ES2234579T3 - 2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales. - Google Patents

2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales.

Info

Publication number
ES2234579T3
ES2234579T3 ES00913872T ES00913872T ES2234579T3 ES 2234579 T3 ES2234579 T3 ES 2234579T3 ES 00913872 T ES00913872 T ES 00913872T ES 00913872 T ES00913872 T ES 00913872T ES 2234579 T3 ES2234579 T3 ES 2234579T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amino
compounds
sub
virus
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00913872T
Other languages
English (en)
Inventor
Jiri Zemlicka
Yao-Ling Qiu
John C. Drach
Roger G. Ptak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wayne State University
University of Michigan
Original Assignee
Wayne State University
University of Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wayne State University, University of Michigan filed Critical Wayne State University
Application granted granted Critical
Publication of ES2234579T3 publication Critical patent/ES2234579T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/52—Two oxygen atoms
    • C07D239/54—Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Compuesto que tiene la fórmula o la fórmula en la que B se selecciona del grupo que consiste en 2- amino-6-azidopurina, R1, R2 son grupos alquilo o arilo, X es O y R1X y R2X también pueden ser restos de aminoácidos con X como NH; y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a compuestos novedosos de purina y pirimidina que presentan actividad antiviral y a métodos para prepararlos y usarlos.
Antecedentes de la invención
Los virus son a causa etiológica de muchas enfermedades humanas potencialmente mortales. Son de especial importancia los virus herpes, tales como herpes simple 1 (VHS-1), herpes simple 2 (VHS-2), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB), virus varicela-zóster (VVZ) y virus herpes humano 6 (VHH 6), que se asocian con muchas enfermedades virales comunes. Las infecciones por VHS-1 y VHS-2 se caracterizan por herpes en la piel, boca o región genital. Tras la infección primaria, el virus se refugia en las células neurológicas y puede reaparecer posteriormente en la vida de un paciente. La infección por CMV humano (CMVH) es una dolencia de por vida que puede dar como resultado morbilidad y mortalidad. Estas patologías incluyen microcefalia, hepatoesplenomegalia, ictericia, encefalitis, infecciones de los bebés recién nacidos o fetos en el útero e infecciones de huéspedes inmunodeprimidos. La infección por CMVH es responsable de retinitis, gastritis y neumonitis en pacientes con SIDA y las neumonías o hepatitis inducidas por CMVH son complicaciones graves y frecuentes de los trasplantes de médula ósea. El VEB produce mononucleosis infecciosa y se considera como el agente etiológico de cáncer nasofaríngeo, linfoma inmunoblástico, linfoma de Burkitt y leucoplasia vellosa. El VVZ produce varicela y "culebrilla". Aunque en los niños la varicela no suele ser una enfermedad mortal, la forma recurrente de esta infección, "culebrilla", puede conducir en un estadio avanzado a parálisis, convulsiones y finalmente a la muerte. De nuevo, en los pacientes inmunodeprimidos la infección por VVZ es una complicación grave. El virus herpes humano 6 (VHH 6) que se asocia frecuentemente con exantema en niños también se identificó en pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y puede ser un cofactor en la patogenia de SIDA en huéspedes infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Levine, A. J., Viruses, cap. 4, W. H. Freeman & Co., Nueva York, págs. 67-85 (1992); Human Herpesvirus Infections, Raven Press, Nueva York (1986).
El VIH es la causa subyacente de SIDA, una epidemia mundial con consecuencias mortales. Según la Organización Mundial de la Salud, se registraron más de 4,5 millones de casos de SIDA a finales de 1994 y 19,5 millones de personas se habían infectado por el VIH. Se calcula que para el año 2000, de 30 a 40 millones se habrán infectado por el VIH con 10 millones de casos de SIDA verdadero. Los cálculos de la Global AIDS Policy Coalition (Coalición Global de Políticas sobre SIDA) son considerablemente superiores, hasta 110 millones de infecciones por VIH y 25 millones de casos de SIDA. The Relationship between the Human Immunodeficiency Virus and the Acquired Immunodeficiency Syndrome, The National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades infecciosas), National Institutes of Health (Institutos Nacionales de Salud), Bethesda, Maryland, págs. 1-3 (1995).
Se ha encontrado que varios derivados alquílicos de purinas y pirimidinas y análogos de los mismos presentan actividad antiviral. En particular, aciclovir (Zovirax) y ganciclovir (Cytovene), que pertenecen a este grupo de compuestos, son fármacos aprobados para infecciones causadas por VHS-1, VHS-2, VVZ y CMVH. Acyclovir Therapy for Herpesvirus Infections (Baker, Ed.), M. Dekker, Nueva York (1990); Ganciclovir Therapy for Cytomegalovirus Infection (Spector, S. S., Ed.), M. Dekker, Nueva York (1991). Se ha destinado un esfuerzo considerable al diseño, a la síntesis y a la investigación biológica de análogos de estos fármacos, así como al desarrollo de nuevos agentes antivirales. Larsson, A. et al., Antimicrob. Agents & Chemother. 30:598-605 (1986); Ashton, W. T. et al., J. Med. Chem. 31 :2304-2315 (1988).
Los fármacos actuales para el SIDA incluyen AZT (zidovudina, Retrovir), ddl (didanosina, Videx), ddC (zalcitabina, Hivid) y d4T (estavudina, Zerit). De Clercq, E., J. Med. Chem. 38:2491-2517 (1995). Los análogos alénicos de nucleósidos, tales como adenaleno y citaleno, son ejemplos de agentes anti-VIH que contienen un grupo alquilo insaturado. La patente de los EE.UU. nº 4.935.427; Zemlicka, J., Allenols Derived from Nucleic Acid Bases - a New Class of Anti-HIV Agents: Chemistry and Biological Activity in Nucleosides and Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents (Chu, C. K.; Baker, D. C., Eds.), Plenum Press, Nueva York, págs. 73-100 (1993).
El documento WO 98/30563 da a conocer purinas 2-amino-6-alcoxilo sustituidas como agentes antivirales.
Por tanto, sería deseable proporcionar compuestos novedosos que sean activos frente a virus, incluyendo CMVH, VHS-1, VHS-2, VHH-6, VIH, virus de la hepatitis B (VHB) y otros virus de mamíferos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona 2-hidroximetil-ciclopropilidenmetilderivados novedosos de compuestos heterocíclicos, profármacos y sales de ácidos farmacológicamente aceptables de los mismos. Se ha encontrado que estos compuestos son agentes antivirales útiles y que son eficaces frente a CMVH, VHS-1, VHS-2, VHH-6, VIH, VEB y VHB, así como frente a otros virus de mamíferos.
Los compuestos de la presente invención tienen las siguientes fórmulas:
1
en las que
B es una 2-amino-6-azidopurina.
Los profármacos de los análogos de nucleósidos antivirales de la presente invención incluyen amidatos o ésteres de fosfato lipófilos que pueden atravesar la membrana celular. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el objetivo de los profármacos es proporcionar agentes terapéuticos eficaces para cepas resistentes de virus (McGuigan, C., et al., J. Med. Chem. 36:1048-1052 (1993)) o activar análogos inactivos. Franchetti, P., et al., J. Med. Chem. 37:3534-3541 (1994).
Por tanto, los compuestos de la presente invención también incluyen profármacos de los compuestos novedosos, en los que los profármacos tienen las siguientes fórmulas:
2
en las que
B es un anillo heterocíclico tal como se definió anteriormente para las fórmulas 1 y 2;
X es O; y
R_{1} y R_{2} son alquilo o arilo. El R_{1}X o R_{2}X también puede ser residuos de aminoácidos con X como NH.
Las composiciones útiles para tratar infecciones virales, tales como CMVH, VHS-1, VHS-2, VHH-6, VIH, VEB y VHB contienen una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmulas 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
La presente invención también incluye métodos para sintetizar compuestos de fórmulas 1 y 2, en las que B es una 2-amino-6-azidopurina.
La presente invención también proporciona métodos para sintetizar profármacos de los compuestos tal como se han expuesto en las fórmulas 3 y 4.
La presente invención también proporcionar métodos para sintetizar enantiómeros R y S esencialmente puros enantioméricamente de los compuestos de la presente invención.
Los objetos, las ventajas y características adicionales de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción, tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Las diversas ventajas de la presente invención se harán evidentes para un experto en la técnica con la lectura de la siguiente memoria descriptiva y haciendo referencia a los siguientes dibujos en los que:
La figura 1 muestra la síntesis de 2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas y pirimidinas de purina de fórmulas 1 y 2.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Los compuestos de la presente invención que se ha encontrado que son eficaces frente a virus herpes, virus de la inmunodeficiencia humana y virus de la hepatitis B, son compuestos de fórmulas 1 a 4, en las que B representa una 2-amino-6-azidopurina.
La nomenclatura de los compuestos de la presente invención sigue las convenciones estándar. La numeración del resto de ciclopropilidenmetano unido al anillo B heterocíclico se muestra en las fórmulas 1 y 2. Los anillos de purina y pirimidina se numeran tal como se indica a continuación:
3
Se aprecia que los anillos heterocíclicos que contienen grupos hidroxilo y amino son tautoméricos con los compuestos oxo e imino correspondientes.
Los compuestos preferidos de la presente invención también incluyen los enantiómeros R y S de los compuestos de las fórmulas 1 a 4. Los compuestos descritos por las fórmulas 1 a 4 contienen un átomo de carbono asimétrico marcado en las fórmulas 1 y 2 mediante un asterisco. Los compuestos de la fórmula 1 y 2 de la presente invención son, por tanto, mezclas racémicas de dos enantiómeros ópticos que pueden resolverse mediante métodos convencionales tales como la cromatografía o la cristalización fraccionada de derivados diastereoisoméricos adecuados tales como sales o ésteres con ácidos ópticamente activos (ácido canfor-10-sulfónico, ácido metoxiacético, ácido dibenzoiltartárico, ácido 6-metoxi-2-naftil-2-propanoico, etc.), mediante una síntesis enzimática enantioselectiva de ésteres de un enantiómero tal como acetatos o butiratos o mediante una hidrólisis enzimática enantioselectiva de ésteres de los compuestos de fórmulas 1 y 2, tales como acetatos o butiratos. Las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, lipasas tales como lipasa AK, lipasa P30 o esterasas tales como esterasa de hígado de cerdo. Los compuestos racémicos que contienen un resto de adenina también pueden resolverse mediante la acción de adenosín desaminasa. Alternativamente, los enantiómeros R y S pueden obtenerse mediante métodos sintéticos que utilizan materiales de partida enantioméricamente puros, tal como se describen en los ejemplos 20 a 25.
Los compuestos 3 y 4 derivados de los análogos racémicos 1 y 2 son mezclas de cuatro diastereoisómeros, siempre que R_{1}X no sea igual que R_{2}X.
Las síntesis de los compuestos de la presente invención se resumen en las figuras 1 a 7. Generalmente, pueden usarse cis y trans-2-halógeno-2-halógenometilciclopropano-1-carboxilatos de alquilo como agentes alquilantes adecuados. Previamente, se describieron cis y trans-2-cloro-2-clorometilciclopropano-1-carboxilatos de etilo. Dyakonov, I. A., et al., J. Gen. Chem. URSS (traducción al inglés) 25:1435-1440 (1995). Los cis y trans-2-bromo-2-bromometilciclopropano-1-carboxilatos 6 y 7 más reactivos, que son los reactivos preferidos, se prepararon tal como sigue: adición de diazoacetato de etilo a 2,3-dibromopropeno (5) en presencia de un catalizador adecuado, por ejemplo, tetraacetato de dirrodio (Doyle, M. P., et al., J. Org. Chem. 46:5094-5102 (1981)) y un disolvente orgánico, tal como diclorometano, produjo una mezcla (1,5 : 1) de cis y trans-2-bromo-2-bromometil-ciclopropano-1-carboxilatos de etilo (6 y 7), tal como se describe en la figura 1. La mezcla resultante se utiliza entonces para la alquilación de heterociclos B-H (8, B = resto de purina o pirimidina) en presencia de una base apropiada, por ejemplo, carbonato de potasio o hidruro de sodio en un disolvente orgánico, por ejemplo, N,N-dimetilformamida, para dar una mezcla de cis y trans-1-bromo-2-(carbetoxi)-ciclopropilmetilpurinas o pirimidinas 9 y 10 en la razón de 1,5 : 1, tal como se describe en la figura
2.
Se convirtió una mezcla de bromoésteres 9 y 10 en una mezcla de sin y anti-2-carbetoxiciclopropilidenmetilpurinas 11 y 12 (R = C_{2}H_{5}) usando una base fuerte, por ejemplo, terc-butóxido de potasio en un disolvente apropiado, tal como N,N-dimetilformamida, tal como se muestra en la figura 2.
Alternativamente, la alquilación y eliminación pueden combinarse en una única etapa. Así, la reacción de heterociclo B-H (8, B = purina) con 2-bromo-2-bromometilciclopropano-1-carboxilatos de etilo (6 y 7) se lleva a cabo con carbonato de potasio en N,N-dimetilformamida a una temperatura elevada para dar directamente una mezcla de las sin y anti-2-carbetoxi-ciclopropilidenmetilpurinas 11 y 12 (R = C_{2}H_{5}) deseadas, tal como se muestra en la figura 2. Un tratamiento final de la mezcla de reacción con metanol conduce a la transesterificación para dar los ésteres metílicos 11 y 12 (R = CH_{3}).
La reducción del grupo carboetoxilo o carbometoxilo con un agente reductor adecuado, por ejemplo, hidruro de diisobutilaluminio, y un disolvente orgánico, tal como tetrahidrofurano produce los compuestos de la presente invención, sin y anti-2-hidroximetilciclopropiliden-metilpurinas o pirimidinas 1 y 2, tal como se describe en la figura 2. Después, se separa una mezcla de los compuestos 1 y 2 mediante cristalización o cromatografía en gel de sílice directamente o tras una derivatización adecuada.
Por ejemplo, una mezcla de sin y anti-N^{9}-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)adeninas 1 y 2 (B = adenin-N^{9}-ilo) (no cubiertas por la presente invención) se convierte en los correspondientes derivados de N^{6}-dimetilaminometileno 1 y 2 (B = N^{6}-dimetilaminometilen-adenin-N^{9}-ilo) mediante reacción con N,N-dimetilformamida-dimetilacetal (Zemlicka, J., et al., Collect. Czech. Chem. Commun. 32:3159-3168 (1967)), en un disolvente adecuado, tal como N,N-dimetilformamida, tal como se describe en la figura 3. Los compuestos 1 y 2 (B = N^{6}-dimetilaminometilen-adenin-N^{9}-ilo) se separan entonces mediante cromatografía en gel de sílice y cada isómero se desprotege con amoniaco en metanol para dar los compuestos de la presente invención, sinadenol (1, B = adenin-N^{9}-ilo) e isómero 2 anti (B = adenin-N^{9}-ilo).
Las sin y anti-2-amino-6-cloro-N^{9}-(2-hidroximetilciclo-propilidenmetil)purinas 1 y 2 (B = 2-amino-6-cloropurin-N^{9}-ilo) se separan mediante cromatografía en columna en gel de sílice. Los isómeros sin y anti 1 y 2 (B = 2-amino-6-cloropurin-N^{9}-ilo) se hidrolizan con ácido fórmico al 80% (Harnden, M. R., et al., J. Med. Chem. 33:187-196 (1990)), para dar los compuestos de la presente invención, singuanol (1, B = guanin-N^{9}-ilo) e isómero 2 anti (B = guanin-N^{9}-ilo), tal como se describe en la figura 4.
La amonolisis de la sin-2-amino-6-cloro-N^{9}-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)purina 1 (B = 2-amino-6-cloro-purin-N^{9}-ilo) produce sin-2,6-diamino-N^{9}-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)purina 1 (B = 2,6-diaminopurin-N^{9}-ilo), tal como se muestra en la figura 4.
La reacción de sin-2-amino-6-cloro-N^{9}-(2-hidroximetil-ciclopropilidenmetil)purina 1 (B = 2-amino-6-cloropurin-N^{9}-ilo) con ciclopropilamina da sin-2-amino-6-ciclopropilamino-N^{9}-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)purina 1
(B = 2-amino-6-ciclopropilaminopurin-N^{9}-ilo), tal como se muestra en la figura 4.
La mezcla de sin y anti-N^{1}-(2-hidroximetil-ciclopropilidenmetil)citosinas 1 y 2 (B = citosin-N^{1}-ilo) se somete a benzoilación con un agente de benzoilación adecuado, tal como anhídrido benzoico en un disolvente apropiado, tal como etanol (Otter, B. A., et al., N-Acyl Derivatives of 2'-Deoxycytidine in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Vol. 1, John Wiley & Sons, Nueva York, págs. 285-287 (1967)) para dar sin y anti-(N^{4}-benzoil)-N'-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)citosinas 1 y 2 (B = N^{4}-benzoilcitosin-N^{1}-ilo) que se separan mediante cromatografía en gel de sílice, tal como se describe en la figura 5. Se someten a desbenzoilación a los isómeros separados con amoniaco en metanol para producir sin y anti-N^{1}-(2-hidroximetilciclopropilidenmetil)citosinas 1 y 2 (B = citosin-N^{1}-ilo).
Los profármacos de sin y anti-N^{9}-(2-hidroximetil-ciclopropilidenmetil)adeninas 3 y 4 (B = adenin-N^{9}-ilo) se prepararon mediante la reacción de 1 y 2 (B = adenin-N^{9}-ilo) con metoxialaninilfosforocloridato de fenilo (13) (McGuigan, C., et al., Antiviral Res. 17:311-321 (1992)) usando un catalizador adecuado, por ejemplo N-metilimidazol, en un disolvente orgánico apropiado, tal como tetrahidrofurano y piridina, tal como se describe en las figuras 6 y 7.
Los enantiómeros R y S de los compuestos de fórmulas 1 a 4 pueden sintetizarse utilizando ácidos (R) y (S)-metilenciclopropanocarboxílicos.
Las composiciones dentro del alcance de la invención incluyen aquellas que comprenden un compuesto novedoso de la presente invención en una cantidad eficaz para conseguir un fin pretendido. La determinación de una cantidad eficaz y el fin pretendido está dentro de la experiencia de la técnica. Las dosificaciones preferidas, que son dependientes, por ejemplo, de la gravedad de la infección y de la respuesta individual del paciente al tratamiento, pueden oscilar desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, para dar una concentración sanguínea que oscile desde aproximadamente 0,05 \mug hasta aproximadamente 5 mg por ml de sangre completa.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sales farmacéuticamente aceptables" pretende significar sales de los compuestos de la presente invención con ácidos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, etc. o ácidos orgánicos tales como acético.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden incluir también vehículos adecuados que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el tratamiento de los compuestos activos para dar preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Tales preparaciones, preferiblemente aquellas que pueden administrarse por vía oral, incluyen comprimidos, grageas y cápsulas. Preparaciones preferidas adicionales son aquellas que pueden administrarse por vía rectal, tales como supositorios, así como disoluciones adecuadas para la administración mediante inyección o por vía oral, contienen desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 99%, preferiblemente desde aproximadamente el 25 hasta aproximadamente el 85% del compuesto activo de la presente invención, junto con el excipiente.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican de una manera en sí conocida, por ejemplo, usando los procesos convencionales de mezclado, granulación, preparación de comprimidos, disolución o liofilización. Por tanto, las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse mediante la combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y tratando la mezcla de gránulos, tras la adición de adyuvantes adecuados, si se desea o es necesario, para obtener núcleos de comprimidos o grageas.
Excipientes adecuados son, en particular, sustancias de carga tales como azúcares, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, difosfato de tricalcio o hidrogenofosfato de calcio, así como aglutinantes tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes de disgregación, tales como los almidones anteriormente mencionados y también carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Sobre todo, los adyuvantes son agentes de regulación de flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales como estearato de magnesio o estearato de calcio y/o polietilenglicol. Los núcleos de grageas se dotan con recubrimientos adecuados que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos. Con esta finalidad, pueden usarse disoluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y un disolvente o mezclas de disolventes orgánicos adecuados. Con el fin de producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos, se utilizan disoluciones de preparaciones de celulosa adecuadas, tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de gragea, por ejemplo, para la identificación o con el fin de caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos acti-
vos.
Otras preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras compuestas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas compuestas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden mezclarse con sustancias de carga, tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se disuelven o suspenden preferiblemente en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden usarse estabilizantes.
Las preparaciones farmacéuticas posibles que pueden usarse por vía rectal incluyen, por ejemplo, supositorios que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos parafínicos, polietilenglicoles o alcanoles superiores. También es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base. Los materiales de base posibles incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos parafínicos.
Formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, puede administrarse una suspensión de los compuestos activos como suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes.
Alternativamente, los compuestos activos de la presente invención pueden administrarse en la forma de liposomas, composiciones farmacéuticas en las que el compuesto activo está contenido disperso o presente de manera diversa en corpúsculos que consisten en fases de concentrado acuosas que se adhieren a la capa lipídica hidrófoba. El compuesto activo puede estar presente tanto en la fase acuosa como en la fase lipídica o en el sistema no homogéneo generalmente conocido como una suspensión lipófila.
Se apreciará que los compuestos activos de la presente invención pueden administrarse en combinación con agentes antivirales conocidos, por ejemplo, aciclovir, ganciclovir, zidovudina, AZT, ddl, ddC, 3TC y d4T.
Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los compuestos de la presente invención y los esquemas de síntesis para producir los mismos.
Ejemplo 1 Síntesis de cis y trans-2-bromo-2-bromometilciclopropano-1-carboxilatos de etilo (6 y 7). (Productos intermedios)
Se añadió diazoacetato de etilo (90% en diclorometano, 23,3 ml, 0,20 mol) a una disolución de tetraacetato de dirrodio (22,1 mg, 0,05 mmol) en 2,3-dibromopropeno (5,97%, 68,0 g, 0,34 mol) y CH_{2}Cl_{2} (3 ml) con la ayuda de una bomba de jeringa a una velocidad de 1,1 ml/hora, con agitación a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se destiló a vacío y el destilado se purgó a -78ºC para recuperar 2,3-dibromopropeno sin reaccionar (20 g, 29%). Se añadió agua (100 ml) al residuo aceitoso seguido de una adición en porciones de permanganato de potasio en polvo a 0ºC con agitación. Se consumió un total de 30 g de permanganato. El exceso de permanganato se eliminó mediante la adición de tiosulfato de sodio sólido. Se filtró la mezcla usando una almohadilla de Celite y se lavaron los sólidos con éter (4 x 80 ml) con la ayuda de un sonicador. Se extrajo el filtrado con éter (4 x 70 ml). Se lavaron las porciones de éter combinadas con bicarbonato de sodio acuoso saturado (2 x 100 ml), agua (2 x 250 ml) y salmuera (2 x 100 ml). Tras secado con sulfato de sodio y evaporación del éter, se obtuvo una mezcla de los productos 6 y 7 como un aceite amarillo (51,9 g, 91% de rendimiento), n_{D}^{25} = 1,5131. Era de pureza suficiente como para usarse en las etapas posteriores (ejemplos 2, 4, 6 y 10). El espectro de ^{1}H-RMN indicó una mezcla de isómeros cis y trans 6 y 7 en la razón de 1,5 : 1. La destilación de una muestra de este producto (5,0 g) dio un líquido incoloro (4,5 g), pe 59-64ºC/0,25 mmHg, n_{D}^{25} = 1,5139.
IR (puro): 1733 cm^{-1} (C=O, éster), 1036 y 868 cm^{-1} (anillo de ciclopropano).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta, isómero cis 1,30 (t, 3, CH_{3}), 1,73 (t, 1) y 1,85 (dd, 1, H_{3}), 2,47 (dd, 1 , H_{2}), 3,97 (d, 2, CH_{2}Br), 4,19 (q, 2, OCH_{2}); isómero trans 1,29 (t, 3, CH_{3}), 1,52 (dd, 1) y 1,89 (t, 1, H_{3}), 2,10 (dd, 1, H_{2}), 3,76 (d, 2, CH_{2}Br), 4,21 (q, 2, OCH_{2}).
^{13}C-RMN (CDCl_{3}) ppm, isómero cis 14,14 (CH_{3}), 26,43 (C_{3}), 31,44 (C_{1}), 37,21 (C_{2}), 38,91 (CH_{2}Br), 61,66 (OCH_{2}), 169,32 (C=O); isómero trans 14,30 (CH_{3}), 22,34 (C_{3}), 29,01 (C_{1}), 35,86 (C_{2}), 42,02 (CH_{2}Br), 61,59 (OCH_{2}), 168,12 (C=O).
EM-IE (espectroscopía de masas por impacto electrónico) 288 (M, 0,3), 286 (M, 1,9) y 284 (M, 0,5), 256 (1,6), 258 (2,6) y 260 (1,2), 243 (5,0), 241 (10,2) y 239 (5,3), 211 (7,0), 213 (13,8) y 215 (7,4), 205 (52,2) y 207 (51,0), 177 (96,7) y 179 (94,4), 159 (7,1) y 161 (7,0), 131 (15,2) y 133 (16,8), 97 (30,4), 81 (15,3), 69 (16,3), 53 (70,8), 39 (15,9), 28 (CO, 100,0);
EMAR (espectroscopía de masas de alta resolución):
Calculado para C_{7}H_{10}^{79}Br_{2}O_{2}: M 283,90475. Hallado: M 283,9048.
Calculado para C_{7}H_{10}Br_{2}O_{2}: C, 29,59; H, 3,55; Br, 55,59. Hallado: C, 29,61; H, 3,62; Br, 55,37.
Ejemplo 2 Síntesis de cis-N^{9}-(1-bromo-2-carbetoxiciclopropilmetil)adenina y trans-N^{9}-(1-bromo-2-carbetoxiciclopropilmetil) adenina 9 y 10. (Productos intermedios)
Se añadió una mezcla de dibromoésteres 6 y 7 (858 mg, 3,0 mmol) del ejemplo 1 a una suspensión de la sal sódica de adenina, que se preparó a partir de adenina (405 mg, 3,0 mmol) e hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 120 mg, 3,0 mmol) en N,N-dimetilformamida (25 ml) con agitación, bajo nitrógeno, a temperatura ambiente. La mezcla resultante se calentó hasta 80ºC (temperatura del baño) durante 12 horas. Se evaporó el disolvente a vacío (bomba de aceite), se adsorbió el residuo sobre gel de sílice (3 g) que se puso entonces sobre la parte superior de una columna de gel de sílice (70 g). La elución se realizó con diclorometano-metanol (96 : 4 y 94 : 6), se obtuvieron el isómero cis 9 (305 mg, 29,9% de rendimiento) y el isómero trans 10 (180 mg, 17,6% de rendimiento) como sólidos amarillo pálido. Las muestras analíticas se obtuvieron mediante recristalización en benceno-acetato de etilo (isómero cis 9) y benceno (isómero trans 10).
Isómero cis 9:
Pf 200 - 203ºC
UV (etanol) máx. 260 nm (\varepsilon 14.900), 209 nm (\varepsilon 19.500)
IR (KBr) 3340 y 3150 cm^{-1} (NH_{2}), 1725 cm^{-1} (C=O, éster), 1670, 1600 y 1580 cm^{-1} (anillo de adenina), 1045, 1015 y 867 cm^{-1} (anillo de ciclopropano).
^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}) \delta 1,23 (t, 3, CH_{3}), 1,76 (dd, 1) y 2,00 (t, 1, H_{4\text{'}}), 2,49 (dd, 1, H_{3\text{'}} de ciclopropano), 4,18 (q, 2, OCH_{2}), 4,66 (s, 2, H_{1\text{'}}), 7,24 (s, 2, NH_{2}), 8,10 (s, 2, H_{2} y H_{8} de adenina).
^{13}C-RMN (CD_{3}SOCD_{3}) ppm 13,52 (CH_{3}), 22,25 (C_{4\text{'}}), 28,57 (C3'), 36,28 (C_{2\text{'}}), 46,64 (C_{1\text{'}}), 60,75 (OCH_{2}), 168,82 (C=O); anillo de adenina: 118,10 (C_{5}), 140,46 (C_{8}), 149,20 (C_{4}), 152,03 (C_{2}), 155,49 (C_{6}).
EM-FAB (espectroscopía de masas por bombardeo con átomos rápidos) (matriz de tioglicerol) 341 y 343 (M+2H, 20,3, 18,6), 340 y 342 (M + H, 98,4, 100,0), 262 (8,0), 214 (4,3), 188 (5,9), 136 (25,2).
Calculado para C_{12}H_{14}BrN_{5}O_{2}: C, 42,47; H, 4,16; Br, 23,28; N, 20,65. Hallado: C, 42,24; H, 4,29; Br, 23,15; N, 20,59.
Isómero trans 10:
Pf 186 - 189ºC
UV (etanol) máx. 260 nm (\varepsilon 14.700), 209 nm (\varepsilon 18.700)
IR (KBr) 3350 y 3160 cm^{-1} (NH_{2}), 1745 cm^{-1} (C=O, éster), 1655, 1605 y 1585 cm^{-1} (anillo de adenina), 1045, 1015 y 865 cm^{-1} (anillo de ciclopropano).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta 1,14 (t, 3, CH_{3}), 1,57 (t, 1) y 1,93 (dd, 1, H_{4\text{'}}), 2,64 (dd, 1, H_{3\text{'}}), 4,07 (q, 2, OCH_{2}), 4,52 (d, 2, H_{1\text{'}}), 7,27 (s, 2, NH_{2}), 8,13 y 8,17 (2s, 2, H_{2}y H_{8} de adenina).
^{13}C-RMN (CDCl_{3}) ppm 13,70 (CH_{3}), 19,95 (C_{4\text{'}}), 26,05 (C_{3\text{'}}), 36,99 (C_{2\text{'}}), 51,93 (C_{1\text{'}}), 60,42 (OCH_{2}), 167,63 (C=O); anillo de adenina: 118,01 (C_{5}), 140,30 (C_{8}), 149,23 (C_{4}), 152,14 (C_{2}), 155,55 (C_{6}).
EM-FAB (matriz de tioglicerol) 341 y 343 (M + 2H, 19,0, 18,2), 340 y 342 (M + H, 96,3, 100,0), 262 (32,1), 214 (12,1), 188 (12,5), 136 (78,3).
Calculado para C_{12}H_{14}BrN_{5}O_{2}: C, 42,47; H, 4,16; Br, 23,28; N, 20,65. Hallado: C, 42,60; H, 4,34; Br, 23,14; N, 20,87.
Ejemplo 3 Síntesis de sin-2-amino-6-azido-N^{9}-(2-hidroximetil-ciclopropilidenmetil)purina (1, B = 2-amino-6-azidopurin-N^{9}-ilo)
En un baño de aceite a 107ºC, se calentó una mezcla de compuesto 1 (B = 2-amino-6-cloropurin-N^{9}-ilo, 151 mg, 0,6 mmol) del ejemplo 7 y azida de sodio (117 mg, 1,8 mmol) en N,N-dimetilformamida (10 ml) durante 4 horas. Tras evaporación del disolvente a vacío, se añadió agua (5 ml) al residuo para dar el producto 1 (2-amino-6-azidopurin-N^{9}-ilo) como un sólido blanco (137 mg, 88,4%).
Pf 184-187ºC (desc.)
UV (etanol) máx. 302 nm (\varepsilon 11.450), 281 nm (hombro, \varepsilon 9.830), 229 nm (\varepsilon 30.330)
IR (KBr) 3440, 3310 y 3140 cm^{-1} (NH_{2}y OH), 1640-1680 y 1565 cm^{-1} (olefina y anillo de purina), 1040 y 1020 cm^{-1} (anillo de ciclopropano).
^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}) \delta 1,24 (ddd, 1) y 1,51 (td, 1, H_{4\text{'}}), 2,15 (m, 1H, H_{3\text{'}}), 3,28-3,38 (m, parcialmente solapado con H_{2}O a 3,34, 1) y 3,72 (dt, 1, H_{5\text{'}}), 5,08 (t, 1, OH), 7,32 (d, 1, H_{1\text{'}}),8,47 (s, 2H, 2-NH_{2}), 8,74 (s, 1, H_{8}).
^{13}C-RMN (CD_{3}SOCD_{3}) ppm 6,76 (C_{4\text{'}}), 19,72 (C_{3\text{'}}), 63,13 (C_{5\text{'}}), 110,61 (C_{1\text{'}}), 111,99 (C_{2\text{'}}), 117,45 (C_{5}), 137,41 (C_{8}), 143,63 (C_{4}), 144,42 (C_{2}) y 146,48 (C_{6}).
Calculado para C_{10}H_{10}N_{8}OH_{2}O: C, 43,48; H, 4,38; N, 40,56. Hallado: C, 43,45; H, 4,23; N, 40,48.
Ejemplo 4 Métodos de evaluación antiviral in vitro
Células y virus. Se realizó el crecimiento y paso habituales de células KB en cultivos en monocapa usando medio esencial mínimo (MEM) con sales de Hanks [MEM(H)] o sales de Earle [MEM(E)] complementado con un 10% de suero bovino. Se varió la concentración de bicarbonato de sodio para ajustarse a la capacidad de tamponamiento requerida. Se hicieron crecer cultivos de células MRC-5 o fibroblastos de prepucio humano (HFF) diploides en medio que consiste en MEM(E) con el 10% de suero bovino fetal. Se pasaron las células a diluciones de 1 : 2 a 1 : 10 según procedimientos convencionales usando un 0,05% de tripsina más un 0,02% de EDTA en una solución salina tamponada con HEPES (HBS) (Shipman, C., Jr., Proc. Soc. Exp. Biol. 130:305-310 (1969)), tal como se describió anteriormente. Turk, S. R., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:544-550 (1987). Las células HFF y MRC-5 se pasaron sólo a diluciones 1 : 2. Las células CEM se mantuvieron en un cultivo en suspensión tal como se detalló anteriormente. Kucera, L. S., et al., AIDS Res. Human Retroviruses 9:307-314 (1993).
Procedimientos virológicos. Se preparó CMVH de reserva infectando células HFF a una multiplicidad de infección (m.d.i.) < 0,01 unidades formadores de placa (u.f.p.) por célula. Se cambió el medio de crecimiento celular cada cuatro días hasta que la citopatología era evidente en todas las células (aproximadamente 21 días). Se conservaron los fluidos de sobrenadantes como reserva de virus. Se prepararon reservas de VHS-1 de alto título infectando células KB a una m.d.i. < 0,1 tal como se detalló anteriormente. Turk, S. R., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:544-550 (1987). Se determinaron los títulos virales usando cultivos en monocapa de células HFF para CMVH y cultivos en monocapa de células BSC-1 para VHS-1, tal como se describió anteriormente. Prichard, M. N., et al., J. Virol. Methods 28:101-106 (1990). Brevemente, las células HFF o BSC-1 se cultivaron tal como se describió anteriormente en placas múltiples con 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 3% de CO_{2} y un 97% de aire. Al día siguiente, se inocularon los cultivos con CMVH o VHS-1 y se diluyeron 1 : 3 en serie a través de las once columnas restantes de la placa de 96 pocillos. Se incubaron los cultivos a 37ºC durante 2 horas para permitir la adsorción del virus y después se sustituyó el inóculo de virus por 0,2 ml de nuevo medio. Se incubaron los cultivos durante siete días para CMVH, dos o tres días para VHS-1, se eliminó el medio y se tiñeron las hojas celulares con violeta cristal al 0,1% en metanol al 20%. Se numeraron las placas bajo ampliación de 20 veces en pocillos que tenían la dilución, lo que dio de 5 a 20 placas por pocillos. Se calcularon los títulos virales según la siguiente fórmula: Título (u.f.p./ml) = número de placas x 5 x 3^{n}; en la que n representa la dilución n del virus usado para infectar el pocillo en el que se numeraron las placas.
Ensayos para determinar la actividad antiviral
(a) CMVH. Se ha medido el efecto de los compuestos sobre la replicación de CMVH usando un ensayo de reducción de placas. Se infectaron las células HFF en placas múltiples de 24 pocillos con aproximadamente 100 u.f.p. de CMVH por cm^{2} de hoja celular usando los procedimientos detallados anteriormente. Tras la adsorción de virus, se añadieron los compuestos disueltos en medio de crecimiento para duplicar los pocillos en de tres a seis concentraciones seleccionadas. Tras la incubación a 37ºC durante de 7 a 10 días, se fijaron las hojas celulares, se tiñeron con violeta cristal y se numeraron las placas microscópicas tal como se describió anteriormente. Se calcularon los efectos farmacológicos como un porcentaje de la reducción del número de placas en presencia de cada concentración de fármaco comparado con el número observado en ausencia de fármaco. Se usó ganciclovir (DHPG) como control positivo en todos los experimentos.
También se midió el efecto de los compuestos sobre la replicación de CMVH usando un ensayo de reducción del rendimiento. Se cultivaron las células HFF tal como se describió anteriormente en placas múltiples con 96 pocillos, se incubaron durante la noche, se eliminó el medio y se inocularon los cultivos con CMVH a una m.d.i de 0,5 a 1 u.f.p. por célula tal como se informó en otro momento. Tras la adsorción del virus, se sustituyó el inóculo por 0,2 ml de nuevo medio que contenía los compuestos de prueba. La primera fila de 12 pocillos se dejó inalterada y sirvió como controles de virus. Cada pocillo de la segunda fila recibió 0,1 ml adicionales de medio con el compuesto de prueba a tres veces la concentración final deseada. Se mezclaron los contenidos de los 12 pocillos mediante pipeteado repetido y después se diluyeron 1 : 3 en serie a lo largo de los pocillos restantes. De esta manera, pudieron probarse seis compuestos por duplicado en una única placa con concentraciones de desde 100 \muM hasta 0,14 \muM. Se incubaron las placas a 37ºC durante siete días, se sometieron a un ciclo de congelación y descongelación; se transfirieron alícuotas de cada uno de los ocho pocillos de una columna dada a la primera columna de un cultivo en monocapa nuevo de 96 pocillos de células de HFF. Se mezclaron los contenidos de los 12 pocillos y después se diluyeron 1 : 3 en serie a través de las once columnas restantes de la placa secundaria. Se diluyó cada columna de la placa primaria original a través de una placa separada de esta manera. Se incubaron los cultivos, se numeraron las placas y se calcularon los títulos tal como se describió anteriormente.
(b) VHS-1. Se empleó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar VHS-1. Se cultivaron placas múltiples de 96 pocillos con células BSC-1 a 10.000 células por pocillo, en un volumen total de 200 \mul por pocillo de MEM(E) más 10% de suero bovino. Tras la incubación durante la noche a 37º, se añadió el fármaco y VHS-1 a la tasa de 100 ufp/pocillo. Se bloquearon las placas de ELISA con 200 \mul por pocillo del suero bovino al 10% y Tween al 0,05% en HBS. Tras incubación durante 30 minutos, se aclaró el agente de bloqueo dos veces con HBS-T. Se añadió una dilución 1 : 400 de anticuerpo de conejo anti-VHS-1 conjugado con FA en HBS-F. Se sellaron las placas con papel adhesivo y se incubaron en un agitador tipo "rocker" (oscilante) durante una hora a 37ºC. Se revelaron las placas en la oscuridad con 100 \mul por pocillo de disolución de sustrato que contiene fosfato de p-nitrofenilo. Se leyeron las placas a 492 nm. Se calcularon los efectos farmacológicos como un porcentaje de la reducción del virus en presencia de cada concentración de fármaco comparado con el título obtenido en ausencia del fármaco. Se usó aciclovir como control positivo en todos los experimentos.
(c) VHH-6. En este caso, se realizó el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en placas de amina covalente (Costar, Cambridge, MA). Se activaron las placas mediante la adición de un agente de reticulación homobifuncional, suberato de bis(sulfosuccinimidilo), que se disolvió a 1 mg/ml en 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, pH 7,4) y se añadieron 300 \mul del reticulante a cada pocillo en la placa covalente. El reticulante reaccionó con la función amina sobre la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. El subproducto, N-hidroxisuccinimidasulfito de sodio, se eliminó mediante decantación y lavado de la placa dos veces con PBS. Se solubilizaron muestras que consistían en 150 \mul de células HSB_{2} mixtas suspendidas procedentes de la placa original tratada con fármaco, en un volumen igual de Triton X-100 al 10% en tampón de recubrimiento (Na_{2}HPO_{4} 15 mM, NaHCO_{3} 3,5 mM, pH 9,6). Se cubrió la placa y después se incubó durante 1 hora a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO_{2}. Estas condiciones de unión facilitan la fijación covalente del antígeno al extremo libre del reticulante.
Tras la unión covalente, se decantó la disolución de antígeno y se lavó seis veces la placa con solución salina tamponada con HEPES (Shipman, C., Jr., Proc. Soc. Exp. Biol. 130:305-310 (1969)) con Tween 20 al 0,05% (HBS-T), empapando durante tres minutos para cada lavado. Los sitios no unidos en la placa se bloquearon con 300 \mul por pocillo de leche deshidratada baja en grasa al 2% en PBS (bloqueante) durante 30 minutos a temperatura ambiente, sobre un agitador. Se decantó el bloqueante y se añadieron 50 \mul del anticuerpo monoclonal primario diluido, específico para la glucoproteína gp116 de VHH-6 (GS). La disolución de anticuerpo consistía en anticuerpo diluido 1 : 400 en volúmenes iguales de bloqueante y Triton X-100 al 10% en tampón de recubrimiento. La presencia de tanto el bloqueante como el detergente en las disoluciones de anticuerpo fue necesaria para reducir la señal de fondo. Después se cubrió la placa y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se lavó de nuevo la placa, tal como se describió anteriormente, después se añadió de nuevo el bloqueante, como antes. A continuación, cada pocillo recibió 100 \mul de una disolución del anticuerpo secundario, anticuerpo de conejo anti-ratón marcado con peroxidasa del rábano, diluido a 1 :
400 (como antes). Se incubó la placa durante 1 hora a 37ºC. La placa se lavó de nuevo tal como se describió anteriormente y se reveló usando 100 \mul/pocillo de Turbo TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción con 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 2 M. Se determinó la absorbancia en cada pocillo a 450 /
570 nm.
(d) VIH-1. Se empleó la transcriptasa inversa (TI) como un marcador para VIH-1. Este ensayó midió la presencia de VIH en sobrenadantes de células CEM infectadas con la cepa III_{B} de VIH-1 mediante la cantidad de actividad de TI. Se hicieron crecer las células, se infectaron e incubaron en presencia de siete concentraciones (diluciones a la mitad en log_{10}), empezando a 1 o 100 \muM de compuestos que debían someterse a ensayo. Los procedimientos y el ensayo con TI se llevaron a cabo tal como se detalló anteriormente. Kucera, L. S., et al., AIDS Res. Human Retroviruses 9:307-314 (1993); White, E. L., et al., Antiviral Res. 16:257-266 (1991).
Ensayos de citotoxicidad. Se usaron dos ensayos diferentes para explorar la citotoxicidad de compuestos seleccionados tal como se ha detallado anteriormente. (i) Se determinó la citotoxicidad producida en células HFF estacionarias y en células CEM en crecimiento mediante examen microscópico de las células usadas en placa y ensayos de TI que no se habían afectado por el virus. Turk, S. R., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:544-550 (1987). (ii) Se determinó el efecto de los compuestos durante dos duplicaciones de población de células KB mediante tinción con violeta cristal y cuantificación espectrofotométrica del colorante eluido de las células teñidas. Prichard, M. N., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 35:1060-1065 (1991).
Análisis de los datos. Se construyeron las relaciones dosis-respuesta mediante regresión lineal de la inhibición porcentual de parámetros derivados de las secciones anteriores frente a concentraciones logarítmicas de fármaco. Se calculó la concentración inhibitoria del cincuenta por ciento (CI_{50}) a partir de las líneas de regresión. Se usaron muestras que contenían los controles positivos (aciclovir para VHS-1, ganciclovir para CMVH y tiosemicarbazona de 2-acetilpiridina para la citotoxicidad) en todos los ensayos.
Actividad antiviral
4
Citotoxicidad
5

Claims (10)

1. Compuesto que tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
o la fórmula
7
en la que B se selecciona del grupo que consiste en 2-amino-6-azidopurina, R_{1}, R_{2} son grupos alquilo o arilo, X es O y R_{1}X y R_{2}X también pueden ser restos de aminoácidos con X como NH; y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Compuesto que tiene la fórmula
8
o la fórmula:
9
en la que B se selecciona del grupo compuesto por 2-amino-6-azidopurina, R_{1}, R_{2} son grupos alquilo o arilo, X es O y R_{1}X y R_{2}X también pueden ser restos de aminoácidos con X como NH; y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en sin-2-amino-6-azido-N^{9}-(2-hidroxi-metilciclopropilidenmetil)purina y sales farmacéuticamente aceptables del mismo y profármacos fosforilados del mismo.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el que el compuesto es el enantiómero R o S.
5. Composición que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo farmacéutico aceptable.
6. Uso de un compuesto antiviral seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y combinaciones de los mismos para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un mamífero infectado por un virus.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho mamífero es un ser humano.
8. Uso según las reivindicación 6 ó 7, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en virus herpes humano, virus de inmunodeficiencia humana y virus de la hepatitis B.
9. Uso de una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que debe administrarse un compuesto antiviral adicional.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el compuesto antiviral adicional se selecciona del grupo que consiste en aciclovir, ganciclovir, zidovudina, AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T y combinaciones de los mismos.
ES00913872T 1999-03-12 2000-03-10 2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales. Expired - Lifetime ES2234579T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US267839 1999-03-12
US09/267,839 US6352991B1 (en) 1997-01-08 1999-03-12 2-hydroxymethylcyclopropylidenemethylpurines and -pyrimidines as antiviral agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2234579T3 true ES2234579T3 (es) 2005-07-01

Family

ID=23020343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00913872T Expired - Lifetime ES2234579T3 (es) 1999-03-12 2000-03-10 2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales.

Country Status (10)

Country Link
US (4) US6352991B1 (es)
EP (1) EP1165560B1 (es)
JP (1) JP2002539125A (es)
AT (1) ATE282617T1 (es)
CA (1) CA2366624C (es)
DE (1) DE60015945T2 (es)
DK (1) DK1165560T3 (es)
ES (1) ES2234579T3 (es)
PT (1) PT1165560E (es)
WO (1) WO2000053603A1 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6352991B1 (en) * 1997-01-08 2002-03-05 Wayne State University 2-hydroxymethylcyclopropylidenemethylpurines and -pyrimidines as antiviral agents
EP1490015B1 (en) 2002-03-15 2009-09-23 Wayne State University Novel 2-amino-9-((2-hydroxymethyl) cyclopropylidenemethyl) purines as antiviral agents
ES2370114T3 (es) * 2002-03-15 2011-12-12 Wayne State University 2,2-bis-(hidroximetil)ciclopropilidenmetil-purinas y pirimidinas como agentes antivirales.
UA79293C2 (en) * 2002-07-03 2007-06-11 Univ Wayne State 4-(7'-halo-2-quino (xa-) linyloxy)phenoxy propionic acid derivatives as antineoplastic agents
US20070167353A1 (en) * 2003-10-24 2007-07-19 John Hilfinger Prodrug composition
CA2602097A1 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Process for producing carbapenem derivatives having 1-alkylpyrrolidine structure
NZ566793A (en) * 2005-08-24 2010-03-26 Eisai R&D Man Co Ltd Novel pyridine derivative and pyrimidine derivative
US7473683B2 (en) 2005-09-14 2009-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nonpolar thymidine analogs
ES2375284T3 (es) * 2006-08-23 2012-02-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Sal de un derivado de fenoxipiridina, o cristal de la misma, y procedimiento de producción de la misma.
JP2009132660A (ja) * 2007-11-30 2009-06-18 Eisai R & D Management Co Ltd 食道癌治療用組成物
US20090227556A1 (en) * 2008-01-31 2009-09-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Receptor tyrosine kinase inhibitors comprising pyridine and pyrimidine derivatives
US20100311972A1 (en) * 2008-02-18 2010-12-09 Mitsuo Nagai Method for producing phenoxypyridine derivative
WO2011022712A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Epiphany Biosciences, Inc. Method of treating infectious mononucleosis with acylic nucleoside derivatives
CN104892709B (zh) * 2015-06-04 2018-01-19 新乡学院 一种合成奈拉滨的方法
CN112105624B (zh) * 2018-03-09 2023-09-22 美迪维尔公司 使用(2,2-双羟甲基)亚甲基环丙烷核苷酸治疗癌症
CN108314655B (zh) * 2018-03-29 2021-01-15 河南师范大学 一种铑催化不对称环丙化合成三元碳环嘧啶核苷类似物的方法
CN113185514A (zh) * 2021-03-11 2021-07-30 杨锦飞 一种抗乙型肝炎病毒药物的合成方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62116582A (ja) * 1985-09-24 1987-05-28 ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト ６−および９−位が置換された２−アミノプリン
US4935427A (en) 1987-12-31 1990-06-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pyrimidine and purine 1,2-butadiene-4-ols as anti-retroviral agents
WO1998030563A1 (en) * 1997-01-08 1998-07-16 The Regents Of The University Of Michigan 2-hydroxymethylcyclopropyli- denemethylpurines and -pyrimidines as antiviral agents
US6352991B1 (en) * 1997-01-08 2002-03-05 Wayne State University 2-hydroxymethylcyclopropylidenemethylpurines and -pyrimidines as antiviral agents

Also Published As

Publication number Publication date
US20020193353A1 (en) 2002-12-19
DE60015945T2 (de) 2005-11-03
US6352991B1 (en) 2002-03-05
US6958345B2 (en) 2005-10-25
EP1165560A4 (en) 2002-04-17
JP2002539125A (ja) 2002-11-19
DK1165560T3 (da) 2005-03-14
PT1165560E (pt) 2005-04-29
DE60015945D1 (en) 2004-12-23
CA2366624A1 (en) 2000-09-14
EP1165560B1 (en) 2004-11-17
US20060122203A1 (en) 2006-06-08
US6790841B2 (en) 2004-09-14
CA2366624C (en) 2007-06-12
WO2000053603A9 (en) 2002-05-10
US20050009842A1 (en) 2005-01-13
ATE282617T1 (de) 2004-12-15
WO2000053603A1 (en) 2000-09-14
EP1165560A1 (en) 2002-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2234579T3 (es) 2-hidroximetilciclopropilidenmetilpurinas como agentes antivirales.
US9174990B2 (en) 2-amino-9-[(2-hydroxymethyl) cyclopropylidenemethyl] purines as antiviral agents
ES2392840T3 (es) Análogos de nucleótido para el tratamiento de infecciones virales
US5686611A (en) Nucleoside analogs
US8232275B2 (en) 2,2-bis-(hydroxymethyl)cyclopropylidenemethyl-purines and -pyrimidines as antiviral agents
US9023857B2 (en) Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
WO1998030563A1 (en) 2-hydroxymethylcyclopropyli- denemethylpurines and -pyrimidines as antiviral agents
Chen et al. Boronic acid derivatives targeting HIV-1
EP0294069A2 (en) Purine compounds, process for their preparation, intermediates and pharmaceutical compositions
Boumchita et al. New cyclobutyl analogs of nucleosides. Part 2. Synthesis and antiviral evaluation of 2-amino-7-[3, 3-bis (hydroxymethyl) cyclobut-1-yl]-3H, 7H-pyrrolo-[2, 3-d] pyrimidin-4-one and of cyclobutyl analogs of the pyrimidine nucleosides
WO1993017035A1 (en) 2&#39;ISODIDEOXY-β-D-NUCLEOSIDES AS STABLE ANTIVIRAL AGENTS