ES2233421T3

ES2233421T3 - Metodos de deteccion de diferencias que utilizan colorantes multiples emparejados.

Info

Publication number: ES2233421T3
Application number: ES00952693T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Minden; Alan Waggoner; Susan Janet Fowler
Original assignee: Amersham Biosciences UK Ltd; Carnegie Mellon University
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd; Carnegie Mellon University
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-08-09
Also published as: WO2001011373A3; ATE283486T1; JP2003506718A; US6426190B1; JP4589587B2; CA2381506C; US20020177122A1; US7566544B2; US20040161780A1; AU2005200632A1; WO2001011373A2; CA2381506A1; AU778065B2; AU6534500A; US7598047B2; DE60016233D1; WO2001011373A8; EP1200833B1; EP1200833A1; DE60016233T2

Abstract

Método para comparar composiciones de proteína entre al menos dos muestras celulares diferentes que comprende: (a) preparar un extracto de proteínas de cada una de dichas al menos dos muestras celulares; (b) proporcionar un conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes elegidos entre colorantes capaces de unirse covalentemente a proteínas en dicho extracto de proteínas, donde cada colorante de dicho conjunto (1) tiene una carga neta que mantendrá la carga neta global de las proteínas durante dicha unión covalente y tiene características iónicas y de pH donde la migración relativa de una proteína marcada con cualquiera de dichos colorantes es la misma que la migración relativa de dicha proteína marcada con otro colorante de dicho conjunto, (2) emite luz luminiscente a una longitud de onda que es suficientemente diferente de la luz luminiscente emitida por los demás colorantes de dicho conjunto para proporcionar diferentes señales luminosas detectables; (c) hacer reaccionar cada extractode proteínas de la etapa (a) con un colorante diferente de dicho conjunto de la etapa (b) para proporcionar proteínas marcadas con colorante; (d) mezclar cada una de dichas proteínas marcadas con colorante para formar una sola mezcla o diferentes proteínas marcadas con colorante; (e) separar las proteínas marcadas con colorante de interés en dicha mezcla; y (f) detectar la diferencia de intensidad luminiscente entre las diferentes proteínas marcadas con colorante de interés por detección luminiscente.

Description

Métodos de detección de diferencias que utilizan colorantes múltiples emparejados.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para detectar diferencias en composiciones de proteína, incluyendo proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales, y más particularmente, a un proceso que utiliza un par coincidente de reactivos de marcado para detectar dichas diferencias.

Los investigadores que estudian diversos aspectos de la biología celular usan diversas herramientas para detectar y controlar las diferencias en la estructura, función y desarrollo celular. Una parte esencial del estudio de células es estudiar las diferencias y similitudes en la composición de proteína entre los diferentes tipos de células, etapas de desarrollo y estado. La determinación de las diferencias en el contenido de proteína entre células normales y cancerosas o de tipo silvestre y células mutantes, por ejemplo, puede ser una fuente valiosa de información y una valiosa herramienta de diagnóstico.

Las mezclas de proteínas pueden separarse en sus componentes individuales por diversos medios, incluyendo electroforesis y cromatografía. Puede conseguirse la separación de acuerdo con diferencias de masa realizando la electroforesis en un gel de poliacrilamida en condiciones de desnaturalización. Las electroforesis en gel monodimensional y bidimensional se han convertido en herramientas estándar para estudiar proteínas. La electroforesis monodimensional en SDS (dodecil sulfato sódico) a través de un gel cilíndrico o en placa solo pone de manifiesto las proteínas principales presentes en una muestra ensayada. La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D PAGE), que separa proteínas por concentración isoeléctrica, es decir, por carga en una dimensión y por tamaño en la segunda dimensión, es el método de separación más sensible y proporcionará resolución de la mayoría de las proteínas en una muestra.

Las proteínas migran en geles mono- o bi-dimensionales en forma de bandas o manchas, respectivamente. Las diferentes proteínas se visualizan mediante diversos métodos; por tinción con una proteína colorante específica, por precipitación de proteína mediada por plata, por detección autoradiográfica de una proteína marcada radiactivamente, y por unión covalente de compuestos fluorescentes. Hasta ahora, el último método solo ha podido realizarse después de la etapa de concentración isoeléctrica de 2D PAGE. Inmediatamente después de la electroforesis, los patrones del gel resultantes pueden visualizarse a simple vista, fotográficamente o por captura electrónica de imágenes, por ejemplo, usando un dispositivo enfriado de carga acoplada (CCD).

Para comparar muestras de proteínas de diferentes fuentes, tales como diferentes células o diferentes etapas de desarrollo celular por métodos convencionales, cada muestra diferente se desarrolla actualmente en diferentes carriles de un gel monodimensional o dos geles bidimensionales diferentes. La comparación es por examen visual o formación electrónica de imágenes, por ejemplo, por análisis de imágenes asistido por ordenador de geles mono o bibidimensionales digitalizados.

Los investigadores usan frecuentemente la electroforesis bidimensional. O'Farrell, P. H., "High resolución two-dimensional electroforesis of proteins", Journal of Biological Chemistry, 250: 4007-4021 (1975), separaron proteínas de acuerdo con sus puntos isoeléctricos respectivos en la primera dimensión por la ahora bien conocida técnica de concentración isoeléctrica y por peso molecular en la segunda dimensión por electroforesis en SDS discontinua. Garrels, J. I., "Two-dimensional Gel Electroforesis and Computer Analysis of the Proteins Synthesized By Clonal Cell Lines", Journal of Biological Chemistry, Vol. 254, No. 16,7961-7977 (1979), usaron un sistema de electroforesis de gel bidimensional para estudiar el patrón de síntesis de proteína en células nerviosas y células gliales. Garrels realizó un análisis comparativo de datos entre múltiples muestras para correlacionar la presencia de proteínas particulares con funciones específicas. Se usó un equipo de exploración computerizado para explorar una sección del fluorograma de gel, detectar las manchas e integrar sus densidades. La información se almacenó y se trazó de acuerdo con la intensidad en cada una de las varias exploraciones diferentes.

Urwin, V. E. y Jackson, P., "A multiple High-resolución Mini Two-dimensional Polyacrilamida Gel Electroforesis System: Imaging Two-dimensional Gels Using A Cooled Charge-Coupled Device After Staining With Silver Or Labeling With Fluorofore", Analytical Biochemistry 195: 30-37 (1991) describe una técnica donde se usaron diversos geles de concentración isoeléctrica (IEF) para separar proteínas por carga, después se cargaron en una placa de gel de gradiente de manera que los geles IEF se coloraron de un extremo a otro en la parte superior de la placa de gel. Después los geles se sometieron a electroforesis. Las manchas de proteína resultante se visualizaron por tinción de la placa de gel bidimensional con plata o por marcado fluorescente después de la etapa de concentración isoeléctrica. El marcado debe tener lugar después de la primera electroforesis, es decir, de la concentración isoeléctrica porque la presencia de la marca de fluoresceína sobre la proteína cambia el punto isoeléctrico de la proteína cuando se somete a electroforesis. Además, la etiqueta se une a un azufre en la proteína formando un enlace inestable que tendería a romperse durante la concentración isoeléctrica si la etiqueta su une antes de la etapa de electroforesis. Un artículo de Santaren, J. et al., "Identification of Drosophila Wing Imaginal Disc Las proteínas by Two-Dimensional Gel Analysis and Microsequencing", Experimental Cell Research 206: 220-226 (1993), describe el uso de electroforesis de gel bidimensional de alta resolución para identificar proteínas en Drosophila melanogaster. El gel seco se expuso a una película de rayos X durante cinco días. La película de rayos X se analiza por ordenador para determinar las diferencias en las muestras.

La electroforesis en gel bidimensional ha sido una herramienta poderosa para resolver mezclas complejas de proteínas. Sin embargo, las diferencias entre las proteínas pueden ser sutiles. Las imperfecciones en el gel pueden interferir con las observaciones precisas. Para minimizar las imperfecciones, los geles proporcionados en sistemas de electroforesis disponibles en el mercado se preparan con gran precisión. Incluso con controles meticulosos, no hay dos geles idénticos. Los geles pueden diferir entre sí en los gradientes de pH o en uniformidad. Además, las condiciones de electroforesis de un desarrollo al siguiente pueden ser diferentes. Se han desarrollado programas de ordenador para alineación automatizada de geles diferentes. Sin embargo, todos los paquetes de programas se basan en la expansión o contracción lineal de una o ambas dimensiones de los geles bidimensionales. El programa no puede ajustarse a las distorsiones locales en los geles.

En la publicación internacional número WO 96/33406 se describe un método para superar las dificultades anteriores (solicitud internacional número PCT/US96/05435) que describe un método para detectar diferencias en dos o más muestras de proteínas. Los extractos de proteínas se preparan, por ejemplo, a partir de un grupo diferente de muestras celulares que se quiere comparar. Cada extracto de proteína se marca con un colorante diferente de un conjunto coincidente de colorantes luminiscentes. Los colorantes coincidentes generalmente tienen las mismas características iónicas y de pH aunque emiten luz a diferentes longitudes de onda para mostrar un color diferente tras la detección luminiscente. Los extractos de proteína marcados se mezclan conjuntamente, se separan conjuntamente por electroforesis y las proteínas marcadas se detectan por detección luminiscente.

Las muestras de proteína pueden separarse también por técnicas electroforéticas o cromatográficas alternativas. Dichas técnicas son capaces de separar proteínas o péptidos con alta resolución particularmente en combinaciones ortogonales. Sin embargo, los sistemas cromatográficos actuales tienden a tener menor poder de resolución que los sistemas electroforéticos, es decir, el número de proteínas o péptidos que pueden separarse es menor. Pueden encontrarse trazas típicas de elución en los catálogos de los fabricantes, por ejemplo, el catálogo "BioDirectory'99" de Amersham Pharmacia Biotech en "Chromatography columns and media" empezando en la página 502. No obstante, los sistemas cromatográficos tienen ciertas ventajas sobre la electroforesis para algunas aplicaciones. Por ejemplo, a menudo son más fáciles de automatizar y normalmente es más fácil obtener muestras de las proteínas después de la separación.

Por estas razones, es interesante la separación mediante sistemas cromatográficos, por ejemplo, para perfilar el proteoma. Por ejemplo, Opiteck y colaboradores han publicado ejemplos de sistemas cromatográficos bi-dimensionales donde las fracciones eluidas de un sistema de separación cromatográfica se aplican a un segundo sistema cromatográfico. (Véase específicamente, Opiteck, Lewis y Jorgenson, Anal. Chem, vol. 69, 1518, (1997) que describe el uso de un sistema de intercambio de cationes en combinación con un sistema cromatográfico de fase inversa, y Opiteck et al., Anal Biochem., vol. 258, 349, (1998), que describe el uso de cromatografía de exclusión por tamaño en combinación con cromatografía de fase inversa). El poder de resolución particularmente bajo de la cromatografía de exclusión por tamaño se mitiga en el último documento usando 8 columnas de exclusión por tamaño en serie antes de fraccionar adicionalmente el eluyente por cromatografía de fase inversa. Para este sistema se estimó un poder de resolución teórico de 800 proteínas. El poder de resolución limitado de ciertos sistemas cromatográficos y electroforéticos puede superarse también en la etapa de análisis. La espectrometría de masas se está usando cada vez más para la identificación de proteínas después de la separación cromatográfica o electroforética y puede usarse como método de separación basado en la masa. Por ejemplo, Jensen et al., Anal. Chem. Vol. 71, 2076, (1999) describen el uso de la concentración isoeléctrica capilar como método de separación y después el uso de espectrometría de masas con resonancia ciclotrónica de iones por ionización por pulverización con transformada de Fourier para separar adicionalmente las proteínas en el eluyente del sistema de concentración isoeléctrica, así como para proporcionar un medio de identificación.

El objeto de la presente invención es eliminar los problemas asociados con distorsiones en el gel o variabilidad en la columna y proporcionar un método simple, relativamente rápido y fiable para comparar y contrastar el contenido de proteína de diferentes muestras.

Breve sumario de la invención

Los objetos anteriores se han conseguido mediante el proceso de la presente invención donde se detectan diferencias, si las hubiera, entre múltiples muestras de proteínas, por ejemplo, las extraídas de diferentes células u obtenidas de otras fuentes, marcando cada muestra de dichas proteínas con un colorante luminiscente coincidente diferente de un conjunto de los mismos. Las proteínas, como se usa en este documento, incluyen proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales y porciones de las mismas, incluyendo péptidos. Los colorantes coincidentes generalmente tienen las mismas características iónicas y de pH pero absorben y/o fluorescen la luz a diferentes longitudes de onda, produciendo una fluorescencia de diferente color. Además, los colorantes deberían tener un tamaño similar. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de enlaces covalentes entre el colorante y uno o más sitios de unión en las proteínas, las muestras marcadas se mezclan conjuntamente y las proteínas se separan en un solo proceso de separación. La separación puede ser por electroforesis o por métodos cromatográficos. Cuando la separación es por electroforesis en un solo gel, las proteínas comunes a cada muestra co-migran a la misma posición. De manera similar, cuando la separación es por medios cromatográficos en una columna, por ejemplo, las proteínas comunes a cada muestra migran a la misma posición. Las proteínas que son diferentes migrarán solas hasta localizaciones diferentes en el gel o en momentos diferentes desde la columna y fluorescerán diferentes colores, identificándose de esta manera que muestra inicial tiene una o más proteínas que difieren de otra muestra o muestras iniciales.

La invención incluye también un kit para realizar el método de la presente invención. El kit incluye el conjunto de de colorantes coincidentes, y puede incluir también materiales para separar las proteínas. Opcionalmente, pueden proporcionarse materiales de interrupción para detener la reacción entre la proteína y el colorante cuando sea necesario. Estos materiales pueden comprender, por ejemplo, geles de electroforesis o columnas cromatográficas.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático del proceso de la presente invención.

Las Figuras 2a) y 2b) son imágenes de proteínas marcadas con un par de etiquetas coincidentes preferidas de la presente invención desarrolladas en un solo gel de poliacrilamida SDS.

Las Figuras 3 a)-d) son imágenes de porciones de un gel bidimensional cargado con dos muestras diferentes de extracto bacteriano, una inducida con IPTG y la otra no inducida, marcadas con un colorante diferente del par de colorantes coincidentes de acuerdo con el proceso de la presente invención.

Las Figuras 4 a)-d) son imágenes de porciones de un gel bidimensional cargado con dos muestras diferentes de extracto bacteriano, una que tiene anhidrasa carbónica añadida de manera exógena y una sin anhidrasa carbónica, marcada cada una con un colorante diferente del par de colorantes coincidentes de acuerdo con el proceso de la presente invención.

Las Figuras 5a) y b) son imágenes de proteínas marcadas con Cy2-NHS e hidrazida Cy3 desarrolladas en SDS-PAGE, demostrando que los colorantes de hidrazida marcan específicamente la porción carbohidrato de la glicoproteína.

Las Figuras 6a) y b) son imágenes de mezclas de proteínas marcadas con hidrazida Cy3 y Cy5 en SDS-PAGE.

Las Figuras 7a) y b) son imágenes de una sección de un gel 2DE cargado con un extracto de células HBL100 marcadas con hidrazida Cy3 y un extracto de células BT474 marcadas con hidrazida Cy5.

Las Figuras 8a) y b) son imágenes de un gel 2DE cargado con un extracto de células BT474 marcadas con hidrazida Cy3 sin proteína añadida de manera exógena y un extracto de células BT474 marcadas con hidrazida Cy5 con proteína añadida de manera exógena.

La Figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de intercambio iónico de albúmina de suero bovina marcada con Cy3 (BSA; 33 \mug) y transferían marcada con Cy5 (33 \mug).

La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de intercambio iónico de mioglobina, transferían y albúmina de suero bovina marcada con Cy5 (13 \mug de cada proteína).

La Figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de fase inversa de ribonucleasa a, citocromo c, holo-transferrina y apomioglobina marcadas con Cy5 (3,3 \mug de cada proteína).

La Figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño trioglobulina, apoferritina, IgG y \beta-lactoglobulina marcadas con Cy3 (23,5 \mug de cada proteína).

La Figura 13 es un gráfico que muestra los resultados del análisis diferencial de proteínas mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando muestras marcadas con Cy3 o Cy5. Las proteínas marcadas con Cy3 son trioglobulina (38 \mug), apoferritina (28 \mug), IgG (2,6 \mug), y \beta-lactoglobulina (12 \mug). La muestra marcada con Cy5 no contiene IgG. Las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 se mezclaron antes de la cromatografía.

La Figura 14 es un gráfico que muestra los resultados del análisis diferencial mediante cromatografía de intercambio iónico de muestras marcadas con Cy3 o Cy5. La muestra marcada con Cy3 contenía transferrina y la muestra marcada con Cy5 contenía transferrina y albúmina de suero bovina (13 \mug de cada proteína). Las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 se mezclaron antes de la cromatografía.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

El proceso de la presente invención emplea un conjunto coincidente de colorantes donde cada colorante del conjunto generalmente es igual a los otros colorantes en características iónicas y de pH, y reactividad química para la unión covalente a proteínas, fluoresce a una longitud de onda diferente, mostrando de esta manera una luminiscencia de color diferente cuando se observa. Los colorantes preferiblemente son aproximadamente iguales en peso molecular, aunque no necesariamente. Cada uno de los colorantes dentro del conjunto coincidente de colorantes se usa para marcar proteínas en una diferente de un conjunto de diferentes muestras de proteínas de manera que cada muestra se marca con un colorante diferente del conjunto de colorantes. Después del marcado, las proteínas se mezclan y se separan en el mismo medio por cualquier técnica de separación adecuada conocida, tal como electroforesis o cromatografía. Las técnicas electroforéticas incluyen electroforesis mono- o bi-dimensional, electroforesis capilar de zona, electroforesis capilar en gel, concentración isoeléctrica, isotacoforesis, y cromatografía electrocinética micelar. Las técnicas cromatográficas incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de intercambio iónico.

Haciendo referencia al diagrama esquemático de la Figura 1, se prepara un primer extracto de proteínas por técnicas conocidas a partir de un primer grupo de células, después se marcan con el primer colorante de un par coincidente de colorantes. Se prepara un segundo extracto de proteínas por técnicas conocidas a partir de un segundo grupo de células, después se marcan con el segundo colorante del par coincidente de colorantes. Para marcar la proteína, se incuban la forma reactiva del colorante y la proteína durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un enlace covalente entre la forma reactiva del colorante y los sitios potenciales de unión o enlace en las proteínas. El periodo de tiempo generalmente de de 15 a 30 minutos, dependiendo de la temperatura. El intervalo de temperatura generalmente es de aproximadamente 0ºC a 25ºC. La reacción entre el colorante y las proteínas puede interrumpirse después de que un porcentaje suficiente de sitios de unión disponibles en la molécula de proteína se unan covalentemente al colorante. Puede usarse cualquier material de interrupción conocido adecuado. Pueden usarse también otros métodos para retirar el exceso de colorante, tales como filtración en gel. En las situaciones en las que se permita completarse la reacción de marcado, por ejemplo cuando se ha usado todo el colorante reactivo, puede que no sea necesaria la interrupción o retirada del exceso de colorante.

El primer y segundo grupo de células puede ser cualquiera dos conjuntos de células cuyo contenido de proteína quiere compararse o contrastarse. Por ejemplo, el primer grupo de células pueden ser células de tipo silvestre, o normales, y el segundo grupo de células pueden ser células mutantes de la misma especie. Como alternativa, el primer grupo de células pueden ser células normales y el segundo grupo pueden ser células cancerosas del mismo individuo. También pueden usarse células del mismo individuo a diferentes etapas de desarrollo o fases diferentes del ciclo celular. Las células de un embrión en desarrollo, de la arruga ventral de Drosophila melanogaster, por ejemplo, pueden recogerse como primer grupo de células y las células que se desarrollan adyacentes a las células de la arruga ventral pueden recogerse como segundo grupo de células. Las diferencias en la composición de proteína entre células del mismo tipo de diferentes especies también puede ser objeto de estudio por el proceso de la presente invención. Además, el proceso de la presente invención puede usarse para controlar como responden las células a diversos estímulos o fármacos. Todos los casos que pueden alterar el comportamiento celular expresado como cambios en la proteína pueden detectarse sin necesidad ni gasto de los sistemas 2D PAGE de alta precisión. Los especialistas en la técnica reconocerán que las proteínas para comparación pueden derivarse también de fluidos biológicos, tales como suero, orina, o fluido cefalorraquídeo.

Las muestras marcadas se mezclan y, como se ilustra en la Figura 1, se aplican en alícuotas medidas a un gel, después preferiblemente se someten a 2D PAGE. Puede usarse electroforesis mono-dimensional en SDS en lugar de 2D PAGE. Los procedimientos para desarrollar la electroforesis mono-dimensional y bi-dimensional son bien conocidos para los especialistas en la técnica.

Las proteínas que los dos grupos de células tienen en común forman manchas coincidentes. La proporción de la intensidad fluorescente entre proteínas idénticas de cualquier grupo será constante para la gran mayoría de proteínas. Las proteínas que los dos grupos no tienen en común migrarán independientemente. Por lo tanto, una proteína que es única o de concentración relativa diferente para un grupo tendrá diferentes proporciones de intensidad de fluorescencia de la de la mayoría de manchas de proteína, y producirá un color específico para un extracto de proteína o para el otro, dependiendo de la marca usada. Por ejemplo, las proteínas que están en la primera muestra pueden marcarse de rojo, mientras que el segundo grupo se marca de azul. En condiciones en las que se mezclan conjuntamente cantidades exactamente iguales de proteína de cada grupo y se desarrollan en el mismo gel la proporción de intensidad de fluorescencia será una para la mayoría de proteínas. Aquellas proteínas que son distintas a un grupo o al otro tendrán una proporción de intensidad de fluorescencia menor de o mayor de uno, dependiendo del orden o proporción.

El gel puede analizarse mediante un escáner de fluorescencia de dos longitudes de onda, mediante un microscopio de fluorescencia o mediante cualquier medio conocido para detectar fluorescencia. El análisis del gel puede estar completamente automatizado mediante identificación asistida por ordenador de las diferencias de las proteínas. Usando un sistema de detección electrónico tal como un sistema de exploración por láser con un tubo fotomultiplicador o una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) y una fuente de luz blanca, se crean dos imágenes electrónicas del gel húmedo usando diferentes conjuntos de filtro conocidos para acomodar las diferentes características espectrales de las marcas. Una imagen visiona la fluorescencia del primer colorante usando un primer filtro apropiado para filtrar toda la luz excepto la emitida a la longitud de onda del primer colorante y la otra imagen visiona la fluorescencia del segundo colorante usando un segundo filtro, apropiado para filtrar toda la luz excepto la emitida a la longitud de onda del segundo colorante. La exposición es de aproximadamente 5 a 500 segundos. Las diferencias en las muestras pueden identificarse, tanto durante la electroforesis o como en menos de 1/2 hora después de la electroforesis. Hay disponibles en el Mercado varios paquetes de programas que restarán la primera imagen de la segunda para identificar las manchas que son diferentes, o, como alternativa, las imágenes pueden dividirse para dejar solo las manchas no comunes a ambas imágenes. Cuando se restan las imágenes, las manchas se cancelarán entre sí, dejando solo aquellas que son diferentes. En el análisis de proporciones, las manchas similares proporcionarán un valor de uno. Las diferencias darán como resultado valores mayores que uno o menores que uno.

En el análisis convencional, se desarrolla un control con proteínas conocidas para el tipo de célula a estudiar. Las manchas conocidas en el gel de muestra deben identificarse y marcarse, y compararse con el control y el segundo gel para determinar las diferencias entre los dos geles. En la presente invención, solo hay un gel, por lo que no es necesario marcarlo. Además, el programa usado en procesos convencionales para alinear los diferentes geles antes de comparar y contrastar las diferencias entre proteína no corrige las distorsiones e inconsistencias locales entre dos o más geles. El proceso de la presente invención elimina la necesidad de dicha corrección porque las proteínas marcadas para todas las muestras a ensayar se mezclan y se separan conjuntamente. Cualquier distorsión en un gel de electroforesis, por ejemplo, se experimenta por igual en cada muestra.

La selección y síntesis del conjunto coincidente de colorantes es importante. En el proceso de la presente invención, los colorantes fluorescentes se acoplan covalentemente a las proteínas, preferiblemente a través de los restos de lisina de las proteínas, aunque el acoplamiento puede ser también a los grupos sulfhidrilo o ácido carboxílico en las proteínas. Para proteínas modificadas, los colorantes pueden acoplarse a los grupos modificadores; por ejemplo los colorantes pueden acoplarse al resto azúcar de las glicoproteínas después de la oxidación de las mismas al aldehído. La regulación del pH de las proteínas para forzar la unión de las marcas a un resto aminoacídico para excluir los otros aminoácidos es una técnica bien conocida, como se expone en R. Baker, Organic Chemistry of Biological Components, (Prentice Hall, pub. 1971). Para el análisis de proteínas, se marca una pluralidad de sitios de unión. El porcentaje óptimo de sitios de unión marcados dependerá de los colorantes y los grupos funcionales diana elegidos. Cuando se usan los colorantes preferidos específicamente analizados a continuación en este documento para marcar lisinas, preferiblemente no se marca más del 2% de los sitios de unión y más preferiblemente, ligeramente menos del 1%, para evitar hacer insoluble a la proteína. Por lo tanto, cuando una proteína típica está compuesta por aproximadamente un 7% de lisinas, habrá menos de un aminoácido modificado por cada mil. Una proteína típica está compuesta por aproximadamente 450 aminoácidos. Una estrategia alternativa es marcar todos los grupos funcionales de un tipo particular que está menos extendido en la proteína, por ejemplo los grupos sulfhidrilo en cisteínas. Cuando el sitio de unión es lisina, la unión covalente destruye la carga positiva de la amina primaria de la lisina. Como la concentración isoeléctrica depende de la carga, es importante compensar la pérdida de carga. Un resto básico permanecerá básico. Puede tolerarse un cambio de pKa de un resto por proteína como mucho de 3, con la condición de que no se altere la basicidad o acidez del resto modificado, según el caso. Los colorantes tales como rodamina y fluoresceína no son adecuados por la diferencia de carga.

Los especialistas en la técnica reconocerán que los enfoques de marcado descritos podrían aplicarse igualmente bien a moléculas peptídicas derivadas de células o presentes en fluidos biológicos tales como plasma, suero, orina, fluido ascítico o fluido cefalorraquídeo. Además, durante la preparación de una muestra de proteína para marcarla, en ciertas circunstancias, es beneficioso realizar primero una digestión enzimática con tripsina u otras enzimas proteasas para generar péptidos antes del marcado y separación.

Como alternativa, es posible dirigir grupos específicos de proteínas, tales como proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales, para comparar diferencias en las modificaciones post-traduccionales y otras diferencias que aparecen en proteínas entre dos o más muestras.

Un ejemplo de dichas proteínas son las glicoproteínas. En los últimos años, se ha dado gran importancia al significado funcional de los carbohidratos en las proteínas. Ahora se sabe que los carbohidratos están implicados muchos procesos celulares y enfermedades. Para marcar los grupos carbohidratos terminales de glicoproteínas es posible oxidar en primer lugar los azúcares terminales a aldehídos, seguido de la reacción con un hapteno o un grupo reactivo que lleva flúor tal como una hidrazida, como se describe en Wilchek, M y Bayer, E. A.,"Methods in Enzymology" vol. 138, 429-442 (1987).

Más específicamente esto implicaría: preparar un extracto de dos o más muestras de proteína, incubando cada una de dichas muestras de proteína en presencia de peryodato durante un corto periodo para oxidar dioles vecinales en los azúcares terminales a grupos aldehído. El exceso de peryodato se eliminaría después añadiendo bisulfito, antes de marcar con un colorante fluorescente adecuado de un conjunto coincidente. Como alternativa, es posible marcar específicamente restos de ácido siálico por oxidación de sus carbonos exocíclicos usando una menor concentración de peryodato, típicamente 1 mM y usando una temperatura de 0ºC. También es posible tratar la muestra de proteína con galactosa oxidasa para generar un grupo aldehído sobre los restos galactosa terminales para formar un derivado aldehído C-6, que puede hacerse reaccionar con un flúor adecuado. La reacción del colorante y el carbohidrato puede interrumpirse añadiendo el material adecuado antes de mezclas conjuntamente las muestras y someterlas a un método de separación adecuado.

Los colorantes fluorescentes que pueden usarse para el marcado de glicoproteínas incluyen aquellos colorantes que tienen derivados de hidrazina tales como hidrazidas, semicarbazidas y carbohidrazidas o derivados de amina como grupos reactivos. Para mantener la carga global de la glicoproteína, los colorantes adecuados son aquellos que llevan una carga global neutra. Una carga global neutra puede obtenerse añadiendo engarces cargados adecuadamente a la molécula de colorante para producir la carga global deseada. Los colorantes adecuados incluirían derivados de cianina neutros, derivados de BODLPY® u otros derivados fluorescentes disponibles como conjuntos de colorante coincidente como se describe en este documento y que poseen una carga global neutra.

El método de la presente invención puede aplicarse también a fosfoproteínas que pueden marcarse específicamente con fluoróforos. Las fosfoproteínas realizan papeles biológicos importantes, incluyendo señalización celular, y están implicadas en numerosos mecanismos reguladores. Los grupos fosfato en proteínas pueden marcarse específicamente, por ejemplo, mediante el procedimiento describe en Giese y Wang, Patente de Estados Unidos Nº 5.512.486, que se incorpora a este documento como referencia, usando derivados fluorescentes o de hapteno imidazol. Los reactivos de marcado que llevan grupos imidazol se añaden a las muestras de proteína en presencia de una carbodiimida adecuada para realizar el marcado.

Más específicamente el método implica preparar un extracto de dos o más muestras de proteína, incubar cada una de dichas muestras de proteína con una carbodiimida soluble en agua adecuada, más un derivado de imidazol fluorescente de un conjunto de colorante coincidente. Aunque la carbodiimida activará los carboxilos de cadena lateral así como los fosfatos, el enlace con los grupos carboxilo es inestable cuando el pH se sube a aproximadamente 8. El exceso de material reactivo puede retirarse añadiendo un material de interrupción conocido adecuado. Después se mezclan las muestras y se separan por un procedimiento de separación conocido.

Para mantener la carga global en la fosfoproteína, los derivados de imidazol fluorescentes adecuados llevarían una carga global negativa. Esta carga global negativa podría obtenerse añadiendo un engarce cargado adecuadamente a la molécula de colorante. Los ejemplos de colorantes que pueden usarse incluyen, colorantes de cianina que llevan una carga global negativa, derivados colorantes de escuarato que llevan una carga global negativa u otros derivados fluorescentes que llevan una carga global negativa y están disponibles como conjuntos de colorantes coincidentes. Las moléculas de carbodiimida preferidas son moléculas solubles en agua tales como (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) (EDC) y yoduro de 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida) (EAC).

El primer grupo de colorantes evaluado fueron los colorantes de cianina fluorescentes descritos en Mujumdar, R. B. et al.,"Cyanine dye labeling reagents containing isotiocianate groups", Cytometry 10: 11-19 (1989) y Waggoner et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.268.486 titulada "Method for labeling and detecting materials employing arilsulfonate cianina colorants" expedida en 1993 y que se incorpora a este documento como referencia. Los colorantes de cianina tienen la siguiente estructura general.

1

donde X e Y pueden ser O, S o (CH_{3})_{2}-C, m es un entero de 1 a 3 y al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} o R_{7} es un grupo reactivo que reacciona con nucleófilos amino, hidroxi o sulfhidrilo. Las líneas de puntos representan los átomos de carbono necesarios para la formación de un anillo a tres anillos condensados que tienen de 5 a 6 átomos en cada anillo. R_{3}, R_{4}, R_{6} y R_{7} están unidos a los anillos. El resto reactivo pude ser cualquier grupo reactivo conocido. Los grupos reactivos que pueden unirse directa o indirectamente al cromóforo para formar los grupos R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} o R_{7} pueden incluir restos reactivos tales como grupos que contienen isotiocianato, isocianato, monoclorotriazina, diclorotriazina, piridina mono- o di-sustituida con halógeno, diazina mono- o di-sustituida con halógeno, maleimida, fosforamidita, aziridina, haluro de sulfonilo, haluro de ácido, éster de hidroxisuccinimida, éster de hidroxisulfosuccinimida, éster imido, hidrazina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridil ditio)-propionamida, glioxal, cetona, amino y aldehído.

Debido su carga intrínseca positiva, los colorantes de cianina descritos en la patente de Waggoner et al. son los fluoróforos a elegir cuando se desea una carga positiva para marcar aminas primarias. Las cianinas se unen a la proteína mediante el éster activado del ácido hexanoico. Mientras que el acoplamiento destruye la carga de la cadena lateral de lisina, se compensa la carga intrínseca en el colorante. En efecto, mueve la carga lejos de la molécula de proteína aunque mantiene la misma carga global en la muestra que se va a someter a electroforesis. En la molécula de colorante de cianina, dos anillos de indol funcionalizados se conectan mediante un engarce tales como polieno. Las características espectrales de los colorantes de cianina pueden modularse fácilmente simplemente cambiando la longitud del engarce entre los anillos de indol del colorante. Una longitud mayor o menor del engarce dará como resultado fluorescencia a diferentes longitudes de onda y, por lo tanto, diferentes colores. Sin embargo, cambiando la longitud del engarce cambia la masa molecular del colorante. Como la electroforesis depende también de la masa de las proteínas, el efecto del colorante sobre la masa de una proteína también puede ser de interés. Como las proteínas se marcan antes de la electroforesis, la masa del colorante unido a la proteína no debe alterar significativamente las diferencias relativas en los pesos moleculares de las diversas proteínas en lo extractos. Sin embargo, el peso molecular no es crítico, porque solo se marcan en la proteína un número de sitios relativamente pequeño. Como se ha indicado anteriormente, preferiblemente se marcan menos del 1%, hasta aproximadamente el 2% de los sitios de unión posibles en las proteínas. Si se marcan más, el mantener generalmente pesos moleculares iguales para los colorantes del conjunto de colorantes coincidentes se convierto en una preocupación fundamental.

La diferencia en peso molecular provocada por cambiar la longitud del engarce en los colorantes fluorescentes de cianina puede compensarse modulando el tamaño de una cadena alifática R_{1} o R_{2}, unida a uno de los anillos de indol del colorante. Uno de los R_{1} o R_{2} debe ser un grupo reactivo. Estas restricciones de diseño conducen a la modificación de las cianinas y al desarrollo de un colorante de la fórmula general

2

donde X e Y son iguales a S, O, o CH_{3}-C-CH_{3}, m es un entero de 1 a 3 y cualquiera de R_{1} o R_{2} es un grupo reactivo capaz de unirse covalentemente a la proteína, tal como los grupos reactivos descritos anteriormente para los colorantes de cianina no modificados. Las líneas de puntos representan 1, 2 ó 3 anillos condensados que tienen 5 ó 6 átomos de carbono en cada anillo. Cada lado debe equilibrar el otro lado.

Un ejemplo de un par coincidente de colorantes desarrollado de acuerdo con la siguiente fórmula general:

3

(Propil Cy-3-NHS) que fluoresce en rojo y,

4

(Metil Cy-5-NHS) que fluoresce en el rojo lejano en el espectro, donde R es un grupo reactivo. Como se ha indicado anteriormente, O o S o una combinación de los mismo puede colocarse en las posiciones X e Y en lugar de (CH_{3})_{2}C-.

Los colorantes de cianina son una elección para el conjunto coincidente de colorantes de la presente invención. Pueden usarse otros compuestos colorantes en lugar de las cianinas, tales como colorantes de difluoruro de dipirrometeno boro, los colorantes derivatizados 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a,-diaza-S-indaceno, descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.774.339 de Haugland et al. y que se incorpora a este documento como referencia, que se venden en Molecular Probes, Inc. con la marca comercial BODLPY®. Los colorants BODLPY®, que no tienen carga neta, se unen covalentemente a las cadenas laterales de lisina usando un hidroxisuccinimidil éster activado que forma un enlace de amida. El resultado es la pérdida de la carga positiva de la lisina. Por lo tanto, se usa un grupo de engarce cargado positivamente en los colorantes coincidentes de la invención para reemplazar la amina primaria perdida con la amina terciaria del engarce. Los procedimientos de preparación de colorantes BODLPY® se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.774.339. La adición del engarce cargado positivamente se realiza por técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Un engarce puede diseñarse con tres grupos funcionales; (1) para reaccionar con el éster BODLPY®-NHS, (2) para llevar la carga deseada, y (3) para activarse de manera que la construcción de BODLPY®-engarce reaccione con restos aminoacídicos específicos de las proteínas en el extracto.

Las consideraciones principales para el conjunto coincidente de colorantes son el mantenimiento de la carga y características espectrales diferentes y definidas. Cualquier colorante neutro con un engarce positivo o cualquier colorante cargado positivamente, preferiblemente teniendo cada uno una carga a+1, que por otro lado satisface las necesidades descritas en este documento puede servir colorante del conjunto coincidente de colorantes de la presente invención. Es deseable un peso molecular aproximadamente igual en las muestras de proteína marcada, aunque como se ha explicado anteriormente, no es crítico. La carga intrínseca positiva de los colorantes de cianina se usa ventajosamente en la realización preferida para sustituir la carga positiva de lisina. El pK_{a} de cianina y lisina es bastante diferente; sin embargo, las condiciones se seleccionaron para que la proporción colorante: proteína fuera menor de uno. Este nivel de marcado tan bajo asegura que habrá cambios insignificantes en la migración de la proteína en geles de electroforesis bi-dimensionales. Pueden usarse colorantes que se ajustan al pK_{a} de lisina de manera más próxima. Como alternativa, pueden usarse colorantes que modifican otros restos aminoacídicos, con tal que se conserven las características iónicas del aminoácido en la modificación. En lugar de una lisina, el sitio de unión a la proteína puede ser un grupo sulfhidrilo o carboxílico. Cuando el sitio de unión a la proteína es un grupo sulfhidrilo, el sitio de unión correspondiente en el colorante es un grupo yodoalquilo o maleimida. Cuando el sitio de unión a la proteína es un grupo ácido carboxílico, el sitio de unión correspondiente en el colorante es una clorocetona o una carbodiimida.

Se anticipa que el método de la presente invención puede usarse también para detectar la presencia de diferentes ácidos nucleicos en diferentes muestras. La carga de los ácidos nucleicos es muy negativa. La adición del colorante, por lo tanto, no altera la carga global de los ácidos nucleicos por lo que la elección del conjunto coincidente de colorantes no tiene que compensar la pérdida de cuando se contempla el análisis del ácido nucleico. Para facilitar la unión del colorante, los ácidos nucleicos pueden modificarse para tener un aminoácido libre procedente del núcleo de ácido nucleico por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. También sería adecuada una lisina en este caso.

Ejemplo 1 Síntesis de los colorantes (Metil Cy-5 y Propil Cy-3) 1. Síntesis de derivados de indol (común a ambos colorantes)

Se calentaron 4,8 g (30 mmoles) de 2,3,3-trimetil-(3H)-indol y 35 mmoles del reactivo de bromoalquilo deseado (ácido 6-bromohexanoico o 1-bromopropano) en 40 ml de 1,2-diclorobenceno a 110ºC en atmósfera de nitrógeno gaseoso y se agitaron durante una noche calentando a reflujo. El producto (indol ácido, metil indol, o propil indol) precipitó en forma de una goma anaranjada. El sobrenadante se decantó y la goma se lavó varias veces con éter etílico. Este intermedio se usó tal cual.

2. Intermedio Cy-3

Se añadieron 1,5 g (7,5 mmoles) de propil indol a 1,6 g (7,6 mmoles) de N,N'-difenil formamida en 20 ml de ácido acético glacial y se calentó a reflujo durante 4 horas. El disolvente se retiró al vacío dejando un jarabe naranja oscuro. Este intermedio se usó tal cual.

2a. Intermedio Cy-5

La síntesis del intermedio Cy-5 es la misma que la síntesis de intermedio Cy-3 de la etapa 2 de la síntesis del colorante excepto que se usó 2-metilen-1,3,3-trimetilindolina en lugar de propil indol y el engarce fue malonaldehído dianil. El intermedio gomoso, azulado, se lavó dos veces con éter etílico.

3. Cy-3

Se añadieron 2,5 ml de trietilamina y 1,8 ml de Ac_{2}O anhidro al intermedio de la etapa 2, y la mezcla se llevó a ebullición durante 5 minutos. Se añadieron 1,70 g (5,0 mmoles) de indol ácido y la mezcla se calentó a reflujo durante dos horas. El disolvente se retiró al vacío y los productos se disolvieron en 10 ml de EtOH.

3a. Cy-5

La preparación de Cy-5 es la misma que para Cy-3 excepto que se usó el intermedio de la etapa 2a en lugar del intermedio de la etapa 2.

4. Purificación de los productos de la etapas 3 y 3a

Se separaron metal Cy-5 y propil Cy-3 de los productos secundarios contaminantes realizando una cromatografía ultrarrápida con una fase sólida de gel de sílice y MeOH al 40% en diclorometano como fase móvil.

5. Activación de los grupos carboxilo

El resto ácido carboxílico de cada colorante se convirtió en un N-hidroxisuccinimidil éster disolviendo una cantidad de material purificado en 5 ml de dimetilformamidina seca (DMF). Se añadieron 1,5 equivalentes de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) con 0,1 ml de piridina seca/100 mg de colorante. La reacción se calentó a reflujo a 60ºC durante 90 minutos en atmósfera de nitrógeno.

Ejemplo 2 Marcado de proteínas 1. Cultivo bacteriano

Los experimentos iniciales se realizaron en E. coli que expresaba la proteína quimérica GAL4VP16 bajo el control del promotor lac como se describe en Chasman, D. I. et al., "Activation of yeast polimerase II transcription by Herpesvirus VP16 and GAL4 derivatives in vitro", Molecular Cell Biology 9: 4746-4749 (1989). Se cultivaron dos cultivos bacterianos hasta un OD600 de 0,7 a 37ºC en 125 ml de medio LB estándar que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Se añadió isofeniltiogalactopiranósido (IPTG), un análogo no hidrolizable de lactosa, a un cultivo a una concentración final de 1 mM. Ambos cultivos se incubaron durante 2,5 horas adicionales.

2. Aislamiento de proteínas para electroforesis en gel bi-dimensional

El aislamiento de la proteína fue como sigue. Las bacterias se aislaron por centrifugación. Cada sedimento bacteriano se lavó con tampón de sonicación que contenía Hepes 5 mM KOH pH 8,4, Mg(OAC)_{2} 5 mM. El sedimento se resuspendió en tampón de sonicación que contenía 50 \mug/ml de ARNasa a un volumen final de 100 \mul. Esto se sonicó después en hielo hasta que la solución se hizo transparente, normalmente varios minutos. Se añadió ADNasa a 50 \mug/ml y la muestra se incubó durante 30 min a 0ºC. Se añadieron urea sólida y CHAPS a una concentración final de 8 M y del 5% respectivamente. La muestra se sacó del hielo y se añadió 1 volumen de tampón de lisis. La muestra se marcó inmediatamente o bien se almacenó a -80ºC.

3. Marcado de proteínas

Se añadió propil Cy-3-NHS a la primera muestra y se añadió metil Cy-5-NHS a la segunda muestra de extracto celular a una concentración de 2 nmoles de colorante/50 \mug de proteína. La solución madre de colorante típicamente era 2 mM en dimetil formamida. La reacción se incubó a 0ºC durante 30 minutos. Los tiempo de incubación pueden variar de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos, dependiendo de la temperatura y del tipo de células a estudiar. La incubación puede ser durante 15 minutos cuando la temperatura es de aproximadamente 25ºC. La temperatura no debería estar por encima de la que hace que se degraden las proteínas. La muestra marcada se sometió inmediatamente concentración isoeléctrica o se almacenó a -80ºC.

4. Aislamiento y marcado de proteínas para SDS-electroforesis en gel

Se cultivaron y aislaron bacterias por sonicación como en la etapa 2 del procedimiento de marcado de proteínas, excepto que no se añadió ARNasa o ADNasa. El extracto celular se marcó directamente como en la etapa 3 del procedimiento de marcado de proteínas. Se añadieron SDS, glicerol, Tris HCl pH 6,8, y azul de bromofenol para dar las concentraciones finales de 1%, 10%, 64 mM, y 5 \mug/ml, respectivamente. La muestra se puso después en un baño de agua en ebullición durante 2 minutos y después se sometió a electroforesis.

5. Determinación de la proporción de colorante a proteína

Para evitar problemas de solubilidad con las proteína marcadas, se eligieron condiciones para marcar solo el 1-2% de las lisinas del extracto celular. Esto se basa en la suposición de que el 7% de la media de aminoácidos de una proteína son lisina. La primera etapa para determinar la proporción de colorante a proteína fue la retirada del colorante libre por adsorción a perlas de SM-2 (Bio-Rad). La concentración de proteína se determine por OD260/280. El contenido de colorante se determinó por OD548 y OD650 para propil Cy-3 y metil Cy-5, respectivamente (\in=100.000 para ambos colorantes).

Ejemplo 3 Electroforesis en Gel 1. Electroforesis bi-dimensional

Se realizó electroforesis de alta resolución en gel bi-dimensional por técnicas bien conocidas.

2. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS se realizó por técnicas conocidas.

Ejemplo 4 Formación de imágenes en gel de fluorescencia

Al final de la electroforesis, los geles se empaparon en una solución de metanol al 25% y ácido acético al 7%. Las proteínas marcadas de manera fluorescente en el gel se representaron por imagen de la siguiente manera. Los geles se pusieron sobre una superficie de aluminio anodinado y se irradiaron con un ángulo de incidencia de 60º con una lámpara halógena de 300 W alojada en un proyector deslizante. La luz que salía del proyector se hizo pasar a través de filtros de paso de banda de 1' de diámetro (Chroma Technologies, Brattleboro VT), 545 \pm 10 nm y 635 \pm 15 nm para Cy-3 y Cy-5, respectivamente. Las imágenes se recogieron en una cámara de CCD enfriada (Photometrics Inc., Tucson AZ) equipada con una lente de 50 mm (Nikon) y un doble filtro de emisión de paso de banda (Chroma Technologies, Brattleboro VT), 587,5 \pm 17.5 nm y 695 \pm 30 nm para Cy-3 y Cy-5, respectivamente. La cámara CCD se controló mediante un ordenador Macintosh II si en el que se ejecutó un programa de control de la cámara Photometrics. El tiempo de integración de la imagen varió entre décimas de segundo a varios minutos. Los filtros de excitación se alojaron en un rodete de filtro unido al proyector. Se registraron dos imágenes sucesivas con irradiación de los dos filtros sin mover el gel.

Ejemplo 5 Procesado de imágenes

Los archivos de imágenes se transfirieron a un Personal Iris 4D/35 (Silicon Graphics Inc., Mountain View CA). Los archivos de imágenes se procesaron después usando el programa DeltaVision (Applied Precision, Mercer Island WA). Se usaron los dos esquemas para determinar las diferencias entre las muestras marcadas de manera diferente sobre el gel:

1. Resta

Cada imagen puede considerarse como un conjunto de tipo cuadrícula de intensidades de píxeles. Estos conjuntos de valores pueden manipularse mediante numerosas operaciones aritméticas. En este caso se restó una imagen de la otra. Como las dos muestras cargadas en el gel no se equilibraron perfectamente para la fluorescencia global, una imagen se multiplicó por una constante de equilibrado. Este factor se determinó arbitrariamente de manera que el número de diferencias entre las muestras se mantuvo pequeño.

2. División de imágenes

En este caso una imagen se divide por la otra. Antes de realizar esta operación las imágenes primero se normalizaron a un intervalo de intensidad común. Esto se hizo ajustando los valores de píxel máximo y mínimo de cada imagen a cero y se empleó un valor grande arbitrario, 4095, el valor de salida máximo posible de la cámara CCD. Los valores de píxel intermedio se escalaron linealmente entre estos valores. Después se dividió una imagen por la otra. Se usó también un factor de equilibrado para mantener el cociente medio en uno. Las zonas con diferencias fueron aquellas con un cociente mayor de uno.

Ejemplo 6

1. Diferencias en la electroforesis en gel SDS de la expresión bacteriana inducida por GAL4VP16: la Figura 2 muestra imágenes de proteína marcadas con propil Cy-3 y metil Cy-5 desarrolladas en un solo gel de poliacrilamida SDS.

Los carriles 1-3 muestran la proteína marcada con Cy-3. Las muestras cargadas en los carriles fueron:

Carril 1. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con propil Cy-3.

Carril 2. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con propil Cy-3 más extracto no inducido marcado con metil Cy-5.

Carril 3. Proteína GAL4VP16 purificada macada con propil Cy-3.

Los carriles 4-6 muestran proteína marcada con Cy-5. Las muestras cargadas en los carriles fueron:

Carril 4. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con propil Cy-3.

Carril 5. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con propil Cy-3 más extracto no inducido marcado con metil Cy-5.

Carril 6. Proteína GAL4VP16 purificada macada con propil Cy-3.

Solo el Carril 5 mostró fluorescencia de Cy-5.

Los Carriles 7 y 8 muestran el producto restado del Carril 2 - Carril 5 y Carril 3 - Carril 6, respectivamente. Las flechas indican la posición de GAL4VP16 como se confirma por la posición de la banda de GAL4VP16 purificada en el Carril 8. La identidad de las bandas superiores no se conoce. Sin embargo, hay diversas proteínas que se sabe que pueden ser inducidas por IPTG, incluyendo \beta-galactosidasa.

Los Carriles 9-11 muestran la proteína marcada con Cy-5. Las muestras cargadas en los carriles fueron:

Carril 9. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con metil Cy-5.

Carril 10. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con metil Cy-5 más extracto no inducido marcado con propil Cy-3.

Carril 11. Proteína GAL4VP16 purificada macada con metil Cy-5.

Los Carriles 12-15 muestran la proteína marcada con Cy-5. Las muestras cargadas en los carriles fueron:

Carril 12. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con metil Cy-5.

Carril 13. Extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con metil Cy-5 más extracto no inducido marcado con propil Cy-3.

Carril 14. Proteína GAL4VP16 purificada macada con metil Cy-5.

Solo los Carriles 12-15 mostraron todos algo de fluorescencia de Cy-3. Esto se debe a la ligera convergencia entre los filtros de paso de banda. Esto provoca que el material marcado con Cy-5 aparezca cuando se excita con luz Cy-3. Lo inverso no se ve. El material Cy-3 material no se visualiza por la excitación luminosa Cy-5. Hay dos menaras de eliminar los efectos de convergencia: diseñar mejores filtros de paso de banda o retirar computacionalmente la contribución de Cy-5 a las imágenes de Cy-3 conociendo la constante de convergencia.

Los Carriles 15 y 16 muestran el producto restado del Carril 10 - Carril 13 y Carril 11 - Carril 14, respectivamente. Las flechas indican la posición de GAL4VP16 como se confirma por la posición de la banda de GAL4VP16 purificada en el Carril 16. La identidad de las bandas superiores no se conoce. Sin embargo, hay diversas proteínas que se sabe que pueden ser inducidas por IPTG, incluyendo \beta-galactosidasa.

2. Diferencias en la electroforesis en gel bi-dimensional de la expresión bacteriana inducida por GAL4VP16:

La Figura 3 muestra imágenes de una porción de un gel bi-dimensional cargado con extracto bacteriano inducido por IPTG marcado con propil Cy-3 más extracto no inducido marcado con metil Cy-5.

Panel A. Imágenes tomadas con excitación luminosa Cy-3 que muestra las proteínas inducidas por IPTG.

Panel B. Imágenes tomadas con excitación luminosa Cy-5 que muestra las proteínas no inducidas.

Panel C. Proporción de la imagen de Cy-3 dividida por la imagen de Cy-5.

Panel D. Solapamiento de la imagen del Panel C, coloreado en rojo, y puesta en la parte superior de la imagen del Panel B, coloreado en azul.

3. Diferencias en la electroforesis en gel bi-dimensional de extracto bacteriano con proteína añadida de manera exógena:

La Figura 4 muestra imágenes de una porción de un gel bi-dimensional cargado con un extracto bacteriano marcado con propil Cy-3 que tenía anhidrasa carbónica añadida de manera exógena más extracto marcado con metil Cy-5 sin la anhidrasa carbónica añadida.

Panel A. Imagen tomada con excitación luminosa Cy-3 que muestra las proteínas bacterianas más anhidrasa carbónica.

Panel B. Imágenes tomadas con excitación luminosa Cy-5 que muestra las proteínas bacterianas solas.

Panel C. Proporción de la imagen de Cy-3 dividida por la imagen de Cy-5.

El proceso de la presente invención proporciona una manera sencilla y barata para analizar las diferencias en el contenido de proteína de diferentes células o diferentes muestras de otras fuentes. El proceso elimina los problemas que pueden aparecen cuando se usan dos geles diferentes que deben someterse a electroforesis por separado. Los colorantes coincidentes usados para marcar las diferentes proteínas permiten la electroforesis simultánea de dos o más muestras diferentes en un solo gel. Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia a dos muestras de proteínas y un par coincidente de colorantes, los especialistas en la técnica entenderán que pueden ensayarse más de dos muestras simultáneamente usando un número igual de colorantes coincidentes. Pueden usarse múltiples colorantes siempre y cuando puedan manipularse las características espectrales de los colorantes para proporcionar fluorescencia a numerosas longitudes de onda diferentes dando como resultado imágenes visualmente distinguibles, pudiendo igualarse el pH y las características iónicas de los colorantes generalmente para compensar los cambios hechos a la proteína mediante el enlace covalente al colorante.

Análisis diferencia de glicoproteínas Síntesis del colorante Ejemplo 7

La síntesis de los intermedios del colorante de cianina fue como se ha descrito anteriormente. El resto ácido carboxílico de cada intermedio Cy3 y Cy5 se convirtió en hidrazida como se detalla a continuación.

5

A una solución agitada de Cy-3 (50 mg, 8,9 x 10^{-5} mol) disuelto en acetonitrilo anhidro (2 ml) en una atmósfera de nitrógeno se le añadió diisopropilamina (0,03 ml, 9,7 x 10^{-5} mol) y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-bis(tetrametil)uronio (TSTU) (30 mg, 9,7 x 10^{-5} mol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El análisis del material por cromatografía en capa fina (TLC) puso de manifiesto que no quedaba nada del material de partida, por lo que se añadió un equivalente adicional de diisopropilamina (0,03 ml, 9,7 x 10^{-5} mol) al que posteriormente siguió carbazato de tercbutilo (30 mg, 1,78 x 10^{-4} mol). La reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después el disolvente se retiró al vacío para dar un aceite rosa intensamente coloreado. El aceite se purificó usando una columna de cromatografía ultrarrápida (gradiente de sílice:diclorometano/metanol) dando como resultado un sólido rosa (59 mg, 97%). El producto estaba limpio y correcto por ^{1}H RMN y espectrometría UV/VIS (\lambda_{máx} = 552 nm).

6

Se añadió cloroformo (1 ml) a una porción del sólido rosa (5 mg) y resultó una solución turbia que se trató con ácido trifluoroacético (4 gotas). Después de 1 hora de incubación, la TLC puso de manifiesto que se había consumido todo el producto y que se había formado un producto más polar por lo que los disolventes se retiraron al vacío y el semi-sólido resultante se trituró con éter dietílico y después se secó al vacío. El producto apareció limpio y correcto por ^{1}H RMN y espectrometría UV/VIS (\lambda_{máx} = 552 nm).

Ejemplo 8

La preparación de hidrazida Cy5 es la misma que la de Cy3 excepto que el material de partida es Cy5.

Ejemplo 9 Marcado de proteínas 1) Cultivo celular

Los experimentos iniciales se realizaron en cultivos de líneas celulares epiteliales HBL100 de mama humanas, (véase, In Vitro Cell & Dev. Biol., vol. 26, 933 (1990)), y BT474 de carcinoma ductal de mama humanas, (J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), vol. 61,967 (1978)). Las células HBL100 se desarrollaron hasta confluencia como una monocapa en medio de McCoy 5A suplementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM a 37ºC en CO_{2} al 5% en atmósfera de aire. Las células BT474 se desarrollaron hasta confluencia como una monocapa en medio RPMI 1460 suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, 0,02 mg/ml de insulina bovina, 0,45% de glucosa y piruvato sódico 1 mM a 37ºC en CO_{2} al 5% en atmósfera de aire.

2) Aislamiento de proteína desde las células

Los matraces de monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS para retirar los medios y las células se recogieron por incubación en tripsina. La suspensión celular se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. El sobrenadante se rechazó y el sedimento celular se lavó con Tris para retirar el exceso de sal. Los sedimentos celulares se almacenaron a -70ºC. Se extrajo proteína de las células por sonicación. Los sedimentos celulares (\sim2 x 10^{6} células/ml) se resuspendieron en tampón de lisis que contenía urea 2 M, tampón acetato 100 mM pH 5,5, NP-40 1% (v/v) y SDS al 0,1% (p/v) y se sonicaron en hielo 4 veces cada uno durante 20 segundos. Los lisatos celulares se centrifugaron a 4ºC a 13.000 rpm en un micrófuga durante 5 minutos para retirar el residuo celular y retener el sobrenadante. Los sobrenadantes celulares se almacenaron a -20ºC.

3) Determinación de la concentración de proteína para estimar la proporción colorante:proteína

Para evitar los problemas de solubilidad con las proteínas marcadas y para permitir el uso de proporciones consistentes colorante:proteína, la concentración de proteína extraída se determinó mediante el ensayo de proteína BioRad Dc (BioRad Laboratories).

4) Marcado de carbohidrato en glicoproteínas usando colorantes de hidrazida a) Marcado de glicoproteínas modelo para SDS-PAGE

i) Se prepararon soluciones de glicoproteínas individuales como soluciones madre de 10 mg/ml en agua. Se tomaron 10 ug de cada proteína para marcar y se diluyeron con tampón acetato pH 5,5 hasta una concentración final del tampón de 100 nM.

ii) Los restos de azúcar se oxidaron añadiendo metaperyodato sódico en agua para dar una concentración final de 10 mM y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El exceso de metaperyodato se retiró añadiendo metabisulfito sódico en tampón acetato 200 mM pH 5,5 para dar una concentración final de 5 mM y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Se añadió hidracida Cy3 a la primera muestra celular y se añadió hidracida Cy5 al segundo extracto celular a una concentración de \sim25 nmol / 10 \mug de proteína. La solución madre de colorante fue típicamente de 10 mM en dimetilformamida. La reacción de marcado se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los tiempos de incubación pueden variar de aproximadamente 10 a 60 minutos y la temperatura de incubación puede variar de 0ºC a \sim25ºC dependiendo del tipo de células a estudiar. La temperatura no debería estar por encima de la que provocaría la degradación de las proteínas y el tiempo no debería ser mayor que el que provocaría el marcado no específico.

iii) Se añadió tampón de muestra a la carga de gel a muestras marcadas para dar concentraciones finales de SDS al 2% (p/v), glicerol al 10% (v/v), Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, mercaptoetanol al 5% (v/v), azul de bromofenol al 0,01%. La muestra se colocó en un baño de agua en ebullición durante 4 minutos y después se sometió a electroforesis.

b) Marcado de mezclas sencilla de glicoproteína por SDS-PAGE

Se prepararon mezclas sencillas de 12 ó 14 proteínas modelo diferentes que contenía \sim10 \mug cada una de proteínas de 10 mg/ml de soluciones madre de proteína para dar una escala de pesos moleculares. La solución de proteína se diluyó: 1 con tampón acetato 200 mM pH 5,5. Las mezclas de proteínas se marcaron de acuerdo con el procedimiento descrito en la etapa 4a (ii) anterior. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE después de la adición del tampón de muestra como se ha descrito.

c) Marcado de glicoproteínas en extractos celulares para electroforesis en gel bi-dimensional

Se extrajo la proteína de las células como se describe en la etapa 3 de este ejemplo y se usó directamente parra marcar los grupos carbohidrato en glicoproteínas. Se marcaron \sim150 \mug de proteína extraída como se describe en la etapa 4a (ii) anterior. Las muestras marcadas (\sim25-50 \mug) se mezclaron con 2x IEF de tampón de muestra (urea 8 M, CHAPS al 4% (p/v), Pharmalytes al 2% (v/v), 20 mg/ml de DTT) y se cargaron directamente en las tiras de concentración isoeléctrica (gradientes de pH inmovilizados, Amersham Pharmacia Biotech).

5) Marcado de restos de lisina en proteínas usando colorantes NHS

Las proteínas se marcaron en los restos de lisina con colorantes NHS reactivos con amina como se ha descrito anteriormente usando 200 pmo de Cy2-NHS éster/50 \mug de proteína en tampón Tris 5 mM. Las proteínas de los extractos celulares se marcaron directamente con Cy2 como se ha descrito anteriormente.

6) Electroforesis en gel

1. Electroforesis bi-dimensional: la electroforesis bi-dimensional de alta resolución se realizó por técnicas bien conocidas de acuerdo con Laemmli [Nature, vol. 227, 680-685 (1970)].

2. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS: la electroforesis en gel de poliacrilamida- SDS se realizó por técnicas conocidas.

7) Formación de imágenes en gel de fluorescencia

Al final de la electroforesis, las proteína marcadas por fluorescencia los geles formaron imágenes usando escáneres disponibles en el mercado con longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas [excitación Cy2 480/30 emisión 530/30; excitación Cy3 540/25, emisión 590/35; excitación Cy5 620/30, emisión 680/30].

Ejemplo 10 Marcado de glicoproteínas modelo

Las Figuras 5a) y b), respectivamente, muestran imágenes de proteínas marcadas con Cy2-NHS e hidrazida Cy3 desarrolladas en SDS-PAGE.

Los Carriles 1 y 3 muestran proteínas marcadas en restos de lisina con Cy2 NHS éster visualizado con excitación y emisión de Cy2.

Carril 1. Transferrina marcada con Cy2 (peso molecular - 76 kDa).

Carril 3. Inhibidor de tripsina de soja marcado con Cy2 (peso molecular - 20 kDa).

Los Carriles 2 y 4 muestran las mismas proteínas marcadas en los grupos carbohidrato con hidrazida Cy3 visualizada con excitación y emisión de Cy3.

Carril 2. Transferrina marcada con Cy3.

Carril 4. Inhibidor de tripsina de soja marcado con Cy3.

Los Carriles 1 y 3 muestran que tanto transferrina como el inhibidor de tripsina se marcan con el colorante de lisina Cy2. El carril 4 muestra el marcado de transferrina con hidrazida Cy3. El inhibidor de tripsina en el carril 4 no es visible con Cy3 ya que esta proteína no está glicosilada y, por lo tanto, no se marca con Cy3.

Ejemplo 11 Análisis diferencial por SDS-PAGE de mezclas sencillas de proteínas

Las Figuras 6a) y b) muestran imágenes de mezclas de proteínas marcadas con hidrazida Cy3 (6a) y Cy5 (6b) desarrollada en SDS-PAGE. La mezcla de proteínas B se preparó marcando 10 mg de cada una de las siguientes proteínas -
fetuina, albúmina, carboxipeptidasa Y, ribonucleasa B, \alpha-1 glicoproteína ácido, inhibidor de tripsina, lactoglobulina, citocromo C, \alpha-lactalbúmina, lisozima, mioglobina y actina. La mezcla de proteína A contiene proteínas idénticas a la mezcla B más transferrina y anhidrasa carbónica.

Los Carriles 1 y 3 de la Fig. 6 (a) muestran mezclas de proteínas A y B marcadas con Cy3.

Carriles 2 y 4 de la Fig. 6 (b) muestran mezclas de proteínas A y B marcadas con Cy5.

El Carril 5 muestra una mezcla de proteína A marcada con Cy3 más mezcla de proteína B marcada con Cy5.

El Carril 6 muestra una mezcla de proteína A marcada con Cy5 más mezcla de proteína B marcada con Cy3.

Los Carriles 5 y 6 con la mezclas de proteínas desarrolladas en el mismo carril muestran detección diferencial de las dos proteínas adicionales en la mezcla A - en el carril 5 visible en la imagen de Cy3 y en el carril 6 visible en la imagen de Cy5.

Ejemplo 12 Análisis 2DE diferencial de extractos de células de mamíferos

Las Figuras 7 (a) y (b) muestran imágenes de una sección de un gel 2DE cargado con extracto de células HBL100 marcadas con hidrazida Cy3 (7a) y extracto de células BT474 marcadas con hidrazida Cy5 (7b). Las diferencias en el contenido de glicoproteína de las líneas celulares resultan evidentes a partir de los diferentes patrones de manchas obtenidas con los dos extractos celulares. Algunas de las diferencias cualitativas y cuantitativas se han resaltado con flechas.

Ejemplo 13 Análisis 2DE diferencial de extractos de células de mamíferos con proteína añadida de manera exógena

Los extractos celulares se prepararon como se describe en las etapas 1-4 del Ejemplo 9 anterior. Para estimular las diferencias en lisatos celulares complejos los extractos celulares se marcaron con hidrazida Cy3 y Cy5 y se añadieron glicoproteínas conocidas marcadas con Cy5 a la muestra marcada con Cy5. Las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 se mezclaron después en volúmenes iguales antes de 2DE. Las Figuras 8a) y b) muestran imágenes de un gel 2DE cargado con un extracto celular marcado con Cy3 (8a) (sin proteína añadida de manera exógena) y un extracto celular marcado con Cy5 (8b) con proteína añadida de manera exógena. Las proteínas añadidas fueron las siguientes:

20

La sección de gel resaltada muestra proteínas cuyo peso molecular varía de \sim 15 a 80 kDa y el pH varía entre 5-8. Esta porción excluye por lo tanto las proteínas fetuina, \alpha-1 glicoproteína ácida y albúmina de ser seleccionadas en la imagen de Cy5.

Las imágenes de Cy3 y Cy5 muestran buena reproducibilidad en las manchas detectadas usando los dos colorantes para marcar la misma muestra celular BT474 y las diferencias pueden atribuirse a las proteínas añadidas de manera exógena. Transferrina y anhidrasa carbónica se resaltan en la imagen de Cy5 pero no son visibles en la imagen de Cy3. La presencia de carboxipeptidasa-Y en la muestra de Cy5 no se ha demostrado claramente aunque esto puede deberse a numerosas causas tales como el solape con proteínas celulares endógenas que evita que se resuelvan o el bajo nivel de carbohidrato en la proteína.

Análisis diferencial de proteínas por cromatografía en columna Ejemplo 14 Marcado de proteínas

Las proteínas se marcaron mediante un enfoque de marcado mínimo diseñado para añadir una sola marca a cada proteína. Este procedimiento da como resultado que solo se marca una pequeña proporción de cada proteína. Los niveles de proteína indicados en el siguiente texto son la cantidad de proteína total y no tienen en cuenta la proporción de proteína realmente marcada. Los colorantes que contienen una sola carga neta positiva se hicieron reaccionar con los grupos amina primaria de la proteína para evitar el cambio en el estado de carga global de la proteína.

Los N-hidroxisuccinimidil ésteres de los derivados Cy3 y Cy5 ajustados por peso molecular (Amersham Pharmacia Biotech) que contienen una sola carga positiva se añadieron al tampón (Tris 20 mM/HCl pH 7,6) que contienen proteína o péptido a una proporción de 800 picomol de colorante por 200 microgramos de proteína en un volumen total de 46 \mul. La solución se incubó en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. La reacción se detuvo después por la adición de 4 \mul de una solución de lisina 10 mM y la incubación en hielo durante 10 minutos más.

Las proteínas purificadas se marcaron por separado o se mezclaron y después se marcaron. La immunoglobulina G antiratón (IgG) se obtuvo del suministrador (Amersham Pharmacia Biotech) preparada marcada con Cy3 o Cy5.

Instrumentación

Se usó un sistema FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) compuesto por bombas, válvulas y controlador para bombear muestras a través de las columnas cromatográficas. El eluyente de cada columna se alimentó a una célula de flujo a través de cuarzo de 8 \mul (Hellma) colocada en un fluorímetro F4500 (Hitachi). Los elementos ópticos, sin embargo, no se optimizaron ya que la célula de flujo a través tenía una ventana vertical y el rayo de luz tenía un alineamiento horizontal, que limitaba la sensibilidad potencial de este sistema particular. Se usó el programa diseñado para emitir impulsos de excitación y emisión a 2 longitudes de onda para permitir el control continuo de la presencia proteínas marcadas con Cy3 y Cy5. Para la detección de Cy3, los ajustes de longitud de onda usados fueron de 530 nm (excitación) y 570 nm (emisión). Para la detección de Cy5, los ajustes fueron de 630 nm (excitación) y 670 nm (emisión). El ancho de la rendija para excitación y emisión fue de 10 \mum.

Cromatografía

Las proteínas o péptidos marcados con Cy3 y Cy5 se detectaron simultánea y continuamente durante la elución en columnas cromatográficas. Se crearon perfiles de mezclas de proteínas o péptidos en diversos tipos de columna. Las diferencias entre dos muestras de proteína podían examinarse también marcando las muestras con diferentes fluoróforo y mezclando después seguido de cromatografía y detección simultánea de la fluorescencia de los dos fluoróforos.

Ejemplo 15 Columna de intercambio iónico

Se equilibró una columna de intercambio iónico MonoQ HR5/5 (50 x 5 mm de diámetro interno) (Amersham Pharmacia Biotech) con tampón de partida (Tris 20 mM/HCl pH 7,6). Las muestras de proteína preparadas en tampón de partida se aplicaron a la columna usando un bucle de 100 \mul. Las proteínas se fluyeron de la columna usando linear gradiente lineal del mismo tampón que contenía NaCl 350 mM durante un periodo de 25 minutos a un caudal de 0,5 ml por minuto. Las proteínas marcadas con Cy3 y Cy5 se detectaron simultánea y continuamente durante la elución de la columna de intercambio iónico.

La Figura 9 muestra la separación de albúmina de suero bovina (BSA) marcada con Cy3 y transferían marcada con Cy5.

La Figura 10 muestra la separación de la mezcla de mioglobina, transferrina y albúmina de suero bovina marcadas con Cy5.

En la Figura 14 se muestra el análisis diferencial por cromatografía de intercambio iónico y detección de fluorescencia. Una muestra que contiene transferrina marcada con Cy3 se ha mezclado con otra muestra que contiene transferrina marcada con Cy5 y albúmina de suero bovina (BSA) marcada con Cy5. La ausencia de BSA de la segunda muestra está clara.

Ejemplo 16 Columna de fase inversa

Se equilibró una columna ProRPC (sílice basada en una mezcla C1/C8)(100 x 5 mm de diámetro interno) con una mezcla de eluyente A (70%) y eluyente B (30%). El eluyente A contenía ácido trifluoroacético al 0,1%, trietilamina al 0,1% en agua (95%) y acetonitrilo (5%). El eluyente B contenido en ácido trifluoroacético al 0,1%, trietilamina al 0,1% en agua (25%) y acetonitrilo (75%). Las muestras de proteína preparadas en el eluyente A se aplicaron a la columna usando un bucle de 100 \mul y se eluyeron usando un gradiente lineal del 70% de eluyente A/30% de eluyente B a 20% de eluyente A/80% de eluyente B durante un periodo de 25 minutos a un caudal de 0,5 ml por minuto. Las proteínas marcadas con Cy3 y Cy5 se detectaron simultánea y continuamente durante la elución de la columna de fase inversa.

La Figura 11 muestra la separación en fase inversa de la mezcla de ribonucleasa A, citocromo C, holo-transferrina y apomioglobina marcadas con Cy5.

Ejemplo 17 Columna de exclusión de tamaño

Se equilibró una columna Superose 6HR10/30 (300 x 10 mm de diámetro interno) (Amersham Pharmacia Biotech) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM pH 7,4. Las muestras de proteínas preparadas en el mismo tampón se aplicaron a la columna usando un bucle de 100 \mul y se eluyeron a un caudal de 0,5 ml por minuto. Las proteínas marcadas con Cy3 y Cy5 se detectaron simultánea y continuamente durante la elución de la columna de exclusión por tamaño.

La Figura 12 muestra la separación de la mezcla de tiroglobulina, apoferritina, IgG y \beta-lactoglobulina marcadas con Cy3 por cromatografía de exclusión por tamaño.

La Figura 13 muestra el análisis diferencial por cromatografía de exclusión por tamaño. La muestra marcada con Cy3 contiene cuatro proteínas (trioglobulina, apoferritina, IgG y \beta-lactoglobulina) y la muestra marcada con Cy5 muestra justo tres de las cuatro proteínas (menos IgG). La ausencia de la cuarta proteína está clara.

Ejemplo 18 Análisis diferencial de proteína análisis por purificación por afinidad Crecimiento celular, lisis y purificación de afinidad

Los lisatos de bacteria E coli que expresan GST o que no expresan GST se usaron como modelos de muestras complejas de proteína. Las células de la cepa JM109 de E coli se transformaron bien con el plásmido pGEX-5X que codifica GST o con el plásmido de control pTrc99 que no codifica GST (plásmidos de Amersham Pharmacia Biotech) y se cultivaron en placas en placas de agar. Los cultivos líquidos (10 ml) se cultivaron después durante una noche a 37ºC en caldo de cultivo LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Después se inoculó al medio fresco (típicamente 150 ml) con 0,5% del cultivo de partida y se cultivó a un A_{600} de 1,0. Las células se indujeron después por adición de IPTG a una concentración final de 0,5 mM y se incubaron durante 2 a 3 horas más. Las células se recogieron por centrifugación a 2800 g, se recogieron en 7,5 ml de PBS y se lisaron por sonicación (MSE 150 Soniprep) en hielo (30 segundos, el resto durante 90 segundos, repetido 3 veces). El residuo celular se retiró por centrifugación a 2800 g y después de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo se repitió la centrifugación. El sobrenadante (alícuota de 100 \mul normalizada con respecto a la concentración determinada por lectura de A_{280}) se marcó después con 1,5 nmol de colorante Cy en hielo en la oscuridad durante 60 minutos y se inactivó con lisina como anteriormente.

En este punto, los lisatos se trataron por separado o se mezclaron, por ejemplo una muestra de lisato de células pGEX marcadas con Cy3 se mezcla con un volumen igual de lisato de células pTrc marcadas con Cy5. GST era la afinidad purificada del extracto celular usando Glutatión Sepharose 4B (Nº Cat. 17-0756-01, Amersham Pharmacia Biotech) usando el protocolo de método discontinuo proporcionado por el suministrador para selección de proteínas de fusión.

Las muestras se leyeron en el fluorímetro Hitachi de excitación de Cy3 a 530 nm (pico de emisión detectado a 565 nm) y excitación de Cy5 a 630 nm (pico de emisión detectado a 661 nm) usando ranuras de 5 nm para la excitación y emisión. El material que no se unió a la matriz de afinidad se combinó con lavados para determinar la fluorescencia. El material unido a la matriz de afinidad se eluyó usando un exceso de GST no marcado. Antes de la lectura, se diluyó una alícuota de 15 \mul de cada muestra en un volumen total volumen de 100 \mul. Las muestras lavadas se diluyeron 10 veces más antes de la lectura debido a sus valores relativamente altos. Posteriormente, las lecturas se corrigieron para tener en cuenta los volúmenes y diluciones relativas de las fracciones unidas y lavadas.

Purificación de afinidad

Se usó el análisis diferencial por purificación de afinidad para identificar una proteína específica (glutatión-S-transferasa, GST) en un lisato celular. Los experimentos iniciales demostraron que en lisatos celulares bacterianos marcados con Cy3 o Cy5 y analizados por separado, pudo determinarse la presencia de GST. Las muestras de bacteria inducida que contenían el plásmido pGEX que codifica GST contenían claramente proteína GST como indicaba el material fluorescente eluido específicamente de la matriz de afinidad de glutatión con glutatión libre (Tabla 1). Se confirmó que este material era GST formando imagen de fluorescencia de un gel SDS-PAGE que contenía CST purificada marcada con Cy5 (Sigma) y GST purificada por afinidad como se ha descrito anteriormente.

Las muestras de bacteria inducida que contenían el plásmido pTrc que no codifica para GST que, por otro lado es muy similar, parece que no contenían proteína GST. Esta conclusión se indica por un bajo nivel de material fluorescente eluido de la matriz de afinidad y la ausencia de una banda fluorescente de peso molecular correcto en un gel SDS-PAGE.

TABLA I

21

Los experimentos posteriores mostraron que cuando dos lisatos diferentes se marcaban con diferentes colorantes y se mezclaron antes de la purificación por afinidad, las diferencias en el contenido de GST de las dos muestras podrían determinarse mediante su fluorescencia relativa. Por ejemplo, el lisato de células pGEX inducidas marcadas con Cy3 se mezcló con el lisato de células pTrc inducidas marcadas con Cy5 y se purificaron por afinidad. La proporción de material unido contenido en las células que expresaban GST fue más de 10 veces mayor que en células que no expresaban GST (Tabla 2). En la siguiente muestra, lisatos de células pGEX inducidas marcadas con Cy3 se mezcló con lisato de células pGEX no inducidas marcadas con Cy5 y se purificaron por afinidad. La proporción de material unido contenido en las células que expresaban GST de nuevo fue más de 10 veces mayor que en las células que no expresaban GST (Tabla 2).

TABLA 2

22

Claims

1. Un método para comparar composiciones de proteína entre al menos dos muestras celulares diferentes que comprende:

(a) preparar un extracto de proteínas de cada una de dichas al menos dos muestras celulares;

(b) proporcionar un conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes elegidos entre colorantes capaces de unirse covalentemente a proteínas en dicho extracto de proteínas, donde cada colorante de dicho conjunto

(1): tiene una carga neta que mantendrá la carga neta global de las proteínas durante dicha unión covalente y tiene características iónicas y de pH donde la migración relativa de una proteína marcada con cualquiera de dichos colorantes es la misma que la migración relativa de dicha proteína marcada con otro colorante de dicho conjunto,

(2): emite luz luminiscente a una longitud de onda que es suficientemente diferente de la luz luminiscente emitida por los demás colorantes de dicho conjunto para proporcionar diferentes señales luminosas detectables;

(c) hacer reaccionar cada extracto de proteínas de la etapa (a) con un colorante diferente de dicho conjunto de la etapa (b) para proporcionar proteínas marcadas con colorante;

(d) mezclar cada una de dichas proteínas marcadas con colorante para formar una sola mezcla o diferentes proteínas marcadas con colorante;

(e) separar las proteínas marcadas con colorante de interés en dicha mezcla; y

(f) detectar la diferencia de intensidad luminiscente entre las diferentes proteínas marcadas con colorante de interés por detección luminiscente.

2. El método de la reivindicación 1 donde dichos colorantes se unen a una amina primaria de un resto de lisina de la proteína y cada uno de dichos colorantes entre dichos colorantes luminiscentes lleva una carga neta + 1.

3. El método de la reivindicación 1 donde dicho conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes son colorantes de cianina que tienen la siguiente estructura:

7

donde cada una de las líneas de puntos representan átomos de carbono necesarios para la formación de uno a tres anillos condensados que tienen de cinco a seis átomos en cada anillo, X e Y se seleccionan entre el grupo compuesto por S, O y CH_{3}-C-CH_{3}, m es un entero de 1 a 3, uno de R_{1} y R_{2} es un grupo reactivo y el otro es un alquilo.

4. El método de la reivindicación 1 donde dicho colorante tiene al menos un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por isotiocianato, isocianato, N-hidroxisuccinimidil éster, imido éster, glioxal, ácido carboxílico, haloacetamida, maleimida, haluro de alquilo, haluro de ácido, azida, hidrazida, hidrazina, cetona y amino.

5. El método de la reivindicación 1 donde dicho conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes son colorantes neutros unidos al amino primario de un resto de lisina en la proteína mediante un grupo de engarce cargado positivamente.

6. El método de la reivindicación 1 donde dicho conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes son colorantes neutros unidos a un grupo sulfhidrilo en la proteína.

7. El método de la reivindicación 1 donde dicho conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes son colorantes derivados de difluoruro de dipirrometeno boro.

8. El método de la reivindicación 1 donde el método cromatográfico comprende cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de intercambio iónico.

9. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente interrumpir la reacción entre las proteínas y los colorantes antes de mezclar dichas proteínas marcadas con colorante.

10. El método de la reivindicación 1 donde la etapa de detectar las diferencias en el color emitido es por microscopía fluorescente.

11. El método de la reivindicación 1 donde la etapa de detectar las diferencias en el color emitido es por formación electrónica de imágenes.

12. El método de la reivindicación 1 donde las proteínas tienen sitios de unión para unión covalente a dichos colorantes seleccionados entre el grupo compuesto por lisina, ácido carboxílico y grupos sulfhidrilo.

13. El método de la reivindicación 1 donde las proteínas incluyen glicoproteínas que tienen grupos azúcar terminales y la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente la etapa de oxidar los grupos azúcar terminales para formar grupos aldehído; y cada colorante de dicho conjunto tiene un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente con el grupo aldehído.

14. El método de la reivindicación 1 donde las proteínas incluyen fosfoproteínas.

15. El método de la reivindicación 1 donde la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente digerir al menos una porción de las proteínas con enzimas para generar péptidos.

16. Un método para comparar proteínas de interés entre al menos dos muestras diferentes que comprende:

(a) preparar una mezcla de proteínas de cada una de dichas al menos dos muestras;

(b) proporcionar un conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes elegidos entre colorantes capaces de unirse covalentemente a dichas proteínas de dicha mezcla de proteínas, donde cada colorante de dicho conjunto

(1): tiene características iónicas y de pH donde la migración relativa de una proteína marcada con uno cualquiera de dichos colorantes es la misma que la migración relativa de dicha proteína marcada con otro colorante de dicho conjunto,

(2): emite luz luminiscente a una longitud de onda que es suficientemente diferente de la luz luminiscente emitida por los demás colorantes de dicho conjunto para proporcionar una señal luminosa detectable diferente;

(c) hacer reaccionar cada una de dichas mezclas de proteínas de la etapa (a) con un colorante diferente de dicho conjunto de la etapa (b) para proporcionar proteínas marcadas con colorante;

(e) separar las diferentes proteínas marcadas con colorante de interés en dicha mezcla combinada mediante un método cromatográfico; y

17. El método de la reivindicación 16 donde dicho conjunto de colorantes luminiscentes coincidentes son colorantes de cianina que tienen la siguiente estructura:

8

donde cada una de las líneas de puntos representa los átomos de carbono necesarios para la formación de uno a tres anillos condensados que tienen de cinco a seis átomos en cada anillo, cada X e Y se selecciona entre el grupo compuesto por O, S y CH_{3}-C-CH_{3}, m es un entero de 1 a 3, uno de R_{1} y R_{2} es un grupo reactivo y el otro es un alquilo.

18. El método de la reivindicación 16 donde cada colorante tiene al menos un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por isotiocianato, isocianato, N-hidroxisuccinimidil éster, imido éster, glioxal, ácido carboxílico, haloacetamida, maleimida, haluro de alquilo, haluro de ácido, azida, hidrazida, hidrazina, cetona y amino.

19. El método de la reivindicación 16 donde las proteínas tienen sitios de unión seleccionados entre el grupo compuesto por lisina, ácido carboxílico y grupos sulfhidrilo.

20. El método de la reivindicación 16 donde el método cromatográfico comprende cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de intercambio iónico.

21. El método de la reivindicación 16 donde las proteínas son glicoproteínas que tienen grupos azúcar terminales y la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente la etapa de oxidar los grupos azúcar terminales para formar grupos aldehído; y cada colorante de dicho conjunto tiene un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente con el grupo aldehído.

22. El método de la reivindicación 16 donde las proteínas son fosfoproteínas y el colorante incluye un grupo imidazol, comprendiendo adicionalmente dicho método añadir carbodiimida a dicha mezcla de proteínas y colorantes para la reacción de la etapa (c).

23. El método de la reivindicación 16 donde la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente digerir al menos una porción de las proteínas con enzimas para generar péptidos.

24. Un método para comparar proteínas de interés entre al menos dos muestras diferentes que comprende:

25. El método de la reivindicación 24 donde el método cromatográfico comprende cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de intercambio iónico.

26. El método de la reivindicación 24 donde las proteínas son glicoproteínas que tienen grupos azúcar terminales y la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente la etapa de oxidar los grupos azúcar terminales para formar grupos aldehído; y cada colorante de dicho conjunto tiene un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente con el grupo aldehído.

27. El método de la reivindicación 24 donde la preparación del extracto de proteínas comprende adicionalmente digerir las proteínas con enzimas para generar péptidos.

28. El método de la reivindicación 24 donde las proteínas son fosfoproteínas y el colorante incluye un grupo imidazol, comprendiendo adicionalmente dicho método añadir carbodiimida a dicha mezcla de proteínas y colorantes para la reacción de la etapa (c).

29. El método de la reivindicación 24 donde cada colorante tiene al menos un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por isotiocianato, isocianato, N-hidroxisuccinimidil éster, imido éster, glioxal, ácido carboxílico, haloacetamida, maleimida, haluro de alquilo, haluro de ácido, azida, hidrazida, hidrazina, cetona y amino.