ES2229386T3

ES2229386T3 - Nuevos piconavirus, vacunas y kits diagnosticos.

Info

Publication number: ES2229386T3
Application number: ES97939321T
Authority: ES
Inventors: Bo Niklasson
Original assignee: Apodemus AB
Current assignee: Apodemus AB
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2017-09-09
Also published as: US20070003574A1; EA199900286A1; AU4143597A; WO1998011133A1; ATE278709T1; US7101554B2; JP4440345B2; DE69731106D1; US20070003573A1; DE69731106T2; EP0941240B1; SE9603305D0; JP2001500503A; US7855277B2; EP0941240A1; US20030044960A1

Abstract

NUEVO GRUPO DE PICORNAVIRUS QUE, EN LA ZONA NO CODIFICANTE DE SU GENOMA VIRAL, COMPRENDEN UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CORRESPONDE A LA SECUENCIA DE ADNC (I) O SECUENCIAS HOMOLOGAS QUE TIENEN UNA HOMOLOGIA DE, POR LO MENOS, EL 75% CON ESTA, Y QUE PROVOCAN ENFERMEDADES EN LOS MAMIFEROS. SE DESCRIBE TAMBIEN UNA PROTEINA QUE CORRESPONDE A UNA PROTEINA DE LOS PICORNAVIRUS, UN ANTICUERPO O UN ANTISUERO DIRIGIDO CONTRA UNA PROTEINA DE LOS PICORNAVIRUS, UN ANTIGEN QUE COMPRENDE UNA PROTEINA DE LOS PICORNAVIRUS, FUNDAS DE DIAGNOSTICO, VACUNAS, Y EL USO DE LOS PICORNAVIRUS EN LOS MEDICAMENTOS, ESPECIALMENTE PARA TRATAR O PREVENIR LA MIOCARDITIS, LA MIOCARDIOPATIA, EL SINDROME DE GUILLAIN - BARRE, LA DIABETES DEL AZUCAR, LA ESCLEROSIS EN PLACAS, EL SINDROME DE FATIGA CRONICA, LA MIASTENIA GRAVE, LA ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA, LA DERMATOMIOSITIS, LA POLIOMISITIS, EL ABORTO ESPONTANEO Y EL SINDROME DE LA MUERTE SUBITA DEL RECIEN NACIDO. SE DESCRIBEN TAMBIEN UNOS PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO PARALAS ENFERMEDADES INDUCIDAS POR LOS PICORNAVIRUS.

Description

Nuevos picornavirus, vacunas y kits diagnósticos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos picornavirus, proteínas expresadas por los virus, antisueros y anticuerpos dirigidos contra los mencionados virus, antígenos que comprenden proteínas estructurales de los mencionados virus, kits diagnósticos, vacunas, uso de los mencionados virus, antisueros y antígenos en medicamentos y métodos para tratar o prevenir enfermedades causadas por los virus mencionados, tales como miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillain Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes.

Antecedentes de la invención

Recientemente se ha observado un síndrome de muerte súbita entre guías de montaña suecos. De aproximadamente 200 guías de montaña de élite, seis murieron por miocarditis durante 1989-1992 (1). La labor de guía, tratando de encontrar el camino más rápido/más corto entre varios puntos de control y frecuentemente, en zonas forestales, es excepcional en cuanto a la exposición al ambiente. Se ha especulado, por ello, sobre si el síndrome de muerte súbita entre los guías está causado por un agente infeccioso portado por un vector (roedor o artrópodo).

Se ha visto ahora en un estudio epidemiológico que la incidencia de muertes por miocarditis en el norte de Suecia siguió fluctuaciones de la población de 3-4 años (ciclos) del campañol (Clethrionomys glareolus) con un retraso de un año. Previamente se había visto que los cardiovirus, con roedores como s reserva natural, pueden causar el síndrome de Guillian Barré (GBS) en el hombre, diabetes mellitus (DM) en ratones y miocarditis en varias especies, incluidos primates no humanos. Además de la muerte por miocarditis, en el estudio epidemiológico se ha visto que el número de pacientes en los que se ha diagnosticado el síndrome de Guillain Barré (GBS) y diabetes mellitus (DM) en el norte de Suecia siguió las fluctuaciones de 3-4 años de la población de campañoles con diferentes tiempos de
retraso.

Sven Gard y colaboradores estudiaron la prevalencia de anticuerpos al virus de la encefalomielitis (EMCV) en la población sueca normal al comienzo de la década de los 50 (2). Estos estudios revelaron un grado de prevalencia de anticueros sorprendentemente alto mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación, pero no se pudieron confirmar sueros por el ensayo de neutralización. Se encontró que estos ensayos eran un enigma en ese momento, pero pudieron explicarse por la presencia de uno o varios picornavirus afines que circulan en Suecia.

El hecho de que los enterovirus tienen un gran número de miembros y de que los cardiovirus sólo posiblemente tres, podría reflejar la diversidad verdadera de los dos géneros o ser sólo el resultado del notable esfuerzo hecho para aislar nuevos virus de roedores en comparación con el hecho para aislar nuevos enterovirus de seres humanos.

Actualmente, la familia de picornavirus está dividida en cinco géneros (aftovirus, enterovirus, hapatovirus, rinovirus y cardiovirus) (3). Esta taxonomía inicialmente está basada en propiedades morfológicas, fisiológicas y serológicas así como en la capacidad patogénica de los virus. Más recientemente, sin embargo, los virus se han caracterizado sobre la base de su secuencia genómica, puesto que se ha establecido que, en gran parte, los datos de las secuencias coinciden con las propiedades de caracterización usadas previamente (4,5).

El virus prototipo del género de cardiovirus es el virus de la encefalomielites de murino (TMEV). Otro miembro de este género es el virus de la encefalomiocarditis (EMCV). El virus de Vilyuisk, aislado en Rusia de pacientes con una enfermedad neurológica degenerativa, serológicamente está relacionado con el TMEV, pero actualmente se considera si se incluye como tercer miembro distinto del género cardiovirus (6).

En la naturaleza, los cardiovirus tienen una distribución geográficamente muy extendida y hay un gran número de roedores que son huésped natural. Además de roedores, el EMCV se ha aislado de cerdos domésticos, elefantes, leones, primates no humanos y el hombre (7, 8, 9). La infección con TMEV y EMCV ha proporcionado excelentes modelos animales para inducir miocarditis, DM y diferentes trastornos neurológicos tales como enfermedades de pérdida de mielina que se asemejan a la esclerosis múltiple en ratones (10-16). Otros trastornos neurológicos o musculares en los que se sospecha que la infección es el factor desencadenante y en los que también hay un componente autoinmune son, cardiomiopatía, esclerosis múltiple (MS), síndrome de fatiga crónica (CFS), miastenia grave (MG) y esclerosis lateral amiotrópica (ALS). Sin embargo, nunca se ha establecido que el cardiovirus es un patógeno humano significativo, como muy frecuentemente se ha descrito en el hombre en informes de casos, o como infección medida en revisiones seroepidemiológicas (7-17).

Así, puede haber otros picornavirus aún no identificados que circula en la población de roedores salvajes y que ocasionalmente infectan al hombre, dando por resultado miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillian Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes, en individuos genéticamente susceptibles.

La unión epidemiológica entre enfermedades humanas importantes y la abundancia de roedores pequeños y lo que es conocido de antes sobre picornavirus/cardiovirus motivó intentos para aislar nuevos picornavirus de roedores pequeños.

Descripción del trabajo experimental como base para la invención Captura de animales

Se capturaron roedores pequeños en varias lugares del norte de Suecia y se transportaron vivos al Instituto Sueco para el Control de Enfermedades Infecciosas de Estocolmo, Suecia. Se registraron las especies, la fecha y el lugar en que se capturaron los animales. Los animales se sangraron usando anestesia y se sacrificaron. Se extrajeron inmediatamente los órganos y se almacenaron a -70ºC hasta que se comprobó la presencia de virus. Para el aislamiento de virus se ensayó un total de 53 Clethrionomys glareolus y 28 Microtus agrestis.

Aislamiento de virus

La técnica de aislamiento usada en el presente estudio es diferente de la muy frecuentemente se usa. Las células usadas para el aislamiento se mantuvieron como mínimo durante dos semanas y se detectó el crecimiento de virus tanto por CPE (efecto citopatogénico) como por tinción de las células por un gran número de sueros humanos usando IFT (ensayo de inmunofluorescencia). Ninguno de los nuevos virus presentados aquí hubiera sido aislado usando un procedimiento rutinario para detectar cardiovirus/ picornavirus. Crecen a un título más bajo y el CPE se manifiesta lentamente.

De cada animal, se analizaron separadamente saliva mezclada con homogeneizado de pulmón y heces. El animal se inoculó en un matraz T25 de células BHK-21 confluentes. Las células se hicieron pasar ciegas dos veces a la semana durante dos semanas. Al final de este período, o antes si se presentaban señales de CPE, las células se sacaban del matraz T25 con una espátula de goma, se ponían en portaobjetos de manchas de 10 pocillos, se secaban al aire y se fijaban con acetona. Las células se tiñeron luego con series de suero humano que incluyen los de 5 pacientes de esclerosis múltiple, 5 pacientes recientemente diagnosticados de DM y 5 atletas que murieron de miocarditis y de los que se tomaron muestras de sangre en la autopsia. Todos los matraces T25 (separadamente saliva-pulmón y heces) se ensayaron individualmente por ITF usando la serie completa de suero humano a una dilución de 1:10.

Para más análisis se seleccionaron las células que presentaban una reacción positiva por IFT usando las series de suero humano. El análisis incluía la inoculación intracerebral en ratones amamantados de 1 día, caracterización serológica y análisis de secuencia.

Antisueros y procedimientos serológicos

Las antisueros para los aislados de virus se implantaron en ratones (NMRI) y cobayas (Dunkin Hartley). A los animales se inyectó intraperitonealmente el material sobrenadante de un cultivo de células (células BHK-21) y se recogió suero 4-6 semanas después. Los sueros de preinmunización se ensayaron individualmente mientras que los sueros de postinmunización se combinaron de todos los animales infectados.

Para ensayar los títulos de anticuerpos en animales inmunizados, se usó un ensayo indirecto de inmunofluorescenci (IFT), descrito anteriormente (18,19). En resumen, se prepararon portaobjetos de manchas incubando el virus en células de riñón de mono verde (GMK) durante 6-10 días. Al aparecer un signo discreto de CPE, las células se extrajeron del matraz con una espátula de goma y se pusieron sobre los portaobjetos de microscopio, se secaron y se fijaron en acetona fría (4ºC) y se almacenaron a -70ºC. El título se determinó incubando suero diluido en PBS en los portaobjetos a 37ºC durante 1 h en una cámara de humedad, a lo que sigue un fragmento (F(ab')_{2} de conjugado de FITC de caprino anti IgG humano específico de cadena \gamma, Sigma Immuno Chemicals (F-1651) o inmunoglobulinas Daco (F0313) de conejo antirratón incubnado como se ha indicado.

Los títulos de anticuerpos para virus se determinaron por una modificación del ensayo de neutralización con reducción de placa (PRNT) descrito por Early y otros (20). En el ensayo, los sueros se diluyeron en serie cuatro veces y se mezclaron con un volumen igual que contenía 80-100 unidades de formación de placa (pfu) de virus por 50 \mul. Las mezclas se incubaron luego a 37ºC durante 60 min, y seguidamente se inocularon 50 \mul en cada uno de 2 pocillos de una placa de cultivo de tejidos que contenía una monocapa confluente de células Vero. Después de adsorción durante 60 min a 37ºC, los pocillos se cubrieron con 0,5 ml de una mezcla a 42ºC de una parte de agarosa al 1% y una parte de medio de base 2x de Eagle con sales de Earle, tampón Hepes 17 mM, suero fetal de ternera al 8% caliente, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug de estreptomicina. Las placas de cultivo de tejidos se incubaron a 37ºC en atmósfera húmeda de CO_{2} al 5% durante 3-7 días. Luego se aplicó a las placas una segunda cobertura (0,5 ml) que contenía tinte rojo neutro (1:9000) y las placas se enumeraron al día siguiente. Como criterio para los títulos de neutralización del virus, se usó una reducción del 50% de las placas.

Microscopía electrónica

Los medios de cultivo de células o los homogeneizados de tejido de cerebro se examinaron por microscopia electrónica con contraste negativo (EM). Se inoculó una gotita de 10 \mul en rejillas de Formvar/revestidas con carbón a 20.000 x g para eliminar restos de células y finalmente se peletizó el material sobrenadante sobre rejillas en un aparato Beckman Airfuge durante 10 min a 160.000 x g. Las rejillas se tiñeron con ácido fosfowolfrámico al 2% (pH 6,0) y se exminaron en un microscopio electrónico Philips CM 100 a un aumento de cómo mínimo 46.000.

Datos de secuencias

Los aislados 87-102, 174F y 145SL se hicieron crecer en la línea A549 de carcinoma de pulmón humano en botellas de rodillo de 1600 cm^{2}. La nata se filtró a través de filtros de acetato de celulosa (Costar) de 0,45 \muM y el virus se peletizó a 20.000 g durante 24 h a 4ºC. Se aisló el RNA de los pelets que contenían el virus usando tiocianato ácido de guanidina como se ha descrito (Chomczynski y Sacchi). La síntesis de cDNA se realizó en condiciones estándar usando 1 \mug de RNA, transvertasa AMV inversa (Boehringer-Manheim) y oligonucleótidos 14 mer al azar como cebadores en un volumen de reacción de 20 \mul. Se amplificaron fragmentos de 5'UTR viral usando cebadores de consenso específicos a cardiovirus: (sentido) 5'-GGCCGAAGCCGCTTGGAATA-3' (SEM) y (antisentido) 5'-GTGGCTTTTGGCCGCAGAG-3' (ATVEM), ambos cebadores modificados después de los cebadores EMCV2 y EMCV1 previamente descritos (Jongen y otros, 1993, Ann. Reum. Dis. 52:575-578. Las secuencias de antivirus eran del Dr. A. Palmenberg (comunicación personal). Las condiciones de amplificación eran: 30 ciclos a 94ºC, 30 s; a 50ºC, 30 s; a 72,2ºC, 2 min. Los fragmentos amplificados se clonaron en el pCRII T-vector (In-Vitrogen). Las secuencias virales clonadas se secuenciaron usando un kit de secuenciación de ciclos de A Taq polimerasa FS y los datos se recogieron en una máquina de secuenciación ABI Prism 310 usando cebadores inversos M13-21 y M13 (Perkin Elmer). Se obtuvo un fragmento de 1,8 kb que se extendía de 5'-UTR a las secuencias de poliproteína viral mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de polimerasa) del cDNA del aislado 145SL. Los cebadores eran: (sentido) 5'-ACAGTGCATTCCACAC-3' SLJU1) o 5'-CCGCTCCACAATAGA-3' (SLJU2) y (antisentido) 5'-GATCTCAGAC-3' (cebador 118). Los cebadores SLJU1 y SLJU2 están situados inmediatamente adyacentes entre sí y se seleccionaron como cebadores de consenso para los aislados de Ljungan de la invención con la mínima homología posible con los grupos EMCV y TMEV de virus. Las condiciones de amplificación fueron 30 ciclos a: 94ºC, 30 s; 42ºC, 1 min; 72,2ºC, 2 min. El cebador antisentido 118 dio productos de PCR de análogo tamaño, pero ninguno de los cebadores dio fragmentos de PCR cuando se usaron solos. La secuencia del cebador había sido publicada antes (Bauer, D. y otros, 1993, Nucl. Acids Res. 21:4272-4280). El fragmento obtenido de PCR de 1,8 kb se clonó y secuenció como se ha descrito antes.

Resultados del trabajo experimental

Se seleccionaron tres aislados de virus basados en la reacción con las series de suero humano y que presentaban un tamaño y una estructura compatibles con un picornavirus en EM. El primer aislado se denominó Ljungan 87-102. Ljungan es un río del condado de Medelpad, Suecia, en el que se capturaron los animales.

El segundo y el tercer aislado se denominaron Ljungan 174F y Ljungan 145SL, respectivamente.

Los tres aislados procedian de C. glareolus.

Los tres aislados mataron ratones amamantados en 3-5 días.

El títuls del cerebro de ratón era de 10^{9} (aproximadamente), mientras que el título del cultivo de células era de sólo 10^{5} (aproximadamente).

Microscopía electroónica

Las partículas de virus, de 27 nm de diámetro, eran esféricas con la superficie casi sin rasgos distintivos y aparecían individualmente o como agregado pequeños. En raros casos, la tinción penetró en las partículas, lo que hacía que parecieran cáscaras vacías.

Resultados serológicos

Se encontró, después de ensayar varias líneas diferentes de células en células de riñón de mono verde, células que eran muy adecuadas para hacer preparaciones en portaobjetos para el ensayo de IFT para serología. Los datos cruzados de IFT usando suero de ratón se dan e la Tabla 1.

TABLA 1 IFR cruzado usando células GMK infectadas con virus. Los ratones inmunes se titularon usando diluciones de 4 veces comenzando con la dilución 1:10

	VIRUS
	87-012	174F	145SL
Antisueros
87-012	2560	160	<10
174F	160	160	<10
145SL	40	40	640

Datos de PRNT (ensayo de neutralización por reducción en placa), resultados preliminares. Los sueros de conejo contra TEMV y EMCV con un título de 1:160 homólogo tenían un título de menos de 10 a los tres aislados. Fracasaron varios intentos para hacer antisueros con un título de neutralización en campañoles, ratones, conejos y cobayas. Todos los animales produjeron por IFT anticuerpos de título más alto, pero no por PRNT. Los campañoles fracasaron en la producción de anticuerpos por IFT.

Datos de secuencias Secuencias de 5'UTR y genes de poliproteína de aislados de virus de Ljungan

Los cebadores de consenso de cardiovirus dieron un producto de 303 bp para los tres aislados 87-102, 174F y 145SL, en comparación con 284 bp para el virus EMC. El fragmento amplificado se situó inmediatamente después del extremo terminal del tracto poli C en el virus EMC. Los productos de la PCR específicos para los aislados Ljungan se obtuvieron sólo cuando la temperatura de reanillamiento era de 50ºC, y no de 58ºC, que era óptima para obtener productos de cDNA de virus EMC. El posterior análisis de secuencia reveló que el cebador ATVEM casaba mal en cuatro posiciones internas, justificándose esta diferencia en la temperatura de reanillamiento. Una alineación de las secuencias de 5'UTR para los tres aislados Ljungan, EMC y virus de Vilyuisk (Tabla 2) revela una mayor similaridad entre EMCV y el virus de Vilyuisk que entre cualquiera de los dos aislados y los Ljungan. Demuestra también que cada aislado Ljungan es diferente de los otros por varios cambios de nucleótidos. Los aislados 174F y 145Sl son similares al aislado 87-102. La homología de secuencias entre 174F y 145Sl era de casi 95% (tres bases no determinadas en la secuencia), mientras que la homología entre 87-102 y 145 SL era de 91%.

La estrategia escogida para obtener fragmentos de PCR adicionales a partir de aislados de virus de Ljungan fue una modificación de una técnica para detectar mRNAs expresados diferencialmente (Bauer, D. y otros, 1993, Nucl. Acids Res. 21:4272-4280). Como un ensayo de esta estrategia, se aisló y amplificó cDNA del aislado Ljungan 145SL usando las condiciones anteriores, usando el cebados SLJU1 o el SLJU2 como cebador de sentido y uno de veinte oligonucleótidos 10-mer de secuencia escogida al azar como cebador "antisentido".

Si los productos de PCR obtenidos con los cebadores SLJU1 o SLJU2 y un mer-10 tenían un tamaño similar, y ninguno de los cebadores daba un producto de este tamaño cuando se usaban solos en la PCR, se aisló y clonó el fragmento obtenido. Sólo una combinación de cebadores satisfizo este criterio, a saber, los cebadores SLJU1 o SLJU2 en combinación con el oligonucleótido 10-mer 118, que dio un producto de PCR de 1,18-1,19 kb. De este fragmento, se secuenciaron 819 bp desde el terminal 3'. Esta secuencia contenía un marco de lectura abierta (ORF) de 663 bp en el sentido de la poliproteína viral. Este ORP se usó para buscar el banco de datos suizo de proteínas usando el servicio de búsqueda BLITZ de EMBL con los parámetros de búsqueda por defecto. Las 10 puntuaciones máximas fueron las secuencias de poliproteína de picornavirus, que incluyen 8 secuencias de cardiovirus. Se encontró que la homología era de más de 188 a.a. En la Tabla 3 se presenta la relación de este segmento de la poliproteína viral con cardiovirus anteriormente secuenciados. El Dr. A. Palmemberg nos facilitó una alineación comparativa de todos los cardiovirus. En la Tabla 3, la secuencia de TMEBeAn se tomó, arbitrariamente, como cepa índice. Para los 12 cardiovirus que permanecen en la alineación, sólo se muestran diferencias en la secuencia de aminoácidos. La alineación de la secuencia de Ljungan 145SL se representa análogamente en la parte superior. Puesto que el algoritmo de búsqueda BLITZ tiene en cuenta idénticos y similares aminoácidos, los últimos se han indicado por una letra pequeña, mientras que las diferencias con TMEBeAn están en mayúsculas como para las otras cepas de la
alineación.

Como conclusión, los datos presentados para los aislados de Ljungan son característicos para los tres virus, pero incompletos. Sin embargo, la comparación de secuencias clonadas de una parte altamente conservada de la región 5'-no traducida de cardiovirus y las secuencias de codificación para proteínas capsídicas virales de un aislado (Ljungan 145SL) revelan claramente que los virus de Ljungan están relacionados con los cardiovirus, pero son parientes mucho más lejanos que los cardiovirus identificados con anterioridad. Mientras que la homología de aminoácidos (aminoácidos idénticos) de los virus dentro del grupo de Theiler es de 96-97%, la homología respecto al virus de Vilyuisk es de aproximadamente 83% y los virus de EMC son análogos en 67-74% a TMEBeAn, el virus 145SL de Ljungan tiene sólo aproximadamente un 32% de aminoácidos idénticos a los de TMEBeAn. Incluso si se considera que la homología es idéntica y similares los aminoácidos, esta medida de la relación sería de sólo 50% entre 145SL de ljungan y TMEBeAn (la cifra correspondiente será de 79-83% entre EMC y TMEBeAn).

Alineación de secuencias

La Tabla 2 presenta una alineación de tres aislados de virus Ljungan (1.87-012, 2.174F, 3. 145SL) [SEQ ID NO:1, 2 y 3, respectivamente] con secuencias de cardiovirus publicadas (4. TMEBeAn, 5. Viljuisk, 6. EMCV). La secuencia alineada empieza en 29 nt 3' del extremo del tracto poli-C en EMCV y la secuencia corresponde a nt 557-808 (aproxi-
madamente) en los diferentes genomas virales. Los espacios insertados en las secuencias se indican por un período (.).

TABLA 2

1

2

En esta región del genoma viral, Ljungan 174F tiene una homología de 94% con Ljungan 87-012 (tomado aquí como cepa indicadora para comparaciones) y Ljungan 145SL tiene residuos homólogos en un 91% a Ljungan 87-012. La cepa TMEBeAn tiene 69% de restos homólogos a Ljungan 87-102, Vilyisk tiene 68% y EMCV tiene 68% de restos homólogos a Ljungan 87-012. Usando el mismo criterio para calcular la homología, EMCV tiene una homología de 85% con TMEBeAn.

La Tabla 3 presenta la alineación de secuencias de cDNA de las secuencias de codificación de poliproteínas del aislado Ljungan 145SL [SEQ ID NO: 4] a las secuencias de cardiovirus secuenciados en la alineación compilada por el Dr. A. Palmenberg (comunicación personal). La cepa TMEBeAn se tomó arbitrariamente como cepa indicadora, en tanto que los aminoácidos de las restantes cepas se muestran sólo si se diferencian de la cepa indicadora. Para el aislado Ljungan 145SL, se indican en letra pequeña aminoácidos similares pero no idénticos. La homología de aminoácidos entre Ljungan 145SL y otros cardiovirus se estableció explorando todo el Banco Suizo de Datos de Proteínas usando el algoritmo de búsqueda BLITZ con parámetros estándar de búsqueda.

TABLA 3

3

Ensayo serológico que indica la relación entre los virus Ljungan y diabetes mellitus y miocarditis

Se estableció una prueba serológica usando un ensayo indirecto de inmunofluorescencia usando células de riñón de mono verde infectadas con virus, fijadas con acetona. Los pacientes se exploraron a una dilución de 1:8 y se titularon sueros positivos. Se consideraron positivos los sueros con un título de 1:32 o más.

Se ensayaron en cuanto a la presencia de anticurpos a los tres virus de la invención, sueros de 59 niños (de 1-16 años de edad) del área de Estocolmo diagnosticados recientemente de diabetes mellitus (DM) y 34 niños de control de la misma área geográfica. 19 de los 59 pacientes (32%) con DM resultaron ser positivos en la exploración y 2 de los 34 controles (6%) se encontró que eran positivos a uno o más de los tres virus (diferencia significativa = 0,002, ensayo exacto de Fisher). Se estudiaron también nueve pacientes con DM recientemente diagnosticados (edad 23-46 años) del condado de Medelpad. Se seleccionaron dos controles para cada paciente adulto con DM y se emparejaron atendiendo a la edad, sexo y área geográfica de residencia. Se encontró que cinco de los nueve pacientes (56%) con DM y uno de los 18 (6%) pacientes de control eran positivos para uno o más de los 3 virus (diferencia significativa = 0,008, ensayo exacto de Fisher).

También se dispuso de suero de 5 atletas que murieron súbitamente de miocarditis. Para cada paciente con miocarditis se seleccionaron tres controles y se emparejaron atendiendo a la edad, sexo y área geográfica de residencia. Cuatro de los 5 (80%) de los pacientes que murieron de miocarditis y uno de los 15 (7%) de los 15 controles (7%) se encontró que eran positivos a uno o más de los tres virus Ljungan (diferencia significativa = 0,005, ensayo exacto de Fisher).

Descripción de diferentes aspectos de la invención

En lo que sigue, se describirán diferentes aspectos de la invención. Todos estos aspectos están relacionados con un nuevo grupo de picornavirus.

Así, un primer aspecto de la invención está dirigido a un nuevo grupo de picornavirus, a saber, picornavirus que comprenden en su genoma viral, con más precisión, en la región no codificadora, una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de cDNA seleccionada entre el grupo constituido por

SEQ ID NO: 1 (Ljungan 87-012)

4

y secuencias homólogas que tiene una homología de cómo mínimo 75% con la SEQ ID NO:1. Los picornavirus de la invención deben causar, además una enfermedad mamífera.

En una realización preferente de este aspecto de la invención, las mencionadas secuenciias homólogas tienen una homología de cómo mínimo 80%, como mínimo de 85% o como mínimo 90% con la SEQ ID NO:1.

En una realización particularmente preferente, la mencionada secuencia homóloga es una entre la SEQ ID NO:2 (Ljungan 174F)

SEQ ID NO:2 (Ljungan 174F)

5

y

SQ ID NO: 3 (Ljungan 145SL)

6

Estas secuencias (ID NO:2 y 3) tienen una homología de 94% y 91% con la SEQ ID NO:1, respectivamente.

Ha de tenerse en cuenta que las homologías en la región de codificación de diferentes virus de la invención pueden variar considerablemente, pero en la región no codificadora comparten una homología de cómo mínimo 75% con la SEQ NO:1.

Las secuencias de nucleótidos, SEQ ID: 1, 2 y 3, corresponden a aproximadamente los nucleótidos 557-808 (una región conservada) en el genoma de virus de la encefalitis (EMVC). Estos tres virus han sido aislados de roedores salvajes, con más precisión, de campañoles. Los virus se pueden multiplicar en líneas de células y, para una producción a gran escala de productos de picornavirus, se puede insertar el genoma del virus en otros organismos.

Un segundo aspecto de la invención está dirigido a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por

SEQ ID NO: 4 (proteína parcial estructural de Ljungan 145)

7

y secuencias homólogas que tienen una homología de al menos 75% de aminoácidos idénticos con la SEQ ID NO:4,

y fragmentos antigénicos de las secuencias.

En una realización de la invención, las secuencias homólogas tienen una homología de cómo mínimo 80%, de cómo mínimo 85% o de cómo mínimo 90% de aminoácidos idénticos con la SEQ NO:4.

La SEQ NO:4 es el resultado de una secuenciación parcial preliminar de la secuencia de cDNA de la secuencia codificadora de poliproteína del aislado de virus Ljungan 145SL. La mencionada proteína que comprende la SEQ ID NO:4 de aminoácidos, las mencionadas secuencias homólogas y los mencionados fragmentos antigénicos son útiles como ingredientes activos en medicinas y como reactivos diagnósticos en kits diagnósticos.

Un tercer aspecto de la invención concierne a un antisuero o anticuerpo dirigido contra una proteína estructural del virus definido en el primer aspecto de la invención. En el segundo aspecto de la invención se define un ejemplo de tal proteína estructural. Tal antisuero o anticuerpo es útil como ingrediente activo en medicinas y como reactivo diagnóstico en kits. Se pueden usar anticuerpos policlonales y monoclonales, y éstos se producen adecuadamente usando los mencionados virus o fragmentos de ellos específicos para los mencionados virus para inmunizar mamíferos.

Un cuarto aspecto de la invención está dirigido a un antígeno que comprende al menos parte de una proteína estructural de picornavirus definida en el primer aspecto de la invención, incluida una subunidad de ella. Un ejemplo de tal antígeno es la proteína, y partes antigénicas de ella, definida en el segundo aspecto de la invención. Tal antígeno de la invención es útil como ingrediente activo en medicinas y como reactivo diagnóstico en kits diagnósticos.

Un quinto aspecto de la invención está dirigido a un kit diagnóstico que comprende al menos un miembro del grupo constituido por

(a): un antisuero o anticuerpo de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o una parte de él que se une a un antígeno,

(b): un antígeno de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención o una parte de él que se une a un antígeno,

(c): una o varias sondas diseñadas respecto al genoma del virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención, y

(d): uno o varios cebadores diseñados con respecto al genoma del virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Los diferentes miembros de un kit diagnóstico dependerán del método diagnóstico a emplear. Además de la lista anterior de posibles miembros del kit diagnóstico, el mencionado kit puede contener muestras de referencia positiva, muestras de referencia negativa, diluyentes, soluciones de lavado y tampones. Además, acompañarán al kit instrucciones para el uso.

Los miembros (a) y (b) de la lista dada encuentran uso en métodos inmunodiagnósticos, tales como el ensayo inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA), un ensayo radioinmune (RIA) o un ensayo de inmunofluorescencia (IFA).

Los miembros (c) y (d) de la lista anterior encontrarán uso en la detección directa de virus. Preferiblemente, en la detección directa de un virus de acuerdo con la invención se usa un método diagnóstico basado en la técnica de PCR (reacción en cadena de polímeros) con tales cebadores.

Todos los métodos diagnósticos antes mencionados son bien conocidos en la técnica y una persona experta con conocimientos corrientes de la técnica seleccionará miembros útiles de un kit diagnóstico para el método diagnóstico a usar.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a una vacuna que tiene como componente inmunizante o neutralizante un miembro seleccionado entre el grupo constituido por

(a): el virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención,

(b): el virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención en forma atenuada,

(c): el virus de acuerdo con la invención muerto,

(d): un antígeno de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, incluida una subunidad del virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención, y

(e): DNA correspondiente al RNA genómico del virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En una realización de este aspecto de la invención, la mencionada vacuna puede comprender adicionalmente un coadyuvante. Obviamente, tal coadyuvante debe ser un coadyuvante que haya sido autorizado para vacunas por las autoridades responsables para medicinas veterinarias o humanas.

La vacuna puede contener otros ingredientes necesarios para preparados específicos para administración oral, subcutánea, intramuscular o intradérmica. Se describen ingredientes adicionales adecuados en la Farmacopea europea o de EE.UU.

Los miembros alternativos (a), (b) y (c) son ejemplos de virus enteros convencionales, virus atenuados y subunidades de vacunas desarrolladas para otros tipos de virus, y el miembro (d) representa la incorporación de DNA en células específicas al cuerpo, que luego expresarán estructuras específicas a un virus y elicitan inmunidad frente al virus mencionado.

Un séptimo aspecto de la invención está dirigido a un picornavirus de acuerdo con el primer aspecto de la invención, opcionalmente en forma atenuada o muerto, un antisuero o anticuerpo de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o un antígeno de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, para uso en un medicamento (para uso veterinario o humano). Un ejemplo de un medicamento así es una vacuna de acuerdo con la invención descrita en su sexto aspecto.

El octavo aspecto de la invención concierne al uso de un picornavirus de acuerdo con el primer aspecto de la invención, opcionalmente en forma atenuada o muerto, un antisuero o anticuerpo de acuerdo con el tercer aspecto de la invención o un antígeno de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, en la preparación de un medicamento para tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por el mencionado virus.

En una realización del mencionado uso, la enfermedad causada por el virus mencionado es una entre miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillian Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes.

Un noveno aspecto de la invención está dirigido al uso de un miembro del grupo constituido por

(a): el virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención,

(c): el virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención muerto,

(e): DNA correspondiente al RNA genómico del virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención,

en la preparación de un medicamento para tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por un virus de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En una realización del mencionado uso, la enfermedad causada por el virus mencionado es una entre miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillain Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes.

El régimen de dosificación será determinado por el productor de la vacuna sobre la base de experimentos con animales y ensayos clínicos.

Referencias

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20. Earley, E., Peralta, P.H. y Johnson, K.M.: A plaque neutralization method for arboviruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 125:741 (1967).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): Solicitante:

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(A): Nombre: Bo Niklasson

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Calle: Sibyllegatan 15

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(C): Ciudad: Estocolomo

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(D): País: Suecia

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(E): Código postal (ZIP): 114 42

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Título de la invención: Nuevos picornavirus, vacunas y kits diagnósticos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Número de secuencias: 4

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(iv): Forma legible del ordenador:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Tipo del medio: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Ordenador: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Software: PatenIn Release nº. 1.0. Versión nº. 1.30. (EPO)

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

\vskip1.000000\baselineskip

(2). INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 264 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Carácter de la cadena: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Fuente original:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Organismo: Picornaviridae

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Aislado individual: Ljungan 87-012

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2). INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 261 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Carácter de la cadena: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Fuente original:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Organismo: Picornaviridae

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Aislado individual: Ljungan 174F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2). INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 264 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Carácter de la cadena: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v): Fuente original:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Organismo: Picornaviridae

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Aislado individual: Ljungan 145SL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2). INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 179 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Carácter de la cadena:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v): Tipo de fragmento: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): Fuente original:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Organismo: Picornaviridae

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Aislado individual: Ljungan 145SL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

11

Claims

1. Picornavirus, que comprende en la región no codificadora de su genoma viral una secuencia de nucleótidos que corresponde a una secuencia de cDNA seleccionada entre el grupo constituido por

SEQ ID NO: 1 (Ljungan 87-012)

12

y secuencias homólogas que tienen, como mínimo, 75% de homología con la SEQ ID NO:1, y que, además, causan una enfermedad mamífera.

2. Picornavirus de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las mencionadas secuencias homólogas tienen, como mínimo, una homología de 80%, como mínimo de 85% o como mínimo de 90% con la SEQ ID NO:1.

3. Picornavirus de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la mencionada secuencia homóloga es una entre

SEQ ID NO: 2 (Ljungan 174F)

13

y SEQ ID NO: 3 (Ljungan 145SL

14

4. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por

SEQ ID NO:4 (proteína estructural parcial de Ljungan 145S)

15

16

y secuencias homólogas que tienen una homología de aminoácidos idénticos de cómo mínimo 75% con la SEQ ID NO:4,

y fragmentos antigénicos de las secuencias.

5. Antisuero o anticuerpo dirigido contra una proteína estructural específica para el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Antígeno que comprende al menos una parte de una proteína estructural específica para el picornavirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. Kit diagnóstico que comprende al menos un miembro del grupo constituido por un antisuero o anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 o una parte de él que se une a un antígeno, un antígeno de acuerdo con la reivindicación 6 o una parte de él que se une a un anticuerpo, una o varias sondas diseñadas respecto al genoma del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

y

uno o varios cebadores diseñados con respecto al genoma del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

8. Vacuna que tiene que tiene como componente inmunizante o neutralizante un miembro seleccionado entre el grupo constituido por

(a): el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

(b): el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en forma atenuada,

(c): el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 muerto,

(d): un antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, que incluye una subunidad del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

: y

(e): DNA correspondiente al RNA genómico del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que adicionalmente comprende un coadyuvante.

10. Picornavirus de Ljungan de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en forma atenuada o muerto, un antisuero a anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 o un antígeno de acuerdo con la reivindicación 6 para uso en un medicamento.

11. Uso de un picornavirus de Ljungan de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en forma atenuada o muerto, un antisuero a anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 o un antígeno de acuerdo con la reivindicación 6 en la preparación de un medicamento para tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por el mencionado virus.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la enfermedad causada por el mencionado virus es una entre miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillain Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes.

13. Uso de un miembro del grupo constituido por

(a): el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

(d): un antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, que incluye una subunidad del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y

(e): DNA correspondiente al RNA genómico del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la preparación de un medicamento para tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por el virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la enfermedad causada por el mencionado virus es una entre miocarditis, cardiomiopatía, síndrome de Guillain Barré y diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrópica, dermatomiositis, polimiositis, aborto espontáneo y síndrome de muerte súbita en lactantes.