ES2249836T3

ES2249836T3 - Combinacion de las enzimas proteoliticas tripsina, bromelaina y papaina para el tratamiento de la glomerulonefritis.

Info

Publication number: ES2249836T3
Application number: ES98934986T
Authority: ES
Inventors: Gerhard Stauder; Karl Ransberger
Original assignee: Mucos Pharma GmbH and Co
Current assignee: Mucos Pharma GmbH and Co
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: WO1998058667A1; EP0920332B1; EP0920332A1; DE19726253A1; DE59813159D1; DE19726253C2; ATE308339T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE LA UTILIZACION DE AL MENOS UNA ENZIMA PROTEOLITICA Y OPCIONALMENTE RUTOSINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA GLOMERULONEFRITIS. COMO ENZIMA PROTEOLITICO SE UTILIZA PREFERENTEMENTE TRIPSINA, BROMELAINA O PAPAINA O UNA COMBINACION DE ELLAS.

Description

Combinación de las enzimas proteolíticas tripsina, bromelaína y papaína para el tratamiento de la glomerulonefritis.

El presente invento se refiere a la utilización de una combinación de las enzimas proteolíticas tripsina, bromelaína y papaína, y eventualmente de rutina, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de la glomerulonefritis.

La glomerulonefritis es un concepto colectivo para enfermedades renales bacterianas de diferentes tipos, con procesos de inflamación en los corpúsculos renales, y secundariamente en otras partes de las nefronas y del intersticio renal. Durante una glomerulonefritis se puede llegar al almacenamiento de concreciones de complejos inmunitarios dentro del tejido. Ciertos modelos experimentales de la glomerulonefritis membranosa pueden provocar una grave proteinuria, acompañada con frecuencia por un síndrome nefrótico. Con frecuencia, en el caso de la nefritis en suero y de la fase autóloga de la nefritis de Heymann, se llega también a una hipercolesterolemia. Una forma de la nefritis activa en suero, que es inducida por inmunización de ratones con dextranos, provoca una nefropatía de IgA espontánea en los pacientes. Además de ello, se acumulan depósitos mesangiales sobrantes y algunos depósitos capilares, principalmente con IgA, en los glomérulos. Aparece además una importante hematuria y algunas veces una proteinuria.

Puesto que la glomerulonefritis va acompañada, por lo tanto, con un gran número de graves problemas para el cuerpo, y es difícil en algunos casos una terapia, se están emprendiendo esfuerzos en muchas direcciones para curar la enfermedad, o, sin embargo, por lo menos disminuir sus síntomas y afecciones.

Junto a una terapia con antibióticos, se dedica por lo tanto una atención aumentada a agentes de apoyo, que complementan o refuerzan el tratamiento.

El tratamiento de diferentes estados morbosos con proteinasas es conocido desde hace algún tiempo. Tales proteinasas son p.ej. papaína, tripsina y bromelaína.

Sin estar vinculado a ninguna teoría, se supone que el efecto de las proteinasas se basa por regla general en una intervención en el sistema inmunitario.

El presente invento se basó en el problema técnico de poner a disposición un medicamento adicional para el tratamiento de la glomerulonefritis. Este problema se resuelve, conforme al invento, mediante el objeto del invento que se indica en la reivindicación 1. Las reivindicaciones subordinadas se refieren a formas preferidas de realización del invento.

Sorprendentemente, se encontró que ciertas proteinasas, eventualmente en combinación con rutina, actúan también en el caso de una enfermedad tal como la glomerulonefritis.

De acuerdo con la reivindicación 1 del presente invento, está prevista la utilización de una combinación de las enzimas proteolíticas tripsina, bromelaína y papaína, y eventualmente de rutina, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de la glomerulonefritis.

Se supone que la disolución enzimática de los depósitos inmunitarios glomerulares constituye el fundamento del efecto terapéutico, aún cuando otros mecanismos, tales como p.ej. una expresión celular modificada de citocinas y de receptores de citocinas, de metaloproteasas tisulares endógenas y de moléculas de adhesión celular, son asimismo metas potenciales de las proteasas, así como también una reducción de las células T hiperactivas.

La enzimas utilizadas conforme al invento se pueden aislar a un precio barato a partir de las materias primas siguientes.

La bromelaína es una enzima activa proteolítica procedente del jugo exprimido de la piña tropical (ananás) y también se puede aislar además a partir de frutos maduros.

La papaína es una enzima proteolítica, que se obtiene a partir del jugo lácteo de los frutos carnosos no maduros del papayo Carica Papaya. La papaína pura es un polipéptido cristalino con un P.M. (peso molecular) de 23350, que consiste en una cadena de 212 radicales de aminoácidos con 4 puentes de disulfuro; se conocen la secuencia y la estructura espacial. La papaína se emplea en múltiples casos: En virtud de su propiedad desdobladora de proteínas como "agente ablandador o enternecedor de carne" o "sal ablandadora", para la clarificación de cerveza, para la producción de pan y galletas duras, en el tratamiento del cuero, en la industria textil para desengomar la seda y para evitar el afieltramiento de la lana, en la industria del tabaco con el fin de mejorar la calidad, para la recuperación de plata a partir de un material fotográfico usado, y además en la bacteriología para la obtención de peptonas. En la medicina, la papaína sirve ya para el apoyo de la digestión enzimática, para la limpieza enzimática de heridas, y como aditivo a agentes de limpieza de prótesis dentales. Para finalidades especiales, se ofrecen formulaciones de papaína también fijadas a polímeros de materiales sintéticos o a soportes de agarosa. La papaína se ha utilizado también como catalizador para la síntesis de oligopéptidos.

La tripsina es una enzima proteolítica, que asimismo se forma en el páncreas y que se emplea ya terapéuticamente en unión con otras enzimas. Ella pertenece a las serina - proteinasas. La tripsina cristalina tiene un P.M. de aproximadamente 23.300, es soluble en agua, pero no en un alcohol, posee un valor óptimo del efecto a un pH de 7-9 y desdobla cadenas de péptidos específicamente por el lado de carboxi de los radicales de aminoácidos de carácter básico L-lisina y L-arginina. La estructura espacial de la tripsina, que consiste en 223 aminoácidos, es conocida.

Además, se puede añadir adicionalmente rutósido al medicamento. El rutósido, también conocido como rutina, es un glicósido, que pertenece a los flavonoides.

Una actividad especialmente buena se muestra en el caso de la utilización de una combinación de las enzimas bromelaína, papaína y/o tripsina. Junto al efecto digno de mención e inesperado de estas enzimas sobre el mejoramiento de un estado morboso de glomerulonefritis, la utilización combinada de las enzimas mencionadas tiene además la ventaja de que no aparecen efectos colaterales dañinos, ni siquiera en el caso de un utilización a largo plazo.

Una actividad especialmente buena la tiene la utilización combinada de 20 a 100 mg de bromelaína, de 40 a 120 mg de papaína y de 10 a 50 mg de tripsina por cada unidad de dosis.

Formas preferidas de realización se describen en las reivindicaciones 2 y 3.

En otra forma preferida de realización, se utilizan de 10 a 100 mg, de modo especialmente preferido 100 mg, de rutósido x 3 H_{2}O por cada unidad de dosis.

El medicamento puede contener además todas las sustancias coadyuvantes y/o de vehículo usuales.

Como sustancias coadyuvantes y de vehículo entran en cuestión p.ej. lactosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, ácido metacrílico, un copolímero del tipo A, goma laca, Makrogol 6000, ftalato de dibutilo, vainillina, dióxido de titanio, arcilla blanca, una poliindona, cera amarilla y cera de carnauba.

Los siguientes Ejemplos deben explicar el invento en particular.

Ejemplo 1 Materiales y métodos 1. Materiales

Se utilizó el medio de cultivo celular RPMI 1640 con las siguientes adiciones: NaHCO_{3} (de Biochrom, 2 g/l); L-glutamina (de Biochrom, 2 mM), piruvato de Na (de Biochrom, 1 mM), NaN_{3} (de Sigma, 0,01%).

En el caso de una estimulación de las células, se empleó o bien fitohemaglutinina M (de Biochrom, 5 \mug/ml) o \gamma-interferón (100 U/ml). La estimulación de las células se efectuaba en tal caso a lo largo de 1-3 días con adición de un suero de ternero fetal al 10% (de Biochrom).

Como dianas para las enzimas que se han de investigar se utilizaron células mononucleares periféricas humanas, recientemente aisladas (sangre tratada con citrato). Después del aislamiento usual mediante un Ficoll, las células se lavaron múltiples veces y se emplearon en estado recientemente obtenido en los experimentos. Se aislaron granulocitos neutrófilos asimismo a partir de sangre reciente tratada con citrato. En este caso la separación de los linfocitos / monocitos se efectuó mediante un gradiente de Ficoll de 2 etapas.

2. Anticuerpos monoclonales utilizados

Para el reconocimiento específico de las estructuras superficiales de los leucocitos, se utilizaron anticuerpos (AC) monoclonales. Éstos reconocen en los correspondientes antígenos en cada caso un epítopo definido, que se presenta solamente una única vez en la estructura en el caso de los antígenos que nosotros hemos investigado. En la Recopilación 1 se exponen los marcadores superficiales investigados, los anticuerpos monoclonales así como las células dianas analizadas.

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Recopilación 1

Marcadores superficiales analizados, anticuerpos monoclonales utilizados y células dianas del tratamiento con enzimas

Marcador	Epítopo Ref. a AC.	Fluorocromo	Productor	Célula diana
CD2	Leu5b	PE^{1}	B.D.^{3}	Linfocitos T
CD4	Leu3a	PE	B.D.	Linfocitos T
	OKT4	FITC^{2}	Ortho^{4}	Linfocitos T
CD11b	Leu15	PE	B.D.	Granulocitos
CD25	IL-2R	PE	B.D.	Blastos con PHA

^{1} Ficoeritrina, fluorescencia roja
^{2} Isotiocianato de fluoresceína, fluorescencia verde
^{3} Becton Dickinson, Heidelberg
^{4} Ortho Diagnostics

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3. Condiciones de incubación

Las células recientemente aisladas y tratadas se incubaron con las enzimas bromelaína, papaína y tripsina (ingredientes de medicamentos de la entidad Mucos) con las concentraciones en cada caso indicadas en las leyendas de las tablas y las Figuras. En el caso de la mezcla de las tres enzimas, la relación de mezcladura correspondía a 22,7 : 15,5 : 11,9 (bromelaína : papaína : tripsina, referida a 40 \mug/ml, = "BPT"). Se investigaron tres concentraciones de enzimas (40, 10, 2,5 \mug/ml). La incubación tuvo lugar en un medio exento de suero a 37ºC.

Las proteasas se formularon inmediatamente antes de las incubaciones. En los medios de cultivo celular estaba contenido aziduro de sodio al 0,01%. Por medio de esta adición se impide a las células expresar renovadamente moléculas de receptores durante el proceso de incubación o los procesos de lavado. Después de la separación por lavado del medio de cultivo celular, las células son activables de nuevo (propiedad no demostrada).

Después de una correspondiente incubación de las células con las respectivas enzimas, de una separación por lavado de las enzimas y de la marcación con anticuerpos monoclonales (de acuerdo con los datos del fabricante), se llevó a cabo inmediatamente el análisis de los marcadores superficiales.

4. Citometría analítica de flujo de paso

Todas las investigaciones para la modulación de las moléculas superficiales de células se llevaron a cabo mediante una citometría analítica de flujo de paso (FACSCAN, de la entidad Becton Dickinson, Heidelberg) mediando utilización de un programa lógico (software) específico para el aparato (Lysis I). Con un correspondiente ajuste del aparato así como con la utilización conjunta de referencias, es decir células que se habían tratado sin enzimas pero en el mismo proceso, se efectuó la medición.

Para cada subclase de los anticuerpos monoclonales se utilizó conjuntamente un correspondiente testigo de isotipo conjugado con fluorescencia. En este caso se trata de una inmunoglobulina de ratón, con la que se determina por citometría de flujo la capacidad de la fijación inespecífica de las células dianas.

Por cada histograma se midieron 10.000 células. La respectiva población celular se separó con la denominada "puerta (gate) electrónica" en la que se encontraban entonces por lo menos 3.500 células.

5. Exposición de los resultados

La evaluación y el análisis de los datos se efectuaron independientemente del proceso de medición en el citómetro de flujo de paso mediante un programa lógico, que es específico para el aparato. En este caso, se compararon cada vez los histogramas de los testigos, es decir de las muestras celulares sin tratar, con los histogramas de las células tratadas con enzimas.

La representación en bruto comprende un histograma ópticamente expresivo, pero relativamente poco claro, en el que se reproducen diferentes mediciones individuales dispuestas unas sobre otras. Aquí se puede hacer ópticamente transparente en particular el efecto de las enzimas, en comparación con la referencia. Para estas investigaciones, la magnitud a medir no es la proporción porcentual de una subpoblación en la población global de leucocitos, sino la densidad relativa de receptores, que se representa como la intensidad de fluorescencia.

A partir de estos histogramas, que se dan a modo de ejemplo y tienen un carácter ilustrativo, se pueden deducir datos que reflejan la intensidad relativa de fluorescencia de la medición individual. Ésta es una medida de la densidad relativa de moléculas de receptores o moléculas superficiales en el caso de una población celular medida.

Los gráficos de barras muestran en una representación logarítmica la mediana de la fluorescencia relativa. De esta manera, se puede representar en comparación con la referencia la reducción de la densidad de la respectiva molécula superficial dependiendo de la concentración de enzimas.

En las tablas están contenidos los datos de experimentos independientes. Los números de los donantes tienen validez solamente para la respectiva tabla, y no son transferibles a otras tablas. Si en la tabla se indica por ejemplo un valor de 40%, esto significa que, en el caso de este antígeno, un 40% de todas las moléculas superficiales se ha modificado por la enzima, de tal manera que el anticuerpo monoclonal específico ya no reconoce a su epítopo. Si no se observa ninguna reducción, entonces aparece en las tablas el valor "0". La cifra porcentual indicada expresa por consiguiente el rendimiento enzimático frente a los antígenos individuales. Unos valores hasta de 20% se consideran como no relevantes en el caso individual.

Para una valoración del efecto de las enzimas sobre los antígenos individuales, es favorable escoger una escala comparativa apropiada. Salvo unas pocas excepciones, todas las investigaciones se llevaron a cabo en condiciones normalizadas de incubación. Por consiguiente, para estas condiciones experimentales se puede indicar la concentración a la mitad del efecto, que se conoce a partir de anteriores informes de investigaciones.

Para el cálculo de la concentración a la mitad del efecto se evaluaron los datos mediante una regresión no lineal. La mediana de la intensidad de fluorescencia en función de la concentración empleada de enzima y de la referencia se ponen en relación entre sí, y a partir de esto se puede calcular la cantidad de la enzima que conduce a una reducción del 50% de la intensidad relativa de fluorescencia o bien de la densidad de receptores, modificada en la estructura.

Figura 1: Modulación de CD2 por proteasas; se indica la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia; células dianas: linfocitos. El testigo positivo (= la referencia) lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el anticuerpo monoclonal específico para CD2. El testigo negativo lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el isotipo de anticuerpos. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos del Donante 1 (compárese la Tabla 1) como valor medio de dobles determinaciones y la desviación típica.

Figura 2: Modulación de CD4 (epítopo Leu3a) mediante proteasas; se indica la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia; células dianas: linfocitos. El testigo positivo (= la referencia) lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el anticuerpo monoclonal específico para CD4. El testigo negativo lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el isotipo de anticuerpos. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos del Donante 2 (compárese la Tabla 2) como valor medio de dobles determinaciones y la desviación típica.

Figura 3: Modulación de CD4 (epítopos OKT4 y Leu3a) mediante tripsina; se indica la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia; células dianas: linfocitos. El testigo positivo (= la referencia) lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el anticuerpo monoclonal específico para CD4. El testigo negativo lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el isotipo de anticuerpos. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos de un donante (compárese la Tabla 3) como valor medio de dobles determinaciones y la desviación típica.

Figura 4: Modulación de CD11b mediante proteasas; se indica la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia; células dianas: granulocitos. El testigo positivo (= la referencia) lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el anticuerpo monoclonal específico para CD11b. El testigo negativo lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el isotipo de anticuerpos. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos de un donante como valor medio de dobles determinaciones y la desviación típica.

Figura 5: Modulación de CD25 por proteasas; se indica la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia; células dianas: blastos activados con PHA (fitohemaglutinina). El testigo positivo (= la referencia) lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el anticuerpo monoclonal específico para CD25. El testigo negativo lo constituyen células sin tratar, que se habían incubado con el isotipo de anticuerpos. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos del Donante 1 como valor medio de dobles determinaciones y la desviación típica.

Figura 6: Reducción de la densidad de antígenos de Leu3a por tripsina. Células mononucleares periféricas humanas recientemente aisladas se incubaron con tripsina en un medio exento de suero, a continuación se lavaron y se marcaron con el anticuerpo monoclonal anti-Leu3a. La reducción de la densidad relativa de fluorescencia de CD4 de la población de linfocitos es la medida de la actividad de la enzima. La concentración a la mitad del efecto de la tripsina frente al epítopo Leu3a de CD4 se calcula a través de la curva ajustada.

Resultados TABLA 1 Modulación de CD2 por proteasas; células dianas: linfocitos. Se indica la reducción porcentual de la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia, que es una medida del rendimiento enzimático. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los resultados de tres experimentos con células de tres diferentes donantes

Enzima	Nº	40 \mug/ml	10 \mug/ml	2,5 \mug/ml
Bromelaína	1	11,1	17,9	17,4
	2	6,1	12,2	14,3
	3	0	0	0

Papaína	1	22,4	21,4	34,7
	2	5,4	9,5	17,0
	3	0	0	0

Tripsina	1	75,7	73,6	73,0
	2	83,7	21,1	0,7
	3	96,3	85,4	50,9

BPT	1	71,9	54,7	38,2
	2	74,1	8,8	18,4
	3	94,8	72,6	25,2

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TABLA 2 Modulación de CD4 (epítopo Leu3a) por proteasas; células dianas: linfocitos. Se indica la reducción porcentual de la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia, que es una medida del rendimiento enzimático. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los resultados de dos experimentos con células de dos diferentes donantes

Enzima	Nº	40 \mug/ml	10 \mug/ml	2,5 \mug/ml
Bromelaína	1	24,6	0	0
	2	16,2	0	0

Papaína	1	2,5	3,2	0
	2	0	0	5,7

Tripsina	1	99,3	93,0	64,1
	2	99,4	96,2	57,5

BPT	1	98,3	49,3	23,0
	2	99,4	79,2	20,2

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TABLA 3 Modulación de los epítopos Leu3a y OKT4 de CD4 por tripsina; células dianas: linfocitos. Se indica la reducción porcentual de la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia, que es una medida del rendimiento enzimático. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los datos de un donante

Enzima	Epítopo	40 \mug/ml	20 \mug/ml	10 \mug/ml
Tripsina	Leu3a	98,5	96,7	87,1
	OKT4	6,5	6,3	19,5
	Epítopo	5 \mug/ml	2,5 \mug/ml	1,25 \mug/ml

Tripsina	Leu3a	65,2	41,9	28,8
	OKT4	13,3	10,8	9,3

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TABLA 4 Modulación de CD11b por proteasas; células dianas: granulocitos. Se indica la reducción porcentual de la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia, que es una medida del rendimiento enzimático. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los resultados de tres experimentos con células de tres diferentes donantes

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Enzima	Nº	40 \mug/ml	10 \mug/ml	2,5 \mug/ml
Bromelaína	1	0	0	26,4
	2	0	0	no determinado
	3	13,5	8,1	27,5

Papaína	1	0	0	0
	2	0	0	0
	3	7,9	35,9	20,0

Tripsina	1	0	0	no determinado
	2	17,0	0	0
	3	19,0	1,9	13,9

BPT	1	0	4,3	no determinado
	2	0	0	0
	3	3,1	8,6	4,7

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TABLA 5 Modulación de CD25 por proteasas; células dianas: linfocitos, monocitos, células NK (asesinas). Se indica la reducción porcentual de la mediana de la intensidad relativa de fluorescencia, que es una medida del rendimiento enzimático. El período de tiempo de incubación con las enzimas fue de 60 min. Se representan los resultados de dos experimentos con células de dos diferentes donantes. Antes del experimento, las células se estimularon con mitógenos durante 3 días

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Enzima	Nº	40 \mug/ml	10 \mug/ml	2,5 \mug/ml
Bromelaína	1	90,7	80,1	59,7
	2	62,6	43,6	0

Papaína	1	92,2	81,0	60,7
	2	62,6	43,6	0

Tripsina	1	91,2	88,2	71,0
	2	78,9	73,9	52,8

BPT	1	92,1	89,7	50,9
	2	79,4	44,1	12,2

TABLA 6 Concentración (\mug/ml) calculada a la mitad del efecto de bromelaína, papaína, tripsina y su combinación para la reducción en un 50% de la densidad de moléculas superficiales celulares. La incubación de las enzimas duró 1 hora

Enzimas	CD2	CD4^{3}	CD25^{4}
Concentración a la mitad del	n.a.	n.a.	18,4
efecto de bromelaína^{1}
Intervalo^{2}	-	-	14-23
Concentración a la mitad del	n.a.	n.a.	12,4
efecto de papaína^{1}
Intervalo^{2}	-	-	11-14
Concentración a la mitad del	1,5	2,5	< 2,5
efecto de tripsina^{1}
Intervalo^{2}	1-2	2,3-3,1
Concentración a la mitad del	9,3	16,4	16,0
efecto de B-P-T^{5} ^{1}
Intervalo^{2}	7,5-14	15,5-18	13-19

^{1} Calculado a partir de valores medios de 2 ó 3 experimentos independientes
^{2} Valores mínimos y máximos, intervalo de confianza al 95% = 1 \Delta, estimado
^{3} Modulación del epítopo Leu3a de CD4
^{4} Presente en células estimuladas
^{5} Mezcla de las proteasas bromelaína : papaína : tripsina en la relación 22,7 : 15,5 : 11,9
n.a.: no activa en el sistema investigado (como máximo 40 \mug de enzima/ml, incubación durante 1 h)

Claims

1. Utilización de una combinación de las enzimas proteolíticas tripsina, bromelaína y papaína para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de la glomerulonefritis, caracterizada porque se utilizan de 20 a 100 mg de bromelaína, de 40 a 120 mg de papaína y de 10 a 50 mg de tripsina por cada unidad de dosis, y porque se utiliza eventualmente de modo adicional rutósido.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se utilizan 90 mg de bromelaína, 120 mg de papaína y 100 mg de rutósido por cada unidad de dosis.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se utilizan 90 mg de bromelaína, 48 mg de papaína y de 100 mg de rutósido por cada unidad de dosis.

4. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se utilizan de 10 a 100 mg, de modo preferido 100 mg, de rutósido x 3 H_{2}O por cada unidad de dosis.