JP5334773B6 - Ｔｒａｉｌに結合する受容体 - Google Patents

Description

ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られているタンパク質は、リガンドの腫瘍壊死因子ファミリーの一員である（Ｗｉｌｅｙ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３〜６８２，１９９５）。ＴＲＡＩＬは、ウィルス感染細胞だけでなく多くの様々なタイプの癌細胞を含むある種の形質転換細胞のアポトーシスを誘導する能力を示した（ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３及びＷｉｌｅｙ等、同上）。

ＴＲＡＩＬに結合する受容体タンパク質が同定されればＴＲＡＩＬの生物活性のさらなる研究に有益であろう。しかしながら、本発明以前にＴＲＡＩＬの受容体はひとつも報告されていなかった。

ＷＯ９７／０１６３３

Ｗｉｌｅｙ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３〜６８２，１９９５

本発明は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られているタンパク質と結合する、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）と称される新規なタンパク質に指向されている。ＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているＤＮＡ及びそのようなＤＮＡを含む発現ベクターが提供される。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを産生する方法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞をＴＲＡＩＬ−Ｒの発現を促進する条件で培養し、次いで発現されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをその培養物から回収することを含む。ＴＲＡＩＬ−Ｒと免疫反応する抗体もまた提供される。

図１は、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列とそれによってコードされるアミノ酸配列を示す。このＤＮＡ断片は実施例３に記載される。 図２は、実施例７に記載されるアッセイの結果を示す。このアッセイにおいて、可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを阻止した。 図３は、実施例８に記載される実験の結果を示す。示された化合物はＴＲＡＩＬ受容体を発現している細胞のアポトーシスを阻害することが証明された。

ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）と称される新規なタンパク質が本明細書において提供される。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）と称されるサイトカインと結合する。以下に論じられるように、ＴＲＡＩＬ−Ｒのある特定の使用はＴＲＡＩＬと結合するこの能力から生まれている。例えば、ＴＲＡＩＬ−ＲはＴＲＡＩＬの生物活性を阻害すること又はアフィニティークロマトグラフィーによってＴＲＡＩＬを精製することに使用を見出す。

ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として表示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。この配列情報が、ＴＲＡＩＬ受容体タンパク質を、受容体の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーの一員として同定する（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９〜９６２，１９９４）。細胞外ドメインはシステイン過多の繰り返し部分を含むが、このモチーフがこのファミリーの他の受容体におけるリガンド結合にとって重要であることが報告されてきた。ＴＲＡＩＬ−Ｒは細胞質領域にいわゆる「デスドメイン」を含むが、ある特定の他の受容体のこのようなドメインはアポトーシス信号の伝達に関連している。このタンパク質の上記及び他の特徴は以下でより詳細に論じる。

ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質又はその免疫原性断片はそれらと免疫反応する抗体を産生するための免疫原として利用され得る。本発明の１つの態様では、抗体はモノクローナル抗体である。

ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、実施例１に記載されるようにして精製された。実施例２には、ＴＲＡＩＬ−Ｒの断片に由来するアミノ酸配列情報が示されている。本発明の１つの態様はＴＲＡＩＬに結合し得る精製されたヒトＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質に指向されていて、本明細書中でＴＲＡＩＬ−Ｒはアミノ酸配列ＶＰＡＮＥＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３２７〜３３３位のアミノ酸）を含むものとして特徴づけられる。別の態様では、ＴＲＡＩＬ−ＲはＥＴＬＲＱＣＦＤＤＦＡＤＬＶＰＦＤＳＷＥＰＬＭＲＫＬＧＬＭＤＮＥＩＫＶＡＫＡＥＡＡＧＨＲＤＴＬＸＴＭＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３３６〜３８６位のアミノ酸、１つの未知アミノ酸をＸと表示）という配列を追加的に含む。また、これら特徴的なアミノ酸配列の唯一つを含むＴＲＡＩＬ−Ｒ断片も提供される。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びそれによってコードされるアミノ酸配列が図１に示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）：実施例３を参照せよ。図１に示されるアミノ酸配列は、ある特定の他の受容体タンパク質の細胞質領域に見出される、いわゆる「デスドメイン」の特徴を有する。このようなドメインはアポトーシス信号の伝達に関連していると報告されてきた。細胞質のデスドメインは、Ｆａｓ抗原（ＩｔｏｈとＮａｇａｔａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９３２，１９９３）、ＴＮＦ受容体タイプＩ（Ｔａｒｔａｇｌｉａ等、Ｃｅｌｌ ７４：８４５，１９９３）、ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０〜９９２，１９９６）及びＣＡＲ−１（Ｂｒｏｊａｔｓｃｈ等、Ｃｅｌｌ ８７：８４５〜８５５，１９９６）のなかに同定されてきた。これらデスドメインの細胞内アポトーシス信号カスケードの開始における役割は以下でさらに論じる。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＡ）を含むヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。図１に表示された断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３３６〜３８６位のアミノ酸として示されるＴＲＡＩＬ−Ｒの領域に相当している。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、シグナルペプチドとして機能するＮ末端の疎水性領域、続いて細胞外ドメイン、２１１〜２３１位のアミノ酸を含む膜貫通領域、及びＣ末端の細胞質ドメインを含む。コンピュータ分析は、シグナルペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１〜５１に相当することを予測している。従って、シグナルペプチドが開裂すると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５２〜４４０位のアミノ酸を含む成熟タンパク質が産生される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基５２〜４４０を含む成熟タンパク質の計算分子量は、約４３キロドルトンである。コンピュータが予測する次に可能性のあるシグナルペプチダーゼ開裂部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の（下降順で）５０位及び５８位のアミノ酸の後である。

本発明の別の態様では、成熟ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質のＮ末端残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５６位にあるイソロイシン残基である。ＴＲＡＩＬ−Ｒのいくつかのトリプシン消化ペプチド断片の配列が、Ｎ末端配列決定法及びナノＥＳ ＭＳ／ＭＳ（ナノエレクトロスプレータンデム型質量分析法）の組み合わせによって決定された。このペプチド断片の１つのＮ末端アミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５６位にあるイソロイシンであった。この断片がトリプシン開裂部位に先行されなかったので、この（Ｉｌｅ）５６残基はシグナルペプチドの開裂から生じるＮ末端残基に相当する可能性がある。

本発明のさらなる態様は、Ｎ末端残基としてアミノ酸５４を有する成熟ＴＲＡＩＬ−Ｒに指向されている。ＴＲＡＩＬ−Ｒの１つの調製物（ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞で発現される可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質）では、シグナルペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５３位の残基の後で開裂された。

当業者は、特別に調製されたＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の分子量が、グリコシル化の程度のような要因によって異なる場合があることを認めるであろう。特別に調製されるＴＲＡＩＬ−Ｒのグリコシル化様式は、例えばこのタンパク質が発現される細胞のタイプによって違うかもしれない。さらに、ある一定の調製物も様々にグリコシル化された多くの種類のタンパク質を含むかもしれない。関連する天然のグリコシル化様式を持つ又は持たないＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが本明細書中に提供される。大腸菌のような細菌の発現系におけるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。

１つの態様では、このタンパク質は約５０〜５５キロダルトンの範囲内の分子量によって特徴づけられるが、これは天然の完全な長さのヒトＴＲＡＩＬ−Ｒの調製物のために決定された分子量である。分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定され得る。

実施例１はＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を精製する１つの方法を示す。ジャーカット細胞を破壊し、その後の精製方法はアフィニティークロマトグラフィー（ＴＲＡＩＬを含むクロマトグラフィーマトリクスを利用する）及び逆相ＨＰＬＣを含む。

本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、既知のタンパク質精製技術を用いた適切な他の方法によっても精製され得る。１つの別の手法では、クロマトグラフィーマトリクスは代わりにＴＲＡＩＬ−Ｒと結合する抗体を含む。ＴＲＡＩＬ−Ｒを発現する他の細胞タイプ（例えば、実施例２に記載されるＰＳ−１細胞）はジャーカット細胞の代わりになり得る。上記の細胞は、凍結融解サイクル法、音波処理、機械的破砕法又は細胞溶解剤の使用を含む多くの既存技術のいずれによっても破壊され得る。

所望される精製の程度はタンパク質の意図される使用次第である。比較的高純度が所望されるのは、例えば、タンパク質がインビボ投与される場合である。有利には、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは他の（非ＴＲＡＩＬ−Ｒ）タンパク質に相当するタンパク質のバンドがＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検出されないほどに精製される。当業者には、グリコシル化の違い、翻訳後のプロセシングの違い、といったもののために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質に相当する多重バンドが視覚化される場合があることが認識されるだろう。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で単一のタンパク質バンドによって示されるように、最も好ましくは実質的に均質なものになるまで精製される。タンパク質バンドは銀染色、クマシーブルー染色又は（タンパク質が放射標識されていれば）オートラジオグラフィーによって視覚化される場合もある。

本発明は、天然に存在するもの又は組換えＤＮＡ技術が関わる方法のような様々な技術を介して産生されるものを含め、種々の形態のＴＲＡＩＬ−Ｒを包含する。このようなＴＲＡＩＬ−Ｒの形態には、ＴＲＡＩＬ−Ｒの断片、誘導体、変異体及びオリゴマー、さらにＴＲＡＩＬ−Ｒ又はその断片を含む融合タンパク質があるが、それに限定されるものではない。

ＴＲＡＩＬ−Ｒは、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基といったような他の化学成分との共有又は凝集結合体を形成することによってその誘導体を創製するように修飾され得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒの共有的誘導体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒアミノ酸側鎖上の官能基に又はＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドのＮ末端又はＣ末端において化学成分を結合させることによって製造され得る。診断（検出）又は治療薬がＴＲＡＩＬ−Ｒについた結合体は、以下により詳しく論じるように、本明細書中で考慮される。

本発明の範囲内にある他のＴＲＡＩＬ−Ｒ誘導体は、Ｎ末端又はＣ末端の融合といった組換え培養における合成のような、他のタンパク質又はポリペプチドとＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの共有又は凝集結合体を含む。融合タンパク質の例はＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーに関連して以下に論じる。さらに、ＴＲＡＩＬ−Ｒ含有融合タンパク質はＴＲＡＩＬ−Ｒの精製及び同定を促進するために加えられたペプチドを含み得る。このようなペプチドは、例えば、ポリ−Ｈｉｓ又は米国特許第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８に記載された抗原同定ペプチドを含む。このようなペプチドの１つがＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＬｙｓというＦｌａｇ（登録商標）ペプチドであり、これは抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体と可逆的に結合したエピトープを提供し、発現される組換えタンパク質の迅速なアッセイと簡便な精製を可能にする。４Ｅ１１と表記されるマウスのハイブリドーマは、本明細書中に援用する米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるようなある種の２価金属カチオンの存在下でＦｌａｇ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ９２５９の下でアメリカ・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、イーストマンコダック社、サイエンティフィックイメージングシステム部門、ニューヘーヴン、コネチカット、から入手し得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞膜結合型及び可溶（分泌）型のいずれもが本明細書中に提供される。可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを発現している生きた細胞を例えば遠心分離によって培養液から分離し、所望のタンパク質の存在に対して培養液（上澄液）をアッセイすることによって同定され得る（同時に、非可溶性の膜結合型から区別される）。培養液にＴＲＡＩＬ−Ｒが存在していることは、このタンパク質が細胞から分泌され、所望のタンパク質の可溶型となることを示している。

受容体タンパク質の可溶型は、通常そのタンパク質を細胞表面に保持させ得る膜貫通領域を欠いている。本発明の１つの態様では、可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドはこのタンパク質の細胞外ドメインを含む。可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、それが産生される細胞から分泌される限りは、細胞質ドメイン又はその一部分を含んでもよい。可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５２〜２１０位のアミノ酸を含む可溶性のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒである。他の可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、限定しないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＸ〜２１０位のアミノ酸を含むポリペプチドを含み、ここでＸは５１〜５９までの整数である。

ＴＲＡＩＬ−Ｒの可溶型はこのタンパク質の膜結合型に比較していくつかの長所を有する。可溶性タンパク質は細胞から分泌されるので組換え宿主細胞からのタンパク質の精製が促進される。さらに、可溶性タンパク質は、一般に例えば静脈内投与のようなある種の応用により適している。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ断片が本明細書中に提供される。このような断片は多くの従来技術のいずれによっても調製され得る。所望のペプチド断片は化学的に合成してもよい。１つの別の手段は、酵素による消化、例えば特定のアミノ酸残基によって定義される部位でタンパク質を開裂させることが知られている酵素でタンパク質を処置することによってＴＲＡＩＬ−Ｒ断片を産生することを伴う。また別の適した技術は、所望のポリペプチド断片をコードしているＤＮＡ断片を単離してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することに関わる。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドがＰＣＲにおける５’及び３’プライマーとして利用される。

断片の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列にある少なくとも２０又は少なくとも３０の連続したアミノ酸を含むものである。細胞質ドメイン由来の断片は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ介在性の信号伝達の研究、及び生物学的な信号の伝達に関連した細胞プロセスを調節することに使用を見出す。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの断片はまた抗体産生における免疫原として利用され得る。特定の態様は、ＴＲＡＩＬを結合する能力を保持しているＴＲＡＩＬ−Ｒのポリペプチド断片に指向されている。このような断片は上記に記載したような可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドでもよい。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の天然に存在する変異体が本明細書中に提供される。このような変異体は、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシングから又はＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質のタンパク分解性の開裂から生じるタンパク質を含む。選択的ｍＲＮＡスプライシングからは、例えばこのタンパク質の天然に存在する可溶型のような、短縮型の（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）生物活性のあるＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を生じる場合がある。タンパク分解から生じる変異には、例えばＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質から１つ又はそれ以上の末端アミノ酸（通常は１〜５の末端アミノ酸）がタンパク分解によって除去されることによる、様々なタイプの宿主細胞における発現時のＮ又はＣ末端の差異がある。アミノ酸配列における差異が遺伝的多形型（タンパク質を産生する個体間の対立遺伝子変異）に起因するＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質も本明細書中に考慮される。

当業者はまた、シグナルペプチドの開裂部位が、コンピュータ・プログラムによって予測されるものとは異なる場合があること、及び組換えＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを発現させるのに利用される宿主細胞のタイプのような要因に応じて変わる場合があることを認めるであろう。あるタンパク質の調製物は、１つ以上の部位でシグナルペプチドが開裂されるので、種々のＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含む場合がある。すでに論じたように、本明細書中で提供される成熟ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の特定の態様は、Ｎ末端アミノ酸としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５１、５２、５４、５６又は５９位の残基を有するタンパク質であるが、それに限定されるものではない。

ＴＲＡＩＬ−Ｒの様々なドメインに関する論考について言えば、当業者はこのタンパク質のそのような領域の上記境界はおおまかであることを認めるだろう。例証すると、膜貫通領域の境界が（その目的のために供されるコンピュータ・プログラムを用いて予測し得るが）上記に記載したものと異なる場合がある。従って、細胞外ドメインのＣ末端が上記に同定された残基とは異なる可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが本明細書中で考慮される。

他の天然に存在するＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ及びポリペプチドには非ヒトの種に由来するものを含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２というヒトＴＲＡＩＬ−Ｒの、他の哺乳類種由来の相同体が本明細書中で考慮される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＤＮＡ配列に基づいたプローブは、慣用の交叉種ハイブリダイゼーション技術を用いて他の哺乳類種由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに利用され得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列は本明細書中で開示される天然の配列と異なっていてもよい。１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする既知の遺伝暗号の縮重性により、ＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたものとは異なってもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質をコードすることが可能である。このような変異ＤＮＡ配列は、サイレント突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の間に起こる）から生じても、天然の配列に対する計画的な突然変異誘発の産物であってもよい。従って、本明細書中に提供されるＤＮＡ配列のなかには、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ）及び天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列に対する遺伝暗号の結果として縮重しているＤＮＡがある。

本明細書中に提供されるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドのなかには、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒの生物活性を保持している天然のＴＲＡＩＬポリペプチドの変異体がある。このような変異体は、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと実質的に相同であっても、１つ又はそれ以上の欠損、挿入又は置換のために天然のＴＲＡＩＬ−Ｒとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の態様は、限定しないが、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列に比較して１〜１０のアミノ酸残基が欠失、挿入又は置換しているＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む。本発明のＴＲＡＩＬ−ＲコードＤＮＡは、１つ又はそれ以上の欠失、挿入又は置換のために天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡとは異なるが、生物活性のあるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをコードする変異体を含む。ＴＲＡＩＬ−Ｒの生物活性の１つはＴＲＡＩＬと結合する能力である。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＤＮＡに中等度ストリンジェント又は高度ストリンジェント条件でハイブリダイズすることができ、生物学的に活性なＴＲＡＩＬ−Ｒをコードする核酸が本明細書中で提供される。このようなハイブリダイズする核酸は変異したＤＮＡ配列及び、例えば非ヒト哺乳類のような非ヒト種由来のＤＮＡを含むが、それに限定されるものではない。

中等度ストリンジェント条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、「分子クローニング：実験マニュアル」第２版、１巻、１．１０１〜１０４頁、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９に記載される条件を含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって規定されたような中等度ストリンジェンシィ条件は、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液の使用及び約５５℃、５ＸＳＳＣ、一晩中というハイブリダイゼーション条件を含む。高度ストリンジェント条件は、より高い温度でのハイブリダイゼーション及び洗浄操作を含む。本発明の１つの態様は、高度ストリンジェント条件でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ配列に指向されているが、ここで前記条件は６８℃でハイブリダイゼーションさせた後に６３〜６８℃において０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することを含む。

本明細書中で提供されるある種のＤＮＡ及びポリペプチドは、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ含む。また、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ又はポリペプチドが天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、又は少なくとも９８％同一である配列を含む態様も考慮されている。この同一性比率は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手し得るＧＡＰコンピュータ・プログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムに対する好ましいデフォルトパラメータは、（１）ヌクレオチドに対する（同定記号の１値及び非同定記号の０値を含む）単一の比較マトリクス、及びＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編、「タンパク質の配列・構造アトラス」、国立バイオ医学研究財団、３５３〜３５８頁、１９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリクス、（２）各ギャップ（ｇａｐ）に対する３．０のペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ）及び各ギャップの各記号に対する追加的な０．１０のペナルティ、及び（３）エンドギャップに対するノー・ペナルティ、を含む。

本発明の特定の態様では、変異ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドはアミノ酸配列において天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと異なるが、生物活性においては天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと実質的に同等である。１つの例は、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと実質的に同じ結合親和性をもってＴＲＡＩＬと結合する変異ＴＲＡＩＬ−Ｒである。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるような慣用の方法によって測定され得る。

変異したアミノ酸配列は、天然ＴＲＡＩＬ−Ｒの１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が別の残基に置換されているが、この保存的に置換されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが天然のタンパク質の有する所望の生物活性（例えばＴＲＡＩＬに結合する能力）を保持しているという保存的な置換を含みうる。ある既定のアミノ酸は同様の物理化学的特性を有する残基によって置換され得る。保存的な置換の例は、１つの脂溶性残基を例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａのような別の脂溶性残基とお互いに置換すること、又は、１つの極性残基を別の極性残基と、例えばＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎの間でお互いに置換することを含む。他の保存的な置換、例えば同様の疎水特性を有する全体領域の置換に関わること、もよく知られている。

もうひとつの変異体の例においては、生物活性にとって必須ではないＣｙｓ残基をコードする配列が、Ｃｙｓ残基が欠損又は他のアミノ酸で置換されるように変更され、再生時に不適正な分子内ジスルフィド結合の形成が阻止される。ＴＮＦ−Ｒファミリーのある受容体は、その細胞外ドメインにシステイン過多の繰り返しモチーフを含む（Ｍａｒｓｔｅｒｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５７４７〜５７５０，１９９２）。これらの繰り返し部分はリガンド結合にとって重要であると考えられている。例証すると、Ｍａｒｓｔｅｒｓ等、同上は、この繰り返し部分の１つを欠く可溶性ＴＮＦ−Ｒ１型ポリペプチドのＴＮＦα及びＴＮＦβに対する結合親和性が１０倍減少していること、また、さらに繰り返し部分を欠失させると、このリガンドの検出し得る結合性が完全に失われることを示した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒは２つのそのようなシステイン過多の繰り返し部分を含むが、第一のものは残基９４〜１３７を含み、第二のものは残基１３８〜１７８を含む。上記システイン過多ドメインの内部にあるシステイン残基は、ＴＲＡＩＬ結合活性の保持が所望されるときは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ変異体において有利なことに変更されないままである。

他の変異体は、隣接した二塩基性アミノ酸残基の修飾によって製造され、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在している酵母系での発現を増強することができる。ＥＰ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化する部位特異的突然変異誘発の使用を開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ及びＬｙｓ−Ａｒｇの対をこれら隣接塩基性残基の出現をなくすように変更する残基の欠失、付加又は置換によって不活性化される。成熟ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の７２−７３、１５４−１５５、３２２−３２３、３２３−３２４及び３５９−３６０位のアミノ酸においてそのような隣接した塩基性の残基対を含む。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合はＫＥＸ２による開裂に対してほとんど非感受性なので、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−ＡｒｇをＬｙｓ−Ｌｙｓへ変換することはＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的及び好ましいアプローチを代表している。

ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、その変異体及び断片を含め、任意の適切なアッセイにおいて生物活性を試験され得る。ＴＲＡＩＬに結合するＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの能力は慣用の結合アッセイで確かめられるが、その実施例は以下に記載される。

発現系
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡを含む組換えクローニング及び発現ベクター、並びに組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡを含む発現ベクターは、そのＤＮＡによってコードされるＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを製造するために使用され得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの産生法は、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードする組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞をＴＲＡＩＬ−Ｒの発現を促進させる条件下で培養し、次いで発現したＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドをこの培養物から回収することを含む。当業者は、用いられる宿主のタイプ、並びにＴＲＡＩＬ−Ｒが膜結合型かそれとも宿主細胞から分泌される可溶型か、というような要因に応じて発現されたＴＲＡＩＬ−Ｒの精製法が変わることを認めるであろう。

任意の適切な発現系が利用され得る。ベクターは、哺乳類、微生物、ウィルス又は昆虫の遺伝子に由来するような適切な転写又は翻訳の調節ヌクレオチド配列と機能可能に結合したＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終止を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能に結合している。従って、プロモーターのヌクレオチド配列がＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモーターのヌクレオチド配列は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列と機能可能に結合している。所望される宿主細胞における複製能力を与える複製起点、及び形質変換体を同定する選択遺伝子が発現ベクターに一般に導入される。

さらに、（天然又は異種の）適当なシグナルペプチドのコード配列が発現ベクターに導入され得る。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、ＴＲＡＩＬ−Ｒがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳されるようにＴＲＡＩＬ−Ｒ配列と読み枠内で融合され得る。所望の宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの細胞外分泌を促進する。このシグナルペプチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒが細胞から分泌されるときＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドから開裂される。

ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母又はより高等な真核生物の細胞がある。哺乳類又は昆虫の細胞が一般に宿主細胞としての使用に好ましい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞の宿主とともに使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターが、例えばＰｏｕｗｅｌｓ等、「クローニングベクター：実験マニュアル」、エルシーバー、ニューヨーク（１９８５）に記載されている。本明細書中に開示されるＤＮＡ構築体に由来するＲＮＡを用いてＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを産生するために、無細胞翻訳系も利用され得る。

原核生物はグラム陰性又はグラム陽性菌を含み、例えば、大腸菌やバシラスである。形質転換に適した原核生物の宿主細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカス属に含まれる様々な他の種を含む。大腸菌のような原核宿主細胞では、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、原核宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進するためのＮ末端メチオニン残基を含みうる。このＮ末端Ｍｅｔは発現された組換えＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドから開裂され得る。

原核宿主細胞に用いられる発現ベクターは、通常１つ又はそれ以上の表現型によって選択し得るマーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子とは、例えば、抗菌耐性を与える又は自己栄養要求性をもたらすタンパク質のコード遺伝子である。原核宿主細胞にとって有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）のような市販されているプラスミドに由来するものを含む。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むので、形質転換された細胞を同定する簡便な方法を提供する。適切なプロモーター及びＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２ベクターに挿入される。他の市販ベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマシアファインケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）及びｐＧＥＭ１（プロメガバイオテク、マジソン、ＷＩ、アメリカ）がある。

組換え原核宿主細胞の発現ベクターとして一般的に使用されているプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８及びＧｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験マニュアル」コールドスプリングハーバーラボラトリー、４１２頁，１９８２）を含む。特に有用な原核宿主発現系は、λファージＰ_Ｌプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ易熱性リプレッサー配列を利用する。アメリカ・タイプカルチャー・コレクションから入手し得る、λＰ_Ｌプロモーターの誘導体を取り込むプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９，ＡＴＣＣ ３７０９２に存在）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＰＲ１，ＡＴＣＣ ５３０８２に存在）がある。

ＴＲＡＩＬ−Ｒは、あるいは酵母の宿主細胞、好ましくはサッカロマイセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）で発現されてもよい。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はクリベロミセスのような酵母の他の属も利用され得る。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自動複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終止配列及び選択マーカー遺伝子をしばしば含む。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホ−グルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのような他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓ等、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；及びＨｏｌｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）に対するプロモーターが含まれる。酵母での発現に使用される他の適切なベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７にさらに記載されている。もうひとつの別の手段は、Ｒｕｓｓｅｌ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）及びＢｅｉｅｒ等（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって記載されたグルコースで抑制性のＡＤＨ２プロモーターである。酵母と大腸菌のいずれでも複製されるシャトルベクターは、大腸菌における選択及び複製用（Ａｍｐ^ｒ遺伝子及び複製起点）のｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列を上記酵母ベクターに挿入することによって構築され得る。

酵母のα因子リーダー配列がＴＲＡＩＬポリペプチドの分泌を指示するために利用されうる。このα因子リーダー配列はしばしばプロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎ等、Ｃｅｌｌ ３０：９３３，１９８２及びＢｉｔｔｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照せよ。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列も当業者に知られている。リーダー配列は１つないしそれ以上の制限部位を含むようにその３’末端の近傍で修飾され得る。これによってリーダー配列の構造遺伝子への融合が促進される。

酵母の形質転換プロトコールは当業者に知られている。そのようなプロトコールがＨｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８によって記載されている。このＨｉｎｎｅｎ等のプロトコールは選択培地においてＴｒｐ^＋形質転換体を選択するが、ここで選択培地は、０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カサミノ（ｃａｓａｍｉｎｏ）酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍＬアデニン及び２０μｇ／ｍＬウラシルを含む。

ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は「富（リッチ）」培地における発現誘導のために生育され得る。富培地の１例は、１％酵母抽出物、２％ペプトン及び８０μｇ／ｍＬアデニンと８０μｇ／ｍＬウラシルを添加した１％グルコースを含むものである。グルコースが培地から消費されるとＡＤＨ２プロモーターの脱抑制が起こる。

哺乳類又は昆虫の宿主培養系も組換えＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを発現させるために利用され得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生用のバキュロウィルス株がＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。哺乳類起源の確立された細胞系もまた利用され得る。適切な哺乳類宿主細胞系の例は、サルの腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ等、Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、及びＭｃＭａｈａｎ等（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）によって記載されたアフリカミドリザルの腎臓細胞株、ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株を含む。

哺乳類宿主細胞の発現ベクターに対する転写及び翻訳の制御配列がウィルスゲノムから摘出され得る。一般的に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列はポリオーマ・ウィルス、アデノウィルス２、シミアン・ウィルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウィルスに由来する。例えば、ＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、ＳＶ４０複製起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位は、哺乳類宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を提供するのに使用され得る。ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有用なのは、ウィルスの複製開始部位をも含み得る断片としていずれもウィルスゲノムから容易に入手されるからである（Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。ＳＶ４０ウィルスの複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向かって広がる約２５０ｂｐの配列が含まれる限り、より短い又はより長いＳＶ４０断片も使用され得る。

哺乳類宿主細胞に用いられる発現ベクターはＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示されたようにして構築され得る。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞において哺乳類のｃＤＮＡを安定な高レベルで発現させるための有用な系は、実質的にＣｏｓｍａｎ等（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって記載された方法によって構築され得る。Ｃｏｓｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４に記載された高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる哺乳類発現ベクターはＥＰ−Ａ−０３６７５６６及びＷＯ９１／１８９８２に記載されている。１つの別の手段として、ベクターはレトロウィルスに由来してもよい。完全な長さのＴＲＡＩＬ−Ｒが過剰に発現すると、形質転換されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞に膜泡状化（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）と核濃縮を生じたが、このことは細胞死の機構がアポトーシスであることを示している。このようなＴＲＡＩＬ−Ｒ介在性のアポトーシスが起こる宿主細胞に対しては適切なアポトーシス阻害剤を発現系に含める場合がある。

組換えＴＲＡＩＬ−Ｒを発現している宿主細胞のＴＲＡＩＬ−Ｒ誘導性アポトーシスを阻害するために、この細胞はアポトーシス阻害剤として機能するポリペプチドをコードする発現ベクターとともに同時形質転換してもよい。このようなポリペプチドをコードする発現ベクターは従来の方法によって製造され得る。もうひとつのアプローチは培養液にアポトーシス阻害剤を添加することを含む。ポックスウィルスＣｒｍＡ、バキュロウィルスＰ３５、ＦＡＤＤのＣ末端断片及びトリペプチド誘導体ｚＶＡＤ−ｆｍｋを使用して宿主細胞の死を減少させることが、実施例６及び８に示されている。

ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）は、エンザイムシステムプロダクツ、ダブリン、カリフォルニアから供されるトリペプチドベースの化合物である。実施例８に示されるように、ｚＶＡＤ−ｆｍｋはＴＲＡＩＬ−Ｒを発現する細胞が培養される培地へ添加してもよい。

後にＣｒｍＡと称された３８キロダルトンの牛痘由来のタンパク質が、Ｐｉｃｋｕｐ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７６９８〜７７０２，１９８６；本明細書中に援用する）に記載されている。ＣｒｍＡの配列情報は、Ｐｉｃｋｕｐ等、同上の図４に示されている。ＣｒｍＡタンパク質を産生し精製する１つのアプローチがＲａｙ等（Ｃｅｌｌ，６９：５９７〜６０４，１９９２；本明細書中に援用する）に記載されている。

バキュロウィルスである核多面体病ウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａによってコードされる３５キロダルトンのタンパク質がＦｒｉｅｓｅｎとＭｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２２６４〜２２７２，１９８７；本明細書中に援用する）に記載されている。ここでバキュロウィルスｐ３５と表記されるこのタンパク質の配列情報が、ＦｒｉｅｓｅｎとＭｉｌｌｅｒ、同上の図５に示されている。

デスドメイン含有の細胞質タンパク質、ＦＡＤＤ（ＭＯＲＴ１としても知られる）は、Ｂｏｌｄｉｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５〜７７９８，１９９５；本明細書中に援用する）に記載されている。ＦＡＤＤは、アポトーシスに介在するある種の受容体の細胞質のデスドメインと直接的又は間接的に結合していると報告されている（Ｂｏｌｄｉｎ等、Ｃｅｌｌ ８５：８０３〜８１５，１９９６年６月号；Ｈｓｕ等、Ｃｅｌｌ ８４：２９９〜３０８，１９９６年１月号）。

本発明の１つの態様では、（タンパク質のＣ末端部分に位置する）デスドメインを含むがアポトーシス・エフェクター機能の起因されているＮ末端領域を欠いている、短縮型ＦＡＤＤポリペプチドがアポトーシスを減少させるために利用されている。Ｎ末端で短縮された、ある特定のＦＡＤＤ欠失突然変異体のポリペプチドを用いて、他のアポトーシス誘導受容体を発現している細胞の死を阻害することが、Ｈｓｕ等（Ｃｅｌｌ ８４：２９９〜３０８，１９９６年１月号；本明細書中に援用する）に記載されている。

このアプローチは実施例８に明示されているが、これは、Ｂｏｌｄｉｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５〜７７９８，１９９５）に示されたＭＯＲＴ１のアミノ酸配列における１１７〜２４５位のアミノ酸に相当するアミノ酸配列を有する、１つの適切なＦＡＤＤ優性ネガティブ（ＦＡＤＤ−ＤＮ）ポリペプチドを利用するものである。実施例８では、細胞は、ＴＲＡＩＬ−Ｒをコードしている発現ベクター及び、ＦＡＤＤ−ＤＮポリペプチドのＮ末端に融合した上記Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドをコードする発現ベクターで同時形質転換された。

理論に縛られることを望むわけではないが、１つの可能な解釈は、ＦＡＤＤのＣ末端断片は受容体の細胞内デスドメインと結合するがアポトーシスを起こすのに必要なタンパク質のＮ末端部分を欠いている、ということである（Ｈｓｕ等、Ｃｅｌｌ ８４：２９９〜３０８，１９９６年１月号；Ｂｏｌｄｉｎ等、Ｃｅｌｌ ８５：８０３〜８１５，１９９６年６月号）。短縮型ＦＡＤＤは、内因性の完全な長さのＦＡＤＤが受容体のデスドメインと結合することを阻止する可能性がある；従って、このような内因性ＦＡＤＤによって開始されるはずのアポトーシスが阻害されるのである。

本発明の発現系に有用な他のアポトーシス阻害剤は慣用のアッセイ法で同定され得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒ発現細胞のアポトーシスを減少させる能力に対して化合物を試験するこのようなアッセイが実施例８に記載されている。

ポックスウィルスＣｒｍＡ、バキュロウィルスＰ３５及びｚＶＡＤ−ｆｍｋは、ウィルスのカスパーゼ阻害剤である。他のカスパーゼ阻害剤はＴＲＡＩＬ−Ｒ介在性の細胞死を減少させる能力に対して試験され得る。

ＣｒｍＡ、バキュロウィルスｐ３５及びある特定のペプチド誘導体（ｚＶＡＤ−ｆｍｋを含む）を特定の細胞／系においてアポトーシス阻害剤として使用することがＳａｒｉｎ等（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２４４５〜２４５０，１９９６年１２月号；本明細書中に援用する）に論じられている。プログラム化された細胞死につながるシグナル伝達カスケードにおけるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）ファミリープロテアーゼの役割、及びこのようなプロテアーゼの阻害剤をアポトーシスの阻止に使用することがＳａｒｉｎ等、同上及びＭｕｚｉｏ等（Ｃｅｌｌ ８５：８１７〜８２７，１９９６）に論じられている。

一般に、細胞質ドメインを欠いている（つまり、シグナル伝達に関わるタンパク質領域を欠いている）ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの発現に対してアポトーシス阻害剤を利用する必要はない。従って、細胞外ドメイン（又はその断片）だけを含む可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを産生する発現系は、上記アポトーシス阻害剤の１つを含む必要はない。

ＴＲＡＩＬ−Ｒを産生するのに利用され得るシグナルペプチドに関し、所望ならば、ＴＲＡＩＬ−Ｒの天然のシグナルペプチドを異種のシグナルペプチド又はリーダー配列で置換してもよい。シグナルペプチド又はリーダーの選択は組換えＴＲＡＩＬ−Ｒが産生される宿主細胞のタイプのような要因に依存しうる。例証すると、哺乳類の宿主細胞において機能的である異種シグナルペプチドの例は、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されたインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されたインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド； 米国特許第４，９６８，６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；及びＥＰ４６０，８４６に記載されたＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチド、を含む。

ＴＲＡＩＬ−Ｒのオリゴマー型
本発明はＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド（複数）を含むオリゴマーも包含する。ＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーは、共有結合又は非共有結合したダイマー、トリマー又はより高次のオリゴマーの形態で存在し得る。

本発明の１つの態様は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに融合したペプチド成分間の共有的または非共有的な相互作用を介して結合した多くのＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含むオリゴマーに指向されている。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）又は、オリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体由来のある特定のポリペプチドは、以下により詳しく記載するように、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに付着してそのオリゴマー化を促進し得るペプチドのひとつである。

特定の態様では、オリゴマーは２〜４のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドから成る。オリゴマーのＴＲＡＩＬ−Ｒ成分は、すでに記載したように、可溶性のポリペプチドでもよい。
１つの別の方法として、ＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーは免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合したある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ等（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）；Ｂｙｒｎ等（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）及び、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈとＡｒｕｆｆｏ（「免疫グロブリン融合タンパク質の構築」、免疫学の最新プロトコール、補巻４、１０．１９．１〜１０．１９．１１頁，１９９２）に記載されている。

本発明の１つの態様は、抗体Ｆｃ領域にＴＲＡＩＬ−Ｒを融合させることによって作成された２つの融合タンパク質を含むＴＲＡＩＬ−Ｒダイマーに指向されている。ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする融合遺伝子が適切な発現ベクターに挿入される。ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現され、抗体分子とほぼ同様にして会合されるが、このとき鎖間ジスルフィド結合がＦｃ成分間に形成され、２価のＴＲＡＩＬ−Ｒを産生する。

本明細書中に提供されるのは、抗体由来のＦｃポリペプチドに融合したＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む融合タンパク質である。Ｆｃ成分間のジスルフィド結合を介して結合した２つの融合タンパク質を含むダイマーだけでなく、そのような融合タンパク質をコードするＤＮＡもまた提供される。本明細書中に使用される「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体Ｆｃ領域に由来するポリペプチドの天然及び変異型を含む。ダイマー化を促進するヒンジ部を含むこのようなポリペプチドの短縮型もまた含まれる。

ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（本明細書中に援用する）に記載された１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ部から天然Ｃ末端に伸びる短鎖ポリペプチドである。もうひとつの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号及びＢａｕｍ等（ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２〜４００１，１９９４）に記載されたＦｃ変異型である。この変異型のアミノ酸配列はＷＯ９３／１０１５１に示された天然Ｆｃ配列のそれと、１９位のアミノ酸がＬｅｕからＡｌａに変化していること、２０位のアミノ酸がＬｅｕからＧｌｕに変化していること、及び２２位のアミノ酸がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、同一である。この変異型はＦｃ受容体に対して減少した親和性を示す。

別の態様では、ＴＲＡＩＬ−Ｒは抗体の重鎖又は軽鎖の可変部で置換されていてもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖及び軽鎖の両方で作られるならば、４つものＴＲＡＩＬ−Ｒ細胞外領域を用いてＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーを形成することが可能である。

また、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有する又は有さない、多種のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの中には、本明細書中に援用する米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号に記載されたものがある。所望のペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、任意の適切な慣用技術を用いて、ＴＲＡＩＬ−ＲをコードするＤＮＡ配列の中に、同じ読み枠で挿入され得る。例えば、リンカーをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドがＴＲＡＩＬ−Ｒコード配列の中で連結され得る。特定の態様では、融合タンパク質は、ペプチドリンカーによって分離された２〜４の可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む。

オリゴマーのＴＲＡＩＬ−Ｒを製造する別の方法はロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインとはそれが存在するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。もともとロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質の中で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９，１９８８）、それ以来多種多様なタンパク質の中に見出されてきた。既知のロイシンジッパーには、ダイマー化又はトリマー化する天然に存在するペプチド及びその誘導体がある。可溶性のオリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、肺の界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーがＨｏｐｐｅ等（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，１９９４）に記載されている（本明細書中に援用する）。修飾されたロイシンジッパーを使用してそれに融合した異種タンパク質の安定なトリマー化を可能にすることがＦａｎｓｌｏｗ等（Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７〜２７８，１９９４）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合した可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は適切な宿主細胞で発現され、形成される可溶性オリゴマーＴＲＡＩＬ−Ｒが培養上澄液から回収される。

オリゴマーのＴＲＡＩＬ−Ｒには、ＴＲＡＩＬに対する例えば２価、３価の結合部位という特性がある。Ｆｃ成分を含む上記融合タンパク質（及びそれより形成されるオリゴマー）は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製できるという利点を提供する。オリゴマーのＴＲＡＩＬ−Ｒをコードする又はＴＲＡＩＬ−Ｒオリゴマーの製造に有用な融合タンパク質をコードするＤＮＡが本明細書中に提供される。

アッセイ
ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質（ＴＲＡＩＬ−Ｒの断片、変異体、オリゴマー及び他の形態を含む）は、慣用の結合アッセイのような任意の適切なアッセイにおいて、ＴＲＡＩＬに結合する能力を試験され得る。例証すると、ＴＲＡＩＬ−Ｒは検出可能な試薬（例、放射性核種、発色団、比色又は蛍光反応の触媒酵素、といったもの）で標識され得る。標識されたＴＲＡＩＬ−ＲをＴＲＡＩＬを発現している細胞と接触させる。ついで細胞を洗浄し、結合していない標識ＴＲＡＩＬ−Ｒを除去し、細胞に結合した標識の存在を、その標識の性質に応じて選択される適切な技術によって決定する。

結合アッセイ法の１つの実施例は以下の通りである。ＴＲＡＩＬ−ＲのｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターが、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３（本明細書中に援用する）に記載されたようにして構築される。ヒト及びマウスＴＲＡＩＬのＤＮＡおよびアミノ酸配列情報はＷＯ９７／０１６３３に示されている。ＴＲＡＩＬはＮ末端細胞質ドメイン、膜貫通領域及びＣ末端細胞外ドメインを含む。１０ｃｍ^２ディッシュ中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を組換え発現ベクターで形質転換する。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ初期−早期エンハンサー／プロモーターから駆動されるＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎ等（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）によって記載されたように、アフリカミドリザルの腎臓細胞株、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来した。

形質転換された細胞を２４時間培養し、各皿の細胞を２４ウェルプレートに分割する。さらに４８時間培養した後、この形質転換細胞（約４ｘ１０^４細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ｍｇ／ｍＬの非脂肪性乾燥乳が添加された結合培地（２５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍＬのアジ化ナトリウム、２０ｍＭヘペス［Ｈｅｐｅｓ］ｐＨ７．２、を含むＲＰＭＩ １６４０）である。次いで細胞を様々な濃度の可溶性ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質とともに３７℃で１時間インキュベートする。次いで細胞を洗浄し、結合培地中の一定飽和濃度の^１２５Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧと、穏やかに撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。十分に洗浄した後、トリプシン処理によって細胞を遊離させる。

上記で利用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して指向され、ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ社、ウェストグローヴ、ＰＡより入手し得る。この抗体は標準的なクロラミン−Ｔ法を用いて放射性ヨード化される。抗体は細胞に結合した任意のＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分に結合する。すべてのアッセイにおいて、^１２５Ｉ−抗体の非特異的結合は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃの不在下、並びにＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ及び２００倍モル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下においてアッセイされる。

細胞に結合した^１２５Ｉ−抗体は、パッカード・オートガンマカウンターで定量化される。アフィニティー計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）は、マイクロヴァクスコンピュータで処理されるＲＳ／１（ＢＢＮソフトウェア、ボストン、ＭＡ）に基づいてなされる。

他のタイプの適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例証すると、ＴＲＡＩＬ−Ｒ変異体の生物活性は、ＴＲＡＩＬへの結合に対して天然のＴＲＡＩＬ−Ｒと競合する変異体の能力をアッセイすることによって決定され得る。

競合的結合アッセイは、慣用の方法によって実施され得る。競合的結合アッセイに利用され得る試薬は、放射標識されたＴＲＡＩＬ−Ｒ及び細胞表面に（内因性又は組換え）ＴＲＡＩＬを発現している無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞を含む。例えば、放射標識された可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ断片は、細胞表面のＴＲＡＩＬに結合することに対して可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒ変異体と競合するために使用され得る。無傷細胞の代わりに、プロテインＡ又はプロテインＧのＦｃ成分との（固相上での）相互作用を介して固相に結合した可溶性ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質を置換し得る。プロテインＡ及びプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムは、ファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ＮＪより入手できるものを含む。別のタイプの競合的結合アッセイは、可溶性ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質のような放射標識された可溶性ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ−Ｒを発現している無傷細胞を利用する。競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイによって定性的な結果が得られるのに対し、スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）は、定量的な結果を生むのに利用され得る。

生物活性に対する別のタイプのアッセイは、例えばジャーカット細胞として知られるヒト白血病Ｔ細胞株のような標的細胞のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスを阻止する能力に対してＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを試験することに関わる。ジャーカットクローンＥ６−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）と称される細胞系のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスは、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３（本明細書中に援用する）に記載されたアッセイ方法に示されている。

ＴＲＡＩＬ−Ｒの使用
ＴＲＡＩＬ−Ｒの使用は以下のものを含むが、それに限定されるものではない。これらのＴＲＡＩＬ−Ｒの使用のあるものはＴＲＡＩＬに結合する能力に由来する。

ＴＲＡＩＬ−Ｒはタンパク質精製の試薬として使用を見出す。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、固体の支持物質に付着してアフィニティークロマトグラフィーによってＴＲＡＩＬを精製するのに使用され得る。特定の態様では、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド（本明細書中に記載されるＴＲＡＩＬに結合し得る任意の形態）は、慣用の方法によって固体の支持体へ付着される。１つの実施例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含むクロマトグラフィーカラムが入手される（ファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ＮＪ）。別の手段では、ＴＲＡＩＬ／Ｆｃタンパク質は、Ｆｃ成分との相互作用を介してプロテインＡ又はプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着される。

ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質はまたＴＲＡＩＬ−Ｒへの結合親和性に関するＴＲＡＩＬタンパク質の生物活性を測定することに使用を見出す。従ってＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、例えば種々の条件下におけるＴＲＡＩＬタンパク質の貯蔵寿命及び安定性をモニターする「品質保証」試験を実施する人々によって利用され得る。例証すると、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、種々の温度で保存されたり、種々の細胞タイプで産生されたＴＲＡＩＬタンパク質の生物活性を測定する結合親和性試験に利用され得る。ＴＲＡＩＬ−ＲはまたＴＲＡＩＬタンパク質の修飾（例えば、化学修飾、短縮、突然変異、等）の後に生物活性を保持しているかどうかを確認するために利用され得る。修飾されたＴＲＡＩＬタンパク質のＴＲＡＩＬ−Ｒに対する結合親和性を非修飾ＴＲＡＩＬタンパク質のそれと比較して、ＴＲＡＩＬの生物活性に対するその修飾の不都合な影響を検出する。そうすれば、あるＴＲＡＩＬタンパク質の生物活性は、例えばそれを研究試験に用いる前に、確認することができる。

ＴＲＡＩＬ−Ｒはまた細胞表面にＴＲＡＩＬを発現する細胞を精製する又は同定することに使用を見出す。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドはカラムクロマトグラフィーマトリクスのような固相又は似たような適切な基質に結合する。例えば、磁気ミクロスフェアをＴＲＡＩＬ−Ｒでコートして磁場のかかった保温容器に保つことができる。ＴＲＡＩＬ発現細胞を含む細胞混合物の懸濁液をＴＲＡＩＬ−Ｒの付着した固相に接触させる。細胞表面にＴＲＡＩＬを発現している細胞は固定化されたＴＲＡＩＬ−Ｒに結合し、結合しなかった細胞は洗い落とされる。

また、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、検出可能な成分と結合し、ＴＲＡＩＬの発現を試験される細胞とともにインキュベートし得る。インキュベーション後、結合しなかった標識化ＴＲＡＩＬ−Ｒは除去され、検出可能な成分の細胞表面における存在又は不在が確認される。

さらに別のものでは、ＴＲＡＩＬ⁻細胞を含むことが疑われる細胞混合物がビオチニル化したＴＲＡＩＬ−Ｒとともにインキュベートされる。インキュベーション時間は通常少なくと十分な結合を保証する１時間である。得られた混合物をアビジン被覆ビーズの詰まったカラムに通し、よってビオチンのアビジンに対する高親和性によって、所望される細胞がビーズと結合することが可能になる。アビジン被覆ビーズを使用する方法は知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０Ｄ：２３９，１９８６を参照）。洗浄して非結合性の物質を除去すること、及び結合した細胞の遊離は、慣用の方法を用いて実施される。

ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドはまた、それに付着した薬剤をＴＲＡＩＬを担う細胞まで運搬するキャリアーとしての使用を見出す。ＴＲＡＩＬ発現細胞は、Ｗｉｌｅｙ等（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３〜６８２，１９９５）に同定されるものを含む。従ってＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、診断又は治療剤をそのような細胞（又は細胞表面にＴＲＡＩＬを発現することが見出される他の細胞タイプ）へインビトロ又はインビボの方法で運搬することに使用され得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに付着し得る診断（検出）又は治療剤は、限定しないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬物、放射性核種、発色団、比色又は蛍光反応の触媒酵素等を含み、その意図される応用に応じて特定の薬剤が選択される。毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、リボソーム不活化タンパク質、トリコテセン類（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）のような真菌毒素、及びそれらの誘導体又は断片（例えば、短鎖）がある。診断用に適した放射性核種は、限定しないが、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ及び^７６Ｂｒを含む。治療用に適した放射性核種の例は、^１３１Ｉ、^２１１Ａｔ、^７７Ｂｒ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^１０９Ｐｄ、^６４Ｃｕ、及び^６７Ｃｕである。

このような薬剤は任意の適切な慣用方法によってＴＲＡＩＬ−Ｒに付着され得る。タンパク質であるＴＲＡＩＬ−Ｒはアミノ酸の側鎖に官能基を含み、これが所望の薬剤の官能基と反応して例えば共有結合を形成する。あるいは、このタンパク質又は剤は所望の反応性官能基を産生又は付着するように誘導化してもよい。誘導化は、様々な分子をタンパク質に付着させるために供される二官能性連結試薬（ピアスケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ）の１つを付着させることを伴ってもよい。タンパク質を放射標識する多くの技術が知られている。放射性核種金属は、例えば適切な二官能性キレート剤を使用することによってＴＲＡＩＬ−Ｒへ付着され得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ及び（好ましくは共有結合した）適切な診断又は治療剤を含む結合体はこのようにして製造される。この結合体は、投与されるか又は特定の応用に適した量で適用される。

本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ及びポリペプチドは、欠失又は不十分な量のＴＲＡＩＬ−Ｒによって（直接的又は間接的に）引き起こされる障害の治療方法の開発において使用され得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドはそのような障害に罹患している哺乳類へ投与してもよい。また、遺伝子治療アプローチを採用してもよい。天然のＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチド配列の開示によって欠失ＴＲＡＩＬ−Ｒ遺伝子の検出及びその正常ＴＲＡＩＬ−Ｒコード遺伝子による置換が可能になる。欠失遺伝子は、インビトロの診断アッセイにおいて、及び本明細書中に開示される天然ＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチド配列をこの遺伝子の欠失を有していることが疑われる人間に由来するＴＲＡＩＬ−Ｒ遺伝子のそれと比較することによって、検出され得る。

本発明のタンパク質の別の使用は、種々の細胞タイプでのＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ相互作用を阻害することから生じる生物学的効果を研究するための研究ツールとしてである。ＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドはまたＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ又はその相互作用を検出するインビトロアッセイに利用してもよい。

ＴＲＡＩＬ−Ｒはインビトロ又はインビボの方法でＴＲＡＩＬの生物活性を阻害するのに利用してもよい。精製されたＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドはＴＲＡＩＬが内因性の細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒに結合することを阻害するのに使用され得る。このようにしてＴＲＡＩＬが内因性の受容体に結合することから生じる生物学的効果が阻害される。例えば、ＴＲＡＩＬに結合し得る上記のＴＲＡＩＬ−Ｒ断片、オリゴマー、誘導体、及び変異体を含めて種々の形態のＴＲＡＩＬ−Ｒが利用され得る。１つの態様では、ＴＲＡＩＬの生物活性を阻害するために、例えば、特定の細胞のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスを阻害するために、可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒが利用される。

ＴＲＡＩＬ−ＲはＴＲＡＩＬ介在性の障害を治療するために哺乳類へ投与してもよい。このようなＴＲＡＩＬ介在性の障害は、ＴＲＡＩＬによって（直接的又は間接的に）引き起こされる又は増悪される病態を含む。

ＴＲＡＩＬ−Ｒは血栓性微小血管障害の治療に有用であると思われる。１つのこのような障害は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である（Ｋｗａａｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７１，１９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、Ｂｌｏｏｄ ８０：１８９０，１９９２）。ＴＴＰに起因した死亡率の上昇がアメリカ疾病コントロールセンターによって報告されている（Ｔｏｒｏｋ等、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５０：８４，１９９５）。

ＴＴＰ罹患者（ＨＩＶ^＋及びＨＩＶ⁻患者を含む）由来の血漿は皮膚微小血管起源のヒト上皮細胞のアポトーシスを誘導するが、大血管起源のものは誘導しない（Ｌａｕｒｅｎｃｅ等、Ｂｌｏｏｄ，８７：３２４５，４月１５日，１９９６）。従って、ＴＴＰ患者の血漿はアポトーシスを直接的又は間接的に誘導する１つ又はそれ以上の因子を含むと考えられている。ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３（本明細書中に援用する）に記載されているように、ＴＲＡＩＬはＴＴＰ患者の血漿に存在していて、微小血管上皮細胞のアポトーシスを誘導する役割を果たしている可能性がある。

もうひとつの血栓性微小血管障害は、溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）である（Ｍｏａｋｅ，Ｊ．Ｌ．Ｌａｎｃｅｔ，３４３：３９３，１９９４；Ｍｅｌｎｙｋ等、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５５：２０７７，１９９５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、同上）。本発明の１つの態様は「成人性ＨＵＳ」（小児も罹患するが）とよく言われる病態を治療するためにＴＲＡＩＬ−Ｒを使用することに指向されている。小児／下痢関連性ＨＵＳとして知られている障害は成人性ＨＵＳとは病因が異なる。

小血管の凝塊形成によって特徴づけられる他の病態がＴＲＡＩＬ−Ｒを使用して治療され得る。そのような病態は以下のものであるが、それに限定されない。小児ＡＩＤＳ患者の約５〜１０％に見られる心臓の問題に小血管の凝塊形成が関与していると考えられている。心臓内微小血管の破損が多発性硬化症患者に報告されている。さらなる例として、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の治療が考慮されている。

１つの態様では、患者の血液又は血漿を体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）ＴＲＡＩＬ−Ｒと接触させる。ＴＲＡＩＬ−Ｒは慣用の方法によって適切なクロマトグラフィーに結合され得る。患者の血液又は血漿を、マトリクスに結合したＴＲＡＩＬ−Ｒを含むクロマトグラフィーカラムに流した後、患者に戻す。固定化された受容体は、ＴＲＡＩＬと結合することで、患者の血液からＴＲＡＩＬタンパク質を除去する。

また、ＴＲＡＩＬ−Ｒは、血栓性微小血管障害の罹患者にインビボで投与され得る。１つの態様では、可溶型のＴＲＡＩＬ−Ｒがその患者に投与される。
従って、本発明は、有効量のＴＲＡＩＬ−Ｒの使用を介して、血栓性微小血管障害を治療する方法を提供する。ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドは、微小血管上皮細胞に対するＴＲＡＩＬ介在性の障害（例えば、アポトーシス）を阻害するためのインビボ又は体外的な方法に利用され得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒは、特定の障害を治療するのに有用な他の剤と一緒に利用され得る。Ｌａｕｒｅｎｃｅ等（Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５，１９９６）に報告されたインビトロ試験では、抗Ｆａｓ阻止抗体、オーリントリカルボン酸又は寒冷型沈降物の枯渇した正常血漿を用いることによって、微小血管上皮細胞のＴＴＰ血漿介在性アポトーシスの減少が達成された。

従って、上皮細胞のＦａｓリガンド介在性アポトーシスを阻害する剤を上皮細胞のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスを阻害する剤と組み合わせて、患者を治療し得る。１つの態様では、ＴＲＡＩＬ−Ｒ及び抗Ｆａｓ阻止抗体が、ＴＴＰやＨＵＳのような血栓性微小血管障害に特徴づけられる障害の罹患者へ一緒に投与される。Ｆａｓ抗原（ＣＤ９５）に対して指向されたモノクローナル阻止抗体の例がＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／１０５４０（本明細書中に援用する）に記載されている。

本発明の別の態様はＨＩＶ感染患者のＴＲＡＩＬ介在性Ｔ細胞死を減少させるためのＴＲＡＩＬ−Ｒの使用に指向されている。ＡＩＤＳの進展におけるＴ細胞アポトーシスの役割が多くの研究の主題になっている（例えば、Ｍｅｙａａｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２１７〜２１９，１９９２；Ｇｒｏｕｘ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：３３１，１９９２；Ｏｙａｉｚｕ等、「ＨＩＶ感染における細胞の活性化とアポトーシス」 Ａｎｄｒｉｅｕ及びＬｕ編、プレナムプレス，ニューヨーク，１９９５，１０１〜１１４頁、を参照）。ある特定の研究者たちはＦａｓ介在性アポトーシスの役割を研究してきたが、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）の関与もまた探究されてきた（Ｅｓｔａｑｕｉｅｒ等、Ｂｌｏｏｄ ８７：４９５９〜４９６６，１９９６;Ｍｉｔｒａ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８７：５８１〜５８５，１９９６；Ｋａｔｓｉｋｉｓ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９〜２０３６，１９９５）。Ｔ細胞アポトーシスは多数のメカニズムを介して発現するらしい。

ＨＩＶ^＋患者に見られるＴ細胞死の少なくともいくつかにＴＲＡＩＬが介在していると考えられている。理論に縛られることを望むわけではないが、このようなＴＲＡＩＬ介在性Ｔ細胞死は、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）として知られるメカニズムを介して発現すると考えられている。

活性化されたヒトＴ細胞は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体を介して活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）と名づけられたプロセスの引き金を引くと、プログラム化された細胞死（アポトーシス）を実行するように誘導される。ＨＩＶ感染無症候性者から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞のＡＩＣＤが報告されている（Ｇｒｏｕｘ等、同上）。従って、ＡＩＣＤは、ＨＩＶ感染者におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の枯渇及びＡＩＤＳへの進行にある役割を果たしている可能性がある。

本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくは可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド）を患者に投与することを含む、ＨＩＶ^＋患者におけるＴＲＡＩＬ介在性Ｔ細胞死を阻害する方法を提供する。１つの態様では、ＴＲＡＩＬ−Ｒを用いた治療が開始されるとき、患者は無症候性である。所望ならば、治療の前に、末梢血のＴ細胞をＨＩＶ^＋患者より抽出し、慣用の方法によってＴＲＡＩＬ介在性細胞死に対する感受性を試験してもよい。

１つの態様では、患者の血液又は血漿を体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）ＴＲＡＩＬ−Ｒと接触させる。ＴＲＡＩＬ−Ｒは慣用の方法によって適切なクロマトグラフィーに結合され得る。患者の血液又は血漿を、マトリクスに結合したＴＲＡＩＬ−Ｒを含むクロマトグラフィーカラムに流した後、患者に戻す。固定化された受容体は、ＴＲＡＩＬと結合することで、患者の血液からＴＲＡＩＬタンパク質を除去する。

ＨＩＶ^＋患者の治療において、ＴＲＡＩＬ−Ｒは他のＴ細胞アポトーシス阻害剤と組み合わせて利用され得る。Ｆａｓ介在性アポトーシスはまた、ＨＩＶ^＋者におけるＴ細胞の欠失に関連があるとされている（Ｋａｔｓｉｋｉｓ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９〜２０３６，１９９５）。従って、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）介在性及びＴＲＡＩＬ介在性のＴ細胞死に感受性のある患者は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ相互作用を阻止する剤とＦａｓ−Ｌ／Ｆａｓの相互作用を阻止する薬剤の双方で治療され得る。Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結合を阻止するのに適した剤は、限定されないが、可溶性Ｆａｓポリペプチド;可溶性Ｆａｓポリペプチドのオリゴマー型（例えば、ｓＦａｓ／Ｆｃのダイマー）;アポトーシスを生じる生物信号を伝達することなくＦａｓに結合する抗Ｆａｓ抗体;Ｆａｓ−ＬのＦａｓへの結合を阻止する抗Ｆａｓ−Ｌ抗体;及びＦａｓに結合するがアポトーシスを生じる生物信号を伝達しないＦａｓ−Ｌの変異型、である。好ましくは、この方法に利用される抗体はモノクローナル抗体である。抗Ｆａｓモノクローナル抗体を阻止することを含め、Ｆａｓ−Ｌ／Ｆａｓ相互作用を阻止するのに適した薬剤の例がＷＯ９５／１０５４０に記載されており、本明細書中に援用する。

本発明のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの有効量を、生理学的に許容される希釈剤、キャリアー又は賦形剤のような他の成分と組み合わせて含む組成物が、本明細書中に提供される。ＴＲＡＩＬ−Ｒは医薬的に有用な組成物を製造するために用いられる既知の方法に従って製剤化され得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒは、単独の活性物質として又はある適応症に適した他の既知の活性物質とともに、医薬的に許容される希釈剤（例えば、生理食塩水、トリス塩酸、酢酸塩及びリン酸緩衝液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル類［ｐａｒａｂｅｎｓ］）、乳化剤、安定化剤、アジュバント及び／又はキャリアーと混ぜて配合され得る。医薬組成物に適したフォーミュレーションは、「レミントンの製薬科学」１６版、１９８０，マック・パブリッシングカンパニー、イーストン、ＰＡに記載されるものを含む。

さらに、そのような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合した又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等のようなポリマー化合物に取り込まれた、又はリポソーム、ミクロ乳濁液、ミセル、単層又は多層性の小胞、赤血球ゴースト又はスフェロブラストに取り込まれたＴＲＡＩＬ−Ｒを含み得る。このような組成物はＴＲＡＩＬ−Ｒの物理的状態、溶解性、安定性、インビボ遊離速度及びインビボクリアランス速度に影響し、意図される応用に応じて選択される。細胞表面上に発現されるＴＲＡＩＬ−Ｒも同様の使用を見出し得る。

本発明の組成物は、天然のタンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー及び生物活性のある断片のような本明細書中に記載される任意の形態のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含んでよい。特定の態様では、組成物は可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド又は可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを含むオリゴマーを含む。

ＴＲＡＩＬ−Ｒは、局所的、非経口的、又は吸入等、任意の適したやり方で投与され得る。「非経口的」なる用語は、例えば、皮下、静脈内、筋肉内の注射、また例えば疾病又は損傷の部位における局所投与を含める。インプラントからの持続性放出も考慮される。当業者は、治療される障害の本質、患者の体重、年齢及び全般の状態、及び投与経路のような要因によって、適切な投与量が変化することを認知するであろう。初期用量は動物試験によって決定され、人間への投与量の評定は業界に受け入れられた方法によって実施される。

生理学的に許容されるフォーミュレーションでＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸を含む組成物も考慮される。ＴＲＡＩＬ−ＲのＤＮＡは、例えば注射用に製剤化され得る。
抗体
ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドと免疫反応する抗体が本明細書中に提供される。このような抗体は、抗体が（非特異的な結合ではなく）抗体の抗原結合部位を介してＴＲＡＩＬ−Ｒに結合するという点において、ＴＲＡＩＬ−Ｒと特異的に結合する。

実施例１に記載されるようにして製造されたＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質は、それと免疫反応する抗体を産生するときの免疫原として利用され得る。また、断片又は融合タンパク質のような別の形態のＴＲＡＩＬ−Ｒも免疫原として利用される。

ポリクローナル及びモノクローナル抗体は従来の技術によって製造され得る。例えば、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ:生物分析の新しい次元」Ｋｅｎｎｅｔ等（編）、プレナムプレス、ニューヨーク（１９８０）；「抗体:実験マニュアル」、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｄ（編）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）を参照のこと。ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して指向されるモノクローナル抗体の産生は実施例４でさらに説明される。

このような抗体の抗原結合断片は、従来の技術によって産生され得るが、本発明によっても包含される。このような断片は、限定されないが、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片を含む。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片及び誘導体もまた提供される。

本発明のモノクローナル抗体は、例えばマウスモノクローナル抗体のヒト化版のような、キメラ抗体を含む。このようなヒト化抗体は既知の技術によって製造され得て、抗体が人に投与されるとき、低減された免疫原性という長所を提供する。１つの態様では、ヒト化抗体は、マウス抗体の可変部（あるいはその抗原結合部位のみ）及びヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体由来の（抗原結合部位を欠いた）可変部断片を含む。キメラ化及びさらに工学処理したモノクローナル抗体を産生する方法は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８）、Ｌｉｕ等（ＰＮＡＳ ８４：３４３９，１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋ等（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９）及びＷｉｎｔｅｒとＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９，１９９３年５月）に記載されているものを含む。

この抗体の使用のなかには、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの存在を検出するアッセイにおける使用がある。この抗体はまた免疫アフィニティークロマトグラフィーによってＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を精製するときに利用され得る。

ＴＲＡＩＬ−ＲのＴＲＡＩＬへの結合をさらに阻止し得る上記の抗体は、そのような結合から生じる生物活性を阻害するために使用され得る。このような阻止抗体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ発現細胞に対するＴＲＡＩＬの結合を阻害する能力に対して抗体を試験するような、任意の適切なアッセイ法を用いて同定してもよい。このような細胞の例は以下の実施例２に記載されるジャーカット細胞及びＰＳ１細胞である。あるいは、阻止抗体は、標的細胞に対するＴＲＡＩＬの結合から生じる生物活性を阻害する能力に対するアッセイにおいて同定してもよい。例えば、抗体は、ジャーカット細胞のＴＲＡＩＬ介在性溶解を阻害する能力に対してアッセイされ得る。

このような抗体はインビトロの方法において利用され得るか、又は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ介在性の生物活性を阻害するためにインビボで投与され得る。細胞表面のＴＲＡＩＬ受容体とＴＲＡＩＬの相互作用によって（直接的又は間接的に）引き起こされる又は増悪される障害はこのようにして治療される可能性がある。１つの治療方法は、ＴＲＡＩＬ介在性の生物反応を阻害するのに有効な量の阻止抗体を哺乳類にインビボ投与することを伴う。ＴＲＡＩＬによって、直接的又は間接的に、引き起こされる又は増悪される障害は、このようにして治療される。モノクローナル抗体は一般にこのような治療法における使用に対して好ましい。１つの態様では、抗原結合性の抗体断片が利用されている。

ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して指向された阻止抗体は、例えばＴＴＰ又はＨＵＳを治療するような血栓性微小血管障害を治療する上記の方法においてＴＲＡＩＬ−Ｒの代用になり得る。この抗体は、微小血管性上皮細胞に対する（アポトーシスのような）ＴＲＡＩＬ介在性の障害を阻害するためにインビボで投与され得る。

ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して産生された抗体は、作動性の（ａｇｎｏｓｉｔｉｃ）（即ち、リガンドを模倣した）性質によってスクリーニングされ得る。このような抗体は、細胞表面のＴＲＡＩＬ−Ｒに結合すると、ＴＲＡＩＬが細胞表面のＴＲＡＩＬ−Ｒに結合するときに引き起こされる生物学的効果に似た生物学的効果（例えば生物信号の伝達）を引き起こす。アゴニスト抗体は、ＴＲＡＩＬに関して報告されているように、ある種の癌細胞又はウィルス感染細胞のアポトーシスを引き起こすために使用され得る。癌細胞（限定されないが、白血球、リンパ腫、メラノーマ細胞を含む）及びウィルス感染細胞を殺すＴＲＡＩＬの能力は、Ｗｉｌｅｙ等（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３〜６８２，１９９５）及びＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３に記載されている。

ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して指向された抗体及び生理学的に許容される希釈剤、賦形剤又はキャリアーを含む組成物が本明細書中に提供される。このような組成物に適した成分は、ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を含む組成物に対して上記に記載されるようなものである。

本明細書中にまた提供されるのは、ＴＲＡＩＬ−Ｒに対して指向される抗体に付着した、検出可能な（例えば診断用の）又は治療用の剤を含む結合体である。このような薬剤の例は上記に示される。この結合体は、インビトロ又はインビボの方法において使用を見出す。

核酸
本発明はＴＲＡＩＬ−Ｒの核酸を提供する。このような核酸は、限定されないが、実施例２に記載されるペプチドをコードするＤＮＡを含む。このようなＤＮＡは遺伝暗号の知識から同定され得る。本発明の他の核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される核酸配列から成る単離ＤＮＡを含む。

本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドの産生、例えば上記に論じた組換え発現系に有用な単離核酸を提供する。このような核酸は、限定されないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡを含む。本発明の核酸分子は、１本鎖及び２本鎖いずれの形でのＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡだけでなく、そのＲＮＡ相補体をも含む。ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びそれらを組み合わせたものを含む。ゲノムＤＮＡは、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３のｃＤＮＡ又はその適切な断片をプローブとして使用する、慣用の技術によって単離され得る。

本明細書中に考慮される任意の形態のＴＲＡＩＬ−Ｒ（完全な長さのＴＲＡＩＬ−Ｒ又はその断片）をコードするＤＮＡが提供される。ＴＲＡＩＬ−ＲコードＤＮＡの特定の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（Ｎ末端のシグナルペプチドを含む）の完全長のヒトＴＲＡＩＬ−ＲをコードするＤＮＡ、及び完全長の成熟ヒトＴＲＡＩＬ−ＲをコードするＤＮＡを含む。他の態様は、可溶性のＴＲＡＩＬ−Ｒをコードする（例えば、シグナルペプチドを有する又は有さないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質の細胞外ドメインをコードする）ＤＮＡを含む。

本発明の１つの態様は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の連続したヌクレオチドを含むＴＲＡＩＬ−Ｒヌクレオチド配列の断片に指向されている。他の態様では、ＤＮＡ断片は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ配列の少なくとも３０、又は少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。本明細書中に提供される核酸は、１本鎖及び２本鎖の形態をしたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡとともに、前記断片のＤＮＡ及びＲＮＡ相補体を含む。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸断片の使用のなかにはプローブ又はプライマーとしての使用がある。遺伝暗号及び実施例２に示されるアミノ酸配列に関する知識を用いて、幾組みもの縮重したオリゴヌクレオチドが製造され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ断片が単離され増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとしての使用を見出す。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ核酸の他の有用な断片は、標的となるＴＲＡＩＬ−ＲのｍＲＮＡ（センス）又はＴＲＡＩＬ−ＲのＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る１本鎖の核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを含む。本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドはＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡのコード領域の断片を含む。このような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０のヌクレオチドを含む。あるタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導し得ることは、例えば、ＳｔｅｉｎとＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）及びｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に記載されている。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸配列に結合すると、２本鎖分子が形成され、その２本鎖の増強された分解、転写又は翻訳の未熟な終止、又は他の手段を含むいくつかの手段の１つによって標的配列の転写又は翻訳が阻止される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはこのようにしてＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の発現を阻止するために使用され得る。さらにアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは修飾された糖リン酸ジエステル骨格（又はＷＯ９１／０６６２９に記載されるような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここでそのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性である。抵抗性の糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定である（即ち、酵素分解に抵抗し得る）が、標的ヌクレオチド配列に結合し得る配列特異性を保持している。

センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるような有機成分及び、ポリ−（Ｌ−リジン）のような、標的核酸配列に対する親和性を増加させる他の成分に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）のような挿入剤、及びアルキル化剤又は金属錯体もセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと結合して標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し得る。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ_４介在性ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入法によって、又はエプスタイン・バーウィルスのような遺伝子導入ベクターを用いることによって、標的核酸核酸配列を含む細胞へ導入され得る。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは適切なレトロウィルスベクターへ挿入され得る。標的核酸配列を含む細胞はインビボ又は体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）組換えレトロウィルスベクターと接触される。適切なレトロウィルスベクターは、限定しないが、マウスレトロウィルスであるＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃ（ＷＯ９０／１３６４１を参照のこと）と表記される二重コピーベクターを含む。

センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成によって標的ヌクレオチド配列を含む細胞へ導入され得る。適切なリガンド結合分子は、限定しないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、その対応する分子又は受容体に結合したり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合した変換体が細胞に侵入するのを阻止するこのリガンド結合分子の能力に実質的に干渉しない。

また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的ヌクレオチド配列を含む細胞へ導入され得る。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは細胞内部で内因性リパーゼによって分離される。

以下の実施例は本発明の特定の態様をさらに詳しく示すために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
実施例１：ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の精製
ヒトＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）タンパク質は以下の方法によって調製された。ヒト急性Ｔ白血病細胞株であるジャーカット細胞の細胞膜からＴＲＡＩＬ−Ｒを単離した。ジャーカット細胞が選択されたのは、アフィゲル（ａｆｆｉ−ｇｅｌ）ビーズ（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡ）に共有結合したＦｌａｇ（登録商標）ペプチドを用いて、表面がビオチニル化したジャーカット細胞から特定のバンドがアフィニティー沈殿され得るからである。この沈殿バンドは分子量約５２ｋＤを有している。約４２ｋＤのマイナーな特定のバンドも存在していたが、恐らくはＴＲＡＩＬ−Ｒのタンパク分解産物又はグリコシル化の少ない形態と解釈される。

約５００億個のジャーカット細胞が遠心分離によって採取され（８０ｍＬの細胞ペレット）、１度ＰＢＳで洗浄した後、液体窒素にショック（ｓｈｏｃｋ）冷凍した。Ｍａｅｄａ等（Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７３１:１１５、１９８３;本明細書中に援用する）に記載された第３の方法に以下の５つの変更を加えて、形質膜を単離した。
１．以下のプロテアーゼ阻害剤が指定の濃度ですべての溶液に含まれた:アプロチニン，１５０ｎＭ;ＥＤＴＡ，５ｍＭ;ロイペプチン，１μＭ;ｐＡＰＭＳＦ，２０μＭ;ペファブロック，５００μＭ;ペプスタチンＡ，１μＭ;ＰＭＳＦ，５００μＭ。
２．ジチオトレイトールは使用しなかった。
３．ＤＮＡアーゼは均質化（ホモジェナイゼーション）溶液に使用しなかった。
４．１ｍＬの細胞ペレットに対し、１．２５ｍＬの均質化緩衝液を使用した。
５．均質化は、すりガラスのダンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジェナイザーを５回通すことによって達成した。

細胞膜を単離した後、１％のオクチルグルコシド及び上記濃度の上記プロテアーゼ阻害剤をすべて含む５０ｍＬ ＰＢＳに単離細胞膜を再懸濁した。次に、得られた溶液を４℃、３０分のインキュベーションの間、繰り返し渦状に撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）した。この溶液をＬＥ−８０ベックマン超遠心機（ベックマンインスツルメンツ社、パロアルト、ＣＡ）、ＳＷ２８ローターにて２０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液（膜抽出物）を得た。

クロマトグラフィー
上記のように製造された膜抽出物からＴＲＡＩＬ−Ｒを精製する第１の工程はアフィニティークロマトグラフィーであった。先ず膜抽出物を抗Ｆｌａｇ（登録商標）Ｍ２アフィゲルカラム（２ｍＬのアフィゲルビーズに１０ｍｇのモノクローナル抗体Ｍ２が結合したもの）に流し、非特異的に結合する物質を吸着させた。次に、この通り抜け（フロースルー）画分をＦｌａｇ（登録商標）ＴＲＡＩＬアフィゲルカラム（１ｍＬのアフィゲルビーズに１０ｍｇの組換えタンパク質が結合したもの）に流した。

アフィゲル支持体は、誘導化、架橋化したアガロースゲルビーズのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡより入手できる）である。上記に論じたように、Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓは、特異的なモノクローナル抗体によって可逆的に結合したエピトープを提供し、発現される組換えタンパク質の迅速なアッセイ及び簡便な精製を可能にする。Ｍ２とはＦｌａｇ（登録商標）に結合するモノクローナルである。Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体、並びにＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質を製造及び使用するための他の試薬は、イーストマンコダック社、サイエンティフィックイメージングシステム部門、ニューヘーヴン、コネチカット、から入手される。Ｆｌａｇ（登録商標）ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（可溶性のＴＲＡＩＬポリペプチドに融合したＦｌａｇ（登録商標）を含む）の製造は、本明細書中に援用するＰＣＴ出願ＷＯ９７／０１６３３にさらに詳しく記載されている。

上記カラムは以下の緩衝液それぞれ２５ｍＬで以下の順序で洗浄した:
１．１％オクチルグルコシドを含むＰＢＳ
２．ＰＢＳ
３．追加的な２００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ
４．ＰＢＳ
結合した物質を５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）１ｍＬ分画にて数回溶出し、各分画につき直ちに３００μＬの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．５）で中和した。各分画のＴＲＡＩＬ結合活性を以下に記載されるＴＲＡＩＬ−Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。ＴＲＡＩＬ結合活性の高い分画をプールし、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液とし、次いでキャピラリー逆相ＨＰＬＣカラム［内径５００μｍＸ２５ｃｍ、５μｍのＶｙｄａｃ Ｃ_４素材（Ｖｙｄａｃ、ヘスペリア、ＣＡ）を充填した融合シリコンキャピラリーカラム］にて、０．１％ＴＦＡを含む０％〜１００％のアセトニトリル水溶液の連続（ｌｉｎｅａｒ）勾配液（１分間につき２％）を用いてクロマトグラフした。次に、高いＴＲＡＩＬ結合活性を有する分画を上記のようにして決定し、プールして、所望されるならば、凍結乾燥した。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ特異的ＥＬＩＳＡ
ＴＲＡＩＬ−Ｒ含有試料（５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３溶液をＮａＯＨでｐＨ９としたもの）の段階希釈液を、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｒｅｋの９６ウェル平底Ｅ．Ｉ．Ａ．微量滴定プレート（ＩＣＮバイオメディカル社、オーロラ、ＯＨ）に１００μＬ／ウェルで載せた。４℃１６時間のインキュベーション後、ウェルは０．０５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−トゥイーン）２００μＬで６回洗浄した。このウェルを５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む１μｇ／ｍＬのＦｌａｇ（登録商標）ＴＲＡＩＬのＰＢＳ−トゥイーン溶液とともに９０分間（各ウェル１００μＬ）インキュベートし、次いで上記のようにして洗浄した。次に、各ウェルを５％ＦＣＳを含む、１μｇ／ｍＬの抗Ｆｌａｇ（登録商標）モノクローナル抗体Ｍ２のＰＢＳ−トゥイーン溶液とともに９０分間（各ウェル１００μＬ）インキュベートし、次いで上記のようにして洗浄した。引き続き、ポリクローナル山羊抗ｍＩｇＧ１特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合性抗体（市販用ストックを５％ＦＣＳを含むＰＢＳ−トゥイーン溶液で１／５０００に希釈したもの）でウェルを９０分間（各ウェル１００μＬ）インキュベートした。ＨＲＰ結合性抗体は、サザンバイオテクノロジーアソシエーツ社、バーミンガム、アラバマから入手された。次いでウェルは、上記のようにして６回洗浄された。

ＥＬＩＳＡの顕色のために、基質混合物［各ウェル１００μＬの、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（キルケガードペリーラボラトリーズ、ゲイザースブルグ、メリーランド）の１：１前混合液］をウェルに添加した。十分な発色反応の後、この酵素反応を２Ｎの硫酸を添加（各ウェル５０μＬ）して終止させた。（ＴＲＡＩＬ結合活性を示す）発色強度は、４５０ｎｍにおける吸光度をＶＭａｘプレートリーダー（モレキュラーデバイス、サニヴェイル、ＣＡ）で測定することによって決定した。

実施例２：アミノ酸配列
（ａ）ジャーカット細胞から精製したＴＲＡＩＬ−Ｒ
ジャーカット細胞から単離したＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を、従来の方法を用いて、トリプシンで消化した。このトリプシン消化によって産生されたペプチド断片の１つに対してアミノ酸配列分析を実施した。この断片は以下の配列を含むことが判明したが、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列の３２７〜３３３位のアミノ酸、即ち、ＶＰＡＮＥＧＤに対応する。

（ｂ）ＰＳ−１細胞から精製したＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質はＰＳ−１細胞からも単離された。ＰＳ−１は、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）を致死的に照射した後に自然発生的に出現したヒトＢ細胞株である。このＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質を、慣用の方法を用いて、トリプシンで消化した。このトリプシン消化から生じた幾つかのペプチド断片に対してアミノ酸配列分析を実施した。この断片の１つは以下の配列を含むことが判明したが、これは（ａ）に示される断片と同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列の３２７〜３３３位のアミノ酸、即ち、ＶＰＡＮＥＧＤに対応する。

実施例３：ＤＮＡ及びアミノ酸の配列
ＴＲＡＩＬ−Ｒをさらにトリプシンで消化したペプチド断片のアミノ酸配列が決定された。このペプチドの２つのアミノ酸配列に基づいて、縮重したオリゴヌクレオチドが製造された。ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ断片が単離され、縮重オリゴヌクレオチドを５’及び３’プライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲは、実施例２に記載されたＰＳ−１細胞株由来のｃＤＮＡを鋳型として用いて、慣用の方法に準じて実施した。単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（プライマーの部分に対応する部分を除く）及びそれによってコードされるアミノ酸配列が図１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４）に示されている。ＰＣＲによって単離された全ＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ断片の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド９８８〜１１６４に対応し、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３３０〜３８８位のアミノ酸をコードする。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列は、ある他の受容体に見出されるいわゆるデスドメインと有意な相同性を有している。Ｆａｓの細胞質領域及びＴＮＦ受容体タイプＩはそれぞれデスドメインを含み、これがアポトーシス信号の伝達に関連している（Ｔａｒｔａｇｌｉａ等、Ｃｅｌｌ ７４:８４５，１９９３;ＩｔｏｈとＮａｇａｔａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８:１０３９２，１９９３）。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列は、ＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞質ドメインの内部に見出されると考えられている。

上記の単離断片由来のプローブがｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１０ベクター中のヒト包皮線維芽細胞由来のｃＤＮＡ）をスクリーニングするために使用され、ヒトＴＲＡＩＬ−ＲｃＤＮＡが単離された。このｃＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、それによってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。

実施例４：ＴＲＡＩＬ−Ｒに結合するモノクローナル抗体
この実施例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒに結合するモノクローナル抗体を製造する方法を明示する。このような抗体を産生するのに利用され得る適切な免疫原は、限定しないが、精製されたＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質又は細胞外ドメインのようなその免疫原性断片、又はＴＲＡＩＬ−Ｒを含む融合タンパク質（例えば、可溶性のＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質）である。

精製ＴＲＡＩＬ−Ｒは、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるような従来技術を用いて、それと免疫反応するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。簡略に言うと、完全フロイントアジュバントで乳化したＴＲＡＩＬ−Ｒの免疫原でマウスを免疫し、１０〜１００μｇの量を皮下又は腹腔内に注射する。１０〜１２日後、免疫化した動物に不完全フロイントアジュバントで乳化したＴＲＡＩＬ−Ｒをさらに追加免疫する。マウスはその後１週間から２週間の免疫化スケジュールで定期的に追加免疫される。後眼窩出血又は尾先端切除によって血清サンプルを周期的に採取してドットブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合性免疫吸着剤検定）又はＴＲＡＩＬ結合の阻害によってＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体を試験する。

適度な抗体力価を検出した後、陽性動物に対してＴＲＡＩＬ−Ｒの生理食塩溶液を最後に１回静脈注射する。３〜４日後、この動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１又は好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）に融合させる。融合によってハイブリドーマ細胞が産生され、これを非融合細胞、ミエローマハイブリッド及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地の入ったマルチマイクロタイタープレートにまく。

Ｅｎｇｖａｌｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８:８７１，１９７１及び米国特許第４，７０３，００４号に開示された技術を適用することによって、ハイブリドーマ細胞を精製ＴＲＡＩＬ−Ｒへの反応性に対するＥＬＩＳＡでスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、ベックマン等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４:４２１２，１９９０）に記載された抗体捕捉技術である。陽性のハイブリドーマ細胞を同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒモノクローナル抗体を含む腹水を産生させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は様々な技術によってフラスコまたはローラーボトルの中でインビトロで生育させ得る。マウスの腹水で産生されたモノクローナル抗体は硫安沈殿の後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製され得る。また、プロテインＡ又はプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた、ＴＲＡＩＬ−Ｒへの結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーと同様に、使用され得る。

実施例５：ノーザンブロット分析
ＴＲＡＩＬ−Ｒ ｍＲＮＡの組織分布を以下のようなノーザンブロット分析によって検討した。放射標識プローブ（実施例３のｃＤＮＡライブラリースクリーニングに使用したものと同じ放射標識プローブ）の部分標本に２つの異なるヒト多組織ノーザンブロット（クローンテク、パロアルト、ＣＡ;バイオチェイン、パロアルト、ＣＡ）を添加した。ハイブリダイゼーションは、かつて記載された（Ｍａｒｃｈ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１５:６４１〜６４７，１９８５）ように、５０％ホルムアミドにて６３℃、一晩の条件で実施した。次いでブロットを６８℃で３０分間、２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄した。ＲＮＡ負荷（ｌｏａｄｉｎｇｓ）を標準化するために、グリセロール−アルデヒド−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）が用いられた。

脾臓、胸腺、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）、前立腺、精巣、卵巣、子宮、胎盤及び胃腸管に沿った多数の組織（食道、胃、十二指腸、空腸／回腸、結腸、直腸及び小腸を含む）を含めて、検査したすべての組織に、４．４キロベース（ｋｂ）の単一の転写産物が存在していた。最高レベルのＴＲＡＩＬ−ＲｍＲＮＡを有する細胞及び組織は、ＧＡＰＤＨ特異的プローブとの対照ハイブリダイゼーションとの比較によって示されるように、ＰＢＬｓ、脾臓及び卵巣である。

実施例６：結合アッセイ
完全長のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒが発現され、ＴＲＡＩＬに結合する能力を試験された。この結合アッセイは以下のようにして実施された。

可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドのＮ末端に融合したロイシンジッパーペプチド（ＬＺ−ＴＲＡＩＬ）を含む融合タンパク質がこのアッセイに利用された。Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチドをコードするＤＮＡを、三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーをコードする配列に置換した他は、本質的にＷｉｌｅｙ等（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３:６７３〜６８２，１９９５;本明細書中に援用する）においてＦｌａｇ（登録商標）ＴＲＡＩＬ発現構築体の製造のために記載されたようにして、発現構築体を製造した。発現ベクターｐＤＣ４０９というこの構築体は、可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドのＮ末端に融合したロイシンジッパー成分が続くヒトサイトメガロウィルス由来のリーダー配列をコードした。ＴＲＡＩＬポリペプチドは、Ｗｉｌｅｙ等（同上）に記載されたように、ヒトＴＲＡＩＬの９５〜２８１位のアミノ酸（細胞外ドメインの断片）を含んでいた。ＬＺ−ＴＲＡＩＬはＣＨＯ細胞において発現され、培養上澄液から精製された。

ｐＤＣ４０９と称された発現ベクターは、ＭｃＭａｈａｎ等（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１〜２８３２，１９９１；本明細書中に援用する）に記載されたｐＤＣ４０６ベクターに由来する哺乳類の発現ベクターである。（ｐＤＣ４０６と比較して）ｐＤＣ４０９に加えられた特徴は、多クローニング部位（ｍｃｓ）における独自の制限部位の追加、ｍｃｓの下流に位置する３つの終止コドン（各読み取りフレームに１つ）、及びｍｃｓの下流にあってｍｃｓに挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にするＴ７ポリメラーゼプロモーター、を含む。

完全長のヒトＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の発現には、完全なコード領域（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＤＮＡ配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲに利用された鋳型は、実施例３に記載された、ヒト包皮線維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンであった。単離され増幅されたＤＮＡを発現ベクターｐＤＣ４０９に挿入し、ｐＤＣ４０９−ＴＲＡＩＬ−Ｒと表記される構築体を産生した。

上記及び実施例８で論じられるように、組換えＴＲＡＩＬ−Ｒを発現する宿主細胞のアポトーシスを阻害するためにＣｒｍＡタンパク質が利用された。ｐＤＣ４０９−ＣｒｍＡと称される発現ベクターは、ｐＤＣ４０９の中にポックスウィルスのＣｒｍＡをコードするＤＮＡを含んでいた。ＣｒｍＡと表記された３８キロダルトンの牛痘由来タンパク質については、Ｐｉｃｋｕｐ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７６９８〜７７０２，１９８６；本明細書中に援用する）に記載されている。

ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞は、ｐＤＣ４０９−ＴＲＡＩＬ−Ｒ及びｐＤＣ４０９−ＣｒｍＡによって同時形質転換されたか、又はｐＤＣ４０９−ＣｒｍＡ単独で形質転換された。この細胞を１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。形質転換後４８時間、細胞を非酵素的に分離し、ＬＺ−ＴＲＡＩＬ（５μｇ／ｍＬ）、ビオチニル化抗ＬＺモノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）及びフィコエリトリン結合性ストレプトアビジン（１:４００）とともにインキュベートした後、蛍光標示式細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）によって分析した。血球計算分析はＦＡＣスキャン（ベクトンディキンソン、サンホセ、ＣＡ）によって実施した。

ＴＲＡＩＬ−Ｒ及びＣｒｍＡをコードするベクターで同時形質転換されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞では、ＣｒｍＡをコードするベクター単独で形質転換された細胞に比べると、ＬＺ−ＴＲＡＩＬの結合が有意に増強されたことを示した。

実施例７：ＴＲＡＩＬ−Ｒは標的細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを阻止する。
ジャーカット細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを阻止する能力に対してＴＲＡＩＬ−Ｒを試験した。このアッセイに利用したＴＲＡＩＬ−ＲはｓＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃと称される融合タンパク質の形態であり、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合したヒトＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞外ドメインを含むものであった。

実施例６に記載したｐＤＣ４０９ベクターの中にｓＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃタンパク質をコードしている融合遺伝子を含む組換え発現ベクターでＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞を形質転換し、融合タンパク質の発現が可能になるよう培養した。ｓＴＲＡＩＬ−Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を培養上澄液から回収した。異種タンパク質をコードしているＤＮＡにＩｇＧ１ＦｃポリペプチドをコードしているＤＮＡを融合する方法はＳｍｉｔｈ等（Ｃｅｌｌ ７３:１３４９〜１３６０，１９９３）に記載されているが、本明細書中でも同様の方法を利用した。

対照として利用したＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃと称される融合タンパク質は、ｐ７５又はｐ８０ＴＮＦ−Ｒ（Ｓｍｉｔｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９〜１０２３，１９９０；Ｓｍｉｔｈ等、Ｃｅｌｌ ７６：９５９〜９６２，１９９４）として知られるＴＮＦ受容体タンパク質の細胞外ドメインを含み、Ｆｃポリペプチドに融合していた。ヒトＴＲＡＩＬに対して指向された阻止抗体であるマウスのモノクローナル抗体もこのアッセイに利用された。

ジャーカット細胞が、様々な又は一定の濃度のＬＺ−ＴＲＡＩＬ（ＬＺ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質については実施例６に記載）とともに、様々な濃度のｓＴＲＡＩＬ−Ｒ−Ｆｃ、ＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ又はＴＲＡＩＬ特異的モノクローナル抗体の非存在下又は存在下でインキュベートされた。かつて記載された（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５:５５〜６３，１９８３）ＭＴＴ細胞活性アッセイ（ＭＴＴとは、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドのこと）を用いて、細胞死を定量化した。この結果が図２に示されているが、これは無処置（△）又は可変濃度（▲）又は一定濃度（○、●、□、■）のＬＺ−ＴＲＡＩＬ（１３ｎｇ／ｍＬ）とともに、可変濃度のＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ（■）、ＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ（□）又は抗ＴＲＡＩＬ抗体（○）の存在下又は非存在下（●）で処置されたジャーカット細胞の細胞死比率を表している。すべての材料に対する可変濃度は１０μｇ／ｍＬから始めて連続的に希釈した。

抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体及びｓＴＲＡＩＬ−Ｒ／ＦｃがそれぞれＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを用量依存的に阻止したのに対し、ＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃは阻止しなかった。従って、ＴＲＡＩＬ−Ｒの細胞外ドメインは、ＴＲＡＩＬに結合し、標的細胞のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスを阻害することが可能である。

実施例８：ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスはカスパーゼ阻害剤及びＦＡＤＤ−ＤＮによって阻止される。
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法によって、ＴＲＡＩＬ−Ｒの発現プラスミド（ｐＤＣ４０９−ＴＲＡＩＬ−Ｒ）を用いて、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（培地中１０μＭ）の存在下又は非存在下で３倍過剰の空の発現ベクター（ｐＤＣ４０９）とともに、又は３倍過剰の発現ベクターｐＤＣ４０９−ＣｒｍＡ、ｐＤＣ４０９−ｐ３５又はｐＤＣ４０９−ＦＡＤＤ−ＤＮとともに、形質転換した。さらに、大腸菌ｌａｃｚ遺伝子の発現ベクター（４００ｎｇ／スライド）をすべてのＤＮＡ混合物とともに同時形質転換した。形質転換された細胞は、スライド台に固定した箱の中で培養された。

哺乳類の発現ベクターであるｐＤＣ４０９及び完全長のヒトＴＲＡＩＬ−ＲをコードしているｐＤＣ４０９−ＴＲＡＩＬ−Ｒベクターについては実施例６に記載されている。トリペプチド誘導体であるｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）は、エンザイムシステムプロダクツ、ダブリン、カリフォルニアから供される。

ＣｒｍＡと表記された３８キロダルトンの牛痘由来のタンパク質がＰｉｃｋｕｐ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７６９８〜７７０２，１９８６；本明細書中に援用する）に記載されている。ＣｒｍＡの配列情報は、Ｐｉｃｋｕｐ等、同上の図４に示されている。

バキュロウィルスである核多面体病ウィルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａによってコードされる３５キロダルトンのタンパク質がＦｒｉｅｓｅｎとＭｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２２６４〜２２７２，１９８７；本明細書中に援用する）に記載されている。ここでバキュロウィルスｐ３５と表記されるこのタンパク質の配列情報は、ＦｒｉｅｓｅｎとＭｉｌｌｅｒ、同上の図５に示されている。

ＦＡＤＤ（ＭＯＲＴ１とも称される）は、Ｂｏｌｄｉｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５〜７７９８，１９９５；本明細書中に援用する）に記載されている。ＦＡＤＤ−ＤＮ（ＦＡＤＤ優性ネガティブ）と呼ばれるこのタンパク質は、デスドメインを含むＦＡＤＤのＣ末端断片である。Ｎ末端Ｆｌａｇ（登録商標）エピトープ標識（上記に記載）に融合したＦＡＤＤ−ＤＮをコードするＤＮＡを、実施例６に記載されたｐＤＣ４０９発現ベクターに挿入し、ｐＤＣ４０９−ＦＡＤＤ−ＤＮを形成させた。このＦＡＤＤ−ＤＮポリペプチドは、Ｂｏｌｄｉｎ等、同上に示されたＭＯＲＴ１アミノ酸配列の１１７〜２４５位のアミノ酸に相当する。

形質転換から４８時間、細胞をＰＢＳで洗浄し、グルタルアルデヒドで固定した後、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）とともにインキュベートした。β−ガラクトシダーゼを発現している細胞は青く染まる。染色された細胞の比率が減少することはβ−ガラクトシダーゼ発現の欠失を示し、ｌａｃｚ遺伝子で同時形質転換された、このタンパク質を発現する細胞の死と関連する。

この結果が図３に示されているが、ここでプロットされた数値は少なくとも３回の個別実験の平均値及び標準偏差を表している。ポックスウィルスＣｒｍＡ、バキュロウィルスｐ３５、ＦＡＤＤ−ＤＮ及びｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、ＴＲＡＩＬ−Ｒを発現している形質転換細胞の死をいずれも効果的に減少させた。

本発明は、以下の態様１−３９をも提供する。
態様１．アミノ酸配列ＶＰＡＮＥＧＤを含むことを特徴とする、ＴＲＡＩＬに結合し得る精製されたＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）ポリペプチド。
態様２．前記ポリペプチドが約５０〜５５キロダルトンの分子量であることをさらに特徴とする、態様１に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様３．前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＥＴＬＲＱＣＦＤＤＦＡＤＬＶＰＦＤＳＷＥＰＬＭＲＫＬＧＬＭＤＮＥＩＫＶＡＫＡＥＡＡＧＨＲＤＴＬＸＴＭＬを含むことをさらに特徴とする、態様１に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様４．前記ポリペプチドが約５０〜５５キロダルトンの分子量であることをさらに特徴とする、態様３に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様５．ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド、及びｂ）ＴＲＡＩＬに結合し得る、（ａ）のポリペプチドの断片、を含むグループから選択される精製されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様６．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｘ〜４４０位のアミノ酸を含み、ｘは５１〜５９までの整数である、態様５に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様７．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５４〜４４０位のアミノ酸を含む、態様６に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様８．前記断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の細胞外ドメインを含む、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒである、態様５に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様９．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む精製されたＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様１０．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様９に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様１１．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１０に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様１２．前記ポリペプチドが天然に得られたものである、態様９に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド。
態様１３．態様５に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを２ないし４つ含むオリゴマー。
態様１４．態様８に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドを２ないし４つ含むオリゴマー。
態様１５．態様５に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド、並びに及び生理学的に許容される希釈剤、賦形剤又はキャリアーを含む組成物。
態様１６．態様８に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド、並びに生理学的に許容される希釈剤、賦形剤又はキャリアーを含む組成物。
態様１７．図１に示されるヌクレオチド配列を含む、単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様１８．ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド、及びｂ）ＴＲＡＩＬに結合し得る、（ａ）のポリペプチドの断片、を含むグループから選択されるポリペプチドをコードする単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様１９．前記ＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１〜４４０位のアミノ酸をコードする、態様１８に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２０．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｘ〜４４０位のアミノ酸を含み、ｘは５１〜５９までの整数である、態様１８に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２１．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５４〜４４０位のアミノ酸を含む、態様２０に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２２．前記断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒである、態様１８に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２３．前記ＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２４．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様２３に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２５．前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、態様２４に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２６．前記ポリペプチドが天然に得られたものである、態様２３に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様２７．態様１８によるＤＮＡを含む発現ベクター。
態様２８．態様１９によるＤＮＡを含む発現ベクター。
態様２９．態様２０によるＤＮＡを含む発現ベクター。
態様３０．態様２２によるＤＮＡを含む発現ベクター。
態様３１．態様２３によるＤＮＡを含む発現ベクター。
態様３２．態様２７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
態様３３．態様２８に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
態様３４．態様２９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
態様３５．態様３０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
態様３６．態様３１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
態様３７．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列の少なくとも６０のヌクレオチド又はそのＤＮＡ又はＲＮＡ相補体を含む単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ ＤＮＡ。
態様３８．態様５に記載のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド又はその抗原結合断片に対して指向された抗体。
態様３９．前記抗体がモノクローナル抗体である。態様３８に記載の抗体。

Claims (9)

1. ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに対して指向された抗体又はその抗原結合断片であって、該ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、
   ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチド；
   ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｘ〜４４０位のアミノ酸、ここでｘは５１〜５９までの整数である、を含むポリペプチド；及び
   ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５４〜４４０位のアミノ酸を含むポリペプチド；
   からなるグループから選択される、前記抗体又はその抗原結合断片。
2. ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに対して指向された抗体又はその抗原結合断片であって、該ＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｘ〜２１０位のアミノ酸、ここでｘは５１〜５９までの整数である、を含む可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒである、前記抗体又はその抗原結合断片。
3. ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の５２〜２１０位のアミノ酸を含む、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドに対して指向された抗体又はその抗原結合断片であって、該ＴＲＡＩＬ−ＲポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。
5. ＴＲＡＩＬ−Ｒポリペプチドが天然に生じたものである、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、および生理学的に許容される希釈剤、賦形剤又はキャリアーを含む組成物。
8. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片についた検出可能な剤又は治療薬を含む結合体。
9. 請求項６に記載の単離されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。

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