ES2229669T3

ES2229669T3 - Peptidos antimicrobianos.

Info

Publication number: ES2229669T3
Application number: ES99902926T
Authority: ES
Inventors: Arie Van Nieuw Amerongen; Engelmundus Cornelis Ignatius Veerman; Willem Van't Hof; Eva Josephine Helmerhorst
Original assignee: Barnaux Healthcare BV
Current assignee: Barnaux Healthcare BV
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: DE69920877T2; CA2319094A1; WO1999037678A2; JP2003524578A; EP1051433A2; AU759026B2; NL1008139C2; DE69920877D1; ATE278710T1; US6638531B1; CA2319094C; AU2301499A; WO1999037678A3; EP1051433B1

Abstract

Péptidos con actividad antimicrobiana, teniendo los péptidos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre KRLFKKLKFSLRKY (péptido 9) KRLFKKLLFSLRKY (péptido 10) LLLFLLKKRKKRKY (péptido 11)

Description

Péptidos antimicrobianos.

La presente invención se refiere a nuevos péptidos con una actividad antimicrobiana. La actividad antimicrobiana se dirige particularmente contra bacterias, hongos y levaduras.

El uso de los antibióticos conocidos ya no es suficiente en un creciente número de casos para el tratamiento de infecciones. Muchas cepas bacterianas han desarrollado resistencia a las clases conocidas de antibióticos y en los últimos treinta años no se han descubierto nuevas clases de antibióticos. En vista de lo anterior, es muy deseable una nueva clase de agentes antimicrobianos. Los péptidos y las proteínas alcalinas que se encuentran en la saliva tienen una actividad bactericida y fungicida in vitro. Las histatinas forman una familia conocida de dichos péptidos salivares. Sin embargo, para ser también clínicamente aplicables es deseable que la actividad antimicrobiana sea incluso superior. Una mayor actividad compensa la degradación proteolítica del agente que ocurre siempre en un mayor o menor grado. Además, es deseable una degradación proteolítica reducida en relación con los péptidos de origen natural. Finalmente, desde un punto de vista económico con respecto a la producción de los péptidos, se recomienda que los agentes antimicrobianos sean relativamente pequeños.

El objeto de la presente invención es proporcionar nuevos agentes antibacterianos y antifúngicos que no tengan las desventajas indicadas anteriormente y que cumplan en todo lo posible los requisitos recomendados.

Esto se consigue con la invención mediante péptidos formados por una cadena de aminoácidos que contiene un dominio de 10 a 25 aminoácidos, en la que la mayoría de los aminoácidos de una mitad del dominio son aminoácidos cargados positivamente y la mayoría de la otra mitad del dominio son aminoácidos no cargados.

La estructura de estos péptidos tiene diversas variaciones. En primer lugar, el dominio puede formar una hélice \alpha, de la cual al menos una mayoría de las posiciones 1, 2, 5, 6, 9, (12, 13, 16, 19, 20, 23 y 24) contiene un aminoácido cargado positivamente, la posición 8 es un aminoácido cargado positivamente o no cargado y al menos la mayoría de las posiciones 3, 4, 7, 10, (11, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 25) contiene un aminoácido no cargado. Estos péptidos tienen una anfipaticidad lateral, es decir, un momento hidrófobo máximo a 100º. Expresado de una manera sencilla, estos péptidos son hidrófobos en el lado izquierdo e hidrófilos en el lado derecho o viceversa. Estos péptidos se denominan de "tipo I" en el presente documento.

El dominio puede formar además una hélice \alpha, de la cual al menos una mayoría de las posiciones 1, 2, 5, 6, 9, (12, 13, 16, 19, 20, 23 y 24) contiene un aminoácido no cargado, la posición 8 es un aminoácido cargado positivamente o no cargado y al menos la mayoría de las posiciones 3, 4, 7, 10, (11, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 25) contiene un aminoácido cargado positivamente. Estos péptidos tienen una anfipaticidad lateral, es decir, un momento hidrófobo máximo a 100º. Expresado de una manera sencilla, estos péptidos son hidrófobos en el lado derecho e hidrófilos en el lado izquierdo o viceversa. Estos péptidos se denominan de "tipo II" en el presente documento y son en principio simétricamente especulares a los péptidos de tipo I.

Además, el dominio puede formar una hélice \alpha, en la que al menos una mayoría de las posiciones 1 a 6 (o 7 u 8 ó 9 ó 10 u 11 ó 12) contiene un aminoácido no cargado y un aminoácido cargado positivamente se encuentra en la posición 7 (u 8 ó 9 ó 10 u 11 ó 12 ó 13) a 25. Estos péptidos tienen una anfipaticidad longitudinal, es decir, un momento hidrófobo mínimo a 100º. Estos péptidos son hidrófobos en su "parte superior" e hidrófilos en su "parte inferior". Dichos péptidos se designan como de "tipo III".

A la inversa, el dominio puede formar una hélice \alpha, en la que al menos una mayoría de las posiciones 1 a 6 (o 7 u 8 ó 9 ó 10 u 11 ó 12) contiene un aminoácido cargado positivamente y un aminoácido no cargado se encuentra en la posición 7 (u 8 ó 9 ó 10 u 11 ó 12 ó 13) a 25. Estos péptidos tienen igualmente una anfipaticidad longitudinal y por lo tanto un momento hidrófobo mínimo a 100º. Estos péptidos son hidrófobos en su "parte inferior" e hidrófilos en su "parte superior". Dichos péptidos se designan como de "tipo IV".

Por último, el dominio puede formar una denominada lámina \beta y contiene un aminoácido cargado positivamente en al menos una mayoría de las posiciones 1, 3, 5, 7, 9 (11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25) y un aminoácido no cargado en al menos una mayoría de las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, (12, 14, 16, 18, 20, 22, 24). Dicha lámina \beta es lateralmente anfipática y tiene un momento hidrófobo máximo a 180º. La estructura de lámina \beta es más plana que la de la hélice \alpha y, expresado de una manera sencilla, es hidrófoba en la izquierda e hidrófila en la derecha o viceversa. Estos son péptidos de "tipo V".

Los aminoácidos cargados positivamente se eligen preferiblemente del grupo formado por ornitina (O), lisina (K), arginina (R) e histidina (H), mientras que los aminoácidos no cargados se eligen preferiblemente del grupo formado por los aminoácidos alifáticos glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), los aminoácidos con una cadena lateral dipolar metionina (M), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), los aminoácidos con una cadena lateral aromática fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). Los aminoácidos en el límite entre hidrófilos e hidrófobos se pueden elegir de ambos grupos o de los aminoácidos restantes.

En principio, apenas se puede detectar alguna diferencia en la actividad cuando uno de los aminoácidos positivos y/o uno de los aminoácidos no cargados se sustituye por un aminoácido al azar. La mayoría de los aminoácidos cargados positivamente es, por lo tanto, el número total de los aminoácidos cargados positivamente menos 1 y la mayoría de los aminoácidos no cargados es preferiblemente el número total de aminoácidos no cargados menos
1.

El dominio puede ser una parte de un péptido mayor pero también puede constituir por sí mismo todo el péptido. Cuando el dominio forma parte de un péptido mayor, los aminoácidos C terminal y/o el N terminal que entonces están presentes pueden ser aminoácidos al azar.

Se recomiendan particularmente los siguientes péptidos del tipo I:

KRLFKKLKFSLRKY

\hskip1cm

(péptido 9)

KRLFKKLLFSLRKY

\hskip1,2cm

(péptido 10)

Un péptido particularmente preferido del tipo III tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

LLLFLLKKRKKRKY

\hskip1,2cm

(péptido 11)

Los péptidos según la invención también pueden contener modificaciones adicionales. Estas modificaciones son, por ejemplo, un anillo amida N terminal, por ejemplo con anhídrido de ácido acético, o una ruptura alternativa de la resina de síntesis mediante la cual se modifica el C terminal. Para esto último se puede prever una sustitución del grupo ácido carboxílico C terminal por un grupo amida, éster, cetona, aldehído o alcohol. Los péptidos con dicha modificación son por ejemplo:

KRLFKELKFSLRKY-amida

\hskip1cm

(péptido 12)

KRLFKELLFSLRKY-amida

\hskip1cm

(péptido 13)

Además de los péptidos sencillos, también se pueden fabricar oligómeros. Éstos son preferiblemente oligómeros lineales de los péptidos según la invención. La unión puede ser cabeza-a-cabeza y cola-a-cola así como cabeza-a-cola, mediante síntesis directa o mediante unión enzimática post-sintética. Para una formación del poro trans-membrana se requiere una longitud de péptido mínima. Los oligómeros de los péptidos según la invención tienen doble longitud y por lo tanto son más capaces en principio de abarcar toda la doble capa fosfolípida de la membrana celular bacteriana de una vez. La actividad del péptido se podría mejorar más aún mediante esto. Además, la extensión de los péptidos proporciona la estabilización de la conformación de hélice. Normalmente se debe insertar un separador. En la síntesis directa de los oligómeros unidos cabeza-a-cola se puede insertar un separador para fijar mediante el uso de una cadena de aminoácidos no naturales de la correcta longitud, por ejemplo \beta-alanina, ácido \gamma-amino butírico, ácido \varepsilon-amino caproico, etc. Se usan reactivos de unión heterodifuncionales, como son los comercialmente disponibles para unir antígenos peptídicos a proteínas transportadoras (por ejemplo 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), 3-[piridilditio]propionato de N-succinimidilo (SPDD) etc.) para fabricar oligómeros lineales con un separador insertado. Para uniones cabeza-a-cabeza y cola-a-cola se pueden usar aminoácidos trivalentes como ácido asparagínico (D), ácido glutamínico (E), ornitina (O), lisina (K), serina (S), cisteína. Dichos oligómeros son por ejemplo:

^{\alpha}N,^{e}N-(KRLFKKLKFSLRKY)_{2}K-amida

\hskip1cm

(péptido 18)

Los péptidos 14 y 15 (Tabla 1) se obtienen mediante síntesis del péptido 2 con una cisteína N terminal respectivamente C terminal adicional, en la que después se obtiene el oligómero mediante oxidación al aire. El péptido 18 se obtiene al hacer uso de la estrategia de Péptido Antigénico Múltiple (MAP), en la que se usó como primer aminoácido en la resina de síntesis una lisina que tiene en ambos grupos \alpha- y \varepsilon-amino una protección Fmoc, por la cual se sintetizaron simultáneamente dos cadenas de aminoácidos idénticas (péptidos 2, 3 y 9) en una molécula de
lisina.

Los péptidos descritos en la presente memoria descriptiva no tienen o tienen apenas alguna actividad hemolítica en tampones fisiológicos como PBS (solución salina tamponada con fosfato). Una baja actividad contra eritrocitos de origen humano es una indicación de baja toxicidad. Esta selectividad es esencial para el uso de estos péptidos como antibióticos.

Los péptidos según la invención se pueden usar en o como un agente antibacteriano, en o como un agente antifúngico y en o como un agente contra la infección por levaduras. Su actividad se ilustrará más a fondo en los ejemplos adjuntos.

La invención por lo tanto se refiere más aun a los péptidos para uso como agente antibacteriano, para uso como un agente antifúngico y para uso como un agente anti-micótico.

También es parte de la invención el uso de los péptidos para fabricar una medicina para el tratamiento de infecciones bacterianas y para la fabricación de una medicina para el tratamiento de infecciones fúngicas y/o infecciones por levaduras.

Los péptidos según la invención se pueden usar en diferentes formas farmacéuticas de administración. Son particularmente recomendadas los nebulizadores, los ungüentos, los geles y las pastillas. Estas formas de administración se pueden usar para controlar bacterias de levaduras, como Candida, en la cavidad oral, en la piel, en ganado o en la comida, y hongos.

La invención se ilustra más a fondo en los ejemplos adjuntos, que sólo se proporcionan a modo de ilustración y no limitan la invención de ninguna forma.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de péptidos

Los péptidos según la invención se sintetizaron químicamente según describieron Van 't Hof y col. (1991) y Helmerhorst y col. (1997). Los péptidos se sintetizaron usando el procedimiento de bolsa T, que se adaptó para 9-fluorenilmetoxicarbonilo (química de (Fmoc)). Las resinas de alcohol p-benciloxibencílico a las que los primeros aminoácidos de protección N-Fmoc ya estaban unidos, se dispusieron en las bolsas T. Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo en N,N-dimetil formamida. Tras la finalización de la cadena de aminoácidos se separó de la resina y se retiraron simultáneamente los grupos de protección de la cadena lateral con una mezcla de 5% de tioanisol, 5% de fenol, 5% de agua y 85% de ácido trifluoroacético. Los análisis de pureza se llevaron a cabo mediante HPLC en fase inversa y mostraron un único pico con sólo unos pocos contaminantes (menos de 5%).

Todos los péptidos se disolvieron en tampón fosfato potásico (PPB) 10 mM, pH 7,0, a una concentración de 2 mg/ml y se almacenaron a -80ºC. El pH final de la solución de reserva fue 6,0. Las concentraciones de péptido exactas que se usaron en el ensayo antibacteriano se determinaron mediante análisis de aminoácidos.

La Tabla 1 proporciona una visión general de los péptidos 2 a 13 que se fabricaron de este modo. Los péptidos 1 y 2 de esta tabla muestran respectivamente la histatina 5 y la parte C terminal de ésta. Los aminoácidos en negrita son cambios en relación con el péptido 2.

Ejemplo 2 Actividad antibacteriana contra monocultivos in vitro

Se cultivaron monocultivos de las bacterias Streptococcus mutans (R9), Streptococcus sanguis (SB 179), Streptococcus salivarius (SS 196), Actinomyces naeslundii (WVU 627), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Prevotella intermedia (T588) y Veillonella parvula (ATCC 17745) hasta una fase logarítmica tardía en BHI (Difco), se lavaron tres veces en tampón fosfato potásico 10 mM (PPB) y se diluyeron hasta una suspensión de 10^{6} UFC/ml. Se mezclaron en vasos Eppendorf de polipropileno (Costar) 250 \mul de esta suspensión por duplicado con 250 \mul de una solución de péptido antimicrobiano según la invención (la concentración de péptido final fue 100 \mug/ml) y se incubaron durante media hora a 37ºC en condiciones aeróbicas. El tratamiento de control se llevó a cabo en PPB 10 mM sin
péptido.

Después de la incubación las muestras se centrifugaron, se retiraron 400 \mul del sobrenadante y se añadieron 400 \mul de PBS (fosfato sódico 9 mM pH 7,0 en NaCl 150 mM), en el que los péptidos son inactivos. Las muestras se diluyeron más aun en PBS y se depositaron 50 \mul de diluciones de diez veces y de mil veces en agar sangre (Difco) para realizar recuentos de viabilidad.

Los resultados de las pruebas se muestran en la tabla 2. Ésta muestra que los péptidos según la invención tienen una actividad claramente superior a la histatina 5 de origen natural.

TABLA 1

100

TABLA 2

1

Ejemplo 3 Inhibición del crecimiento

El crecimiento de la levadura Candida albicans, Torulopsis glabrata y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se analizó al hacerlos crecer en agar en el que se pusieron 10 \mug de cada uno de los péptidos según la invención. La tabla 3 muestra el resultado. "+" designa una inhibición completa del crecimiento, "+/-" designa una inhibición parcial y "-" significa sin inhibición.

TABLA 3

2

Ejemplo 4 Inhibición de la producción de ácido láctico

Todos los péptidos según la invención se analizaron para comprobar su capacidad para inhibir la producción de ácido láctico de las bacterias Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius y Lactobacillus rhamnosus. La formación de ácido láctico es una medida para la actividad metabólica.

Para este fin se cultivaron células de bacterias durante 1 hora en PPB 10 mM con 0,5 de glucosa y diferentes concentraciones de los péptidos. La formación de ácido láctico se monitorizó por medio de espectrofotometría. La tabla 4 muestra el resultado. "+" designa una inhibición completa a 4-20 \mug/ml de péptido, "-" significa sin inhibición de la formación del ácido láctico a > 100 \mug/ml de péptido.

TABLA 4

3

Ejemplo 5 Aniquilación de levaduras

Se incubaron 5 * 10^{6} células de Candida pseudotropicalis, Candida albicans 10231, Cryptococcus neoformans, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida glabrata y Candida albicans 32345 y un mutante deficiente en ergosterol de éstas durante una hora y media a 37ºC en presencia de una serie de dilución de un péptido según la invención o anfotericina B en tampón de fosfato potásico 1 mM, pH 7,0. La viabilidad se determinó mediante depositado. Se usó como control positivo PGLa sintética ("Proteína que comienza con Glicina y termina con Leucin-amida", con la secuencia de aminoácido GMASKGAIAGKIAKVALKAL-amida). El control negativo fue un péptido formado por los residuos 1 a 14 de cistatina S sintética (SSSKEENRIIPGGI). La anfotericina es una medicación antimicótica conocida. Sin embargo hay un mutante de Candida albicans (de cepa 32354), que no tiene ergosterol en su membrana celular y que es resistente a la anfotericina B. Los valores de CI_{50} son concentraciones de péptidos en las que el 50% del inóculo es aniquilado. La Tabla 5 muestra el resultado.

TABLA 5

4

Ejemplo 6 Actividad antibacteriana en una biopelícula oral artificial

Se fabricó una biopelícula oral artificial al colocar discos de hidroxiapatita durante cinco días en un sistema de cultivo continuo de siete tipos de bacterias aeróbicas y anaeróbicas (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Actinomyces naeslundii, Veillonella parvula, Prevotella intermedia y Fusobacterium nucleatum).

Los discos con la biopelícula formada sobre éstos se incubaron posteriormente durante media hora con diferentes concentraciones de péptido en tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 7,0. La biopelícula se trató entonces con ultrasonidos a partir de los discos, se diluyó en PBS y se depositó en placas de agar semi-selectivas. Los recuentos anaeróbicos totales se contaron (Streptococci + Actinomyces) en placas de agar sangre incubadas aeróbicas, los valores Gram-negativos totales (Veilonella, Fusobacterium y Prevotella) en placas que contienen vancomicina y los recuentos totales en agar sangre incubado anaeróbico. Un péptido inactivo de la Proteína de la Glándula de Von Ebner (VEGh, 3-21: LLASDEEIQDVSGTWYLKA) se usó como control negativo.

Los resultados se muestran en la tabla 6. En la presente memoria descriptiva "*" significa que la aniquilación es significativamente mayor que la del control negativo (p < 0,05).

TABLA 6

5

Ejemplo 7 Actividad antimicrobiana en bacterias orales

Para determinar si los péptidos según la invención también son activos contra bacterias como las que se encuentran en la boca, las bacterias se recogieron de la saliva y la placa. La saliva se agitó en un mezclador vorticial y se centrífugo. El aglomerado se lavó con tampón de fosfato potásico 10 mM y se incubó durante una hora a 37ºC con tampón (control negativo), péptido 10 (100 \mug/ml; invención), PLGa (100 \mug/ml; control positivo) y clorhexidina (50 ppm). La tabla 7 muestra el resultado.

TABLA 7

6

Ejemplo 8 Aniquilación de bacterias mediante péptido 10 en comparación con histatina 5

Se incubaron 10^{6} bacterias de los tipos Klebsiella (ATCC 43816) y Pseudomonas aeruginosa (PA01, aislamiento clínico) durante 1 hora a 37ºC en tampón de fosfato sódico 10 mM con caldo de soja tríptica al 1% (pH 7,4) en presencia de 25 ó 50 \mug/ml de histatina 5, 3,12, 6,25, 12,5, 25 ó 50 \mug/ml de péptido 10, 10 \mug/ml de protegrina (control positivo), 50 \mug/ml de péptido 4 o sin péptido (ambos controles negativos). Además se incluyó un blanco que no se incubó durante una hora a 37ºC (t = 0 min). Las unidades formadoras de colonias de cada muestra se determinaron entonces por medio de cultivo en placas en una DST (Prueba de Sensibilidad Diagnóstica).

La figura 1A muestra un histograma del número de unidades formadoras de colonias (UFC) de cada muestra con Klebsiella. La Figura 1B muestra los resultados para Pseudomonas.

Ejemplo 9 Aniquilación de Candida albicans mediante péptido 10 en comparación con histatina 5 con distintos tiempos de incubación

Se incubaron 10^{6} Candida albicans durante 1 ó 3 horas a 37ºC en tampón de fosfato sódico 10 mM con Sabouraud al 1% (pH 7,4) en presencia de 25, 50 ó 100 \mug/ml de histatina 5, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 ó 100 \mug/ml de péptido 10, 10 \mug/ml de protegrina (control positivo), 50 \mug/ml de péptido 4 o sin péptido (ambos controles negativos). Además se incluyó un blanco que no se incubó durante una hora a 37ºC (t = 0 min). Las unidades formadoras de colonias de cada muestra se determinaron entonces como se describe anteriormente con las placas Sabouraud.

La Figura 2A muestra un histograma del número de unidades formadoras de colonias (UFC) de cada muestra después de 1 hora de incubación. La Figura 2B proporciona los resultados para 3 horas de incubación.

Ejemplo 10 Aniquilación de especies de Salmonella y Yersinia mediante péptido 10

El péptido 10 se añadió en una concentración de 50 \mug/ml a un cultivo con 10^{6} bacterias de Salmonella typhimurium. Con fines de control se incluyó como blanco un cultivo al que no se le hubo añadido nada. El número de UFC se determinó en los puntos en los que el tiempo fue 0, 1, 2 y 3 horas. Se hizo lo mismo con Yersinia enterocolitica (PYv+). A partir de las figuras 3A y 3B respectivamente puede verse que al añadir el péptido 10 el número de bacterias cae por debajo del límite de detección.

Como puede verse a partir de los ejemplos anteriores, los péptidos según la invención tienen una actividad antibacteriana, antimicótica y antifúngica considerablemente mayor que la histatina 5 de origen natural. También se ha descubierto que los péptidos particulares tienen un efecto aniquilador en microorganismos que son resistentes a agentes antimicrobianos usados en la actualidad.

Claims

1. Péptidos con actividad antimicrobiana, teniendo los péptidos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre

KRLFKKLKFSLRKY

\hskip1cm

(péptido 9)

KRLFKKLLFSLRKY

\hskip1,2cm

(péptido 10)

LLLFLLKKRKKRKY

\hskip1,2cm

(péptido 11)

2. Péptidos según la reivindicación 1, en la que el extremo N está amidado.

3. Péptidos según la reivindicación 1 ó 2, en los que el grupo ácido carboxílico C terminal está sustituido por un grupo amida, éster, cetona, aldehído, o alcohol.

4. Oligómeros de dos o más péptidos según las reivindicaciones 1-3.

5. Péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso como un agente antibacteriano.

6. Péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso como un agente antifúngico.

7. Péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso como un agente antimicótico.

8. Uso de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un medicamento para tratar infecciones bacterianas.

9. Uso de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un medicamento para tratar infecciones fúngicas.

10. Uso de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un medicamento para tratar infecciones provocadas por levaduras.

11. Composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos según las reivindicaciones 1-4 y uno o más excipientes adecuados.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11 en la forma de un nebulizador, un ungüento, un gel o una pastilla.