ES2231228T3 - Sistema de control de insectos. - Google Patents
Sistema de control de insectos.Info
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Abstract
Procedimiento para controlar una población de insectos destinatarios, que comprende: (i) proporcionar un gen que comprende una secuencia de codificación que codifica un constituyente de un sistema enzima/pro-fármaco y una zona reguladora unida operativamente a la secuencia de codificación en los insectos destinatarios de un modo específico para el sexo; (ii) transformar al menos parte de la población de insectos destinatarios con el gen y permitir a los elementos transponibles propagarse a la población de insectos destinataria; y (iii) administrar a la población de insectos destinatarios el(los) constituyente(s) restante(s) del sistema enzima/pro-fármaco, en el(los) que el enzima es capaz de catalizar la transformación del pro-plaguicida a plaguicida.
Description
Sistema de control de insectos.
La presente invención se refiere a procedimientos
para controlar las poblaciones de insectos utilizando técnicas
genéticas.
Los insectos son responsables de extensos daños a
los cultivos mundiales con enormes consecuencias económicas
correspondientes. Para tratar de reducir los daños infringidos por
los insectos, se han dedicado recursos al desarrollo y despliegue de
insecticidas, que controlan las poblaciones de insectos matando los
insectos destinatarios. Aunque los insecticidas son en muchos casos
eficaces, se sabe que son tóxicos a las formas de vida aparte de los
insectos destinatarios, que tienen importantes consecuencias
medioambientales. Sería por lo tanto ventajoso desarrollar
pro-insecticidas inactivos que se transformen en su
forma activa principalmente en el insecto destinatario.
Se han realizado intentos para controlar los
insectos por medios biológicos. Por ejemplo, los procedimientos
empleados actualmente para controlar las poblaciones de determinados
miembros de la clase de dípteros incluyen la liberación de hembras
estériles.
Por ejemplo, tal como se indica en la patente
U.S. nº 5.840.865, la mosca mediterránea de la fruta (mosca
mediterránea) Ceratitis capitata es la principal plaga
agrícola para muchas especies de frutos que está extendida
geográficamente en las regiones tropicales y templadas. La mosca
mediterránea se ha introducido relativamente hace poco tiempo en el
Nuevo Mundo y parece que se extiende rápidamente, amenazando las
áreas productoras de frutas en América del Norte (Carey, J.R.,
Science 253; 1369 (1991)). Como a mediados de los 70, la
técnica de insectos estériles se ha utilizado para la erradicación y
control de la mosca mediterránea. Este procedimiento se basa en la
disminución o en el desplome de las poblaciones de moscas después de
las liberaciones de gran número de insectos estériles en las áreas
infestadas y ofrece una alternativa ambientalmente atractiva a la
pulverización masiva con insecticidas (Knipling, E.F.,
Science 130: 902 (1959)).
Aunque la utilización de insectos hembra
estériles ralentiza el crecimiento de la población de mosca
mediterránea y puede conducir a su desplome temporal, no conduce a
la destrucción de los insectos hembra, que son responsables del daño
a los cultivos. Además, como las hembras estériles no se reproducen,
el procedimiento necesita liberaciones repetidas de hembras
estériles en el medio. Recientes mejoras incluyen la eliminación
potencial de hembras transgénicas en masa atacando por la
retaguardia los medios que utilizan los genes terminales inducibles
bajo el control del antibiótico tetraciclina (Heinrich y Scott,
PNAS 97: 8229-8232, 2000).
Por lo tanto continua siendo necesario un control
técnico de la mosca mediterránea y, de otros insectos y de otras
plagas que puedan destruir de forma selectiva los insectos hembra o
macho pero que sean más aceptables medioambientalmente que la
atomización en masa de insecticidas tóxicos y no requieran la
utilización a gran escala de antibióticos para mejorar las técnicas
de esterilización.
Además, muchos problemas sanitarios humanos y
veterinarios están relacionados con la extensión de enfermedades por
los insectos. Los ejemplos incluyen los mosquitos, las moscas
tse-tse y la mosca doméstica común. El control de
las poblaciones de insectos que ponen en peligro la salud humana o
animal también es por lo tanto deseable.
La presente invención proporciona un
procedimiento para controlar una población de insectos
destinatarios, que comprende:
a) proporcionar un gen que comprende una
secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-fármaco y un activador capaz de
conducir la secuencia de codificación en el insecto destinatario de
modo específico para el sexo;
b) transformar al menos parte de la población de
insectos destinatarios con el gen y permitir a los elementos
transponibles propagarse a la población de insectos destinataria;
y
c) administrar a la población de insectos
destinatarios el/los constituyente(s) restante(s) del
sistema enzima/pro-fármaco.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una
"población de insectos destinatarios" se refiere a un grupo de
insectos, ya sea delimitada por especies o líneas geográficas, o
ambas, que se desea controlar. Por ejemplo, una población de
insectos puede referirse a una especie de insectos dada que infesta
un cultivo determinado en un área geográfica dada. Por otra parte,
se puede referir a todos los insectos que infestan cualquier cultivo
en un área geográfica, o una especie dada sin referencia a ninguna
limitación geográfica, o a una población de insectos que es
responsable de un problema sanitario humano o veterinario, tal como
la propagación del paludismo. Los insectos destinatarios son los
miembros individuales de la población de insectos.
"Insecticida" tal como se utiliza en la
presente memoria significa cualquier plaguicida que se destine a
controlar cualquier insecto destinatario dirigiéndose a las células
del insecto. Los insecticidas que se pueden modificar según la
invención para ser pro-insecticidas incluyen pero no
se limitan a imidacloprid y metamidofos.
Los "pro-insecticidas",
"pro-fármacos" y
"pro-plaguicidas" se utilizan indiferentemente
y tal como se utilizan en la presente invención significan cualquier
sustancia sustancialmente inactiva o sustancialmente no tóxica en
ausencia de un enzima transformador o una mezcla que comprende dicha
sustancia que se puede transformar en sustancia activa o tóxica
mediante la acción de un enzima. Los
pro-insecticidas se pueden diseñar de forma
específica para el objeto o diseñar preferentemente modificando
químicamente los insecticidas existentes utilizando, por ejemplo,
metilación o acetilación como se pone de manifiesto en esta memoria.
El término "sustancialmente" tal como se utiliza en esta
memoria significa "pro-insecticida",
"pro-fármaco" y
"pro-plaguicida", que es al menos el 50%; 60%;
70%; 80%; 90%; 95%; 98% e incluyendo hasta el 100% inactivo en
comparación con la forma activa.
"Enzima" tal como se utiliza en esta memoria
significa una sustancia que cataliza la reacción incluyendo pero sin
limitarse a proteína o polipéptido o a un fragmento de dicha
proteína o polipéptido. Un "enzima" tal como se utiliza en esta
memoria cataliza una reacción que transforma un
pro-insecticida o pro-fármaco para
ser un insecticida o fármaco, respectivamente. Ejemplos de enzimas
incluyen pero no se limitan a oxidasas, esterasas y amidasas.
"Control" tal como se utiliza en esta
memoria se refiere a la limitación, prevención o reducción del
crecimiento, es decir de al menos aproximadamente el 10% por
generación, preferentemente al menos aproximadamente 50%, 80% o
incluso hasta e incluyendo el 100% de la población de insectos.
Preferentemente, esto se consigue matando los insectos
destinatarios. De forma ventajosa, se elimina la población de
insectos.
"Gen", tal como se utiliza en esta memoria
se refiere a una secuencia de ácido nucleico, generalmente ADN, que
codifica un polipéptido o proteína y que comprende además las
secuencias de ácido nucleico requeridas para transcribir la
secuencia de codificación en una célula huésped adecuada. La
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o proteína se
denomina en esta memoria "secuencia de codificación" y las
secuencias requeridas para la regulación de la transcripción de la
secuencia se denominan "secuencia de control" tal como
"potenciador" o "activador".
La secuencia de codificación codifica un
constituyente de un sistema enzima/pro-fármaco. El
constituyente puede ser una cualquiera o más partes del sistema,
mientras no sea autosuficiente para producir o transformarse en el
fármaco activo a partir del pro-fármaco. Por lo
tanto, el constituyente preferentemente es un enzima o un fragmento
de un enzima que es responsable de la activación del
pro-fármaco. Como alternativa, puede ser el propio
pro-fármaco. El/los constituyente(s)
restantes del sistema enzima/pro-fármaco se
administran aparte, por ejemplo por pulverización, matando de este
modo los insectos destinatarios que expresan la secuencia de
codificación según la invención.
Una característica de la presente invención es
que el activador utilizado para dirigir la transcripción de la
secuencia de codificación es funcionalmente activo de modo
específico para el sexo. Esto significa que la secuencia de
codificación se expresa prácticamente sólo en un sexo de los
insectos destinatarios, ya sea macho o hembra. Tal como se utiliza
en esta memoria, "prácticamente sólo" se refiere a una
selectividad para un sexo dado en la proporción de al menos
aproximadamente 70:30, 80:20, 90:10 ó preferentemente 100:0. El gen
que se utiliza para transformar los insectos se utiliza
preferentemente para transformar los insectos destinatarios hembra.
La transformación de los machos se prefiere especialmente cuando un
activador que se utiliza para llevar la secuencia de codificación
sea solamente funcional en los insectos hembra destinatarios. Esto
permite la destrucción selectiva de insectos hembra, a la vez que se
mantiene una población de insectos hembra que pueden morir con el
gen que comprende la secuencia de codificación mientras que
permanece inalterada por el pro-fármaco. Este
planteamiento es muy ventajoso cuando la hembra es responsable de
propagar los daños o la enfermedad.
En los casos en los que el macho es responsable
de la propagación de los daños o de la enfermedad, se puede invertir
la técnica, de modo que una secuencia de codificación solamente
funcional en insectos macho es propagada por hembras portadoras.
La invención proporciona además un insecto de un
sexo dado, insecto ha sido transformado con un gen que comprende una
secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-fármaco y una zona reguladora,
preferentemente activadora, unida operativamente y capaz de dirigir
la secuencia de codificación prácticamente sólo en insectos del sexo
opuesto. Después de la selección en masa de las condiciones de
ataque los insectos supervivientes se pueden erradicar opcionalmente
para la utilización de técnicas de insectos estériles.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
un vector que es capaz de transformar una célula del insecto
destinatario, cuyo vector comprende un gen que comprende una
secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-fármaco y un activador capaz de
dirigir la secuencia de codificación en insectos destinatarios de
modo específico para el sexo.
Fig. 1. Representación esquemática del transposón
YP/GFP. Hsp70P es un activador y Hsp70T es la secuencia terminal del
gen Hsp70 de D. melanogaster (Loukeris et al. 1995,
Science 270, 2002-2005). C. c. blanco
significa el ADNc blanco natural de Ceratitis capitata
(Zwiebel et al. 1995, Science 270, 2005 Loukeris et
al. 1995, Science 270, 2002-2005). GFP es
el mutante S65T del gen de Aequorea victoria que codifica la
proteína verde fluorescente (Heim et al., Nature
373:663-664, 1995). YP1P es el activador/potenciador
del cuerpo grueso del gen que codifica la proteína 1 de la yema de
Drosophila melanogaster. El fragmento XholI
BamHI que contiene el activador/potenciador YP1 (desde las
bases -362 a +54, número de registro X01524 del banco de genes) se
obtuvo por PCR del ADN de Drosophila (cepa yw). El
transposón está clonado en el vector del plásmido
pTZ18-19 (Pharmacia).
Fig. 2. Expresión de las moscas GFP bajo el
control del activador YP de Drosophila en Drosophila
melanogaster. (A) Macho homocigótico transformado; (B) hembra
heterocigótica transformada; (C) hembra homocigótica transformada;
(D) hembra no transformada. El mismo campo se fotografió para
epifluorescencia (parte superior) y para epifluorescencia con luz
tenue incidente (parte inferior), para demostrar las moscas no
fluorescentes.
Fig. 3. Expresión específica de la hembra de GFP
en moscas mediterráneas bajo el control del activador YP de
Drosophila. A la izquierda se presenta una hembra
transformada. A la derecha se presenta un macho transformado. Parte
superior: epifluorescencia. Parte inferior: luz incidente.
Fig. 4. Análisis por transferencia Western de la
expresión dirigida por el activador YP de GFP en moscas
Drosophila melanogaster. El número que identifica la línea
transformada está indicado en la parte superior como C que significa
una mosca de referencia, no transformada, 42.1, 19.3 y 21.2. F
indica una mosca hembra y M indica una mosca macho. Se
homogeneizaron grupos de diez moscas (de 2 a 5 días) en
Tris\cdotHCl en 20 mM pH 8,0 conteniendo EDTA 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 5 mM y NaCl 30 mM. Se sometió
un sobrenadante de centrifugación a 14.000xg a
SDS-PAGE y se transfirió a un filtro de
nitrocelulosa. Para la detección se utilizó un anticuerpo monoclonal
anti-GFP (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA) y un anticuerpo secundario comercial acoplado a la peroxidasa de
rábano picante. Los fragmentos de peso molecular alto son debidos al
fondo.
Fig. 5. Sensibilidad de D. melanogaster
(cepa yw) a 5-FU. Se utiliza de forma
rutinaria la cepa yw como receptor para la generación de
líneas transgénicas. Se atacan las moscas en pienso normal para
Drosophila enriquecido con 5-FU a las
concentraciones indicadas de 0 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM y 50 mM
de 5-FU. El eje x representa el tiempo en días y el
eje y representa el número de moscas. Los puntos de los datos
representan el número de moscas supervivientes.
Fig. 6. Letalidad dependiente de la dosis de
D. melanogaster para 5-FU. El eje x
representa la concentración de 5-FU en mM y el eje y
representa el número de moscas. Las moscas de la cepa yw que
se utilizaron en el experimento de transformación descrito
anteriormente, se atacaron con pienso normal para Drosophila
enriquecido con 5-FU a las concentraciones indicadas
y se determinaron las moscas recién nacidas después de 9 días. Cada
uno de los puntos de los datos representa la media \pm desviación
estándar de los tres experimentos independientes, cada uno con 100
moscas.
La presente invención es aplicable al control de
cualquier población de insectos destinatarios, que comprende
cualquier insecto destinatario, si la población es homogénea o
heterogénea. Por ejemplo, los insectos que se controlan utilizando
la presente invención incluyen pero no se limitan a Bactrocera
oleae (mosca del olivo) que afecta a los cultivos del olivo;
Bactrocera orientales (mosca de la fruta oriental) que afecta
a muchos cultivos frutales; Heliothis armigera (gusano
bellotero del algodón) que afecta al algodón; Trichoplusa ni
(oruga de la calabaza) que afecta a las calabazas; Manduca
sexta (gusano cornudo del tabaco) que afecta al tabaco;
Lobesia botrana (mariposa de la vid) que afecta a las uvas;
Anopheles gambiae (mosquito) que produce el paludismo;
Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla) que produce la
fiebre amarilla; Glossina morsitans (mosca
tse-tse) que produce la tripanosomosis (enfermedad
del sueño); Simulium sp. (mosca negra) que produce la
oncocercosis (ceguera de los ríos); Phlebotomus sp. (mosca de
la arena) que produce la leishmaniosis visceral
(kala-azar); Musca domestica (mosca
doméstica) que propagan muchas infecciones bacterianas. En la forma
de realización preferida, la presente invención se utiliza en
poblaciones de insectos que incluyen o están constituidas por la
mosca mediterránea de la fruta, C. capitata (mosca
mediterránea).
Los genes del enzima que transforma el
pro-fármaco, conocidos también como genes
"suicidas" se han utilizado para activar posteriormente los
fármacos citotóxicos de forma selectiva en las células tumorales
transfectadas. Los sistemas enzima/pro-fármaco son
conocidos en la técnica. Un pro-fármaco es un
fármaco, con frecuencia un fármaco potencialmente tóxico, que se
activa de forma selectiva, es decir se vuelve tóxico, por la acción
de un enzima. Los sistemas enzima/pro-fármaco se
basan en la administración de una enzima a las células u organismos
destinatarios, antes de la administración del
pro-fármaco. Únicamente las células u organismos
destinatarios que expresen el enzima serán afectados por el
pro-fármaco. Un sistema
enzima/pro-fármaco frecuente es el sistema
5-fluoruracilo/citosina desaminasa, en el que el
precursor no tóxico 5-fluorcitosina
(5-FC) se transforma en el fármaco citotóxico
5-fluoruracilo (5-FU) por la acción
de la citosina desaminasa (véase Austin & Huber, (1993) Mol.
Pharmacol. 43:380-387).
En una forma de realización, los enzimas que se
pueden utilizar para transformar un pro-plaguicida
en un plaguicida activo, tales como esterasas, amidasas y oxidasas
de función mixta que se denominan también P450, se pueden
caracterizar y clonar a partir de una variedad de organismos,
incluyendo eurobacterias, arqueobacterias y eucarioides. Una
estrategia típica para utilizar dicha enzima, p.ej., metabolizar un
pro-plaguicida específico, implicaría la
identificación de organismos por la presencia de la actividad
enzimática. Para este fin se puede utilizar un grupo de organismos,
tal como un grupo de bacterias del suelo cultivadas, un grupo de
tejidos o células de insectos o un grupo de tejidos o células
vegetales.
La identificación se puede realizar, por ejemplo,
incubando el pro-plaguicida con un extracto de
tejidos o de bacterias. En el caso de las oxidasas con función mixta
que se localizan en los microsomas de los tejidos eucarióticos, se
puede utilizar una fracción microsómica como fuente de actividad. Se
puede aislar una fracción microsómica por procedimientos rutinarios
de fraccionamiento subcelular. Se pueden utilizar sobrenadantes de
los extractos celulares a alta velocidad para otros enzimas
solubles. La determinación de la actividad enzimática se puede
realizar detectando el/los producto(s) de reacción por
tecnologías analíticas químicas normalizadas bien conocidas por los
expertos en la materia. Por ejemplo, se puede(n) separar
el/los producto(s) de reacción utilizando cromatografía de
gases (GC). Se puede utilizar la espectrometría de masas acoplada a
GC (GCMS) para confirmar la estructura de los compuestos.
Una vez determinada la actividad enzimática, se
puede clonar el gen que codifica el enzima activador utilizando
varios procedimientos de clonación diferentes bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, se genera un banco de ácidos nucleicos del
organismo utilizando la tecnología de ADN recombinante normalizada.
Se puede cribar un banco genómico para genes bacterianos o un banco
ADNc para genes eucarióticos utilizando metodología normalizada.
En una forma de realización, se utiliza la
hibridación con sondas de ácido nucleico de un gen relacionado,
p.ej. una esterasa clonada o el gen P450 de un organismo relacionado
por evolución. Como alternativa, se puede realizar la identificación
por complementación. En este último planteamiento, se utiliza un
banco de expresión, es decir un banco construido en un plásmido con
expresión disponible en el comercio o un vector viral, para
transfectar células que no expresan normalmente la actividad
enzimática y se aísla el clon que contiene el gen activador por
identificación de las colonias individuales del banco para la
expresión de la actividad enzimática. Un gen recién identificado se
puede clonar a continuación en vectores útiles según la invención,
se describe más adelante.
Los pro-fármacos, además de ser
inactivos en organismos o células que no pueden transformarles,
pueden tener también otras ventajas, tales como una mejor
solubilidad en los lípidos y/o estabilidad química.
Las toxinas de los
pro-insecticidas o de los
pro-fármacos que se han diseñado para ser
convertibles únicamente en determinados insectos, son conocidas en
la técnica y han sido preparadas, por ejemplo, por modificación
selectiva de la toxina final, especialmente en el caso de los
organofosfatos y de los carbamatos. Los ejemplos incluyen
precursores de los inhibidores de acetilcolinesterasa, tales como
paratión y profenofós, que son oxidados en insecticidas activos por
enzimas de la familia P-450 del citocromo. Sin
embargo, la aplicación de pro-insecticidas a
poblaciones de insectos mata únicamente los insectos que expresan de
forma natural el enzima. Para hacer que las plagas de insectos que
no expresan de forma natural el enzima transformador susceptible se
necesita la transferencia del gen que codifica el enzima
transformador en el huésped y un medio de transferencia del gen de
un modo medioambientalmente aceptable dentro de la población de
insectos destinatarios.
En una forma de realización, el enzima
transformador que codifica la secuencia codifica el enzima esterasa
que transforma DPX-JW062 en su metabolito activo
como da a conocer Wing et al. incorporado a esta memoria como
referencia (Wing et al., Arch Insect Biochem Physiol
37:91-103, 1998). El
pro-insecticida es, en este aspecto de la invención,
DPX-JW062. DPX-JW062 es un compuesto
de oxadiazina biotransformado en lepdóptera en una potente toxina
que bloquea los canales del sodio de entrada del voltaje.
DPX-JW062 tiene baja actividad/toxicidad en otros
organismos. Por consiguiente, la expresión de la lepdóptera que
transforma el enzima en otros insectos hará a los insectos
destinatarios vulnerables a la toxicidad provocada por
DPX-JW062.
Como alternativa, la secuencia de codificación
codifica un enzima de la familia del citocromo
P-450. Aunque la mayoría de los insectos posee
enzimas de la familia del citocromo P-450, la
eficacia de la bioconversión de los
pro-insecticidas transformados por dichos enzimas se
puede aumentar transformando el insecto con un enzima más eficaz y/o
sobreexpresado, permitiendo una disminución de la dosis eficaz de
pro-insecticida. Los
pro-insecticidas adecuados en este aspecto de la
invención incluyen los organofosfatos y los carbamatos. Por ejemplo,
el pro-insecticida puede ser un inhibidor de
acetilcolinesterasa tal como paratión y profenofós. La clonación y
la expresión de los enzimas del citocromo P-450 del
órfido responsables de la transformación del paratión y del
profenofós permitirían una ampliación del intervalo susceptible a
través de la expresión desaparecida en especies de insectos de otro
modo resistentes.
En general, los genes útiles en la puesta en
práctica de la invención, así como los vectores que los codifican,
se pueden preparar según planteamientos normalizados utilizados en
biología molecular. Véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª ed.,
John Wiley & Sons, Inc.
Un gen que codifica la citosina desaminasa (CD)
es un ejemplo de enzimas transformadores de
pro-fármacos. La citosina desaminasa (CD; EC
3.5.4.1) del enzima bacteriano codificada por cod A está
presente en muchas bacterias y hongos pero está ausente en plantas y
animales superiores. CD cataliza la desaminación de citosina a
uracilo. Los microorganismos que expresan el gen CD transforman a
través de un mecanismo similar la 5-fluorcitosina
(5-FC) no tóxica en el
5-fluoruracilo (5-FU), metabolito
muy tóxico que es letal para la célula. Ya que los organismos
superiores no expresan normalmente la citosina desaminasa, no
metabolizan normalmente la citosina a uracilo. Además no desaminan
5-FC. El 5-FC no es tóxico para los
eucariotas a concentraciones que producen actividad
anti-microbiana intensa. Sin embargo,
5-FU tiene potentes efectos citotóxicos en las
células eucarióticas y se utiliza ampliamente como agente
quimiterapéutico en el tratamiento del cáncer. El
5-FU se metaboliza a 5'-trifosfato
de 5-fluoruridina y 5'-monofosfato
de
5-flúor-2'-desoxiuridina,
inhibiendo tanto la síntesis de ARN como de ADN y produciendo la
muerte celular. Por lo tanto, las células eucarióticas modificadas
genéticamente para expresar CD deberían transformar
5-FC en 5-FU y ser sensibles de
forma selectiva a 5-FC en comparación con las
células naturales no modificadas. Esto se demostró en primer lugar
utilizando las células humanas del carcinoma colorrectal
transfectadas con una construcción que expresa el CD bacteriano. Las
células de carcinoma colorrectal transfectadas son aproximadamente
600 veces más sensibles a 5-FC que las células no
transfectadas (Austin y Huber, 1993, Molec. Pharmacol. 43:
380-387).
Según una forma de realización adicional, el
pro-fármaco es un glucurónido de mostaza
p-hidroxianilina, que se transforma en la toxina de
la mostaza de p-hidroxi-anilina
mediante el enzima transformador
\beta-glucuronidasa, que debe estar localizada en
el espacio extracelular (Cheng et al., Biochem.
Pharmacol. 58:325-328, 1999). Preferentemente,
por lo tanto, la secuencia de codificación codifica la
\beta-glucuronidasa de E. coli.
Una "zona reguladora" que regula una
secuencia de codificación incluye uno o más activadores o uno o más
potenciadores.
Un "activador" se define en esta memoria
como una secuencia de nucleótidos que inicia la transcripción de un
gen que está relacionado operativamente con ésta. Un
"activador" y/o "potenciador" se encuentra en un fragmento
de ácido nucleico, que puede ser de cualquier tamaño, mientras
confiera la actividad indicada cuando se asocie operativamente con
un gen o con una secuencia de codificación en cuestión. El fragmento
puede ser, p.ej., 5 mil pares de bases (kb = 5000 pares de bases); 1
kb; 500 nucleótidos (nt); 200 nt; 100 nt; o incluso tan pequeño como
10 a 20 nt.
Los genes de la proteína de la yema se conservan
mucho (Sappington y Raikhel, 1995, Insect Biochem Mol. Biol.
28, 277-300). Se han caracterizado los sistemas
basados en numerosos genes de la proteína de la yema de
Drosophila, (Ronaldson y Bownes,1995, Genet Res.
66:9-17) y se utilizan para efectuar la expresión
del gen heterólogo específico de las hembras (véase, Heinrich y
Scott, 2000, PNAS 97:8229-8232; Thomas et
al., 2000, Science 287:2474-2476). Se han
caracterizado también los genes de la proteína de la yema para la
mosca mediterránea (Rina y Savakin, 1991, Genetics
127:769-780). La naturaleza conservada de los genes
de la proteína de la yema indican que los elementos reguladores que
dirigen los genes heterólogos en los insectos hembra se pueden
aislar y caracterizar utilizando el planteamiento genético
normalizado. De este modo están disponibles en la técnica los
activadores específicos del sexo adecuados para dirigir una
secuencia de codificación como se indicó anteriormente. En una forma
de realización preferida, se pueden utilizar los genes de
vitelogenina que codifican las proteínas de la yema como fuente de
activadores adecuados. En el caso en que los insectos destinatarios
sean moscas mediterráneas (C. capitata), se pueden utilizar
los activadores VG1 y VG2 tal como se describe en Rina y Savakin,
Genetics 127:769-780, 1991.
Potenciador Yp de Drosophila. Los genes de
la proteína de la yema (Yp) en Drosophila melanogaster siguen
un modelo de expresión extricto específico para el tejido, el sexo y
temporal, que se transcribe únicamente en el cuerpo grueso de la
hembra adulta y en las células del folículo del ovario. Un
potenciador del cuerpo grueso (FBE) situado 196 bp corriente arriba
del punto superior de Yp1 es suficiente para determinar la expresión
específica del sexo, de la fase y del cuerpo grueso tanto de los
genes yp1 como yp2, tal como describió Garabedian et al.,
Cell 45:859-867, 1985. Más recientemente, un
solo potenciador (33 bp) en el FBE se ha supuesto que está implicado
en la regulación de la expresión génica de yp. Este potenciador
específico para las hembras y para el cuerpo grueso consta de dos
elementos potenciadores (o y r). Un elemento (22 bp) contiene dos
puntos de unión a la proteína, el dsx A y un bzip1 solapante, que se
une a la proteína DmC/EBP (slbo), un miembro de la familia
bZIP de activadores de transcripción. El otro elemento es un punto
de unión de 11 bp para una proteína desconocida (An y Wensink, 1995,
EMBO J. 14:1221-1230).
La transformación de los insectos destinatarios
se puede realizar utilizando una técnica adecuada para preparar
insectos transgénicos. Actualmente, existen varias técnicas
reconocidas en la materia tales como la transfección del ADN que
utiliza transgesones, la utilización de vectores víricos y la
utilización de vectores episómicos que se transmiten a través de las
células reproductoras. Preferentemente, la transformación se realiza
utilizando un vector adecuado. La invención proporciona de este modo
un vector que es capaz de transformar una célula del insecto
destinatario, cuyo vector comprende un gen que comprende una
secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-fármaco y un activador capaz de
llevar la secuencia de codificación a los insectos destinatarios de
forma específica para el sexo.
Preferentemente, el vector es una transposición o
un elemento que se puede transponer. La invención proporciona por
consiguiente un procedimiento como el indicado anteriormente, en el
que la etapa de transformación comprende las etapas de:
(a) proporcionar una transposición bien como
elemento que se puede transponer que codifica una proteína
transposasa que es activa en los insectos destinatarios; un ARN que
codifica una transposasa o una proteína purificada de
transposasa.
(b) modificar el elemento que se puede transponer
insertando elementos reguladores y el gen que codifica la actividad
enzimática; y
(c) transformar los insectos destinatarios con el
elemento modificado que se puede transponer en presencia de la
actividad de transposasa.
Los transposones son elementos genéticos que son
capaces de "saltar" o de cambiar desde una posición a otra
dentro del genoma de una especie. Están ampliamente distribuidos
entre los animales, incluyendo los insectos. Los transposones son
activos dentro de sus especies huésped debido a la actividad de una
proteína transposasa codificada por los propios elementos. Los
avances en la comprensión de los mecanismos de transposición han
dado como resultado el desarrollo de herramientas genéticas basadas
en los transposones que se pueden utilizar para la transferencia
génica.
Se puede utilizar cualquier elemento activo que
pueda cambiar de posición en el insecto destinatario deseado.
Preferentemente, sin embargo, el elemento que puede cambiar de
posición se selecciona de entre la superfamilia de transposones
Tet/Mariner que está constituida esencialmente por Minos, mariner,
Hermes y piggyBac.
Minos es un elemento que puede cambiar de
posición que es activo en la mosca mediterránea. Está descrito en la
patente U.S. nº 5.840.865. La utilización de Minos para transformar
los insectos se describe en la patente U.S. anterior.
Mariner es un transposón aislado en origen de
Drosophila, pero descubierto desde hace tiempo en varios
invertebrados y especies de vertebrados. La utilización de mariner
para transformar los organismos se describe en la solicitud de
patente internacional WO99/09817.
Hermes procede de la mosca doméstica común. Su
utilización en la creación de insectos transgénicos se describe en
la patente U.S. nº 5.614.398.
PiggyBac es un transposón procedente del huésped
del baculovirus Trichplusia ni. Su utilización para la
transformación de la línea reproductora de la mosca mediterránea ha
sido descrita por Handler et al., (1998) PNAS (USA)
95:7520-5.
Según la presente invención, se generan insectos
que se liberan en poblaciones naturales de insectos. Los insectos
transgénicos de la invención se entrecruzarán por consiguiente con
las poblaciones naturales para producir insectos destinatarios que
sean vulnerables a un pro-insecticida. La invención
se refiere de este modo a un insecto de un sexo dado, insecto que ha
sido transformado con un gen que comprende una secuencia de
codificación que codifica un constituyente de un sistema
enzima/pro-fármaco y un activador capaz de dirigir
la secuencia de codificación prácticamente en insectos del sexo
opuesto. Preferentemente, el insecto es un insecto macho.
Preferentemente el insecto puede ser atacado en masa. Más
preferentemente, el insecto es una mosca mediterránea.
Para crear pro-insecticidas no
tóxicos, los insecticidas disponibles actualmente se pueden hacer
inactivos modificando un grupo químico que se requiere para la
actividad biológica. Dichos grupos incluyen, pero no se limitan a
grupos amino o imino. La modificación se puede llevar a cabo, por
ejemplo, por metilación o acetilación.
La activación metabólica es un proceso enzimático
en la especie destinataria que transforma el plaguicida en una
estructura biológicamente más activa. De este modo, los inhibidores
débiles o los no-inhibidores pueden ser cambiados
frecuentemente en productos de toxicidad letal por sistemas
diseñados para degradar compuestos xenobióticos (pág. 129 en
Insecticide Mode of Action ed. Joel R. Coats, Academic Press,
1982).
En el campo general de los insecticidas de
fosfato, el proceso de activación más frecuente mediado por la
oxidasa de función mixta es la transformación de P\rightarrowS en
P\rightarrowO, p.ej. paratión en paraoxón. (Nakatsogawa y Morelli,
1976; Ero, 1974; Fukuto, 1978).
En una forma de realización de la invención, se
puede utilizar el sistema de
pro-plaguicida-plaguicida
acefato-metamidofós. Metamidofós (fosforamidoticato
de O, S-dimetilo, C_{2}H_{8}NO_{2}PS) fue
introducido en 1969 por Chevron Chemical y Bayer. Es un
insecticida/acaricida de organofosfato residual, generalizado, muy
activo por contacto y acción estomacal. Metamidofós es un potente
inhibidor de acetilcolinesterasa (AchE). Es eficaz contra los
insectos masticadores y succionadores y se utiliza para controlar
áfidos, pulgas, gusanos, moscas blancas, trípidos, orugas de la
calabaza, escarabajos de la patata de Colorado, barrenadores de la
patata, gardamas, ácaros, saltahojas y muchos otros. Se ha
determinado la toxicidad de metamidofós en índices LD_{50} oral
agudos de 21 y 16 mg/kg de peso corporal para ratas macho y hembra
respectivamente.
Acefato es un
N-acetil-derivado de metamidofós
(acetilfosforamidoticato de O, S-dimetilo,
C_{9}H_{10}NO_{3}P_{5}) que ha sido introducido por Chevron
Chemical como una mejora de segunda generación de metamidofós. Se
utiliza para el control de una amplia gama de insectos picadores y
succionadores, especialmente áfidos, incluyendo las especies
resistentes, en frutos, vegetales (p.ej., patatas y remolachas
azucareras), vino y cultivo de lúpulo y en horticultura (p.ej., en
cultivos al aire libre de rosas y crisantemos). Acefato y su
metabolito principal, metamidofós, son tóxicos para Heliothis
spp. que se consideran resistentes para otros insecticidas de
organofosfato. Se ha determinado la toxicidad de acefato como índice
A de LD_{50} oral agudo 945 y 866 mg/kg para ratas macho y hembra
respectivamente (45 a 54 veces menos tóxico que su metabolito
metamidofós).
El propio acefato no es un inhibidor de AchE; su
transformación en metamidofós, que es un inhibidor, requiere una
escisión mediada por el enzima del enlace
carbonilo-N. Casi todos los sistemas vivos contienen
amidasas que se escinden en amidas alifáticas sencillas. Sin
embargo, el acefato no es una amida sencilla y algunas amidasas no
específicas pueden encontrarlo un sustrato pobre. Metamidofós ha
sido observado como el metabolito principal de acefato en plantones
de alubia, calabaza y tomate (Tucker, 1972, Report, Chevron Chemical
Company, Richmont, California). La escisión del enlace
carbonilo-N no es un proceso no específico, como se
indica en las observaciones de esta actividad de las amidasas
activadoras, es muy sensible a las variaciones en la estructura del
acefato.
Parece ser que existe una relación directa de la
reacción de activación y de la toxicidad en los insectos
destinatarios. En la oruga de las yemas del tabaco Heliothis
virescens, acefato y metamidofós presentan una actividad
comparable. Se observó una pequeña cantidad de metamidofós en la
larva del gusano a las 2 horas de una aplicación tópica de acefato.
Sin embargo, en el gorgojo de bola Anthonomus gran adulto el
metamidofós de Boheman es 75 veces más tóxico que el acefato a pesar
de la rápida absorción de ambos compuestos. No se observó ningún
metabolismo de acefato a metamidofós en el gorgojo de bola, un hecho
coherente con su baja toxicidad (Bull, 1979, J. Agric. Food
Chem. 27:268).
Muchos organismos vivos poseen una o más amidasas
que escinden una fracción importante de acefato aplicada a
metamidofós. Los animales tal como la rata (Tucker, 1976) y la mosca
blanca hembra (Kao y Fukuto, 1977) también transforman una cantidad
significativa de acefato o de sus análogos en metamidofós. En su
estudio de los análogos de propionilo y hexanoilo, Kao y Fukuto
fueron capaces de relacionar la toxicidad directamente con la
cantidad de activación. Esto sugiere de forma acusada que el acefato
no transformado es esencialmente no tóxico.
De este modo la combinación de un gen que
codifica un enzima amidasa capaz de transformar el acefato en su
forma activa metamidofós hará a los insectos susceptibles a
aplicaciones del acefato previamente no tóxico.
Se ha publicado también que la toxicidad de los
análogos de acefato para la mosca doméstica es coherente con la
cantidad de metamidofós formado metabólicamente; el análogo de
propionilo genera prácticamente más metamidofós en esta especie y es
35 veces más tóxico (Kao y Fukuto, 1977, Pestc. Biochem.
Physiol. 7:83).
En otra forma de realización de la invención,
Imidacloprid
(1-[8-cloro-3-piridinil)metil]-N-nitro-2-imidazolidinimina,
C_{9}H_{10}CIN_{5}O_{2}) y
N-Me-imidacloprid se pueden utilizar
como un sistema pro-plaguicida.
Imidacloprid es un insecticida generalizado, de
cloro-nicotinilo para el control de los insectos
succionadores incluyendo saltahojas del arroz, áfidos, trípidos,
moscas blancas, termitas, insectos del césped, insectos del suelo y
algunos escarabajos. Es el utilizado más frecuentemente en el arroz,
cereales, maíz, patatas, vegetales, remolachas azucareras, frutos,
algodón, lúpulo y césped y es especialmente generalizado cuando se
utiliza para el tratamiento de semillas o del suelo. El producto
químico actúa por interferencia con el receptor nicotinérgico de
acetilcolina (nAcR) que es más abundante en insectos que en los
animales de sangre caliente. Es eficaz por contacto y por acción
estomacal (Kidd, H. y James, D.R, Eds. The Agrochemicals
Handbook, tercera edición. Royal Society of Chemistry
Information Services, Cambridge, UK, 1991 (actualizada).
10-2). Se ha determinado la toxicidad de
imidacloprid como LD_{50} aguda oral en ratas es 450 mg/kg de
peso corporal.
N-Me-imidacloprid
es un pro-insecticida de imidacloprid. La
introducción de un grupo metilo en la posición 3 de imidacloprid con
anillo de imidazol disminuye la afinidad de unión a nAcR 100 veces.
Sin embargo, N-Me-imidacloprid es
tan potente como imidacloprid en la mosca doméstica.
N-Me-imidacloprid se puede
transformar en imidacloprid mediante un sistema de oxidasa con
función mixta in vitro (Yamamoto et al., 1998,
Arch. Insect Biochem. Physiol. 37:24). El compuesto no está
disponible en el comercio. Actualmente, no existen datos de
toxicidad disponibles para
N-Me-imidacloprid.
La transformación de
N-Me-imidacloprid en imidacloprid en
la mosca doméstica indica la presencia de enzimas capaces de
efectuar la transformación del pro-plaguicida.
Véase Magee (1982) en Structure-Act In Vivo
relationships in phosphoramidates, cap. 5, Insecticide made
action Academic Press.
El derivado resultante
(pro-plaguicida) puede ser metabolizado en el
plaguicida activo por enzimas o "enzimas activadoras" que
tienen lugar o son transfectados en los insectos destinatarios. Se
pueden utilizar varios enzimas activadores incluyendo pero sin
limitarse a oxidasas (P450), esterasas y amidasas.
En resumen un gen que codifica un enzima
activadora que transforma un pro-plaguicida en un
plaguicida activo se introduce en el genoma de la especie de la
plaga que no produce normalmente el enzima activador o tiene bajos
niveles de enzima activador. La expresión específica del sexo del
enzima activador en la población de la plaga destinataria aumenta la
propagación del gen en la población de la plaga local cuando se
combina con la aplicación del pro-pesticida de
forma generalizada o no generalizada. En la forma de realización
preferida que se produce en la eliminación selectiva de la población
hembra de la plaga. Los machos supervivientes recombinantes que se
cruzan a continuación llevan el gen de activación a través de la
población local que resulta después de ciclos de aplicación de
pro-insecticida en la reducción o eliminación de
plagas hembra y por consiguiente en la reducción o eliminación de
una población de la plaga local viable.
El diseño de un pro-pesticida que
se basa en un pesticida registrado tal como imidacloprid tiene una
importante ventaja económica sobre la introducción de un nuevo
pro-pesticida: se utiliza la toxicología conocida
del pesticida en lugar de establecer el análisis de la toxicología
extensa de un nuevo compuesto lo que disminuye el tiempo de
comercialización y los costes del análisis toxicológico.
Utilizando procedimientos normalizados, se
prepara una construcción genética que lleva el iniciador C.
capitata VG1 unido operativamente a un ADNc que codifica la
citosina desaminasa de E. coli. El gen de citosina
desaminasa, cuando se introduce en las células del insecto, comunica
sensibilidad al pro-fármaco
5-FC.
La construcción se inserta en el transposón Minos
utilizando técnicas convencionales y, además, las descritas en la
patente U.S. nº 5.840.865. Se utiliza a continuación el transposón
modificado para transformar la mosca mediterránea según los
procedimientos de transgénesis normalizados.
Se reproducen moscas transgénicas que llevan el
transposón modificado para crear cepas transgénicas que expresan el
enzima citosina desaminasa. La caracterización de la actividad de
citosina desaminasa demuestra que el enzima se expresa a un alto
nivel de forma selectiva en las hembras. Además, la expresión de
citosina desaminasa se correlaciona con la vulnerabilidad al
pro-fármaco 5-FC administrado en el
pienso a las moscas.
Se reproduce una cepa muy susceptible y se aíslan
las moscas macho. La introducción de moscas macho en una población
de moscas no transgénicas produce la transferencia rápida del
transgén. Las moscas hembra que han nacido heredando el transgén son
susceptibles a 5-FC, mientras que las moscas macho
permanecen resistentes.
Se utilizaron dos oligonucleótidos específicos
que corresponden a la secuencia publicada del gen CD (Austin y
Huber, 1993, Molec. Pharmacol. 43:380-387) en
la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se utilizó el primer
oligonucleótido para introducir un codón de iniciación "ATG"
con consenso Kozak más íntimamente compatible en lugar de "GTC"
en la secuencia publicada. El oligonucleótido
5'-CGGGATCCACCATGTCGAATAACGCTTTAC-3'
corresponde al extremo 5' de la secuencia CD pero cambia el codón de
iniciación desde GTG hasta ATG, más íntimamente compatibles con la
secuencia de consenso Kozak (Kozak, 1986, Cell
44:283-292). El segundo oligonucleótido introdujo el
sitio de restricción BamHI comenzando 9 bp corriente arriba del ATG.
El oligonucleótido
5'-GCTCTAGATCAACGTTTGTAATCGATGGC-3'
corresponde al extremo 3' de la secuencia CD y contiene un sitio de
restricción Xba I. Se amplificó por PCR un fragmento
de ADN de 1,3 kb del gen CD modificado utilizando el ADN de
plantilla a partir de una cepa de E. coli azul de XL1. El
producto de la PCR se clonó en un vector pGEM-T
fácil (Promega, Madison, WI).
Como primera etapa en la construcción de un
vector de expresión de CD específico de hembras, se clonó un
fragmento Not I que contiene el gen de CD en
pCasper-hs. El vector pCasper-hs
(Thummel y Pirota, 1992, Technical Notes. D.I.S. 71; 150) es
un elemento P basado en el vector de transformación que contiene una
construcción promotor/terminador de Hsp70 que se puede utilizar para
expresar los marcos de lectura abiertos bajo control por choque
térmico. En una segunda etapa, el plásmido resultante,
pCasper-hs-CD se cortó con
XhoI/Bgll I y se utilizó un fragmento de
XholI/BamHI que contiene el activador/potenciador de
YP1 para sustituir al activador Hsp70. Se utilizó el vector
pCasper-YP-CD del plásmido
resultante para transformar a Drosophila.
Se generaron diez líneas transgénicas de
Drosophila utilizando la transformación de la línea
reproductora mediada por Minos, llevando cada una una sola copia de
un transposón (MiYP/GFP-w) que contiene el gen de
Aequorea victoria para el GFP llevado por el
activador/potenciador del cuerpo grueso Yp1 de Drosophila
melanogaster (Fig. 1). En todas las líneas, la fluorescencia de
GFP es detectable en el cuerpo grueso de las hembras adultas, es
dependiente de la dosis, pero es indetectable en los machos adultos
(Fig. 2). Se han generado 15 líneas transgénicas de mosca
mediterránea utilizando el mismo transposón. La Fig. 2 presenta la
expresión específica de las hembras de GFP dirigida por el activador
YP de Drosophila en una de estas líneas de mosca
mediterránea.
La expresión específica del sexo de la proteína
GFP en algunas de estas líneas transgénicas ha sido también
documentado por análisis de transferencia Western utilizando un
anticuerpo GFP-monoclonal disponible en el comercio
(Fig. 4).
Se realizó la transformación utilizando la
metodología descrita anteriormente (Rubin y Spradling, 1982,
Science 218, 348-353). Se detectaron
transfomantes al identificar la progenie G1 de las moscas inyectadas
para la expresión del marcador blanco dominante presente en
pCasper-YP-CD.
Se determinó la actividad de la enzima CD tanto
en moscas transformadas hembras como machos y en una cepa yw que
carece de expresión CD. Se analizó espectrofotométricamente la
capacidad de las moscas para desaminar 5-FC a
5-FU tal como se describió anteriormente (Austin y
Huber, 1993, Molec. Pharmacol. 43:380-387).
En resumen, se homogeneizaron moscas congeladas en tampón de
homogeneización (Tris-Cl 100 mM, pH 7,4, ácido
etilendiaminatetracético [EDTA] 1mM,
\beta-mercaptoetanol 5mM y PMSF 0,5 mM) utilizando
un homogeneizador Ultra-Turrex. Se centrifugó el
homogeneizado a 14.000 g durante 30 min y se utilizó el sobrenadante
para el análisis. Se midió la actividad CD en una mezcla de análisis
de 1 ml conteniendo Tris-Cl 50 mM, pH 7,3, 50 \mul
de sobrenadante y citosina 0,5 mM ó 5-FC. Se
midieron las disminuciones en la absorbancia a 285 nm a lo largo del
tiempo. Se estimó el producto utilizando un coeficiente de extinción
molar de 1,038 x 10^{-3} M^{-1} cm^{-1} para citosina a
uracilo y 1,96 mM^{-1}cm^{-1}para 5-FC a
5-FU.
Se analizaron también por
SDS-PAGE los extractos totales de mosca que se
prepararon para los análisis enzimáticos de CD descritos
anteriormente. Se detectó un fragmento que migra con un peso
molecular aparente de aproximadamente 52.000 en los extractos
preparados de moscas hembras transformadas; este fragmento no fue
detectable en las moscas no transformadas o en las moscas macho
trasformadas. Se confirmó la identidad de la banda de 52 kD con el
análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo
policlonal para CD.
Para evaluar los efectos de 5-FU
en una cepa yw de D. melanogaster, se criaron moscas en
primer lugar en un medio conteniendo 5-FU. Se
cultivaron grupos de 25 moscas en pienso conteniendo varias
concentraciones del fármaco. Se utilizaron cuatro viales de cada
concentración del fármaco para cada experimento y se realizaron tres
experimentos. Se hizo el recuento de las moscas supervivientes por
vial durante un periodo de tiempo. La Fig. 5 presenta las cantidades
de supervivencia a lo largo del tiempo para varias concentraciones
de fármaco; la Fig. 6 presenta la respuesta a la dosis para la
supervivencia a los nueve días. El tratamiento con
5-FU produjo la muerte eficaz de las moscas en un
intervalo de concentración de 30 a 50 mM a los 9 días. No se
pusieron huevos en el pienso que contiene más de 20 mM de
5-FU.
De forma similar se determinó los efectos del
pro-fármaco 5-FC en las moscas
adultas transformadas. El tratamiento con
pro-fármaco de las moscas no transformadas no
produjo ninguna reducción de la viabilidad de las moscas.
Se determinó el efecto del
pro-fármaco 5-FC en las moscas
transformadas por CD criando las moscas con pienso que contiene
varias concentraciones de 5-FC. Las moscas hembras
CD presentaron una reducción sustancial de la viabilidad al aumentar
5-FC cuando se compara con las moscas macho CD.
Otras formas de realización serán obvias para los
expertos en la materia. Debe entenderse que la descripción detallada
anterior se proporciona solamente en aras de la claridad y
únicamente a título de ejemplo.
Claims (24)
1. Procedimiento para controlar una población de
insectos destinatarios, que comprende:
(i) proporcionar un gen que comprende una
secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-fármaco y una zona reguladora
unida operativamente a la secuencia de codificación en los insectos
destinatarios de un modo específico para el sexo;
(ii) transformar al menos parte de la población
de insectos destinatarios con el gen y permitir a los elementos
transponibles propagarse a la población de insectos destinataria;
y
(iii) administrar a la población de insectos
destinatarios el(los) constituyente(s)
restante(s) del sistema enzima/pro-fármaco,
en el(los) que el enzima es capaz de catalizar la
transformación del pro-plaguicida a plaguicida.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el activador es activo para expresar la secuencia de
codificación principalmente en insectos macho destinatarios.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la zona reguladora es activa para expresar la secuencia de
codificación principalmente en insectos hembra destinatarios.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica un enzima que transforma un pro-plaguicida
en su metabolito activo.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica un enzima amidasa que transforma un
pro-plaguicida en su metabolito activo.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica un oxidasa/citocromo P450 funcional mixto que transforma un
pro-plaguicida en su metabolito activo.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica un enzima esterasa que transforma un
pro-plaguicida en su metabolito activo.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica una citosina desaminasa.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de codificación
codifica una \beta-glucuronidasa.
10. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el pro-pesticida comprende un derivado de
organofosfato, fosforamidato, neonicotinoide o de oxadiazina.
11. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el pro-plaguicida/enzima de activación
comprende:
(i) acefato o un análogo de acefato; y
(ii) una amidasa capaz de transformar el acefato
o un análogo de acefato en su metabolito activo metamidofós.
12. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el pro-plaguicida/ enzima de activación
comprende:
(i)
N-Me-imidacloprid o un análogo de
N-Me-imidacloprid; y
(ii) un oxidasa/citocromo P450 funcional mixto
capaz de transformar
N-Me-imidacloprid o un análogo de
N-Me-imidacloprid en su metabolito
activo imidacloprid.
13. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el enzima de activación del pro-plaguicida
comprende:
(i) DPX-JWO62 o un análogo de
DPX-JW062; y
(ii) una esterasa capaz de transformar
DPX-JW062 o un análogo de DPX-JW062
en su metabolito activo.
14. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el pro-plaguicida/enzima de activación
comprende además 5-FC.
15. Vector que es capaz de transformar una célula
del insecto destinatario, cuyo vector comprende un gen que comprende
una secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-plaguicida y una zona reguladora
operativamente unida a la secuencia de codificación en insectos
destinatarios de un modo específico para el sexo, en el que el
enzima es capaz de catalizar la transformación del
pro-plaguicida en plaguicida.
16. Vector que es capaz de transformar una célula
del insecto destinatario, cuyo vector comprende un gen que comprende
una secuencia de codificación que codifica un constituyente de un
sistema enzima/pro-plaguicida y un promotor capaz de
controlar la secuencia de codificación en insectos destinatarios de
un modo específico para el sexo, en el que el enzima es capaz de
catalizar la transformación del pro-plaguicida en
plaguicida.
17. Vector según la reivindicación 15 y 16, que
es un transposón.
18. Transposón según la reivindicación 17, que es
el transposón Minos.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el insecto destinatario es
Ceratitis capitata.
20. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que el promotor es un promotor de gen de la proteína de la yema
de Ceratitis capitata.
21. Insecto de un sexo dado que ha sido
transformado con un gen que comprende una secuencia de codificación
que codifica un constituyente de un sistema
enzima/pro-plaguicida y un promotor capaz de
controlar la secuencia de codificación prácticamente sólo en los
insectos del sexo opuesto, en el que el enzima es capaz de catalizar
la transformación del pro-plaguicida en
plaguicida.
22. Insecto según la reivindicación 21, que es un
insecto macho.
23. Insecto macho seleccionado según las
reivindicaciones 21 y 22 y a continuación irradiado para unas
aplicaciones en una técnica de obtención de insectos estériles.
24. Insecto según la reivindicación 23, que es
Ceratitis capitata.
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