ES2226558B1 - Metodo para la busqueda de marcadores de adn altamente repetidos en el genoma mediante amplificacion al azar. - Google Patents
Metodo para la busqueda de marcadores de adn altamente repetidos en el genoma mediante amplificacion al azar.Info
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Abstract
La presente invención se refiere al descubrimiento de un método de búsqueda de marcadores de DNA altamente repetidos en el genoma que se encuentran en su mayoría asociados a microsatélites o zonas variables, que se ha denominado I.R.A.R.S. (intesive random amplification of repetitive sequences). Consiste en la unión de cebadores al azar en el genoma, para conseguir una amplificación inespecífica. Tras la observación del corrido electroforético, la banda más intensamente teñida, es extraída, clonada y posteriormente secuenciada.
Description
Método para la búsqueda de marcadores de ADN
altamente repetidos en el genoma mediante amplificación al
azar.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de un método de búsqueda de marcadores de DNA
altamente repetidos en el genoma, que se ha denominado I.R.A.R.S.
(intensive random amplification of repetitive sequences). Mediante
el uso de dicha técnica es posible aislar secuencias altamente
repetidas en el genoma como las derivadas de transposición (las
cuales se encuentran en su mayoría asociados a microsatélites) y
secuencias repetidas en tanden que presentan variabilidad en su
longitud. Estos microsatélites pueden presentar polimorfismo en los
distintos animales. Para la detección de las regiones repetidas
utilizamos la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) mediante
cebadores que se unan al azar en el genoma. Una vez obtenidas las
amplificaciones seleccionamos la banda más intensa, para
posteriormente clonarla y secuenciarla.
Estas secuencias son interesantes para su
utilización en la creación del mapa genético, estudios evolutivos
entre especies y biodiversidad, así como para la asociación de
estos marcadores altamente repetidos y polimórficos con QTLs
(quantitative trait loci) y ETLs (economic trait loci). Asimismo,
otra aplicación interesante es su utilización como marcadores en
determinadas patologías que son causadas por anormalidades en el
número o tipo de repeticiones de dichas regiones. Por último, estas
secuencias altamente repetidas pueden ser utilizadas como
marcadores específicos de la especie, teniendo aplicación en la
detección de células de especie en muestras de distinto origen
biológico.
En los últimos años el desarrollo de los mapas
genéticos de las distintas especies animales y humana están
adquiriendo una gran importancia, existiendo diversos proyectos que
engloban a distintos países para cada una de las especies que se
estudian. En el caso concreto del ganado porcino existe el proyecto
PigMap, como aparece recogido en Archibald, A.L. y col., (1995)
"The PigMap consortiumlinkage map of the pig (Sus Scrofa)",
Mammalian Genome 6: 157-175. En estos
momentos, interesa la realización de mapas de alta resolución que
permitan el conocimiento de zonas poco estudiadas del genoma y su
posible relación con caracteres productivos y de interés económico.
Es decir, el objetivo consiste en buscar marcadores polimórficos
uniformemente repartidos por el genoma, a través de los cuales se
pueda llegar al aislamiento, secuenciación y localización de genes
concretos relacionados con caracteres de interés económico o
enfermedades (ETLs, Economic trait loci), así como marcadores
relacionados con caracteres de tipo cuantitativo, más productivos
(QTLS, quantitative trait loci). Asimismo, el conocimiento del mapa
genético presenta otras utilidades como son estudios de evolución y
biodiversidad e identificación de parentescos.
Para lograr estos fines, es necesario la
utilización de marcadores de DNA polimórficos, altamente repetidos
y dispersos por el genoma. Los marcadores de elección utilizados a
lo largo del desarrollo de los mapas hasta ahora han sido: los
microsatélites, los LINEs (Long Interspersed Elements) y los SINEs
(Short Interspersed Elements). Los microsatélites o STR son
secuencias del genoma altamente polimórficas repartidos por todo el
genoma que consisten en repeticiones de uno, dos, tres o cuatro
nucleótidos [(A)n, (AC)n, (GAG)n,
(CTGA)n], como describió Moran, C. (1993) "Microsatellite
repeats in pigs (Sus Scofra) and chicken (Gallus domesticus)
genomes", Journal of Heredity 84:
274-289. Entre los métodos utilizados para aislar
microsatélites destaca el descrito por Weber, J.L. y May, P.E.
(1989) "Abundant class of DNA polymorphims which can be typed
using the polymerase chain reaction", American Journal of
Human Genetics 44: 388-396., en el que
describen un método general para detectar microsatélites, basado en
la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), y en la
cartografía comparativa entre especies. En primer lugar se consigue
la amplificación entre dos oligonucleótidos específicos que
flaquean la región microsatélite de una determinada especie para
posteriormente amplificarlos en otra especie y separar los distintos
alelos según el número de veces que se repiten los dos pares de
bases, generalmente mediante electroforesis vertical en gel de
poliacrilamida. Sin embargo, al estar los microsatélites en
regiones no codificantes, este método presenta el problema de que
la zona estudiada puede no estar conservada entre especies. Este
problema es mostrado por Milan, D. y col. (1994) "Heterologous
amplification obtained on porcine DNA with 657 pairs of primers from
Genethon's Human microsatellites", XXIV International
conference of Animal Genetics 30: 102, los cuales
encontraron un 21% de conservación de secuencias microsatélites
entre porcino y humano.
Otro método consiste en la búsqueda al azar de
estos marcadores en librerías de DNA genómico digerido en pequeños
fragmentos y clonados en plásmidos mediante la hibridación de estos
fragmentos con una sonda marcada (esta sonda es una secuencia de
ADN con las repeticiones específicas del tipo de microsatélite que
se busca). Este método ha sido utilizado para el aislamiento de
diversos microsatélites como por ejemplo el descrito por Vaiman y
col. (1992) Characterization of new bovine dinucleotide repeats.
Animal Genetics 23 (6),537-541. Los
inconvenientes de este tipo de método radican, en primer lugar que
es más laborioso que la utilización de la PCR, y es fácil volver a
localizar los microsatélites ya descritos por otros autores.
En un principio, otro de los métodos utilizados
fue el estudio de las bases de datos localizando en secuencias
intrónicas de genes descritos por otros autores para otro tipo de
finalidad. Sin embargo, actualmente una vez realizados los estudios
por distintos grupos de investigación dichos marcadores ya han sido
estudiados y se ve en la clara necesidad de la localización de los
mismos por otras tecnologías.
Como ya hemos indicado, otros marcadores
altamente polimórficos y repartidos por el genoma son los SINEs
(Short Interspersed Nuclear Elements) y los LINEs (Long
Interspersed Nuclear Elements) se encuentran en el DNA repetido
disperso en las distintas especies animales. Las unidades de
repetición están dispersas en numerosas localizaciones en el genoma
y la mayoría de las familias de DNA pertenecientes a esta clase,
contienen miembros con capacidad de retrotransposición o
transposición a partir de un RNA intermedio. Singer, M. F. (1982)
"SINEs and LINEs: Highly repeated short and long interspersed
repeat sequences in mammaliam genomes" Cell 28:
433-434, clasifica en mamíferos las familias de DNA
repetitivo disperso, dependiendo de la longitud de su secuencia
consenso en dos clases: SINEs y LINEs.
Weiner, A.M. y col., (1986) "Nonviral
retroposons: genes, pseudogenes, and transportable elements
generated by the reverse flowof genetic information",
Annuales of Rewiews of Biochemistry 55:
631-661, definieron los SINEs como secuencias
cortas (70-300 pb) y repetidas de forma dispersa en
el genoma, pudiéndose encontrar más de 100.000 copias de elementos
de una familia determinada. Uno de los ejemplos más conocidos de
este tipo de secuencias es la familia humana conocida como Alu, si
bien, los SINEs han sido descritos en un gran número de especies.
De especial interés son los descritos en el ganado porcino Frengen,
E. y cols., (1991) "Porcine SINEs: Characterization and use in
species-specific amplification", Genomics
10: 949-956.
Lo interesante de este tipo de repeticiones es la
existencia en el extremo 3' de una secuencia rica en Adeninas que
pueden presentar un polimorfismo en los distintos animales. Así,
Economou, E.P. y col. (1990) "The polydeoxyadenylate tract of Alu
repetitive elements is polymorphic in the human genome",
Procedings National Academy Sciences 87:
2951-2954. describieron una nueva clase de
polimorfismos del DNA basada en la variación de la longitud de las
colas de Adeninas (pudiendo ser considerados como microsatélites y
que en general son denominados SINEVA (sine variable poli A). Estos
autores definieron además la potencialidad de otras secuencias que
poseen cadenas de poli (A), como los LINEs, Pseudogenes o
retroposones, para ser polimórficos.
Ellegren (1993) "Abundant (T)n
(A)n mononocleotide repeats in the pig genome: linkage
mapping of the porcine APOB, FSA, ALOX12, PEPN and RNL loci",
Animal Genetics 24: 367-372,
describió este tipo de polimorfismos en la especie porcina. Estos
polimorfismos, generalmente situados en intrones (asociados a
genes), pueden ser de gran utilidad para la cartografía por
ligamiento de genes ya descritos e incluso localizados físicamente,
para los cuales es muy difícil realizar un análisis de ligamiento
debido a la falta o escasez de variación en la secuencia
codante.
Por otra parte, Hwu, H.R. y col., (1986)
"Insertion and or deletionof many repeated DNA sequences in human
and higher ape evolution", Procedings National Academic
Sciences 83: 3875-3879, afirman que los
genomas de los mamíferos contienen unas 50.000 copias de un
elemento disperso y de gran longitud conocido como LINE o familia
L1. Weiner, A.M. y col., (1986) "Nonviral retroposons: genes,
pseudogenes, and transportable elements generated by the reverse
flowof genetic information", Annuales of Rewiews of
Biochemistry 55: 631-661, definen el
tamaño de este elemento como variable, pudiendo ser mayor de 6
Kb.
A diferencia de los SINEs, los familias de LINEs
son más escasos. Además, dentro de las grandes familias se han
identificado subfamilias formadas por los procesos de evolución,
como indican Hayward y col., (1997) "Recombination creates novel
L1 (LINE1) elements in Rattus norvegicus", Genetics
146: 641-654. Los elementos de esta familia,
en las distintas especies, presentan homología entre sí en
fragmentos de longitud considerable. Al igual que las repeticiones
Alu, los elementos L1 no se localizan en secuencias codantes.
Para el aislamiento de SINEs y LINEs se realizan
procedimientos similares a los realizados en el caso de los
microsatélites. Un método consiste en la búsqueda al azar de estos
marcadores en librerías de DNA genómico digerido en pequeños
fragmentos y clonados en plásmidos, mediante la hibridación de estos
fragmentos con una sonda marcada (esta sonda es una secuencia de
ADN consenso que se encuentra en los SINEs y LINEs). De esta manera
podemos aislar los clones que contengan el SINE o LINE. Pero de
nuevo esta tecnología presenta el inconveniente de ser más
laboriosa que la utilización de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa. Como en el caso de los microsatélites, otro método
consiste en la utilización de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR), y la cartografía comparativa entre especies,
amplificando la zona mediante dos oligonucleótidos específicos que
flaquean el LINE o el SINE. Sin embargo, al estar estas secuencias
en regiones no codantes, este método presenta el problema de que la
zona estudiada puede no estar conservada.
Existen unas técnicas específicas, relacionadas
con SINEs y LINEs, utilizadas para la amplificación mediante PCR de
ADN contenido entre dos secuencias dispersas. Esta técnica se
denomina IRS-PCR (Interspersed Repeat
Sequences-Polimerase Chain Reaction). La técnica ha
sido descrita tanto en SINEs o Alu-PCR por Nelson,
D.L. y col. (1989), "Alu Polymerase Chain Reaction: A method for
rapid isolationof human specific sequences from complex DNA
sources". Procedigs National Academy Science 80:
1821-1825. y también en LINEs o Ll PCR descrita por
Miller, J.R. (1994) "Use of porcine interspersed repeat sequences
in PCR-mediated genotyping", Mammalian
Genome 5: 629-632. Sin embargo, esta
técnica no se utiliza para el aislamiento de secuencias repetidas
sino para las secuencias contenidas entre ellas.
Tang, J.Q. y col. (1995)
"Alu-PCR combined with non-Alu
primers reveals multiple polymorphic loci". Mammaliaa
Genome 6: 345-349, realizaron un PCR
múltiple utilizando SINE-primers (oligonucleótidos
complementarios a las secuencias SINEs) y otro cebador diseñado
según la secuencia flanqueante a algún SINE en el extremo 3', lo
cual produce la amplificación de distintas regiones. Diferentes
parejas de SINE-primers, consistentes en un cebador
marcado específico del locus y otro complementario a la región
SINE, producen variedad de bandas como resultado de una
amplificación múltiple. Parece ser que los cebadores de moderada
longitud a menudo pueden unirse a regiones distintas de su locus
específico, sin embargo sólo si utilizamos un cebador
multiespecífico (SINE-primer) podemos visualizar esa
variedad de bandas. Además, como la zona del extremo 3' de los
SINEs es muy polimórfica, estos autores consiguieron amplificar en
una única reacción 2 ó 3 polimorfismos a la vez. Estos
polimorfismos están únicamente relacionados con SINEs.
A la vista de la importancia de las secuencias de
ADN descritas, la utilización de métodos que permitan la detección
y análisis de estas secuencias se hace sumamente importante, debido
a la importancia de completar los distintos mapas genéticos de las
distintas especies. De acuerdo con esto en la presente invención
describimos un método para la detección de este tipo de secuencias
altamente repetidas y que presentan variabilidad en el genoma. Este
tipo de secuencias altamente repetidas, poco estudiadas en genomas
como el porcino, vacuno y otros, podrán aportar datos a los mapas
de la especie y las aplicaciones derivadas de ello. Otra de las
aplicaciones de estas secuencias altamente repetidas, dependiendo
de su naturaleza, es que pueden ser utilizadas como secuencias
específicas de las especies estudiadas, y ser utilizadas como
marcadores especie-específico. La técnica descrita
en esta invención es un método rápido y eficaz en la búsqueda de
este tipo de secuencias del ADN. Este método presenta mayor rapidez
y una alta eficacia en relación a los métodos descritos hasta ahora
para la localización de secuencias altamente repetidas en el
genoma.
La presente invención proporciona un método para
detectar a partir de una muestra de ADN, mediante una reacción
enzimática basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
nuevos marcadores altamente repetidos y polimórficos en el genoma
(microsatélites, SINEs, LINEs). Consiste en hibridar al azar
oligonucleótidos complementarios a las secuencias que flanquean
dichos marcadores de ADN o que la incluyen, y polimerizar
enzimáticamente copias de dicha secuencia de ADN. La presente
invención incluye la elección de los oligonucleótidos que flanquean
dichas secuencias diseñados a partir de tres especies distintas a
la muestra que se utiliza como sustrato en la reacción en cadena de
la polimerasa. La detección del producto resultante de la
amplificación enzimática se lleva a cabo por electroforesis y
tinción con bromuro de etidio.
Otro aspecto adicional de la presente invención
consiste en la extracción del gel de agarosa, tras el corrido
electroforético de la banda de ADN que aparece más intensamente
teñida tras el corrido electroforético y visualización con bromuro
de etidio (Figura 1). Posteriormente, este fragmento de ADN se
donará y secuenciará con el fin de conocer su secuencia. Finalmente
dicha secuencia se estudiará y comparará con otras secuencias del
Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el fin de buscar los
motivos de repetición así como posibles microsatélites.
Está prevista además la realización de una
reacción de amplificación con el fin de estudiar la posible
variabilidad de los microsatélites detectados en las secuencias
aisladas. Para este fin, se procederá a la realización de la unas
reacciones de amplificación en animales pertenecientes a distintas
razas porcinas.
Figura 1 muestra la amplificación inespecífica
obtenida con esta técnica. Carrera 1 es un marcador de talla (Gibco
lkb), carreras 2, 3 y 4 muestran la amplificación inespecífica
obtenida con este método. Las flechas indican la banda más
intensamente teñida que posteriormente es extraída del gel de
agarosa.
La presente invención proporciona un método, en
el cual a partir de una muestra de ADN y mediante la reacción en
cadena de la polimerasa se puedan aislar nuevos marcadores
altamente repetidos y candidatos a ser polimórficos en el genoma
(microsatélites, SINEs, LINEs). Asimismo, la presente invención
proporciona una gran cantidad de secuencias de zonas poco
estudiadas del genoma y que podrán por lo tanto aportar datos
interesantes a los mapas de especie y las aplicaciones derivadas de
ellos, destacando la utilización de estas secuencias repetidas de
la especie como marcadores de especie-específicos.
Los oligonucleótidos que flanquean dichas secuencias han sido
sintetizados a partir de secuencias de humana, rata y bovino,
realizándose la amplificación en porcino con el propósito de
aumentar la inespecificidad en la reacción de amplificación. Los
oligonucleótidos utilizados aparecen en la lista de secuencias.
Estos cebadores fueron diseñados según la secuencia de ADN de las
siguientes especies: cebadores 1,4, 7,9,10, 16 y 17 (Rata),
cebadores 2,3, 5, 6, 12 y 13 (Humana), cebadores 11, 19, 20, 21, 22
y 23 (Bovino), cebadores 8, 15 y 18 (Humana y rata) y cebador 14
(Bovino y rata).
Estos cebadores se utilizaron en muestras ADN
porcino, obtenido a partir de sangre según el método descrito por
Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Las muestras
sanguíneas utilizadas pertenecen a las razas Landrace y
Large-White.
La amplificación de las muestras de ADN se
realizó en un volumen de 25 \mul que contenía 25 ng de ADN, 1x de
tampón de reacción (Tris-HCl 10 mM, pH 9, KCl 50 mM
y 0,1% de Tritón X-100), 3-4 mM de
Cl_{2}Mg, 0,2 mM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, dATP,
dTTP, dGTP y dCTP, 0,5 \muM de cada cebador y 2 unidades de Taq
(Thermoaquaticus polimerasa) (Promega). La reacción de
amplificación fue llevada a cabo mediante un ciclo de
desnaturalización del ADN a 94ºC durante 3 minutos, seguido de
30-35 ciclos de amplificación: 1 minuto a 94ºC, 1
minuto a 46-50ºC y 1 minuto a 72ºC.
Otro aspecto adicional de la presente invención
consiste en la extracción del gel de agarosa, mediante la
herramienta "Concert Rapid Gel Extraction System" (Life
Technologies), tras el corrido electroforético de la banda de ADN
que aparece más intensamente teñida y visualización con bromuro de
etidio (Figura 1). Esta elección se debe a que previsiblemente
dicha banda debe corresponder a zonas altamente repetidas en el
genoma. De manera que al existir más cantidad de estos elementos en
el genoma, hay una mayor amplificación de los mismos y por lo tanto
se visualizan con una tinción más intensa. Tras la extracción, del
ADN del gel de agarosa, los diferentes fragmentos de ADN fueron
clonados mediante la utilización del plásmido
pMos-Blue (Amershan-Pharmacia).
Finalmente estos fragmentos fueron secuenciados mediante el método
de Sanger y cols, (1977), DNA sequencing with chain terminating
inhibitors, PNAS, 74.
Las secuencias obtenidas fueron estudiadas para
encontrar motivos de repetición: LINEs, SINEs, MER (Medium
reiteration frequency sequences), MIR
(Mammalian-wide interspersed repeats), etc. Para
este fin se comparó las secuencias obtenidas con la base de datos
del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el fin de encontrar
homologías con las regiones repetidas descritas en distintas
especies. Con el mismo objetivo, se realizó el estudio de los
motivos de repetición con el programa RepeatMasker
(http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker).
Para cada pareja de cebadores se realizó una amplificación,
extracción del gel de agarosa de la banda más intensamente teñida,
clonación, secuenciación y estudio de las secuencia. Si tras esta
primera amplificación la secuencia no presentaba homología con
ninguna secuencia repetida ni microsatélite, se realizaba una
segunda amplificación con los mismos cebadores, aumentando la
inespecifidad mediante la disminución de la temperatura de
hibridación, y aumento del magnesio. Posteriormente la secuencia
aislada se comparaba nuevamente con las bases de datos del GenBank,
para estudiar los motivos de repetición. Esto se repitió hasta que
se encontró un motivo de repetición o microsatélite en todas las
combinaciones de oligonucleótidos realizadas. Las distintas
combinaciones de estos cebadores para la amplificación, asi como
los resultados sobre las zonas repetidas se muestran en la Tabla
1.
| * Clones que contienen secuencias derivadas de transposición, y con microsatélites incluidos. |
En la Tabla 1, se observa que existen 8
combinaciones de cebadores a partir de las cuales se han aislado
secuencias derivadas de transposición y/o microsatélites en la
primera amplificación realizada. Son 4 las parejas de
oligonucleótidos en las que se necesitaron 2 amplificaciones, 2 en
las que fueron necesarias 3 y 4 amplificaciones para obtener las
regiones de interés.
Un aspecto de la presente invención que se debe
destacar, es la alta eficiencia en el aislamiento de las secuencias
repetidas en el genoma porcino. De forma que de las secuencias
obtenidas, más de un 50% presentaron un motivo de repetición. A
esto hay que sumar un 6% de secuencias que a pesar de no presentar
estos motivos de repetición si que presentan microsatélites. Con lo
cual la eficacia del método para encontrar las regiones que
proponemos es de un 56%. Es necesario indicar que estas secuencias
que presentan motivos de repetición, que se encontraron en los
clones Z-111, Z-120,
Z-123, Z-131 y
Z-134, mostraban secuencias microsatélites que
pueden ser utilizadas para estudios de variabilidad.
Otro aspecto interesante que cabe resaltar de los
resultados obtenidos es que de las secuencias observadas (repetidas
o no) sólo 3 de las 19 secuencias estaban ya descritas en la base
de datos. De esta forma se aportaron 16 nuevas secuencias, no
estudiadas en el genoma porcino. Otro aspecto adicional de la
presente invención es el aislamiento de fragmentos
especie-específico. Los clones
Z-117, Z-128 y Z-130
que presentaron alta homología con gran numero de intrones de genes
de la especie porcina en particular con el ppK98 en el caso de los
dos primeros clones. Esto prueba que la técnica descrita, puede ser
utilizada para localizar secuencias específicas de secuencias
repetidas de la especie porcina y que posteriormente podrán ser
utilizadas como marcadores de especie-específico
aplicables a la detección de células porcinas en distintos tejidos
animales. Así, el 94% de las secuencias obtenidas no están descritas
en la base de datos lo que supone una gran fuente de secuencias de
zonas poco estudiadas del genoma porcino y que podrán por lo tanto
aportar datos interesantes a los mapas de especie y las
aplicaciones derivadas de ellos. Las secuencias obtenidas son las
descritas en la lista de secuencias: Z-101,
Z-104, Z-111,
Z-114, Z-116, Z-117,
Z-118, Z-120; Z-121,
Z-123, Z-128, Z-130,
Z-131, Z-133 y
Z-134.
Para estudiar la posible variabilidad los
microsatélites, en 30 muestras de la especie porcina se realizó la
extracción de ADN a partir de sangre mediante el método descrito
por Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los animales a partir
de los cuales se extrajo el ADN pertenecían a las razas, 5 a
Landrace, 5 large-White, 5 Duroc, 5 Pietrain, 5
Chatos Murcianos y 5 Ibéricos.
La amplificación de los microsatélites se realizó
en un volumen de 25 \mul que contenía 25 ng de ADN, 1x de tampón
de reacción (Tris-HCl 10 mM, pH 9, KCl 50 mM y 0,1%
de Tritón X-100), 2 mM de Cl_{2}Mg, 0,2 mM de cada
desoxirribonucleótido trifosfato, dATP, dTTP, dGTP y dCTP,
[\alpha^{32}P]dCTP (3000Ci/mMol), 0,5 \muM de cada
cebador y 2 unidades de Taq (Thermoaquaticus polimerasa)
(Promega). La reacción de amplificación fue llevada a cabo mediante
un ciclo de desnaturalización del ADN a 94ºC durante 3 minutos,
seguido de 30 ciclos de amplificación: 30 segundos a 94ºC, 30
segundos a 50ºC y 30 segundos a 72ºC.
La visualización del fragmento amplificado se
llevó a cabo mediante electroforesis en geles acrilamida y
posterior exposición autoradiografia.
\newpage
Los microsatélites encontrados en los clones
Z-116, Z-118, Z-120
y Z-133 fueron testados en los 30 animales. Así,
para el clon Z-116 se observó que era monomórfico,
mientras que en los restantes se detectó variabilidad. En el clon
120 se detectaron 2 alelos, encontrándose 3 alelos para los clones
Z-133 y Z-118. Asimismo, se testaron
los microsatélites en 2 familias de la raza Chato Murciano
comprobándose la existencia de herencia mendeliana codominante en
los mismos.
<110> Universidad de Zaragoza y En Su
Nombre y Representación el Rector.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la búsqueda de marcadores
de ADN altamente repetidos en el genoma mediante amplificación al
azar.
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<140> P200000838
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<141>
03-04-2000
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<160> 38
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipCTTCATGGAC ACAATGCTGC
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<210> 2
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<212> DNA
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipCACACCGTAC CTGGGAGG
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<210> 12
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipTAAGGAGATG TCAGCTGTG
\hfill19
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<210> 13
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 13
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<210> 14
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<212> DNA
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<400> 14
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTTAAGACT CCACATGTCT
\hfill20
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<210> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipAGGCCTTCGG TTGGCCTATG
\hfill20
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<210> 24
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<211> 185
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<212> DNA
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<213> Sus Scrofa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-101
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Sus Scrofa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-104
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<210> 26
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<211> 129
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<212> DNA
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<213> Sus Scrofa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-111
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<210> 27
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<211> 88
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
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<400> Z-114
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Sus Scrofa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
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<211> 171
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-128
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-130
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-131
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-133
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> Z-134
Claims (4)
1. Un procedimiento para detectar, mediante una
amplificación enzimática basada en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), una secuencia de ADN caracterizado por la
unión de cebadores inespecíficos, que comprende hibridar dichos
oligonucleótidos en el genoma de un individuo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los oligonucleótidos inespecíficos se
seleccionan de entre secuencias que flanquean zonas repetidas en
especies distintas a la muestra de ADN que se utiliza como sustrato
en la reacción en cadena de la polimerasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque las secuencias de DNA altamente
repetidas objeto de la invención se encuentran en la banda que más
intensamente se tiñe después del barrido electroforético tras la
tincción con bromuro de etidio.
4. Procedimiento según la reivindicación 3
caracterizado por la extracción de la banda de DNA más
intensamente teñida, clonaje y secuenciación de la misma.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200300326A ES2226558B1 (es) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Metodo para la busqueda de marcadores de adn altamente repetidos en el genoma mediante amplificacion al azar. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200300326A ES2226558B1 (es) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Metodo para la busqueda de marcadores de adn altamente repetidos en el genoma mediante amplificacion al azar. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2226558A1 ES2226558A1 (es) | 2005-03-16 |
| ES2226558B1 true ES2226558B1 (es) | 2006-01-16 |
Family
ID=34384812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200300326A Expired - Fee Related ES2226558B1 (es) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Metodo para la busqueda de marcadores de adn altamente repetidos en el genoma mediante amplificacion al azar. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2226558B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19518769C2 (de) * | 1995-05-22 | 1997-04-17 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Inter-LINE-PCR |
| US6803215B1 (en) * | 2000-11-03 | 2004-10-12 | The Chinese University Of Hong Kong | Sequence characterized amplified region (SCAR) test for the authentication of traditional Chinese medicinal materials |
-
2003
- 2003-02-03 ES ES200300326A patent/ES2226558B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BEYER W et al. "Suitability of repetitive-DNA-sequence-based PCR fingerprinting for characterizing epidemic isolates of Salmonella enterica serovar Saintpaul". J. Clin. Microbiol., Jun. 1998, Vol. 36, Nº 6, páginas 1549-54. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2226558A1 (es) | 2005-03-16 |
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