Methods of Using Death Receptor Agonists and EGFR Inhibitors |
US7629315B2 (en) * | 2005-03-09 | 2009-12-08 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Compositions for blocking the inhibitory effect of human CRP on human leptin |
WO2007094842A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-08-23 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides and uses thereof |
WO2007022157A2 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Genentech, Inc. | Apoptosis sensitivity to ap02l/trail by testing for 'galnac-t14 expression in cells/tissues |
WO2007024921A2 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Cell Matrix | Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions |
JP6088723B2 (ja) | 2005-11-23 | 2017-03-01 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | B細胞アッセイに関する組成物及び方法。 |
US20070218504A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-20 | University Of Pittsburgh | Human leptin-derived polypeptides and uses thereof |
EP2379585A2 (en) | 2008-10-10 | 2011-10-26 | Anaphore, Inc. | Polypeptides that bind trail-ri and trail-r2 |
CA2777162A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Anaphore, Inc. | Polypeptides that bind il-23r |
KR20120101050A (ko) | 2009-11-05 | 2012-09-12 | 더 유에이비 리서치 파운데이션 | 기저형 유전자형 암의 치료 방법 |
WO2011116344A2 (en) | 2010-03-18 | 2011-09-22 | The Uab Research Foundation | Targeting cancer stem cells |
RS54846B1 (sr) | 2010-10-29 | 2016-10-31 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Novo anti-dr5 antitelo |
CA2828405A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Istituto Di Ricovero E Cura A Carattere Scientifico Materno-Infantile Bu Rlo Garofolo - Ospedale Di Alta Specializzazione E Di Rilievo Nazionale | Apoptosis-inducing molecules and uses therefor |
WO2012151317A1 (en) | 2011-05-03 | 2012-11-08 | Genentech, Inc. | Vascular disruption agents and uses thereof |
CN102898526A (zh) * | 2011-07-28 | 2013-01-30 | 山东先声麦得津生物制药有限公司 | 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用 |
DK2970473T3 (da) | 2013-03-14 | 2017-11-27 | Bristol Myers Squibb Co | Kombination af dr5-agonist og anti-pd-1-antagonist og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
GB201312155D0 (en) | 2013-07-05 | 2013-08-21 | Ucl Business Plc | Therapeutic invention |
WO2015138638A1 (en) | 2014-03-11 | 2015-09-17 | Theraly Pharmaceuticals, Inc. | Long acting trail receptor agonists for treatment of autoimmune diseases |
US11007251B2 (en) | 2015-12-17 | 2021-05-18 | The Johns Hopkins University | Ameliorating systemic sclerosis with death receptor agonists |
EP3439687A1 (en) | 2016-04-07 | 2019-02-13 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for treating pancreatitis and pain with death receptor agonists |
EP3323428A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-23 | CNRS Centre National de la Recherche Scientifique | Selective c-flip inhibitors as anticancer agents |
EP3910331A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-17 | iOmx Therapeutics AG | Intracellular kinase associated with resistance against t-cell mediated cytotoxicity, and uses thereof |
GB202016058D0 (en) | 2020-10-09 | 2020-11-25 | Ucl Business Ltd | Therapeautic treatment |
EP4257132A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-11 | iOmx Therapeutics AG | Sik3 inhibitors for treating diseases resistant to death receptor signalling |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL122408A0 (en) | 1995-06-29 | 1998-06-15 | Immunex Corp | Dna encoding a trail polypeptide and its preparation |
EP1862548A1 (en) | 1997-01-28 | 2007-12-05 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 4 (DR4 : death receptor 4), member of the TNF-receptor superfamily and binding to trail (APO2-L) |
US20010010924A1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-08-02 | Keith Charles Deen | Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides |
US6313269B1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-11-06 | Smithkline Beecham Corporation | Tumor necrosis factor related receptor, TR6 |
US6872568B1 (en) * | 1997-03-17 | 2005-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 antibodies |
CA2644454A1 (en) * | 1997-03-17 | 1998-09-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 |
EP1007562A4 (en) * | 1997-04-16 | 2000-09-27 | Millennium Pharm Inc | TANGO-63d AND TANGO-63e PROTEINS RELATED TO THE TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR |
US6342369B1 (en) * | 1997-05-15 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Apo-2-receptor |
EP0981618B2 (en) * | 1997-05-15 | 2011-08-24 | Genentech, Inc. | Anti-apo-2 antibody |
AU8400398A (en) | 1997-07-11 | 1999-02-08 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use |
JP2001514888A (ja) | 1997-08-15 | 2001-09-18 | アイドゥン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | Trailレセプター、これをコードする核酸、およびその使用方法 |
EP1012179A2 (en) | 1997-09-12 | 2000-06-28 | Apotech R&D S.A. | Cysteine rich receptors: trail |
-
1997
- 1997-06-26 US US08/883,036 patent/US6072047A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
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