ES2234834T3 - Stolonoxidos. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto de tipo stolonóxido de la fórmula: o un derivado suyo, que es una sal farmacéuticamente aceptable, un éster o una amida, en la preparación de una composición farmacéutica para un método para tratar un mamífero afectado por cáncer.

Description

Stolonóxidos.

La presente invención se refiere a los stolonóxidos, incluyendo metabolitos menores de los stolonóxidos del ascidiano Stolonica socialis y sus derivados, y se refiere además a la citotoxicidad de los stolonóxidos.

Antecedentes de la invención

Los ascidianos marinos siguen focalizando el interés tanto de la investigación marina biomédica como de la química. Los compuestos que se derivan de los aminoácidos, ya sean péptidos o alcaloides, dominan la química de los ascidianos. Sin embargo, los metabolitos no nitrogenados de los ascidianos, aunque considerablemente menores en número, no son bajo ningún concepto menos importantes, ver Faulkner, D.J. Nat. Prod. Rep. 2000, 17, 7-55, y las referencias que se citan allí. Se encuentran raramente las oxilipinas, metabolitos que se derivan mediante biooxidación de los ácidos grasos, entre estos metabolitos no nitrogenados, ver Gerwick, W.H. Lipids 1996, 31, 1215-1231.

Se ha informado del aislamiento del stolonóxido A, un peróxido cíclico nuevo que se aisló como su éster de metilo a partir de una muestra que se recogió de Stolonica socialis de la Isla de Tarifa (Cádiz, España), ver Fontana, A.; González, M.C.; Gavagnin, M.; Templado, J.; Cimino, G. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 429-432.

Breve exposición de la invención

La invención se interesa por el uso de compuestos de fórmula:

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y sus derivados.

Los compuestos incluyen productos aislados naturales y compuestos sintetizados de ellos, y presentan actividad citotóxica frente a líneas de células tumorales.

Se usan los compuestos para la preparación de composiciones farmacéuticas para un método para tratar cualquier mamífero, notablemente un humano, afectado por cáncer, que comprende administrar al individuo afectado una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, o una composición farmacéutica de él.

Se pueden aislar fácilmente ciertos compuestos como mezclas, y se pueden usar tales mezclas en las composiciones.

Nosotros además proporcionamos nuevos compuestos de stolonóxidos y derivados.

Ejemplos de realización preferidos

Los stolonóxidos que se prefieren para el uso en esta invención son los stolonóxidos A, B, C y D de las fórmulas:

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donde R es un H para el compuesto stolonóxido de origen. Los derivados de los stolonóxidos de esta invención son compuestos que se forman mediante la derivatización del ácido carboxílico, y que son, pues, compuestos donde R no es hidrógeno.

Los ejemplos de derivados que forman parte de esta invención incluyen sales, especialmente sales de metales alcalinos tales como la sal sódica; ésteres, especialmente ésteres alifáticos o de arilo opcionalmente sustituidos tales como los ésteres de alquilo C_{1}-C_{6} o mayores, los ésteres de cicloalquilo, los ésteres de alquenilo, los ésteres de alquinilo, los ésteres de arilo tales como ésteres de fenilo, los ésteres de aralquilo, los ésteres de aralquenilo, y los ésteres de aralquinilo, todos los cuales se pueden sustituir opcionalmente con grupos alquilo, alcóxido, alquiltio, halógeno, haloalquilo, carboxilo, hidroxilo, hidroxialquilo, arilo o aminoalquilo, y donde los grupos arilo pueden ser heterocíclicos; o amidas, especialmente amidas simples o amidas N-sustituidas.

Los sustituyentes de tipo halógeno adecuados en los compuestos de la presente invención incluyen F, Cl, Br y I.

Los grupos alquilo tienen preferiblemente desde 1 hasta 12 átomos de carbono, más preferiblemente desde 1 hasta 8 átomos de carbono, todavía más preferiblemente desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y más preferiblemente 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Los grupos alquilo que se prefieren particularmente en los compuestos de la presente invención incluyen metilo, etilo y propilo, incluyendo el isopropilo. Tal como aquí se usa, se refiere el término alquilo, a menos que se modifique de otro modo, tanto para los grupos cíclicos como a los acíclicos, aunque los grupos cíclicos comprenderán como mínimo miembros de anillos de tres átomos de carbono.

Los grupos alquenilo y alquinilo en los compuestos de la presente invención tienen uno o más enlaces insaturados y desde 2 hasta 12 átomos de carbono, más preferiblemente desde 2 hasta 8 átomos de carbono, todavía más preferiblemente desde 2 hasta 6 átomos de carbono, incluso más preferiblemente 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Se refieren los términos alquenilo y alquinilo tal como se usan aquí tanto a los grupos cíclicos como a los acíclicos, aunque se prefieren más, generalmente, los grupos acíclicos lineales o ramificados.

Los grupos alcóxido que se prefieren en los compuestos de la presente invención incluyen grupos que tengan uno o más enlaces de oxígeno y desde 1 hasta 12 átomos de carbono, más preferiblemente desde 1 hasta 8 átomos de carbono, todavía más preferiblemente desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y sobre todo preferiblemente 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono.

Los grupos alquiltio que se prefieren en los compuestos de la presente invención tienen uno o más enlaces tioéter y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente desde 1 hasta 8 átomos de carbono, y todavía más preferiblemente desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono. Se prefieren particularmente los grupos alquiltio que tengan 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono.

Los grupos aminoalquilo que se prefieren incluyen aquellos grupos que tienen uno o más grupos amina primaria, secundaria y/o terciaria, y desde 1 hasta 12 átomos de carbono, más preferiblemente desde 1 hasta 8 átomos de carbono, todavía más preferiblemente desde 1 hasta 6 átomos de carbono, incluso más preferiblemente 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Se prefieren más generalmente los grupos amina secundaria y terciaria que las partes de amina prima-
ria.

Los grupos amido que se prefieren incluyen grupos amido primarios, secundarios o terciarios, e incluyen grupos amido secundarios o terciarios que tengan uno o más grupos alquilo.

Los grupos heterocíclicos adecuados en los compuestos de la presente invención contienen preferiblemente uno, dos o tres heteroátomos que se seleccionan entre átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre e incluyen grupos heteroaromáticos tales como, por ejemplo, el cumarinilo, que incluye el 8-cumarinilo, el quinolinilo, que incluye el 8-quinolinilo, el piridilo, el pirazinilo, el pirimidilo, el furilo, el pirrolilo, el tienilo, el tiazolilo, el oxazolilo, el imidazolilo, el indolilo, el benzofuranilo y el benzotiazol; y grupos heteroalicíclicos tales como, por ejemplo, grupos tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, morfolino y pirrolidinilo.

Los grupos arilo carbocíclicos adecuados en los compuestos de la presente invención incluyen compuestos con un solo anillo o anillos múltiples, incluyendo compuestos de múltiples anillos que contienen grupos arilo separados y/o fusionados. Los grupos arilo carbocíclicos típicos contienen desde 1 hasta 3 anillos separados o fusionados y desde 6 hasta aproximadamente 18 átomos de anillos de carbono. Los grupos arilo carbocíclicos que se prefieren específicamente incluyen el fenilo, incluyendo el fenilo sustituido, tal como el fenilo 2-sustituido, el fenilo 3-sustituido, el fenilo 2,3-sustituido, el fenilo 2,5-sustituido, el fenilo 2,3,5-sustituido y el 2,4,5-sustituido, incluyendo donde uno o más de los sustituyentes fenilo es un grupo atractor de electrones tal como un halógeno, un cianuro, un nitro, un alcanoilo, un sulfinilo, un sulfonilo y similares; un naftilo incluyendo el 1-naftilo y el 2-naftilo; un bifenilo; un fenantrilo; y un antracilo.

Se refieren las referencias de aquí sobre grupos sustituidos en los compuestos de la presente invención, a la parte especificada que puede estar sustituida en una o más posiciones disponibles mediante uno o más grupos adecuados, por ejemplo, un halógeno tal como fluoro, cloro, bromo y yoduro; un cianuro; un hidroxilo; un nitro; un azido; un alcanoilo tal como un grupo alcanoilo C_{1}-C_{6} tal como un acilo y similares; un carboxamido; grupos alquilo que incluyen aquellos grupos que poseen desde 1 hasta 2 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono y más preferiblemente 1-3 átomos de carbono; grupos alquenilo y alquinilo incluyendo grupos que tienen uno o más enlaces insaturados y desde 2 hasta 12 o desde 2 hasta 6 átomos de carbono; grupos alcóxido que que tengan aquéllos que tienen uno o más enlaces de oxígeno y desde 1 hasta 12 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono; arilóxidos tales como el fenóxido; grupos alquiltio que incluyan estas partes que tengan uno o más enlaces tioéter y desde 1 hasta 12 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfinilo que contengan aquellas partes que tengan uno o más enlaces sulfinilo y desde 1 hasta 12 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfinilo que incluyan aquellas partes que tengan uno o más enlaces sulfonilo y desde 1 hasta 12 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono; grupos aminoalquilo tales como grupos que tengan uno o más átomos de N y desde 1 hasta 12 átomos de carbono o desde 1 hasta 6 átomos de carbono; un arilo carbocíclico que tenga 6 o más carbonos, particularmente un fenilo (por ejemplo una parte de bifenilo sustituido o no sustituido); y un aralquilo tal como el bencilo.

La cadena lateral en los compuestos puede ser 10-\alpha o 10-\beta. El doble enlace \Delta^{19,20} en los compuestos puede ser cis o trans.

Los ejemplos de los derivados incluyen los compuestos de fórmula (1a), (2a), (3a) y (4a), donde el sufijo "a" indica una sal sódica, y los compuestos de fórmula (1b), (2b), (3b) y (4b) donde el sufijo "b" indica un éster de metilo. Se prefieren los compuestos 2, 2a, 2b, 3a, y 4a de esta invención per se, mientras que los compuestos que se prefieren para la actividad antitumoral incluyen estos compuestos y los compuestos 1, 1a y 1b. Los compuestos de esta invención pueden estar en una forma sustancialmente pura, y pueden estar libres de otras células o materiales de Stolonica socialis.

Los ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (tabletas, pastillas, cápsulas, gránulos, etc.) o líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con una composición adecuada o una administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier portador u otros compuestos farmacológicamente activos. Se puede necesitar que estas composiciones sean estériles cuando se administren parenteralmente.

La administración de los compuestos o las composiciones de la presente invención puede ser mediante cualquier método adecuado, tal como una infusión intravenosa, preparaciones orales, y administración intraperitoneal e intravenosa. Preferimos que se usen tiempos de infusión de hasta 24 horas, más preferiblemente 2-12 horas, siendo 2-6 horas más preferidas. Los tiempos de infusión cortos que permiten que el tratamiento se lleve a cabo sin la permanencia durante una noche en el hospital son especialmente deseables. Sin embargo, la infusión puede ser desde 12 hasta 24 horas o incluso más si se requiere. Se puede llevar a cabo la infusión a intervalos adecuados de 2 hasta 4 semanas. Se pueden liberar las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención mediante encapsulación con liposomas o nanosferas, en formulaciones de liberación controlada o mediante otros métodos de liberación estándar.

La correcta dosificación de los compuestos variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y el situs particular, el huésped y el tumor que se están tratando. Se tendrán en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la condición del huésped, las combinaciones de drogas, las sensibilidades de reacción y la severidad de la enfermedad. Se puede llevar a cabo la administración continuamente o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada.

Se pueden usar los compuestos y las composiciones de esta invención con otras drogas para proporcionar una terapia de combinación. Las otras drogas pueden formar parte de la misma composición, o se pueden proporcionar como una composición separada para la administración al mismo tiempo o a un tiempo diferente.

La identidad de la otra droga no se limita particularmente, y los candidatos adecuados incluyen:

a) drogas con efectos antimitóticos, especialmente aquéllas que tienen como objetivo elementos citoesqueléticos, incluyendo los moduladores de microtúbulos tales como drogas de taxano (tales como el taxol, el paclitaxel, el taxotere, el docetaxel), las podofilotoxinas o los alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina);

b) drogas antimetabolito tales como el 5-fluorouracilo, la citarabina, la gemcitabina, los análogos de la purina (tales como la pentostatina, el metotrexato);

c) agentes alquilantes tales como las mostazas de nitrógeno (tales como la ciclofosfamida o la ifosfamida);

d) drogas que tienen por objetivo el ADN tales como las drogas de la antraciclina como la adriamicina, la doxorubicina, la farmorubicina o la epirubicina;

e) drogas que tienen por objetivo topoisomerasas tales como el etopósido;

f) hormonas y agonistas de hormonas tales como estrógenos, antiestrógenos (tamoxifeno y compuestos relacionados) y andrógenos, la flutamida, la leuprorelina, la goserelina, la ciproterona o la octreotida;

g) drogas que tienen por objetivo la transducción de señales en células tumorales que incluyen derivados de anticuerpos tales como la herceptina;

h) drogas alquilantes tales como las drogas de platino (cis-platino, carbonoplatino, oxaliplatino, paraplatino) o nitrosoureas;

i) drogas que afectan potencialmente la metástasis de tumores tales como los inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz.

j) terapia de genes y agentes antisentido;

k) terapia de anticuerpos;

l) otros compuestos bioactivos de origen marino, notablemente las didemninas tales como la aplidina o las ecteinascidinas tales como Et-743.

m) esteroides análogos, en particular la dexametasona; y

n) drogas anti-inflamatorias, en particular la dexametasona; y

o) drogas anti-eméticas, en particular la dexametasona.

Ensayos antitumorales

Cultivos de Células. Se mantuvieron las células en fase logarítmica de crecimiento en el Medio Esencial Mínimo de Eagle, con las Sales Equilibradas de Earle, con L-glutamina 2,0 mM, con aminoácidos no esenciales, sin bicarbonato sódico (EMEM/neaa); suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% (FCS), bicarbonato sódico 10^{-2} M y penicilina-G 0,1 g/l + sulfato de estreptomicina.

Se ha llevado a cabo un procedimiento de barrido sencillo para determinar y comparar la actividad antitumoral de estos compuestos, usando una forma adaptada del método que describen Bergeron et al (1984). La línea de células tumorales que se usó fue P-388 (cultivo de suspensión de un neoplasma linfoide de ratón DBA/2), A-549 (cultivo monocapa de un carcinoma de pulmón humano), HT-29 (cultivo monocapa de un carcinoma de colon humano) y MEL-28 (cultivo monocapa de un melanoma humano).

Se sembraron las células P-388 en pozos de 16 mm a 1 x 10^{4} células por pozo en alícuotas de 1 ml de MEM 5FCS que contengan la concentración indicada de droga. Se sembró un conjunto separado de cultivos sin droga como un crecimiento de control para asegurar que las células permanecieran en fase exponencial de crecimiento. Se llevaron a cabo todas las determinaciones por duplicado. Después de tres días de incubación a 37ºC, y un 10% de CO_{2} en una atmósfera del 98% de humedad, se determinó una IC_{50} aproximada comparando el crecimiento en los pozos con droga respecto al crecimiento en el control de pozos.

Se sembraron A-549, HT-29 y MEL-28 en pozos de 16 mm a 2 x 10^{4} células por pozo en alícuotas de 1 ml de MEM 10FCS que contengan la concentración indicada de droga. Se sembró un conjunto separado de cultivos sin droga como un crecimiento de control para asegurar que las células permanecieran en fase exponencial de crecimiento. Se llevaron a cabo todas las determinaciones por duplicado. Después de tres días de incubación a 37ºC, y un 10% de CO_{2} en una atmósfera del 98% de humedad, se tiñeron los pozos con violeta de cristal al 0,1%. Se determinó una IC_{50} aproximada comparando el crecimiento en los pozos con droga respecto al crecimiento en el control de pozos.

Raymond J. Bergeron, Paul F. Cavanaugh, Jr., Steven J. Kline. Robert G. Hughes, Jr., Gary T. Elliot y Carl W. Porter. "Antineoplastic and antiherpetic activity of spermidine catecholamide iron chelators". Biochem. Bioph. Res. Comm. 1984, 121 (3), 848-854.

Alan C. Schroeder, Robert G. Hughes, Jr. y Alexander Bloch. "Effects of Acyclic Pyrimidine Nucleoside Analogues". J. Med. Chem. 1981, 24, 1078-1083.

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Datos antitumorales in vitro

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Ejemplos de la invención

El aislamiento guiado mediante bioensayo de los metabolitos del ascidiano Stolonica socialis de la Isla de Tarifa (Cádiz, España) condujo a una serie de peróxidos cíclicos: una mezcla 9:1 del stolonóxido A (1) y del nuevo stolonóxido B (2), una mezcla 6:4 de sus correspondientes sales sódicas (1a, 2a), y una mezcla menor 6:4 de los nuevos stolonóxidos C (3) y D (4) que se aislaron como sus sales sódicas (3a) y (4a). Se establecieron sus estructuras mediante el estudio espectroscópico tanto de las mezclas naturales, cuyos constituyentes difieren en la geometría de un doble enlace, y los correspondientes ésteres de metilo.

Puesto que parte del proyecto de investigación que se llevó a cabo tenía como objetivo examinar el potencial biomédico de nuevos metabolitos de ascidianos de la costa meridional de España, ver (a) Durán, R.; Zubía, E.; Ortega, M.J.; Naranjo, S.; Salvá, J. Tetrahedron 1999, 55, 13225-1-13232; (b) Ortega, M.J.; Zubía, E.; Ocaña, J.M.; Naranjo, S.; Salvá, J. Tetrahedron aceptado para publicación, recogimos especímenes del ascidiano Stolonica socialis (Hartmeyer, 1903) perteneciente a la Familia de Styelidae. Se recogieron especímenes de S. Socialis a mano usando SCUBA alrededor de la Isla de Tarifa (Cádiz, España) y se congelaron inmediatamente.

Se extrajo el material congelado con una mezcla de acetona:metanol (1:1). Después de la evaporación del disolvente se extrajo el residuo acuoso con Et_{2}O para proporcionar un extracto citotóxico frente a las líneas de células tumorales del linfoma de ratón P-388, del carcinoma de pulmón humano A-549 y del carcinoma de colon humano HT-29 (IC_{50}= 5 \mug/ml). La cromatografía en columna del material soluble en Et_{2}O proporcionó seis fracciones de las cuales se seleccionó la fracción E guiándose por la citotoxicidad frente a las líneas de células tumorales que se mencionaron (IC_{50}= 0,05 \mug/ml). Una purificación mayor de esta fracción usando HPLC de fase inversa permitió el aislamiento de tres pares de compuestos: una mezcla 9:1 del stolonóxido A (1) y el stolonóxido B (2), una mezcla 6:4 de sus correspondientes sales sódicas (1a y 2a), y una mezcla 6:4 de las sales sódicas del stolonóxido C y el stolonóxido D (3 y 4). Los componentes individuales de cada uno de estos tres pares de compuestos demostraron que eran inseparables bajo todas las condiciones de HPLC que se ensayaron y por lo tanto fue necesario derivatizar los constituyentes naturales.

Sección experimental

General. Se midieron las rotaciones ópticas en un polarímetro Perkin-Elmer 241. Se registraron los espectros IR y UV en un espectrofotómetro Genesis Series FT IR Mattson y un Philips PU 8710, respectivamente. Se registraron los espectros de RMN de ^{1}H y ^{13}C a 400 y 100 MHz, respectivamente, en un espectrómetro Varian Unity 400 usando CDCl_{3} como disolvente. Se referenciaron los desplazamientos químicos de protón respecto a la señal residual de CDCl_{3} a \delta de 7,26 y se referenciaron los RMN de ^{13}C respecto al pico central de CDCl_{3} a \delta 77,0. Se realizaron ^{1}H-^{1}H-COSY, LR COSY, HMQC y HMBC usando secuencias de pulsos VARIAN estándar. Se pueden intercambiar las asignaciones marcadas con un asterisco. Se registraron los espectros de masas en un espectrómetro Autospec VG. Se llevó a cabo la cromatografía en columna usando gel de sílice Merck 60 (70-230 mesh). Se realizaron las separaciones de HPLC en un aparato LaChrom-Hitachi equipado con columnas LiChrosorb RP-18 y LiChrosorb Si 60 usando un refractómetro diferencial. Todos los disolventes eran de calidad espectral o se destilaron del envase antes del uso.

Procedimientos de Recogida, Extracción, y Aislamiento. Se recogieron los especímenes de Stolonica socialis (76 g de peso en seco) a mano usando SCUBA alrededor de la Isla de Tarifa en mayo de 1996 y se congelaron inmediatamente. Se extrajo el tejido congelado con acetona-metanol (1:1) a temperatura ambiente. Se evaporó la solución filtrada a presión reducida proporcionando un residuo acuoso que se extrajo más secuencialmente con Et_{2}O (4 x 450 ml) y n-BuOH (3 x 500 ml). Se filtró el extracto de Et_{2}O y se concentró para proporcionar 5,7 g de un aceite naranja citotóxico (5,7 g) que se cromatografió sobre una columna de SiO_{2} eluyendo con mezclas de polaridades crecientes desde hexano hasta Et_{2}O y, seguidamente, AcOEt, CHCl_{3}/MeOH (1:1) y MeOH. Se sometieron las fracciones que se seleccionaron a separaciones por HPLC en fase inversa en una columna preparativa LiChrosorb RP-18 eluyendo con MeOH/H_{2}O (9:1) para proporcionar en orden de elución: las sales sódicas del stolonóxido C y D (3 y 4, 17 mg, 0,220% de peso en seco), las sales sódicas del stolonóxido A y B (1a y 2a, 58 mg, 0,076% de peso en seco), el stolonóxido A y el B (1 y 2, 80 mg, 0,105% de peso en seco). Se completó la purificación final mediante HPLC en modo de fase inversa usando mezclas de MeOH/H_{2}O.

TABLA 1 Datos de RMN de ^{1}H registrados en CDCl_{3} para los metabolitos naturales de Stolonica socialis

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TABLA 2 Datos de RMN ^{13}C registrados en CDCl_{3} para los metabolitos naturales de Stolonica socialis

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Stolonóxidos A y B (1 y 2): polvo amorfo; [\alpha]_{D}^{25}-62,90º (c 0,49, CHCl_{3}); IR (film) 3460, 1745, 1237, 1064 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 234 (\varepsilon=20400) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}); ver Tabla 1; RMN ^{13}C (CDCl_{3}) ver Tabla 2; EIMS (70 eV) m/z (rel. int.) 406 (18), 388 (7), 344 (5), 261 (10), 219 (5), 135 (15), 121 (23), 95 (50), 67 (100); HREIMS m/z 406,2734, C_{24}H_{38}O_{5} requiere m/z 406,2719.

Sales sódicas de los stolonóxidos A y B (1a y 2a): polvo amorfo; [\alpha]_{D}^{25}-76,8º (c 0,19, CHCl_{3}); IR (film) 1579, 1435, 1070 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 234 (\varepsilon = 19600) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}); ver Tabla 1; RMN ^{13}C (CDCl_{3}) ver Tabla 2; (-)LREIMS m/z (rel. int.) 405 [M-Na]^{-} (100), (+)LREIMS m/z (rel. int.) 429 [M+H]^{+} (100); 451 [M+Na]^{+} (5); HREIMS m/z 406,2766, C_{24}H_{38}O_{5} requiere m/z 406,2719.

Sales sódicas de los stolonóxidos C y D (3a y 4a): polvo amorfo; [\alpha]_{D}^{25} +38,0º (c 0,2, CHCl_{3}); IR (film) 1584, 1440, 1057 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 234 (\varepsilon = 22500) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}); ver Tabla 1; RMN ^{13}C (CDCl_{3}) ver Tabla 2; (-)LREIMS m/z(rel. int.) 405 [M-Na]^{-} (100), (+)LREIMS m/z (rel. int.) 429 [M+H]^{+} (100); HREIMS m/z 388,2639, C_{24}H_{36}O_{4} requiere m/z 388,2614.

Metilación de la mezcla de stolonóxidos A (1) y B (2): se añadió un exceso de CH_{2}N_{2} sobre una solución de la mezcla del stolonóxido A (1) y B (2) (22 mg) en Et_{2}O (2 ml) a temperatura ambiente. Después de 1 h., se eliminó el disolvente a presión reducida y se sometió el crudo de la reacción a cromatografía HPLC proporcionando el éster metílico del stolonóxido A (1b, 18 mg) y el éster metílico del stolonóxido B (2b, 2 mg).

Metilación de las mezclas 1a, 2a, y 3, 4: se realizó la metilación de estas mezclas usando el mismo procedimiento que se describió arriba pero se acidificaron previamente las mezclas con una solución de HCl 1N.

Éster metílico del stolonóxido A (1b): aceite incoloro; [\alpha]_{D}^{25}-50,8º (c 0,39, CHCl_{3}); IR (film) 1745, 1640, 1200, 1060 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 235 (\varepsilon = 22000) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 6,25 (m, 2H, H-18 y H-19), 5,82 (ddt, J = 16,9, 10,3, 6,6 Hz, 1H, H-23), 5,44 (m, 2H, H-17 y H-20), 5,03 (ddd, J = 16,9, 1,7, 1,6 Hz, 1H, H-24), 4,97 (bd, J = 10,3 Hz, 1H, H-24), 4,54 (dddd, J = 11,1, 7,7, 5,9, 2,2 Hz, 1H, H-3), 4,06 (ddd, J =11,1, 5,4, 2,4 Hz, 1H, H-6), 3,87 (m, 2H, H-7 y H-10), 3,69 (s, 3H, CH_{3}O-), 2,47 (dd, J =15,6, 7,7 Hz, 1H, H-2), 2,36 (dd, J = 15,6, 5,9 Hz, 1H, H-2), 2,28 (bdd, J = 14,7, 7,4, 2H, H-21), 2,15 (m, 2H, H-16), 2,13 (m, 2H, H-22), 1,99 (m, 1H, H-9), 1,95 (m, 1H, H-8), 1,92 (m, 1H, H-4eq), 1,77 (m, 2H, H-5ax y H-8), 1,70 (m, 1H, H-5eq), 1,58 (m, 1H, H-11), 1,54 (m, 1H, H-4ax), 1,42 (m, 1H, H-9), 1,34 (m, 1H, H-11), 1,33 (m, 1H, H-12), 1,30 (m, 6H, H-13, H-14 y H-15), 1,28 (in, 1H, H-12); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) 170,4 (s, C-1); 138,2 (d, C-23); 132,4 (d, C-17); 130,8 (d, C-20); 124,0 (d, C-19); 123,4 (d, C-18); 114,7 (t, C-24); 83,8 (d, C-6); 79,9 (d, C-10); 78,5 (d, C-7); 77,6 (d, C-3); 51,9 (c, CH_{3}O-); 38,4 (t, C-2); 35,6 (t, C-11); 33,7 (t, C-22); 31,7 (t, C-9); 29,6 (t, C-13)*; 29,5 (t, C-14)*; 29,2 (t, C-15)*; 29,1 (t, C-4); 27,7 (t, C-8); 27,5 (t, C-16); 26,8 (t, C-21); 26,0 (t, C-12); 25,2 (t, C-5); EIMS (70 eV) m/z (rel. int.) 420 (2), 402 (18), 261 (25), 219 (7), 159 (15), 143 (36), 135 (29), 121 (41), 67 (100); HREIMS m/z 420,2865, C_{25}H_{40}O_{5} requiere m/z 420,2876.

Éster metílico del stolonóxido B (2b): aceite incoloro; [\alpha]_{D}^{25}-37,7º (c 0,26, CHCl_{3}); IR (film) 1745, 1200, 1090 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 233 (\varepsilon = 19900) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 6,32 (dd, J = 15,1, 11,0 Hz, 1H, H-19), 5,94 (t, J = 11,0 Hz, 1H, H-18), 5,82 (ddt, J = 16,9, 10,3, 6,6 Hz, 1H, H-23), 5,65 (dt, J = 15,1, 6,7 Hz, 1H, H-20), 5,31 (dt, J = 11,0, 7,6 Hz, 1H, H-17), 5,03 (ddd, J = 16,9, 1,6, 1,3 Hz, 1H, H-24), 4,97 (bd, J = 10,3 Hz, 1H, H-24), 4,54 (dddd, J = 11,2, 7,7, 6,0, 2,3 Hz, 1H, H-3), 4,06 (ddd, J = 11,0, 5,6, 2,6 Hz, 1H, H-6), 3,87 (m, 2H, H-7 y H-10), 3,69 (s, 3H, CH_{3}O-), 2,47 (dd, J = 15,6, 7,7 Hz, 1H, H-2), 2,36 (dd, J = 15,6, 6,0 Hz, 1H, H-2), 2,20 (m, 2H, H-21), 2,17 (m, 2H, H-22), 2,14 (m, 2H, H-16), 1,99 (m, 1H, H-9), 1,95 (m, 1H, H-8), 1,92 (m, 1H, H-4eq), 1,77 (m, 2H, H-5ax y H-8), 1,70 (m, 1H, H-5eq), 1,58 (m, 1H, H-11), 1,54 (m, 1H, H-4ax), 1,42 (m, 1H, H-9), 1,34 (m, 1H, H-11), 1,33 (m, 1H, H-12), 1,30 (m, 6H, H-13, H-14 y H-15), 1,28 (m, 1H, H-12); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) 170,4 (s, C-1); 138,2 (d, C-23); 133,5 (d, C-20); 130,5 (d, C-17); 128,4 (d, C-18); 126,1 (d, C-19); 114,7 (t, C-24); 83,8 (d, C-6); 79,9 (d, C-10); 78,5 (d, C-7); 77,6 (d, C-3); 51,2 (q, CH_{3}O-); 38,4 (t, C-2); 35,6 (t, C-11); 33,6 (t, C-22); 32,7 (t, C-9); 32,2 (t, C-21); 29,6 (t, C-13)*; 29,6 (t, C-14)*; 29,2 (t, C-15)*; 29,1 (t, C-4); 27,7 (t, C-8); 27,7 (t, C-16); 26,0 (t, C-12); 25,2 (t, C-5); EIMS (70 eV) m/z (rel. int.) 420 (2), 402 (17), 261 (27), 219 (9), 159 (17), 143 (76), 121 (61), 67 (100); HREIMS m/z 420,2866, C_{25}H_{40}O_{5} requiere m/z 420,2876.

Ésteres metílicos de los stolonóxidos C y D (3a y 4a): aceite incoloro; [\alpha]_{D}^{25}+41,7º (c 0,3, CHCl_{3}); IR (film) 1745, 1200, 1060 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{max} 234 (\varepsilon = 19600) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) ver Tabla 1; RMN ^{13}C (CDCl_{3}) ver Tabla 2; EIMS (70 eV) m/z (rel. int.) 420 (2), 402 (23), 261 (23), 219 (6), 159 (10), 143 (27), 121 (35), 67 (100); HREIMS m/z 420,2863, C_{25}H_{40}O_{5} requiere m/z 420,2876.

3a: RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 6,25 (m, 2H, H-18 y H-19), 5,82 (ddt, J = 17,0, 10,2, 6,6 Hz, 1H, H-23), 5,44 (m, 2H, H-17 y H-20), 5,03 (bd, J = 17,0 Hz, 1H, H-24), 4,97 (bd , J = 10,2 Hz, 1H, H-24), 4,54 (dddd, J = 11,0, 7,7, 5,9, 2,2 Hz, 1H, H-3), 4,03 (ddd, J = 10,9, 6,0, 2,1 Hz, 1H, H-6), 3,86 (m, 1H, H-10), 3,80 (c, J = 6,0 Hz, 1H, H-7), 3,69 (s, 3H, CH_{3}O-), 2,47 (dd, J = 15,6, 7,7 Hz, 1H, H-2), 2,37 (dd, J = 15,7, 5,9 Hz, 1H, H-2), 2,28 (bdd, J = 14,7, 7,4 Hz, 2H, H-21), 2,16 (m, 2H, H-16), 2,14 (m, 2H, H-22), 2,00 (m, 1H, H-8), 1,98 (m, 1H, H-9), 1,94 (m, 1H, H-5eq), 1,92 (m, 1H, H-4eq), 1,80 (m, 1H, H-8), 1,65 (m, 1H, H-5ax), 1,56 (m, 1H, H-11), 1,55 (m, 1H, H-4ax), 1,45 (m, 1H, H-9), 1,38 (m, 1H, H-12), 1,37 (m, 1H, H-11), 1,28 (m, 1H, H-12), 1,30-1,20 (m, 6H, H-13, H-14 y H-15); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) 170,4 (s, C-1); 138,2 (d, C-23); 132,4 (d, C-17); 130,9 (d, C-20); 124,0 (d, C-19); 123,5 (d, C-18); 114,8 (t, C-24); 83,7 (d, C-6); 79,9 (d, C-10); 78,5 (d, C-7); 77,8 (d, C-3); 51,9 (c, CH_{3}O-); 38,4 (t, C-2); 35,6 (t, C-11); 33,7 (t, C-22); 31,6 (t, C-9); 29,6 (t, C-13)*; 29,5 (t, C-14)*; 29,2 (t, C-15)*; 28,9 (t, C-4); 28,0 (t, C-8); 27,5 (t, C-16); 26,9 (t, C-21); 26,1 (t, C-12); 25,7 (t, C-5).

4a: RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 6,32 (m, 1H, H-19), 5,94 (t ancho, J = 10,9 Hz, 1H, H-18), 5,82 (ddt, J = 17,0, 10,2, 6,6 Hz, 1H, H-23), 5,66 (dt, J = 14,4, 6,4 Hz, 1H, H-20), 5,30 (dt, J = 10,9, 7,3 Hz, 1H, H-17), 5,03 (d ancho, J = 17,0, Hz, 1H, H-24), 4,97 (d ancho, J = 10,2 Hz, 1H, H-24), 4,54 (dddd, J = 11,0, 7,7, 5,8, 2,2 Hz, 1H, H-3), 4,03 (ddd, J = 10,9, 6,0, 2,1 Hz, 1H, H-6), 3,86 (m, 1H, H-10), 3,80 (c, J = 6,0 Hz, 1H, H-7), 3,69 (s, 3H, CH_{3}O-), 2,47 (dd, J = 15,7, 7,7 Hz, 1H, H-2), 2,37 (dd, J = 15,7, 5,8 Hz, 1H, H-2), 2,19 (m, 2H, H-21), 2,14 (m, 2H, H-22), 2,13 (m, 2H, H-16), 2,00 (m, 1H, H-8), 1,98 (m, 1H, H-9), 1,94 (m, 1H, H-5ec), 1,92 (m, 1H, H-4ec), 1,80 (m, 1H, H-8), 1,65 (m, 1H, H-5ax), 1,56 (m, 1H, H-11), 1,55 (m, 1H, H-4ax), 1,45 (m, 1H, H-9), 1,38 (m, 1H, H-12), 1,37 (m, 1H, H-11), 1,28 (m, 1H, H-12), 1,30-1,20 (m, 6H, H-13, H-14 y H-15); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) 170,4 (s, C-1); 138,2 (d, C-23); 133,5 (d, C-20); 130,4 (d, C-17); 128,5 (d, C-18); 126,0 (d, C-19); 114,8 (t, C-24); 83,7 (d, C-6); 79,9 (d, C-10); 78,5 (d, C-7); 77,8 (d, C-3); 51,9 (c, CH_{3}O-); 38,4 (t, C-2); 35,6 (t, C-11); 33,6 (t, C-22); 32,2 (t, C-21); 31,6 (t, C-9); 29,6 (t, C-13)*; 29,5 (t, C-14)*; 29,2 (t, C-15)*; 28,9 (t, C-4); 28,0 (t, C-8); 27,7 (t, C-16); 26,1 (t, C-12); 25,7 (t, C-5).

Los datos espectroscópicos de la mezcla de los stolonóxidos A (1) y B (2), en particular las absorciones de IR a 3460 cm^{-1} y 1745 cm^{-1} y el singulete de RMN ^{13}C a \delta 175,1 sugirió la presencia de dos ácidos carboxílicos. Además, la duplicación que se observó en el espectro de RMN ^{13}C de las señales atribuible a cuatro metinos olefínicos y dos metilenos alílicos, con una intensidad relativa de 9:1, indicó que los compuestos 1 y 2 tan sólo diferían en su estructura olefínica. El tratamiento de esta mezcla con diazometano proporcionó los ésteres metílicos 1b y 2b, que se pudieron aislar después de repetidas separaciones por HPLC.

La determinación de masa de alta resolución de FAB indicó que el éster de metilo mayoritario 1b tenía la fórmula molecular C_{15}H_{40}O_{5}, lo que implica seis grados de insaturación. Se confirmó la presencia del grupo éster de metilo mediante el singulete de RMN ^{1}H a \delta 3,69 (s, 3H) y las señales de RMN ^{13}C a 170,4 (s) y 51,9 (c). El espectro de RMN ^{13}C contenía seis señales de carbono olefínico a \delta 138,2 (d), 132,4 (d), 130,8 (d), 124,0 (d), 123,4 (d), y 114,7 (t) atribuibles a un doble enlace monosustituido y dos dobles enlaces disustituidos. Además, los cuatro dobletes de carbonos metínicos que llevan oxígeno a \delta 83,8 (d), 79,9 (d), 78,5 (d), y 77,6 (d) junto con la ausencia de más señales de carbonilo, metino, o carbono cuaternario en el espectro de RMN ^{13}C, indicaron que 1b era el éster de metilo de un ácido C_{24} que contiene tres dobles enlaces y dos anillos oxigenados, lo que dió lugar a los cuatro metinos que llevan oxígeno, y se tuvo en cuenta para los dos grados de insaturación restantes.

Se ha sugerido la estereoquímica absoluta del stolonóxido A (1) como 3S, 6S, 7S, 10R mediante la aplicación del método de Mosher sobre el diol C-3, C-6 que se obtuvo a través de la apertura del anillo de peróxido mediante hidrogenación catalítica. Para evitar los resultados aparentemente confusos que surgían de los ésteres dobles de MTPA nosotros utilizamos el auxiliar quiral de Mosher pero en el derivado monohidróxido. Este trabajo confirma inequívocamente una estereoquímica absoluta 3S, 6S, 7S, 10R para el stolonóxido A (1).

Se aisló el éster de metilo minoritario 2b, que se obtuvo mediante metilación de la mezcla natural de 1 y 2, como un aceite incoloro de fórmula molecular C_{25}H_{40}O_{5}, tal como indicó la determinación de masa de alta resolución. Una inspección general del RMN ^{1}H y ^{13}C tanto del isómero 1b como del 2b, estableció claramente que se relacionaban estrechamente sus estructuras y que compartieron el mismo esqueleto de carbono y las funcionalidades. Sin embargo, se observaron ligeras diferencias en las señales correspondientes a los dobles enlaces conjugados disustituidos. Así, el espectro de RMN ^{13}C mostró las señales de los carbonos olefínicos a \delta 130,5 (d), 128,4 (d), 126,1 (d), y 133,5 (d) que se correlacionaron en el espectro de HMQC con las señales de protón a \delta 5,31 (1H, dt, J = 11,0 y 7,6 Hz), 5,94 (1H, t, J = 11,0 Hz), 6,32 (1H, dd, J = 15,1 y 11,0 Hz), y 5,65 (1H, dt, J = 15,1 y 6,7 Hz), respectivamente. Las constantes de acoplamiento que se observaron son consistentes con una geometría diferente para cada uno de los dos dobles enlaces conjugados. Desde que se correlacionó la señal del protón trans del doble enlace a \delta 5,65 en el espectro COSY con una señal de protón metilénico alílico a \delta 2,20 (2H, m), que estaba además acoplada con la señal a \delta 2,17 (2H, m) debida al metileno alílico respecto al doble enlace terminal, se debe situar el doble enlace trans en C-19, C-20. Los desplazamientos de RMN ^{13}C de los carbonos metilénicos alílicos C-21 y C-16 a \delta 32,2 (t) y 27,7 (t), respectivamente, proporcionaron la confirmación para la geometría propuesta para los dobles enlaces C-17, C-18 y C-19, C-20. Se caracterizó la estructura del éster de metilo como 2b y se propuso por lo tanto la estructura 2 para el stolonóxido B. En ausencia de una determinación independiente de la estereoquímica absoluta de 2 se asumió con un fundamento biogenético una configuración idéntica de los centros estereogénicos C-3, C-6, C-7, y C-10 como aquélla que se determinó para el stolonóxido A (1).

Es digno de mención que la determinación de la estructura de los ésteres 1b y 2b ayudó a la asignación de los datos de RMN de la mezcla natural de los stolonóxidos A (1) y B (2) respecto a cada uno de los compuestos individuales.

La separación cuidadosa en HPLC de fase inversa permitió el aislamiento de una mezcla de las sales de carboxilato sódico 1a y 2a. La inspección de los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C, aunque indicaron claramente que se relacionaban sus estructuras estrechamente con aquéllas de los stolonóxidos A (1) y B (2), mostraron algunas diferencias de diagnóstico. Así, se desplazaron a campos bajos en el espectro de RMN ^{13}C las resonancias atribuidas a C-1, al metileno C-2, y al metino peróxido C-3 a \delta 177,1 (s), 41,3 (t) y 79,2 (d), respectivamente, respecto a las resonancias que se observaron en los compuestos 1 y 2. Por otra parte, se desplazaron a campos altos en el espectro de RMN ^{1}H las señales de los protones del metileno H-2 y del protón del metano H-3 a \delta 2,26 (2H, m) y 4,45 (1H, m), respectivamente, respecto a aquéllas que se observaron en 1 y 2. Se pueden explicar estos efectos mediante la presencia en 1a y 2a de un grupo carboxilato en C-1 en vez del grupo carboxílico correspondiente, ver Kalinowski, H.O.; Berger, S.; Braun, S. Carbo-13 NMR Spectroscopy John Wiley and Sons, New York, 1988, págs. 198-213, de acuerdo con la absorción a 1579 cm^{-1} en el espectro de IR. El tratamiento de la mezcla con HCl y, seguidamente, con diazometano proporcionó una mezcla de los ésteres de metilo 1b y 2b indicando que 1a y 2a eran sales de carboxilato de 1 y 2, respectivamente. Puesto que el ESIMS de la mezcla de 1a y 2a mostró un ión [M-Na]^{-} a m/z 405 en el modo negativo y los iones [M+H]^{+} y [M+Na]^{+}
a m/z 429 y 451 en el modo positivo, se concluyó que los compuestos 1b y 2b que se aislaron de S. socialis fueron las correspondientes sales de carboxilato sódicas de los stolonóxidos A (1) y B (2).

El componente más polar de los constituyentes de S. socialis fue una mezcla menor 6:4 del stolonóxido C y el D aislados como sus correspondientes sales sódicas (3 y 4). La absorción IR de 3 y 4 a 1584 cm^{-1}, característica de una sal de carboxilato, junto con los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C sugirió que los constituyentes tenían que ser bastante similares a aquéllos presentes en la mezcla de los carboxilatos sódicos de los stolonóxidos A y B (1a y 2a). El ión [M+H]^{+} de ESIMS en el modo positivo a m/z 429 era consistente con una fórmula molecular C_{24}H_{37}O_{5}Na. El tratamiento de la mezcla de 3 y 4 con HCl y seguidamente con diazometano proporcionó los correspondientes ésteres de metilo 3b y 4b que desafortunadamente no se pudieron separar por HPLC bajo diferentes condiciones. Sin embargo, se pudo deducir la estructura de los ésteres de metilo mediante el estudio espectroscópico de la mezcla. Así pues, la fórmula molecular C_{25}H_{37}O_{5}, que se obtuvo de la determinación de masa de alta resolución, indicó que los ésteres de metilo 3b y 4b eran isómeros de los ésteres de metilo de los stolonóxidos A y B (1b, 2b). Además, la comparación de los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C indicó que compartían una estructura en el plano idéntica y que las diferencias estructurales se debían deber a una estereoquímica diferente.

Se estableció la estereoquímica relativa en los centros estereogénicos C-3, C-6, C-7, y C-10 como sigue. Se dedujo la orientación axial de H-3 mediante la observación de una constante de acoplamiento de 11,0 Hz entre las señales H-3 y H-4ax y las correlaciones exhibidas en el espectro de ROESY entre la señal H-3 y las señales H-4eq y H-5ax mientras que la orientación axial de H-6 estaba clara a partir de la observación de una constante de acoplamiento de 10,9 Hz entre las señales H-5ax y H-6 y mediante los picos cruzados que se observaron en el espectro de ROESY entre las señales H-6 y las señales H-5eq y H-4ax. Además, el análisis de las correlaciones que se observaron en el espectro ROESY de las señales H-7 y H-10 con aquéllas de los protones metilénicos a C-8 y C-9 requeriría claramente que H-7 y H-10 se orientaran hacia las caras opuestas del anillo de tetrahidrofurano. Sin embargo, no se pudo establecer inequívocamente la relación estereoquímica entre ambos anillos oxigenados mediante el estudio de RMN de los ésteres de metilo 3b y 4b. Se dedujo esta asignación estereoquímica mediante un estudio cuidadoso de la mezcla inseparable de los epóxidos 6 y 7 que surgió del tratamiento de la mezcla de los ésteres de metilo 3b y 4b con NaOH y seguidamente con diazometano. Básicamente los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C de 6 y 7 eran bastante similares a aquéllos del epóxido 5 que se discutieron arriba excepto por la señal de RMN ^{1}H del H-6 a \delta 3,79 (1H, m) y el doblete de RMN ^{13}C de C-6 a \delta 71,3. Estos desplazamientos químicos se ajustan mejor a una orientación erythro de los sustituyentes alrededor de los centros estereogénicos C-6 y C-7 más que la orientación alternativa threo presente en el epóxido 5, ver Alai, F.Q.; Liu, X.X.; McLaughlin, J.L. J. Nat. Prod. 1999, 62, 504-540. Se propuso basándose en este resultado la estereoquímica relativa 3S*, 6S*, 7R*, 10S* para las sales sódicas de los stolonóxidos C y D (3a y 4a).

Claims (3)

1. El uso de un compuesto de tipo stolonóxido de la fórmula:

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o un derivado suyo, que es una sal farmacéuticamente aceptable, un éster o una amida, en la preparación de una composición farmacéutica para un método para tratar un mamífero afectado por cáncer.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto stolonóxido es un stolonóxido A, B, C o D de la fórmula respectiva:

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donde R es un H, o un derivado de uno de estos compuestos.

3. Un compuesto tipo stolonóxido, donde el compuesto es un stolonóxido B, C o D de las fórmulas:

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donde R es un H para el compuesto stolonóxido de origen, o un derivado suyo que es una sal farmacéuticamente aceptable, un éster o una amida.