ES2248645T3 - Lactobacillus para la preservacion de productos comestibles. - Google Patents

Lactobacillus para la preservacion de productos comestibles.

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ES2248645T3 ES03000001T ES03000001T ES2248645T3 ES 2248645 T3 ES2248645 T3 ES 2248645T3 ES 03000001 T ES03000001 T ES 03000001T ES 03000001 T ES03000001 T ES 03000001T ES 2248645 T3 ES2248645 T3 ES 2248645T3
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Abstract

Un microorganismo de la clase de bacterias Gram- positivas microaerofílicas no formadoras de esporas, del género Lactobacillus, especie casei, tipo de cepa LMG P- 21007 para conservar productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas y derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas.

Description

Lactobacillus para la preservación de productos comestibles.
La presente invención hace referencia al microorganismo natural Lactobacillus casei LMG P-21007 y a su uso para la conservación de productos vegetales, productos de pescado, y productos derivados de animales, mezclas suyas, derivados de productos vegetales, productos de pescado, y productos derivados de animales y mezclas suyas, y particularmente pero no exclusivamente, a la conservación de ensaladas y pescado, tales como salmón, controlando la carga bacteriana patógena y decadente.
Los productos vegetales de la Categoría IV están teniendo una difusión cada vez mayor. Es conocido que la carga bacteriana presente en estos productos depende de su origen, de las condiciones en las que son recogidos o cultivados, etcétera. Las condiciones de almacenamiento (humedad, hojas cortadas) también facilitan el aumento de la carga bacteriana. Durante el almacenamiento y la refrigeración, los muchos cortes en la superficie de los productos, la elevada humedad y la atmósfera gaseosa que es generada dentro de los envases facilita el desarrollo de microorganismos Gram-negativos, que causan el deterioro de los productos y la proliferación de patógenos. Para productos vegetales, con el fin de contrastar el desarrollo de la carga bacteriana, se utiliza el cloro en el lavado de dichos productos. El uso de cloro, aparte de no estar permitido en todos los países, puede alterar las propiedades organolépticas de los productos vegetales. Finalmente, algunos patógenos son capaces de proliferar incluso después de lavar los vegetales con cloro y después de conservarlos a baja temperatura.
El uso de una atmósfera modificada es un medio alternativo para conservar las cualidades organolépticas y comerciales de los productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, y para asegurar su conservación más duradera. Sin embargo, el uso de una atmósfera modificada, que es considerado un medio eficaz para extender el tiempo de conservación de productos alimenticios, incluyendo vegetales de la categoría IV, y para mantener sus cualidades organolépticas y comerciales, conlleva riesgos en cuanto a la seguridad microbiológica, puesto que algunos patógenos pueden desarrollarse o incluso ser estimulados en ciertas atmósferas modificadas y a baja temperatura.
El uso de microorganismos de la especia Lactobacillus casei para controlar la carga bacteriana patógena y decadente ha sido descrito en los siguientes artículos:
- VESCOVO M ET AL: "Aplicación de antimicrobianas productoras de ácido láctico bacterias para controlar patógenos en verduras listas para su uso". JOURNAL OF APPLIED BACTERIOLOGY, vol. 81, nº 2, 1996, páginas 113-119, XP009007306 ISSN; 0021-8847
- VESCOVO MARISA ET AL: "Efectos combinados de inóculo de Lactobacillus casei, atmósfera modificada de envasado y temperatura de almacenamiento en el control de Aeromomas hidrófila en verduras listas para su uso". INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY, vol. 32, nº 5, octubre 1997 (1997-10), páginas 411-419, XP009007365 ISSN: 0950-5423.
- SCOLARI G ET AL: "Caracterización parcial y enlace plásmido de un compuesto antimicrobiano no proteínico en una cepa de Lactobacillus casei de origen vegetal". JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 86, nº, 4, abril 1999 (1999-04), páginas 682-688, XP002234316 ISSN: 1364-5072.
- VIGNOLO G ET AL: "Control de Listeria monocitogenes en ternera picada por ``Lactocin 705'' una bacteriocina producida por Lactobacillus casei CRL 705" INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 29, nº. 2-3, 1996, páginas 397-402, XP002234317 ISSN: 0168-1605.
- RODGERS S: "Conservación de alimentos refrigerados no fermentados con cultivos microbianos-una reseña" TRENDS IN FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, Reino Unido, vol. 12, nº 8, agosto de 2001 (2001-08), páginas 276-284, XP004357930 ISSN: 0924-2244.
La expresión "productos vegetales Categoría IV" es utilizada para designar, en este contexto, fruta, verduras, hortalizas, y otros productos vegetales comestibles, listos para su uso que no pueden definirse como fruta, verduras y hortalizas, mientras que la expresión "productos de pescado y productos derivados de animales" es utilizada para designar, en este contexto, pescado, marisco, moluscos, aves de corral, cerdos, bovinos, ovinos, equinos y cualquier otro animal comestible.
La expresión "derivados de productos vegetales, productos de pescado, y productos derivados de animales" designa preferiblemente pero no exclusivamente productos derivados de su procesamiento, tales como zumos, concentrados, salsas, conservas, etcétera.
El objetivo de la presente invención es permitir una conservación más duradera de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, de mezclas suyas, de derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y de mezclas suyas, sin perder sus cualidades organolépticas y comerciales (aspecto, color, sabor, etcétera).
Un objeto de la presente invención es controlar la carga bacteriana patógena y decadente, que es la principal causa de la pérdida de las cualidades.
Este objetivo y estos y otros objetos son conseguidos por el microorganismo LMG P-21007, el microorganismo estando caracterizado por el hecho de que pertenece a la clase de bacterias Gram-positivo microaerofílicas no formadoras de esporas, al género Lactobacillus, y a la especie casei, tipo de cepa LMG P-21007. El lactobacilo según la invención es capaz de conservar productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas y derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas controlando el desarrollo de la carga bacteriana patógena y decadente, y es capaz de realizar la función inhibitoria a lo largo de una amplia gama de temperatura.
La temperatura de desarrollo de LMG P-21007 está preferiblemente entre 20ºC y 44ºC, más entre 25ºC y 44ºC, incluso más preferiblemente entre 36ºC y 38ºC, y de un modo particularmente preferido es específicamente 37ºC.
Otro aspecto de la invención hace referencia al uso del microorganismo LMG P-21007 para conservar productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas, derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas para controlar el desarrollo de la carga bacteriana decadente y para controlar el desarrollo de la carga bacteriana patógena.
El microorganismo puede utilizarse en una atmósfera ambiente y una atmósfera protectora, preferiblemente una atmósfera protectora. La atmósfera protectora preferiblemente comprende entre 10% y 20% de CO_{2} y N_{2} para la fracción restante.
Preferiblemente, el microorganismo es utilizado fresco, congelado o criodesecado, más preferiblemente fresco. El uso de una forma en lugar de la otra depende de las condiciones contingentes, tales como tiempo de producción, tiempo de transporte y tiempo de utilización, que la persona experta en la técnica será capaz de evaluar en cada instancia.
La temperatura para la actividad inhibitoria del microorganismo puede variar entre 4ºC y 44ºC, preferiblemente entre 4ºC y 12ºC, más preferiblemente entre 4ºC y 8ºC.
La invención hace referencia al uso del microorganismo LMG P-21007 en relación a productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas, derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas.
La invención hace referencia a productos de horticultura, preferiblemente verduras, particularmente ensaladas. Otras verduras particularmente consideradas son los brotes de soja.
La invención hace referencia a productos de pescado y productos derivados de animales, preferiblemente carne de pescado, particularmente salmones, marisco, moluscos y la carne de aves de corral, particularmente pavos, bovinos, cerdos, equinos y ovinos.
La invención hace referencia al control de la carga bacteriana patógena y decadente particularmente en relación al grupo de Enterococci, bacterias coliformes, Pseudomona Daceae, Listeria, Staphylococcus.
Otro aspecto de la invención hace referencia a un producto alimenticio comprendiendo LMG P-21007 y uno o más productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas. Productos vegetales de la Categoría IV son particularmente productos de horticultura, preferiblemente hortalizas, particularmente ensaladas y mezclas suyas. Además, una verdura es preferiblemente el brote de soja.
Los productos de pescado y productos derivados de animales son preferiblemente carne de pescado, particularmente salmones, marisco y moluscos, y la carne de aves de corral, particularmente pavo, carne bovina, carne de cerdo, carne equina y carne ovina.
La Figura 1 es una fotografía de LMG P-21007 vista con un microscopio electrónico de exploración con un aumento de 8000 X.
La Figura 2 muestra la movilidad electroforética de Pep X en las cepas Lactobacillus casei ATCC 334 y LMG P-21007.
La Figura 3 muestra la actividad inhibitoria de LMG P-21007 respecto a Staphylococcus aureus IMPC SA4.
La Figura 4 muestra el peso molecular de las bandas individuales del marcador Supercoiled DNA ladder (GIBCO-BRL).
La Figura 5 muestra el perfil plásmido de LMG P-21007.
La Figura 6 muestra el perfil plásmido de varias cepas de Lactobacilos de diferentes especies.
La Figura 7 muestra el perfil del ADN genómico de LMG P-21007.
Los inventores aislaron el microorganismo LMG P-21007 de verduras frescas de Categoría IV. El aislamiento se realizó con medio MRS agarizado (Difco), específico para bacterias lácticas. El microorganismo LMG P-21007 obtenido de este modo es conservado congelado (-20ºC) o criodesecado. La cepa se caracterizó por ensayos de genotipo y genéticos normales. La morfología de la cepa se observó bajo un microscopio óptico con dispositivo para contraste de fase y bajo un microscopio electrónico de exploración (SEM Mod. HITACHI S2300) y es la morfología típica de la especia Lactobacillus casei. Las imágenes obtenidas bajo el SEM con un aumento de 8000 X se muestran en la Figura 1.
También se determinó lo siguiente: las condiciones de fermentación de los carbohidratos, el tipo de isómero del ácido láctico (L-ácido láctico) y la movilidad electroforética de la encima intracelular X-prolil-dipeptidil aminopeptidasa Pep X. Esta última es mostrada en la Figura 2, que compara la movilidad electroforética de Pep X de LMG P-21007 con la movilidad de Lactobacillus casei ATCC 334.
La resistencia a los antibióticos de la cepa LMG P-21007 y la gama de la actividad inhibitoria in vitro de LMG P-21007 contra microorganismos indicadores Gram + y Gram- también se determinó. La Figura 3 muestra la actividad inhibitoria de LMG P-21007 contra Staphylococcus aureus IMPC SA4, que puede evaluarse a partir del halo de inhibición claramente visible en la Figura.
La temperatura para el desarrollo satisfactorio de LMG P-21007 está entre 20ºC y 44ºC, está entre 25ºC y 44ºC para un desarrollo mejor, está entre 36ºC y 38ºC para el desarrollo óptimo, y está específicamente en 37ºC.
Las características genéticas de LMG P-21007 también se evaluaron; en particular, el análisis del ADN plásmido se realizó y el perfil del ADN genómico se determinó (para LMG P-21007). La Figura 4 presenta el peso molecular de las bandas individuales del marcador Supercoiled DNA ladder /GIBCO-BRL). La Figura 5 muestra en su lugar el perfil del ADN plásmido de LMG P-21007. En particular, el pozo 1 muestra el perfil del marcador II molecular ADN (ROCHE), el pozo 2 muestra el perfil del Supercoiled DNA ladder (GIBCO-BRL), y el pozo 3 muestra el perfil del ADN plásmido de LMG P-21007. La Figura 6 muestra el perfil plásmido de varias cepas de lactobacilos de diferentes especies. Cada perfil corresponde a una única cepa de lactobacilo:
1.
Marcador
2.
Lactobacillus plantarun MV3
3.
Lactobacillus casei AT4
4.
Lactobacillus sake L2S
5.
Lactobacillus curvatus L3S
6.
LMG P-21007
El perfil del ADN genómico de LMG P-21007 se determinó después de la digestión enzimática de ADN cromosómico con enzima Sfi I. El primer pozo de la Figura 7 indica el perfil del marcador utilizado: \lambda ladder PFGE (Roche), mientras que el segundo pozo muestra el perfil del ADN cromosómico de LMG P-21007.
También se realizaron tests para evaluar la actividad de LMG P-21007 contra Pseudomonas, bacterias coliformes fecales y totales en ensaladas de Categoría IV y en brotes de soja. Una suspensión bacteriana acuosa con una concentración adecuada se nebulizó sobre las verduras. Un gramo de biomasa teniendo un contenido de células de 1x10^{11} CFU/g (CFU = unidades que forman colonias) puede resuspenderse en H_{2}O para obtener una suspensión suficiente para tratar 100 Kg de producto de hoja entera u hoja cortada.
El producto nebulizado es parcialmente secado antes de su envasado con el fin de eliminar el exceso de humedad añadida con el proceso de nebulización. Para realizar la comparación entre la carga microbiana del producto tratado con biomasa criodesecada o congelada y la carga del producto tratado con cloro, las concentraciones de coliformes fecales y totales y Pseudomonas se determinaron en el tiempo de t_{o} (directamente después de la nebulización) y al final de su vida útil que es igual a 5+1 días después de la fecha de envasado. Los resultados indican un control significativo de la carga bacteriana en las verduras tratadas con LMG P-21007 respecto de verduras lavadas con cloro. Resultados particularmente significativos se consiguieron en el caso de la oruga, en la que los coliformes totales se encontraron que disminuían respecto a t_{o}, y para brotes de soja, porque 5+1 días después de la fecha de envasado la carga bacteriana para coliformes fecales y totales es menor de 10^{4}.
Los siguientes ejemplos ilustran meramente la presente invención y no deben entenderse en un sentido restrictivo para la presente invención.
\newpage
Ejemplo 1
Preparación de la cepa
La cepa de LMG P-21007 es cultivada en medio MRS (Difco) específico para bacterias lácticas, utilizando un inóculo de 1% de un precultivo en el mismo medio preparado recientemente. Después de 14 horas de fermentación a 37ºC, la densidad celular alcanza valores de 1 a 4 x 10^{9} CFU/ml.
La biomasa es separada del medio de cultivo después de corregir el pH a neutralidad.
Las células resultantes pueden conservarse:
-
congeladas a -20ºC
-
criodesecadas después de añadir un agente protector compuesto de 5% de dextrina, 10% de peptona de soja, 0,2% de extracto de levadura.
Ejemplo 2
Condiciones de fermentación de carbohidratos de LMG P-21007
Las condiciones de fermentación de carbohidratos se determinaron mediante el sistema API 50 CHL (Biomerieux, Francia). Los resultados se leyeron después de 48 horas de incubación de los túneles a 37ºC en condiciones anaeróbicas. Los resultados se ofrecen en la Tabla 1. Las condiciones de fermentación de carbohidratos también se determinaron en un medio mínimo con la adición de cada carbohidrato individual con el fin de confirmar la fermentación mediante el sistema API.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
Azúcares LMG P-21007
Control -
Glicerol \pm
Eritriol -
D-arabinosa -
L-arabinosa -
Ribosa +
D-xilosa -
L-xilosa -
Adonitol -
\beta-metilxilosida -
Galactosa +
D-glucosa +
D-fructosa +
D-manosa +
L-sorbosa +
Ramnosa -
Dulcitol -
Inositol \pm
Manitol +
Sorbitol +
Alfa-metil-D-manosida -
Alfa-metil-D-glucosida +
N-acetilglucosamida +
Amigdalina +
Arbutina +
TABLA 1 (continuación)
Azúcares LMG P-21007
Control -
Esculina +
Salicina +
Celobiosa +
Maltosa +
Lactosa +
Melibiosa -
Sacarosa \pm
Trealosa +
Inulina -
Melicitosa +
D-rafinosa -
Almidón -
Glicógeno -
Xilitol -
\beta-gentiobiosa \pm
D-turanosa +
D-lixosa -
D-tagatosa +
D-fucosa -
L-fucosa -
D-arabitol -
L-arabitol -
Gluconato \pm
2-ketogluconato -
5-ketogluconato - 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Movilidad electroforética de la enzima intracelular X-prolil-dipeptidil aminopeptidasa PepX de LMG P-21007
Con el fin de confirmar la posición taxonómica de la cepa, se analizó la movilidad electroforética de la enzima intracelular X-prolil-dipeptidil aminopeptidasa PepX. La enzima se extrajo mediante ruptura mecánica de las células con ultrasonidos (Labsonic Brown mod. 1510 generador de ultrasonidos). La fracción citoplásmica conteniendo la enzima se sometió a separación en gel poliacrilamida en condiciones no desnaturalizadoras. Después de la electroforesis, la movilidad de la enzima se determinó mediante manchado histoquímico, obtenido mediante un sustrato cromogénico adecuado específico para actividad Pep X. Después del manchado la movilidad de Pep X de la cepa LMG P-21007 se comparó con la movilidad de las cepas de Lactobacillus casei recogidas. La Figura 2 muestra el gel de compara-
ción.
Ejemplo 4
Determinación de la resistencia a antibióticos de la cepa LMG P-21007
La determinación de la resistencia a antibióticos de la cepa LMG P-21007 se realizó mediante el método de difusión de placa, siguiendo las indicaciones de Kirby-Bauer para la evaluación cuantitativa. Los resultados se ofrecen en la Tabla 2.
TABLA 2
Antibiótico Dosis (I.U.) Diámetro Sensibilidad
\beta-lactaminas
\hskip0.5cm Penicilina G 10 15 S
\hskip0.5cm Ampicilina 10 12 R
\hskip0.5cm Cloxacilina 5 0 R
\hskip0.5cm Cefaloridina 30 0 R
Aminosidas
\hskip0.5cm Streptomicina 10 0 R
\hskip0.5cm Neomicina 30 0 R
\hskip0.5cm Kanamicina 30 0 R
\hskip0.5cm Gentamicina 10 0 R
Tetraciclinas
\hskip0.5cm Tetraciclina 30 15 R
\hskip0.5cm Oxitetraciclina 30 18 R
Macrolidas
\hskip0.5cm Spiramicina 100 15 S
\hskip0.5cm Lincomicina 2 8 R
Fenicoles
\hskip0.5cm Cloranfenicol 30 22 S
Riframicinas
\hskip0.5cm Riframicina 30 23 S
Otros
\hskip0.5cm Novobiocina 20 0 S
\hskip0.5cm Vancomicina 30 0 R
Polipéptidos
\hskip0.5cm Colistina 10 0 R
\hskip0.5cm Bacitracina 10 0 R
S = Sensible
R = Resistente 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Determinación de la temperatura óptima de desarrollo de LMG P-21007
Para determinar la temperatura óptima de desarrollo, LMG P-21007 se incubó durante 24 horas en un medio MRS líquido a diferentes temperaturas en una disposición multitermostato. La intensidad del desarrollo se determinó mediante lectura espectrofotométrica con la longitud de onda de 560 nm. Los valores encontrados se ofrecen en la Tabla 3. Los valores muestran un desarrollo satisfactorio de la cepa a temperaturas de entre 20ºC y 44ºC y un desarrollo óptimo a temperaturas de entre 25ºC y 44ºC.
TABLA 3
Temperatura de desarrollo (ºC) \hskip0.75cm Intensidad de desarrollo (OD560 nm)
T0 T2
4 0.057 0.070
8 0.059 0.269
12 0.083 0.410
20 0.047 1.280
25 0.059 1.487
30 0.077 1.600
37 0.075 1.616
44 0.071 1.430
50 0.060 0.199
Ejemplo 6
Espectro de inhibición de LMG P-21007
El espectro de la actividad inhibitoria in vitro de LMG P-21007 contra microorganismos indicadores de Gram+ y Gram- se obtuvo mediante pruebas de difusión de placa. El ensayo se realizó a 8ºC y a 37ºC. Las cepas indicadoras y los resultados son ofrecidos en la Tabla 4. La Figura 3 presenta la actividad inhibitoria de LMG P-21007 contra Staphylococcus aureus IMPC SA4.
TABLA 4
Microorganismos Halo \diameter Inhibición
Indicadores mm
8ºC 37ºC
Microorganismos Gram+
\hskip0.5cm Lactobacillus helveticus ATCC 15009 - -
\hskip0.5cm Lactobacillus reuteri DSM 20016 - -
\hskip0.5cm Lactobacillus plantarum NCDO 1193 10 9
\hskip0.5cm Lactobacillus casei ATCC 334 8 12
\hskip0.5cm Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 9 10
\hskip0.5cm Leoconostoc spp. - -
\hskip0.5cm Staphylococcus aureus IMPC SA4 23 21
\hskip0.5cm Listeria monocytogenes EG 8 12
Microorganismos Gram-
\hskip0.5cm Aeromonas hydrophila 2 10 14
\hskip0.5cm Salmonella typhimurium G 2 7
\hskip0.5cm Citrobacter freundii IMPC CF2 8 12
\hskip0.5cm Enterobacter cloacae IMPC CF3 10 15
\hskip0.5cm Escherichia coli IMPC CT4 6 10
Ejemplo 7
Análisis de ADN plásmido de la cepa de LMG P-21007
El análisis del ADN plásmido de la cepa de LMG P-21007 se realizó utilizando el método lisis descrito por Andreson y Mc Key; Supercoiled DNA Ladder (GIBCO-BRL) se utilizó como marcador de referencia para pesos moleculares. Figura 4.
La Figura 5 muestra el perfil del ADN plásmido de LMG P-21007 y la Figura 6 muestra los perfiles del ADN plásmido de LMG P-21007 en comparación con las cepas que pertenecen a otras especies mesófílas.
Ejemplo 8
Perfil del ADN genómico de la cepa de LMG P-21007
El perfil del ADN genómico de la cepa de LMG P-21007 se obtuvo mediante digestión enzimática del ADN cromosómico con enzima Sfi I según las indicaciones de Ferrero et al. y se analizó mediante electroforesis en campo pulsado (PFGE). \lambda Ladder PFGE (Roche) se utilizó como marcador.
Las condiciones electrofóreticas fueron:
gradiente 4.5 V/cm
tiempo de proceso 24 horas
tiempo de conmutación 1\rightarrow20 segundos
factor ramping lineal
ángulo incluido 120º
agarosa 1%
TBE 0.5 x
Temperatura 14ºC
La Figura 7 muestra el perfil del ADN genómico del LMG P-21007.
Ejemplo 9
Evaluación de la actividad de LMG P-21007 en ensaladas de Categoría IV contra bacterias coliformes y Pseudomonas
Se utilizó LMG P-21007 congelado y criodesecado (véase Ejemplo 1).
La cantidad de LMG P-21007 a ser añadida al producto a ser tratado se programó para obtener una concentración celular de 10^{6} CFU/ml en el producto. Este resultado se consiguió dispersando la biomasa en una cantidad de agua proporcional al rendimiento de fermentación. El rendimiento de fermentación se calculó a partir del conteo microbiano de la biomasa de LMG P-21007.
La suspensión bacteriana acuosa resultante se nebulizó sobre las ensaladas.
Antes del envasado, se eliminó el exceso de humedad añadida con el proceso de nebulización para que las condiciones de conservación en los varios tests fueran comparables.
Para realizar la comparación entre la carga microbiana del producto tratado con la biomasa criodesecada o congelada y la carga del producto tratado con cloro, las concentraciones de coliformes y Pseudomonas se determinaron en el tiempo t_{o} (directamente después de la nebulización) y a la finalización de la vida útil, que es igual a 5+1 días después de la fecha de envasado.
La composición de la atmósfera protectora se estableció durante el envasado:
-
CO_{2}: 10%-20%
-
N_{2}: la fracción restante.
Los valores de las muestras a t_{o} se refieren al producto lavado sólo con agua potable, sin hipoclorito de sodio, para evaluar si el tratamiento con lactobacilos es equivalente al tratamiento con cloro.
Los resultados obtenidos para las ensaladas individuales se ofrecen en las siguientes tablas:
Cosconilla (Reichardia picroides)
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=8.0x10^{2}) (t_{o}=1.5x10^{4})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 7.9x10^{5} 2.2x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 3.4x10^{2} 1.7x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 3.3x10^{2} 4.3x10^{3}
(Continuación)
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=8.0x10^{2}) (t_{o}=1.5x10^{4})
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 3.0x10^{5} 5.0x10^{6}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 5.8x10^{2} 2.3x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 2.8x10^{3} 3.4x10^{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
Achicoria (Cichorium intybus)
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=2.4x10^{4}) (t_{o}=7.0x10^{5})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.3x10^{6} 2.5x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 6.1x10^{5} 3.6x 10^{6}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 8.0x10^{5} 3.9x10^{6}
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.4x10^{6} 6.0x10^{6}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 9.0x10^{4} 7.0x10^{5}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 9.2x10^{4} 1.3x10^{5} 
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla Mesclun
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=4.2x10^{2}) (t_{o}=6.5x10^{4})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 4.2x10^{6} 2.7x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 1.8x10^{4} 7.5x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 1.7x10^{4} 4.2x10^{4}
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.7x10^{6} 2.0x 10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 1.0x10^{3} 4.0x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 7.3x10^{3} 6.0x10^{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
Ensalada Catalana
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=3.3x10^{4}) (t_{o}=8.7x10^{5})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 8.3x10^{6} 7.6x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 5.0x10^{3} 4.2x10^{4}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 4.6x10^{3} 6.3x10^{4}
(Continuación)
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=3.3x10^{4}) (t_{o}=8.7x10^{5})
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.4x10^{6} 5.2x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 1.3x10^{3} 2.1x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 2.5x10^{3} 3.1x10^{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
"Poker" (Ensalada de cuatro vegetales)
Coliformes Pseudomonas
(t_{o}=3.1x10^{3}) (t_{o}=6.5x10^{5})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.3x10^{6} 8.2x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 2.9x 10^{4} 5.3x10^{4}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 4.6x10^{4} 6.7x10^{4}
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 2.5x10^{7} 4.8x10^{7}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 2.2x10^{3} 2.2x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos criodesecados 6.2x10^{3} 3.6x10^{3}
Ejemplo 10
Evaluación de la actividad de LMG P-21007 en productos vegetales de Categoría IV contra coliformes totales y coliformes fecales
LMG P-21007 congelado y criodesecado se utilizó (véase Ejemplo 1).
La cantidad de LMG P-21007 a ser añadida al producto a ser tratado se programó para obtener una concentración celular de 10^{6} CFU/ml en el producto. Este resultado se consiguió dispersando la biomasa en una cantidad de agua proporcional al rendimiento de la fermentación. El rendimiento de fermentación se calculó a partir del conteo microbiano de la biomasa de LMG P-21007.
La suspensión bacteriana acuosa resultante se nebulizó en las ensaladas.
Las ensaladas entonces se sometieron a secado parcial antes de envasado, con el fin de eliminar el exceso de humedad añadido con el proceso de nebulización y de modo que las condiciones de conservación en los varios tests fueran comparables.
Con el fin de comparar la carga microbiana del producto tratado con biomasa criodesecada o congelada y la carga del producto tratado con cloro, las concentraciones de coliformes fecales y totales se determinaron en tiempo t_{o} (directamente después de la nebulización) y a la finalización de la vida útil, igual a 5+1 días después de la fecha de envasado.
La composición de la atmósfera protectora se estableció durante el envasado:
-
CO_{2}: 10%-20%
-
N_{2}: la fracción restante.
Los valores de las muestras a t_{o} hacen referencia al producto lavado sólo con agua potable, sin hipoclorito de sodio, con el fin de evaluar si el tratamiento con lactobacilos es equivalente al tratamiento con cloro.
Los resultados obtenidos para las ensaladas individuales se ofrecen en las siguientes tablas:
Hierba de Canónigo
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{o}=1.5x10^{4}) (t_{0}=<10)
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 3.5x10^{5} (2.4x10^{3})
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 4.0x10^{6} (7.0x10^{1}) 
\vskip1.000000\baselineskip
Oruga
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{o}=8.3x10^{4}) (t_{0}=5.0x10^{3})
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 5.2x10^{6} 4.1x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 7.8x10^{4} 6.3x10^{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
Achicoria Chioggia roja
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{0}=incontable) (t_{0}=<10)
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 6.0x10^{6} incontable
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 3.4x10^{6} incontable
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 2.0x10^{6} <10 
\vskip1.000000\baselineskip
Lechuga
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{o}=3.2x10^{4}) (t_{0}=1.0x10^{4})
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 1.7x10^{5} 7.7x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 3.0x10^{6} 5.0x10^{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
Lechuga Iceberg
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{o}= incontable) (t_{0}=1.4x10^{2})
Atmósfera protectora
\hskip0.5cm lavados con cloro 3.0x10^{5} 2.3x10^{3}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos 1.7x10^{6} 2.1x10^{3}
Brotes de soja
Coliformes totales Coliformes fecales
(t_{o}= incontable) (t_{0}= incontable)
Atmósfera ambiente
\hskip0.5cm lavados con cloro 4.1x10^{6} 5.2x10^{6}
\hskip0.5cm lactobacilos frescos <10^{4} <10^{4}
Ejemplo 11
Evaluación de la actividad de LMG P-21007 en salmón Noruego contra bacterias coliformes, Listeria y Staphylococcus
Una muestra de salmón Noruego ahumado se dividió en tres porciones: una porción de referencia (Test), una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFU/g, y una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFG/g y Lactobacillus LMG P-21007 en la cantidad de 10^{6} CFU/g.
El control de los grupos microbianos (bacterias coliformes, Listeria y Staphylococcus) se realizó cada dos semanas por un periodo de 30 días.
Los resultados se ofrecen en la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupos Salmón Test Salmón + Listeria spp. Salmón + Listeria spp.
microbianos + LMG P-21007
t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30}
Conteo microbiano 4.3x10^{6} 6.0x10^{6} 4.0x10^{6} 4.3x10^{6} 2.0x10^{7} 4.6x10^{7} 4.3x10^{6} 3.0x10^{7} 1.2x10^{7}
aeróbico total
Coliformes totales <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Coliformes fecales <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Psicrófilos totales 3.7x10^{6} 2.0x10^{6} 2.5x10^{6} 3.7x10^{6} 1.3x10^{7} 2.2x10^{7} 3.7x10^{6} 1.0x10^{7} 9.7x10^{6}
Staphylococcus spp. 3.2x10^{5} 6.7x10^{5} 9.0x10^{5} 3.2x10^{5} 7.0x10^{5} 5.0x10^{5} 3.2x10^{5} 3.0x10^{5} 2.0x10^{5}
Bacterias lácticas 2.4x10^{5} 3.0x10^{6} 3.7x10^{7} 2.4x10^{5} 1.3x10^{7} 4.5x10^{7} 2.0x10^{6} 3.6x10^{7} 5.8x10^{7}
Listeria spp. ausente ausente ausente 3.4x10^{5} 9.0x10^{5} 2.0x10^{6} 3.5x10^{5} 1.0x10^{5} 3.0x10^{5} 
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos experimentales muestran que la adición de Lactobacillus LMG P-21007 produce una inhibición del desarrollo de Listeria; durante el periodo de conservación controlado, para la porción de muestra inoculada sólo con Listeria hay un aumento suyo de 1 log (de 10^{5} a 10^{6}), mientras que para la porción inoculada con Listeria y con Lactobacillus LMG P-21007 el nivel de Listeria es mantenido en valores del orden de 10^{5} CFU/g.
Ejemplo 12
Evaluación de la actividad de LMG P-21007 en salmón Escocés contra bacterias coliformes, Listeria y Staphylococcus
Una muestra de salmón escocés ahumado se dividió en tres porciones: una porción de referencia (Test), una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFU/g y una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFU/g y Lactobacillus LMG P-21007 en la cantidad de 10^{6} CFU/g.
El control de los grupos bacterianos (bacterias coliformes, Listeria y Staphylococcus) se realizó cada dos semanas durante un periodo de 30 días.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Grupos Salmón Test Salmón + Listeria spp. Salmón + Listeria spp.
microbianos + LMG P-21007
t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30}
Conteo microbiano 1.0x10^{5} 1.4x10^{8} 8.0x10^{8} 3.0x10^{5} 1.3x10^{8} 4.0x10^{8} 3.0x10^{5} 1.3x10^{8} 2.0x10^{8}
aeróbico total
Coliformes totales <10 1.1x10^{2} <10 <10 9.0x10^{1} <10 <10 2.0x10^{1} <10
Coliformes fecales <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Psicrófilos totales 9.0x10^{4} 1.0x10^{8} 4.0x10^{8} 9.0x10^{4} 9.0x10^{7} 1.0x10^{8} 9.0x10^{4} 8.0x10^{7} 1.2x10^{8}
Staphylococcus spp. 2.0x10^{3} 2.2x10^{6} 4.6x10^{7} 2.0x10^{3} 2.4x10^{5} 7.0x10^{5} 2.0x10^{3} 4.0x10^{4} 17.3x10^{4}
Bacterias lácticas 3.0x10^{5} 5.0x10^{7} 6.7x10^{7} 3.0x10^{5} 8.0x10^{7} 9.3x10^{7} 4.8x10^{6} 1.3x10^{8} 1.6x10^{8}
Listeria spp. ausente ausente ausente 2.0x10^{5} 4.0x10^{5} 8.7x10^{5} 2.0x10^{5} 2.3x10^{4} 4.2x10^{4}
Los datos experimentales muestran que la adición de Lactobacillus LMG P-21007 produce una inhibición del desarrollo de Listeria y Staphylococcus; durante el periodo de conservación controlado, para la porción de muestra inoculada sólo con Listeria, la población permanece a niveles del orden de 10^{5} CFU/g, mientras que la porción inoculada con Listeria y con Lactobacillus LMG P-21007 el nivel de Listeria disminuye, pasando de valores del orden de 10^{5} CFU/g a valores del orden de 10^{4} CFU/g y el nivel de Staphylococcus es menor que el nivel observado en todas las otras muestras (del orden de 10^{4} CFU/g, versus 10^{6} CFU/g de la porción test y 10^{5} CFU/g de la porción inoculada con Listeria).
Ejemplo 13
Evaluación de la actividad de LMG P-21007 en salmón Escocés contra bacterias coliformes, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus y Pseudomonas
Una muestra de salmón Escocés ahumado se dividió en tres porciones: una porción de referencia (Test), una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFU/g y una porción que recibió la adición de Listeria spp. en la cantidad de 10^{5} CFU/g y Lactobacillus LMG P-21007 en la cantidad de 10^{6} CFU/g.
El control de los grupos bacterianos (bacteria coliforme, Listeria y Staphylococcus) se realizó cada dos semanas durante un periodo de 30 días.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Grupos Salmón Test Salmón + Listeria spp. Salmón + Listeria spp.
microbianos + LMG P-21007
t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30} t_{0} t_{15} t_{30}
Conteo microbiano 1.2x10^{4} 1.0x10^{6} 7.0x10^{6} 1.2x10^{4} 8.7x10^{7} 1.7x10^{8} 1.2x10^{4} 3.8x10^{7} 4.6x10^{7}
aeróbico total
Coliformes totales <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Coliformes fecales <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Enterococcus spp. 6.1x10^{1} 5.3x10^{3} 6.3x10^{5} 6.1x10^{1} 6.2x10^{3} 5.8x10^{5} 6.1x10^{1} 4.5x10^{3} 1.8x10^{4}
Pseudomonas spp. 2.3x10^{3} 3.0x10^{4} 2.5x10^{4} 2.3x10^{3} 6.0x10^{4} 5.0x10^{4} 2.3x10^{3} 6.4x10^{4} 6.2x10^{4}
Staphylococcus spp. 2.0x10^{4} 2.6x10^{6} 3.5x10^{6} 2.0x10^{4} 5.4x10^{5} 1.2x10^{6} 2.0x10^{4} 2.7x10^{4} 1.9x10^{5}
Bacterias lácticas 6.2x10^{3} 3.5x10^{5} 7.3x10^{5} 6.2x10^{3} 6.3x10^{5} 8.5x10^{5} 8.2x10^{6} 7.0x10^{6} 9.1x10^{6}
Listeria spp. ausente ausente ausente 2.5x10^{5} 1.9x10^{6} 5.1x10^{6} 2.5x10^{5} 3.0x10^{5} 1.2x10^{5}
Los datos experimentales muestran que la adición de Lactobacillus LMG P-21007 produce una inhibición del desarrollo de Listeria y de Staphylococcus; durante el periodo de conservación controlado; para la porción de muestra inoculada sólo con Listeria, la población de hecho aumenta desde niveles del orden de 10^{5} CFU/g a niveles del orden de 10^{6} CFU/g, mientras que para la porción inoculada con Listeria y con Lactobacillus LMG P-21007 el nivel de Listeria permanece en valores del orden de 10^{5} CFU/g y el nivel de Staphylococcus, mientras que aumenta, aún permanece por debajo del nivel observado en todas las demás muestras.
Ejemplo 14
Efecto de la adición de Lactobacillus LMG P-21007 (10^{6}) en el desarrollo de Listeria spp. inoculado en una muestra de salmón ahumado, después de 30 días de conservación a 4ºC en vacío
Tipo de salmón Concentración de Listeria Concentración de Listeria spp. en Variación en log después de
spp. en la porción Test la muestra inoculada con Listeria conservación a 4ºC en
spp y Lactobacillus LMG P-21007 vacío durante 30 días.
Escocés 2.9x10^{6} 3.4x10^{4} - 2 log
Escocés 7x10^{7} 2.8x10^{4} - 3 log
Escocés 3.4x10^{7} 1.2x10^{5} - 2 log
Escocés 3.4x10^{7} 4x10^{4} - 3 log
Irlandés 6.7x10^{5} 8x10^{4} - 1 log
Irlandés 4.6x10^{6} 3x10^{4} - 2 log
Irlandés 1.2x10^{6} 2.4x10^{4} - 2 log
Irlandés 1x10^{5} 3x10^{3} - 2 log
Noruego 3.2x10^{6} 6.1x10^{5} - 1 log
Noruego 2.4x10^{5} 1.2x10^{4} - 1 log
Irlandés 3x10^{5} 1.7x10^{4} - 1 log 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15
Efecto de la adición de Lactobacillus LMG P-21007 (10^{6}) en el desarrollo de Staphylococcus spp. en una muestra de salmón ahumado, después de 30 días de conservación a 4ºC en vacío
Tipo de salmón Concentración de Concentración de Staphylococcus Variación en log después de
Staphylococcus spp. spp. en la muestra inoculada con conservación a 4ºC en vacío
en la porción Test Lactobacillus LMG P-21007 durante 30 días.
Escocés 4.2x10^{7} 2.1x10^{6} - 1 log
Escocés 5.2x10^{6} 8.3x10^{3} - 3 log
Escocés 3.1x10^{7} 7.2x10^{4} - 3 log
Escocés 2.7x10^{6} 7x10^{4} - 2 log
Irlandés 4.5x10^{6} 3x10^{5} - 1 log
Irlandés 6.2x10^{5} 3.2x10^{5} \hskip0.135cm 0 log
Irlandés 7.1x10^{6} 3.2x10^{5} - 1 log
Ejemplo 15 (continuación)
Tipo de salmón Concentración de Concentración de Staphylococcus Variación en log después de
Staphylococcus spp. spp. en la muestra inoculada con conservación a 4ºC en vacío
en la porción Test Lactobacillus LMG P-21007 durante 30 días.
Irlandés 3.5x10^{5} 1.6x10^{6} + 1 log
Noruego 2.2x10^{7} 8x10^{5} - 2 log
Noruego 2x10^{5} 7x10^{5} \hskip0.135cm 0 log
Irlandés 3x10^{5} 1.7x10^{4} - 1 log

Claims (27)

1. Un microorganismo de la clase de bacterias Gram-positivas microaerofílicas no formadoras de esporas, del género Lactobacillus, especie casei, tipo de cepa LMG P-21007 para conservar productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas y derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas.
2. El microorganismo según la reivindicación 1, caracterizado por una temperatura de desarrollo entre 20ºC y 44ºC.
3. El microorganismo según la reivindicación 2, caracterizado por una temperatura de desarrollo entre 25ºC y 44ºC.
4. El microorganismo según la reivindicación 3, caracterizado por una temperatura de desarrollo de 37ºC.
5. Uso de un microorganismo según la reivindicación 1 para conservar productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales, mezclas suyas y derivados de productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales y mezclas suyas.
6. Uso de microorganismos según la reivindicación 1 para controlar la carga bacteriana decadente.
7. Uso del microorganismo según la reivindicación 1 para controlar la carga bacteriana patógena.
8. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7 en atmósfera ambiente o atmósfera protectora.
9. Uso del microorganismo según la reivindicación 8, en el que la atmósfera protectora tiene la siguiente composición:
- CO_{2}: 10%-20%
- N_{2}: la fracción restante.
10. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7 en el que la temperatura de actividad está entre 4ºC y 44ºC.
11. Uso del microorganismo según la reivindicación 10, en el que la temperatura de actividad está entre 4ºC y 12ºC.
12. Uso del microorganismo según la reivindicación 10, en el que la temperatura de actividad está entre 4ºC y 8ºC.
13. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7, en el que el microorganismo es fresco, congelado o criodesecado.
14. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6, o 7, en el que los productos vegetales pertenecen a las categorías I, IV o V.
15. Uso del microorganismo según la reivindicación 14, en el que los productos vegetales de categorías I, IV y V y mezclas suyas son productos de horticultura.
16. Uso del microorganismo según la reivindicación 15, en el que los productos de horticultura son ensaladas o mezclas de ensaladas.
17. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7, en el que los productos de pescado y productos derivados de animales son carne de pescado, marisco, moluscos, carne de aves de corral, bovinos, cerdos, equinos y ovinos.
18. Uso del microorganismo según la reivindicación 17, en el que la carne de pescado es carne de salmón.
19. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7, en el que los derivados de los productos vegetales, productos de pescado y productos derivados de animales son zumos, concentrados, salsas y conservas suyas.
20. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6 o 7 para controlar la carga bacteriana de bacterias coliformes.
21. Uso del microorganismo según las reivindicaciones 5, 6, o 7 para controlar la carga bacteriana de bacterias del grupo de Enterococci, Pseudomonas Daceae, Staphylococcus y Listeria. 
\newpage
22. Un producto alimenticio comprendiendo el microorganismo según la reivindicación 1 y al menos un producto vegetal, producto de pescado o producto derivado de animales, o al menos un derivado de al menos un producto vegetal, producto de pescado o producto derivado de animales.
23. El producto alimenticio según la reivindicación 22, en el que los productos vegetales y sus mezclas pertenecen a las categorías I, IV y V.
24. El producto según la reivindicación 23, en el que los productos vegetales y sus mezclas son productos de horticultura.
25. El producto alimenticio según la reivindicación 24, en el que los productos de horticultura son ensaladas o mezclas de ensaladas.
26. El producto alimenticio según la reivindicación 22, en el que los productos de pescado o productos derivados de animales y sus mezclas son carne de pescado, marisco, moluscos, carne de aves de corral, cerdos, equinos, bovinos y ovinos.
27. El producto alimenticio según la reivindicación 26, en el que la carne de pescado es carne de salmón.
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