ES2251738T3 - Inhibidor de la invertasa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN ACIDO NUCLEICO QUE CONTIENE AL MENOS UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO, CARACTERIZADO PORQUE EL POLIPEPTIDO ESTA EN CONDICIONES DE REDUCIR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE UNA INVERTASA, EL MISMO POLIPEPTIDO, ASI COMO PLANTAS TRANSGENICAS QUE CONTIENE ESTA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA OBTENER TALES PLANTAS TRANSGENICAS CON UNA MENOR PERDIDA DE SACAROSA EN RELACION CON SU ALMACENAMIENTO.
Description
Inhibidor de la invertasa.
La presente invención se refiere a un ácido
nucleico, que contiene al menos una secuencia de ácidos nucleicos
que codifica para un polipéptido, siendo el polipéptido capaz de
reducir la actividad enzimática de una invertasa, al propio
polipéptido, así como a las plantas transgénicas que contienen esta
secuencia de ácidos nucleicos. Además, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la producción de tales plantas
transgénicas con una pérdida reducida de sacarosa debida al
almacenamiento.
Durante el almacenamiento de la remolacha
azucarera (Beta vulgaris), en el intervalo de tiempo entre
la recolección y el procesamiento, se llega debido a la respiración
o metabolismo de la sacarosa a una pérdida de sacarosa de
aproximadamente el 0,02% al día. Esta pérdida va acompañada además
de una reducción significativa de la calidad debido al incremento
del azúcar reductor, especialmente fructosa y glucosa (Burba, M.
(1976) Atmung und Saccharosestoffwechsel lagernder Zuckerrüben.
Zeitschrift für die Zuckerindustrie 26: 647-658).
La primera etapa metabólica en la descomposición de la sacarosa
durante el almacenamiento de la remolacha es la hidrólisis
enzimática por medio de una invertasa vacuolar. Esta enzima se
sintetiza de novo en el tejido de la remolacha tras su
herida (Milling, R. J., Leigh, R. A., Hall, J. L. (1993) Synthesis
of a vacuolar acid invertase in washed discs of storage root tissue
of red beet (Beta vulgaris L.). J. Exp. Bot. 44:
1687-1694). Ya que la masa principal de la sacarosa
de remolacha se localiza en las vacuolas celulares, la invertasa
vacuolar inducida (por herida) desempeña un papel central para la
pérdida de sacarosa debida al almacenamiento.
Por el momento no hay ninguna solución
satisfactoria para el problema de las pérdidas de sacarosa debidas
al almacenamiento (Burba, 1976). Las medidas más importantes en el
estado de la técnica consisten en el mantenimiento a temperaturas
bajas (por debajo de 12ºC) y de una humedad atmosférica definida
(entre el 90 y el 96%). Sin embargo, todas las medidas establecidas
hasta el momento para la reducción de las pérdidas debidas al
almacenamiento son insatisfactorias.
Una conversión de la sacarosa en las hexosas,
glucosa y fructosa, debida al almacenamiento y, por ello, una
pérdida de sacarosa tiene lugar también durante la llamada
"edulcoración en frío" (cold sweetening) en patatas. Como
consecuencia del tratamiento de frío, se induce en los tubérculos de
la patata una invertasa vacuolar, que determina la razón entre
sacarosa y hexosas (Zrenner, R., Schüler, K., Sonnewald, U. (1996)
Soluble acid invertase determines the
hexose-to-sucrose ratio in
coldstored potato tubers. Planta 198: 246-252). La
formación de las hexosas como consecuencia de la edulcoración en
frío conduce a una pérdida de la calidad en la producción de, por
ejemplo, patatas fritas.
Los frutos de tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.) presentan un alto contenido en agua. Este está
condicionado parcialmente por los azúcares endógenos osmóticamente
activos (sacarosa y hexosas). Un decremento del contenido total de
azúcar por medio de la inhibición de la hidrólisis de la sacarosa
mediada por la invertasa conduce a frutos más pequeños y pobres en
agua (Klann, E. M., Hall, B., Bennett, A. B., (1996) Antisense acid
invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in
transgenic tomato fruit. Plant Physiology 112:
1321-1330). Una disminución del contenido en agua de
los frutos de tomate conduce a un ahorro en los costes energéticos
en la producción de concentrados de frutos (por ejemplo, ketchup).
Dado que la reducción de la actividad de la invertasa vacuolar
sobre la expresión antisentido de la invertasa se lleva a cabo sólo
de manera incompleta con motivo de la presencia de distintas
isoformas, la introducción transgénica de un inhibidor de la
invertasa podría aportar grandes ventajas, especialmente si éste
inhibe las distintas isoformas en la misma medida.
De esta manera, la presente invención se basa en
el objetivo de proporcionar un nuevo sistema que esencialmente no
produzca pérdidas de sacarosa en plantas debidas al
almacenamiento.
Este objetivo se alcanza por medio de los objetos
de la presente invención caracterizados en las reivindicaciones.
Un primer objeto según la invención se refiere a
un ácido nucleico, que contiene al menos una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica para un polipéptido, siendo el polipéptido
capaz de reducir o disminuir la actividad enzimática de una
invertasa.
Los conceptos "ácido nucleico" y
"secuencia de ácidos nucleicos" significan moléculas de ácido
nucleico naturales o semisintéticas o sintéticas o modificadas de
desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos y/o nucleótidos
modificados.
El concepto "polipéptido" comprende
polipéptidos presentes de forma natural y polipéptidos
recombinantes. Polipéptidos recombinantes designan un constructo
producido con técnicas biológicas moleculares, que se basa en el
ADN natural del genoma original o en el ADN natural modificado con
una secuencia de ADN extraño, y que puede recombinarse, por
ejemplo, con plásmidos, y que puede replicarse y expresarse en un
sistema huésped apropia-
do.
do.
La expresión "un polipéptido capaz de reducir
la actividad enzimática de una invertasa" significa un
polipéptido que, como consecuencia del enlace con una invertasa,
reduce su actividad enzimática, de modo que es posible una
inhibición completa con una cantidad suficiente de la proteína
inhibidora. Preferiblemente, se debe alcanzar una inhibición de la
invertasa vacuolar de aproximadamente el 90% mediante la expresión
del inhibidor en la planta
transgénica.
transgénica.
En una forma de realización de la presente
invención se localiza la invertasa en la vacuola en una célula
vegetal. En otra forma de realización, se localiza la invertasa en
la membrana celular. En otra forma de realización, se localiza la
invertasa en el citosol. La invertasa procede preferiblemente de la
remolacha azucarera, de la patata o del
tomate.
tomate.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el ácido nucleico comprende las secuencias de
ácidos nucleicos mostradas en las figuras 1 (SEQ ID Nº 1), 3 (SEQ ID
Nº 2), 12 (SEQ ID Nº 3) y 14 (SEQ ID Nº 4) o segmentos o fragmentos
de las mismas, así como secuencias de ácidos nucleicos que pueden
hibridar con las secuencias complementarias de las secuencias de
ácidos nucleicos mostradas en las figuras 1, 3, 12 y 14 o con
segmentos o fragmentos de las mismas.
En otra forma de realización, el ácido nucleico
según la invención contiene otra secuencia de ácidos nucleicos que
codifica para una secuencia diana. El concepto "secuencia
diana" significa una secuencia de aminoácidos que proporciona el
control objetivo en un compartimento celular definido, por ejemplo,
el control objetivo en la
vacuola.
vacuola.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la secuencia diana comprende la secuencia diana
vacuolar de la lectina de cebada con la secuencia de aminoácidos
siguiente:
LEGVFAEIAASNSTLVAE
En otra forma de realización, el ácido nucleico
según la invención contiene otra secuencia de ácidos nucleicos que
codifica para un péptido señal. El concepto "péptido señal"
significa una secuencia de aminoácidos hidrófoba, reconocida por la
partícula de reconocimiento de señal (SRP). La SRP proporciona la
síntesis del polipéptido completo en el retículo endoplasmático
(RE) rugoso, con la consecuencia de que el polipéptido que se genera
se libera en el lumen del RE.
En otra forma de realización, el ácido nucleico
según la invención contiene una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica para una secuencia de retención del RE.
En una forma de realización preferida, el péptido
señal procede de una invertasa, preferiblemente de la invertasa de
la membrana celular del tabaco.
En otra forma de realización de la presente
invención, el ácido nucleico contiene otra secuencia de ácidos
nucleicos que comprende un promotor apropiado para la expresión en
plantas. Este promotor o secuencia del promotor procede
preferiblemente de la misma planta que la invertasa. En una forma de
realización especialmente preferida de la presente invención, el
promotor es un promotor específico de la patata o de la remolacha
azucarera.
Resumiendo, el ácido nucleico según la invención
puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para
el polipéptido, definida anteriormente y, dado el caso, la secuencia
de ácidos nucleicos que codifica para una secuencia diana definida
anteriormente y/o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para
un péptido señal y/o el promotor definido anteriormente, estando
dispuestas preferiblemente todas las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican para una secuencia de aminoácidos en el marco de
lectura y pudiendo ser degeneradas según el código genético.
Otro objeto de la presente invención es un vector
que contiene el ácido nucleico según la invención, definido
anteriormente, para la expresión del polipéptido recombinante en
células huésped procarióticas o eucarióticas. El vector según la
invención puede contener preferiblemente elementos reguladores
apropiados, tales como promotores, potenciadores, secuencias de
terminación. El vector según la invención puede ser, por ejemplo, un
vector de expresión o un vector para la integración preferiblemente
estable del ácido nucleico según la invención en el material
genético de una célula huésped. Un sistema de expresión apropiado
comprende, por ejemplo, el plásmido Ti o un sistema plasmídico
binario en Agrobacterium tumefaciens como vector para la
integración estable del ácido nucleico según la invención en el
material genético de una planta. Además también, puede introducirse
el ácido nucleico según la invención por ejemplo mediante el
plásmido Ri de Agrobacterium rizogenes, mediante
transferencia genética directa por medio de polietilenglicol,
mediante electroporación o mediante bombardeo de partículas en el
material genético de una planta.
Otro objeto de la presente invención es una
célula huésped que contiene el ácido nucleico según la invención o
el vector según la invención. Son células huésped apropiadas, por
ejemplo, procariontes, como E. coli, o células huésped
eucarióticas como Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris y células de insectos infectadas con
Bacculovirus.
Otro objeto según la presente invención es el
propio polipéptido, que se codifica por la secuencia de ácidos
nucleicos definida anteriormente, pudiendo ser la secuencia de
ácidos nucleicos degenerada según el código genético. El
polipéptido según la invención contiene al menos un segmento de una
secuencia de aminoácidos capaz de reducir la actividad enzimática
de una invertasa. En una forma de realización especialmente
preferida, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos
mostradas en las figuras 1 (SEQ ID Nº 5), 3 (SEQ ID Nº 6), 12 (SEQ
ID Nº 7) y 14 (SEQ ID Nº 8) o segmentos o fragmentos de las mismas.
Además, el concepto "polipéptido" comprende, por ejemplo,
isoformas de la misma planta así como secuencias del inhibidor
homólogas de otros tipos de plantas, siendo la homología en el
plano de las proteínas preferiblemente > 70%.
En una forma de realización según la invención,
el polipéptido contiene además una secuencia de aminoácidos
dispuesta en el extremo C-terminal del polipéptido,
que comprende una secuencia diana definida anteriormente y/o una
secuencia de retención del RE, por ejemplo "KDEL", y/o una
secuencia de aminoácidos dispuesta en el extremo
N-terminal del polipéptido, que comprende un péptido
señal definido anteriormente.
La secuencia de ácidos nucleicos según la
invención, el vector según la invención, así como el polipéptido
según la invención pueden producirse mediante los procedimientos
conocidos en el estado de la técnica.
Otro objeto de la presente invención es una
planta transgénica que contiene al menos el ácido nucleico según la
invención definido anteriormente.
El concepto "planta transgénica" o
"planta" comprende la planta completa como tal, así como sus
partes, como la raíz, el tallo, la hoja, el tejido de un órgano
específico o las células, su material apto para la multiplicación,
especialmente las semillas, y sus plántulas. Además, este concepto
comprende tubérculos y raíces de almidón, por ejemplo, patatas,
batatas y mandioca, y plantas de azúcar, por ejemplo caña de azúcar
y remolacha azucarera, así como el tomate y el maíz.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el tipo natural de la planta transgénica es una
remolacha azucarera, un tomate o una patata.
Otro objeto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para la producción de la planta transgénica según
la invención, en el que se transforma una célula vegetal mediante la
integración estable del ácido nucleico definido anteriormente en el
material genético y se regenera la célula vegetal transformada en la
planta transgénica. Se conocen en el estado de la técnica
procedimientos para la producción de plantas transgénicas.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al uso del ácido nucleico definido anteriormente para la producción
de una planta transgénica con una pérdida reducida de sacarosa
debida al almacenamiento.
Según la invención, puede constatarse que la
disminución de las pérdidas de sacarosa debidas al almacenamiento
mediante la expresión del polipéptido definido anteriormente como
"proteína inhibidora de la invertasa" en plantas transgénicas
representa sorprendentemente un procedimiento altamente específico y
menos contaminante para la mejora de la calidad de los tubérculos,
por ejemplo, de la remolacha azucarera o la patata. Para la
remolacha azucarera se posibilita una disminución del uso de medios
de producción gracias al aumento de la eficacia de la obtención de
azúcar con el nivel de rendimiento prefijado. En el caso de la
patata, se aumenta la calidad del producto de las patatas,
especialmente para la producción de patatas fritas, mediante la
reducción de la formación de hexosa inducida por frío. En el caso
del tomate, se disminuye el contenido en agua del fruto de tomate
mediante la reducción de hexosa osmóticamente activa.
Mediante la combinación de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica para el inhibidor de la invertasa con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una secuencia diana
apropiada, puede lograrse por ejemplo un control objetivo vacuolar
correcto del inhibidor de la invertasa expresado y, de esa manera,
limitarse espacialmente la expresión del inhibidor de la invertasa.
Además, puede limitarse temporalmente la expresión del inhibidor de
la invertasa mediante el uso de, por ejemplo, promotores específicos
para la remolacha o para los tubérculos.
Las figuras muestran:
La figura 1 muestra el ADNc que codifica para el
inhibidor de la invertasa de Nicotania tabacum con una
longitud de 1701 pb, de modo que el marco de lectura abierto
("open reading frame", "ORF") comprende 477 pb con el
nucleótido de inicio 1. El inhibidor de la invertasa codificado por
esta secuencia de ácidos nucleicos presenta 159 aminoácidos con un
peso molecular M calculado de 18.915 y un punto isoeléctrico
calculado de 10,13.
La figura 2 muestra la producción esquemática del
constructo del inhibidor de una forma de realización preferida
según la invención para la transformación de plantas.
La figura 3 muestra otro ADNc que codifica para
un inhibidor de la invertasa localizado en la membrana celular de
células de tabaco con una longitud de 631 pb (sin
poli-A). La secuencia señal utilizada para la
secreción en la membrana celular está marcada con grasa. El sitio
de corte, que es idéntico al extremo N-terminal
secuenciado de la proteína madura, está marcado con una flecha.
La figura 4 muestra la expresión del inhibidor
recombinante de la invertasa del tabaco en E. coli. El ADNc
representado en la figura 3 se clonó en el vector pQE (Qiagen,
Hilden, Alemania). La proteína recombinante se expresó como
proteína de fusión etiquetada con his. A: M, marcador del peso
molecular; 1: Bacterias no inducidas; 2: Bacterias inducidas con
IPTG; 3: Inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco
purificado por cromatografía de afinidad (Ni-NTA).
B: Análisis de Western Blot de las fracciones 1-3 de
A con un antisuero policlonal dirigido contra el inhibidor.
La figura 5 muestra la inhibición dependiente de
la dosis de la invertasa de la membrana celular del tabaco mediante
la proteína inhibidora recombinante. Los puntos muestran la
inhibición tras la incubación previa de ambas proteínas sin
sacarosa, los cuadrados muestran la inhibición sin incubación
previa.
La figura 6 muestra la inducción de la actividad
de la invertasa ácida en remolachas azucareras tras su herida.
La figura 7 muestra la inhición de la actividad
total de la invertasa de remolachas azucareras heridas mediante el
inhibidor de la invertasa obtenido a partir de cultivos celular de
tabaco.
La figura 8 muestra la inhibición de la invertasa
de la membrana celular de la remolacha azucarera mediante el
inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco (veánse las
figuras 3-5). Los puntos muestran la inhibición
tras la incubación previa de ambas proteínas sin sacarosa, los
cuadrados muestran la inhibición sin incubación
previa.
previa.
La figura 9 muestra la inhibición de la actividad
total de la invertasa de remolachas azucareras heridas (invertasa
vacuolar + invertasa de la membrana celular) mediante el inhibidor
recombinante de la invertasa del tabaco (veánse las figuras
3-5). Los puntos muestran la inhibición tras la
incubación previa de ambas proteínas sin sacarosa, los cuadrados
muestran la inhibición sin incubación previa.
La figura 10 muestra la identificación
inmunológica de la invertasa vacuolar (IV) de los frutos de tomate,
así como la detección de un inhibidor del tomate (INH) homólogo al
inhibidor de la invertasa del tabaco. Ambas proteínas fueron
detectadas con antisueros policlonales monoespecíficos. La IV
muestras dos productos de descomposición de 52 y 20 KD según
SDS-PAGE y Western Blot. La IV se une completamente
a la concavalina A Sepharose, mientras que el inhibidor de la
invertasa del tomate está presente en proporciones aproximadamente
iguales en la fracción que se une a ConA y en la que no se une a
ConA.
La figura 11 muestra la inhibición de los tomates
IV mediante el inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco
(veánse las figuras 3-5). Los puntos muestran la
inhibición tras la incubación previa de ambas proteínas sin
sacarosa, los cuadrados muestran la inhibición sin incubación
previa.
La figura 12 muestra la secuencia de un ADNc
parcial para el inhibidor de la invertasa del tomate, que se
amplificó con RT-PCR a partir de ADNc de flores de
tomate.
La figura 13 muestra la comparación de dos clones
parciales (idénticos) del inhibidor de la invertasa del tomate con
el inhibidor de la invertasa del tabaco (veáse la figura 3).
La figura 14 muestra la secuencia de ADNc de un
homólogo citosólico para el clon del inhibidor de la invertasa de
la figura 3. La proteína codificada mediante ese clon es capaz de
inhibir invertasas citosólicas.
Mediante el siguiente ejemplo se explica la
presente invención con mayor detalle.
Todos los métodos para la producción de los
constructos genéticos necesarios, que son de aplicación en el
siguiente ejemplo, corresponden a procedimientos estándar del
trabajo en biología molecular (Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.
E. Moore, D. D., Seidmann, J. G. Smith, J. A., y Struhl, K.
(1987-1996) Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Publishing). La operación de trabajo se
subdivide esencialmente en las siguientes secciones:
- (1)
- La proteína inhibidora se purifica hasta la homogeneidad con elusión salina selectiva de la proteína de la membrana celular, doble cromatografía de intercambio iónico y posterior electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
- (2)
- La proteína inhibidora homogénea se digiere trípticamente y los péptidos de la proteína inhibidora obtenidos se secuencian mediante degradación de Edman.
- (3)
- Partiendo de las secuencias de péptidos obtenidas se sintetizan cebadores degenerados y con su ayuda se amplifican fragmentos de ADN del ADNc del inhibidor con PCR a partir del ADNc completo.
- (4)
- A partir de cultivos celulares de tabaco se produce un biblioteca de ADNc (en un vector de expresión; ZAP Express®, Empresa Stratagene).
- (5)
- Las secuencias parciales del ADNc del inhibidor obtenidas (veáse (2)) se usan para la selección del banco de ADNc.
- (6)
- El clon de longitud completa obtenido se confirma tras la expresión en E. coli (clonación en el vector pQE de la empresa Qiagen) en cuanto a su función (inhibición de la invertasa).
- (7)
- El segmento del clon de ADNc (figura 1) que codifica para la proteína inhibidora se amplifica con PCR. Para esto, se usan cebadores con sitios de corte de restricción, que permiten la posterior ligación con las secuencias señal y diana. En el extremo 5' se liga con la secuencia señal, en el extremo 3' con la secuencia diana para la vacuola.
- Obtención de la secuencia señal: La secuencia señal se amplifica por medio del PCR a partir del ADNc de la invertasa de la membrana celular del tabaco (Greiner, S., Weil, M., Krausgrill, S., Rausch, T. (1995) Plant Phisiology 108: 825-826) (Región: Met^{1}-Val^{23}). Para esto se usan cebadores con sitios de corte de restricción, que permiten la posterior ligación con el ADNc del inhibidor. Obtención de la secuencia diana: La secuencia diana se amplifica a partir del ADNc para la lectina de cebada (Bednarek, S. Y., Taikhel, N. V. (1991) Plant Cell 3: 1195-1206). Para esto se usan también cebadores con sitios de corte de restricción, que permiten la posterior ligación con el ADNc del inhibidor.
- Para la clonación sentido del ácido nucleico de la figura 3 (SEQ ID Nº 2) se corta el ácido nucleico completo con ayuda de endonucleasa de restricción BamH I y Xba I del vector pBK-CMV (éste se genera tras la excisión in vivo a partir del ZAP Express Paguen (empresa Stratagene)). El fragmento de ADN obtenido se liga ahora con un vector de transformación binario cortado BamH I/Xba I y posteriormente se transforma en bacterias.
- Para la
clonación antisentido del ácido nucleico de la figura 3 (SEQ ID Nº
2) se emplean las endonucleasas de restricción BamH I y Kpn I. Por
lo demás, la manera de proceder es la misma
\hbox{que en la clonación sentido.}
- La clonación sentido y antisentido del ácido nucleico de la figura 14 (SEQ ID Nº 4) se lleva a cabo de forma análoga.
- Los constructos así obtenidos se usan para la transferencia genética de Agrobacterium tumefaciens en plantas (por ejemplo, remolacha azucarera, patata y tomate).
- La introducción de la secuencia diana vacuolar para el ácido nucleico de las figuras 3 y 4 se lleva a cabo tal como se describe para el ácido nucleico de la figura 1.
- (8)
- El constructo genético mencionado en (7) se liga en el lado 5' con un promotor específico de la remolacha y el constructo obtenido se clona en un vector de expresión binario.
- (9)
- La planta objetivo se transforma mediante una técnica de transformación apropiada, conocida en el estado de la técnica. La estructura del constructo genético necesario para la transformación se representa en la figura 2.
Se produjo un antisuero para la selección de un
banco de ADNc contra el inhibidor de la invertasa que se expresa en
las células de tabaco. Además de esto, se realizaron reacciones de
PCR para la obtención de una sonda de ADNc homóloga con
oligonucleótidos derivados a partir de secuencias de aminoácidos
parciales. Además, se realizó una detección de oligómeros Con la
detección de oligómeros se aisló el clon de la figura 1. Con
RT-PCR se amplificó un fragmento de 300 pb, que se
usó luego como sonda para la selección del banco de ADNc. De esta
manera se aisló el clon de la figura 3. Por último se expresó en
E. coli como proteína de fusión etiquetada con His (figura
4). La proteína recombinante inhibidora inhibe la invertasa de la
membrana celular del tabaco, observándose una protección del
substrato parcial para esta isoforma de la invertasa (figura 5), que
sin embargo no aparece en otras invertasas localizadas en la
vacuola o en la membrana celular (veáse a continuación). Además, se
aisló un homólogo localizado citosólicamente del clon del inhibidor
representado en la figura 3 (figura 14). La proteína codificada
mediante ese clon puede actuar como inhibidor de invertasas
citosólicas.
La actividad de la invertasa en remolachas
azucareras heridas (figura 6) puede inhibirse mediante la proteína
inhibidora aislada a partir de células de tabaco (figura 7). Las
cinéticas enzimáticas con proteína recombinante del inhibidor del
tabaco confirman que tanto la actividad total de la invertasa
(figura 9) en remolachas azucareras heridas, como la invertasa de
la membrana celular de la remolacha (figura 8) parcialmente
purificada pueden inhibirse mediante el inhibidor de la invertasa
del tabaco.
En los frutos de tomate se expresa, en primer
lugar, la invertasa vacuolar, que en la separación por
SDS-PAGE se descompone en dos productos de
descomposición (52 y 20 KD; figura 10). Junto a la invertasa
vacuolar se expresa también un inhibidor de la invertasa localizado
supuestamente en la membrana celular de aproximadamente 19 KD, que
interacciona con el antisuero contra el inhibidor de la invertasa
del tabaco (figura 10). La invertasa vacuolar aislada a partir de
frutos de tomate se inhibe también mediante el inhibidor
recombinante de la invertasa del tabaco (figura 11). La llamativa
homología secuencial de una secuencia parcial de ADNc de tomate
obtenida por RT-PCR con la secuencia del inhibidor
de la invertasa del tabaco (figuras 12 y 13) apoya la suposición de
que el inhibidor de la invertasa del tomate que se expresa en los
frutos podría estar compartimentado (en el espacio de la membrana
celular) frente a la invertasa vacuolar y, por ello, no inhibe la
invertasa vacuolar in vivo.
Resumiendo, puede establecerse que el inhibidor
apoplástico de la invertasa del tabaco (figura 3) puede inhibir
completamente, tal como se ha demostrado, tanto las invertasas de la
membrana celular como las invertasas vacuolares, especialmente de
la remolacha azucarera y del tomate. Partiendo de una selección
celular diana correcta, el inhibidor de la invertasa del tabaco
puede, de esta manera, usarse para la disminución de las invertasas
localizadas en la vacuola o en la membrana celular en plantas
transgénicas (remolacha azucarera, patata, tomate). El inhibidor de
la invertasa localizado en el citosol (figura 14) regula las
invertasas citosólicas. Su inhibición en plantas trangénicas puede
repercutir ventajosamente en la razón sacarosa/hexosa.
Claims (17)
1. Uso de un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido capaz de reducir la actividad enzimática de una
invertasa, para la producción de una planta transgénica con pérdida
de sacarosa reducida debida al almacenamiento.
2. Uso de un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido capaz de reducir la actividad enzimática de una
invertasa, para la reducción de la formación de hexosa inducida por
el frío en patatas.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
el ácido nucleico contiene al menos las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican para un polipéptido mostradas en las figuras
1 (SEQ ID Nº 1), 3 (SEQ ID Nº 2), 12 (SEQ ID Nº 3) o 14 (SEQ ID Nº
4) o segmentos de las mismas o que contiene una secuencia de ácidos
nucleicos que puede hibridar con las secuencias complementarias de
las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en las figuras 1 (SEQ
ID Nº 1), 3 (SEQ ID Nº 2), 12 (SEQ ID Nº 3) o 14 (SEQ ID Nº 4) o
segmentos de las mismas, siendo capaz el polipéptido de reducir la
actividad enzimática de una invertasa.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que la
invertasa está localizada en la vacuola, el citosol o la membrana
celular de una célula vegetal.
5. Uso según la reivindicación 3 ó 4, en el que
la invertasa procede de la remolacha azucarera, de la patata o del
tomate.
6. Uso según una de las reivindicaciones 3 a 5,
en el que el ácido nucleico contiene además al menos una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica para una secuencia diana.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que la
secuencia diana comprende la secuencia diana vacuolar de la lectina
de cebada siguiente:
LEGVFAEIAASNSTLVAE
8. Uso según una de las reivindicaciones 3 a 7,
en el que el ácido nucleico contiene además al menos una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica para un péptido señal.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el
péptido señal procede de una invertasa.
10. Uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que
el péptido señal procede de la invertasa de la membrana celular del
tabaco.
11. Uso según una de las reivindicaciones 3 a 10,
que contiene además al menos una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica para una secuencia de retención del RE.
12. Uso según una de las reivindicaciones 3 a 11,
que contiene además al menos una secuencia de ácidos nucleicos que
comprende un promotor apropiado para la expresión en plantas.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
promotor procede de la misma planta que la invertasa.
14. Uso según la reivindicación 12 ó 13, en el
que el promotor es un promotor específico de la patata, del tomate
o de la remolacha azucarera.
15. Procedimiento para la disminución de las
pérdidas de sacarosa debidas al almacenamiento, que comprende la
expresión de un polipéptido codificado por un ácido nucleico en un
planta transgénica, que contiene al menos el ácido nucleico
definido según una de las reivindicaciones 1 a 14 integrado
establemente en el material genético, en el que el polipéptido es
capaz de reducir la actividad enzimática de una invertasa.
16. Procedimiento para la mejora de la calidad de
la remolacha azucarera, que comprende la expresión de un
polipéptido codificado por un ácido nucleico en un planta
transgénica, que contiene al menos el ácido nucleico definido según
una de las reivindicaciones 1 a 14 integrado establemente en el
material genético, en el que el polipéptido es capaz de reducir la
actividad enzimática de una invertasa y en el que la planta
transgénica es una remolacha.
17. Procedimiento para la mejora la calidad del
tubérculo de la patata, que comprende la expresión de un polipéptido
codificado por un ácido nucleico en un planta transgénica, que
contiene al menos el ácido nucleico definido según una de las
reivindicaciones 1 a 14 integrado establemente en el material
genético, en el que el polipéptido es capaz de reducir la actividad
enzimática de una invertasa y en el que la planta transgénica es una
patata.
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