ES2225849T3

ES2225849T3 - Metodo para probar la capacidad inmunologica.

Info

Publication number: ES2225849T3
Application number: ES95936055T
Authority: ES
Inventors: Ronald W. Pero
Original assignee: Optigenex Inc
Current assignee: Optigenex Inc
Priority date: 1994-10-27
Filing date: 1995-10-18
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2015-10-18
Also published as: ATE269971T1; JPH10509316A; PT788595E; AU684237B2; WO1996014565A1; DE69533200T2; DE69533200D1; EP0788595A4; US5925571A; EP0788595B1; NZ294919A; EP0788595A1; AU3813595A; DK0788595T3; CA2199943A1

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA COMPROBAR LA COMPETENCIA INMUNE DE UN INDIVIDUO MEDIANTE LA DETERMINACION, A PARTIR DE UNA MUESTRA DE LA SANGRE DEL INDIVIDUO, DE UN VALOR PARA LOS TIOLES TOTALES DEL PLASMA/SUERO QUE INCLUYE TANTO LOS TIOLES DE PROTEINAS COMO LOS TIOLES DIFERENTES A LOS DE PROTEINAS, Y COMPARANDO EL VALOR ASI DETERMINADO CON UN VALOR DE REFERENCIA DE LOS TIOLES TOTALES DEL PLASMA/SUERO PARA DETERMINAR CUANDO EL VALOR OBTENIDO ES MAYOR O MENOR QUE UN VALOR DE REFERENCIA, UN VALOR DETERMINADO INFERIOR AL VALOR DE REFERENCIA SERA INDICATIVO DE UNA FUNCION INMUNE DAÑADA.

Description

Método para probar la capacidad inmunológica.

La invención se refiere a métodos para probar en individuos humanos la alteración de la función inmunológica indicativa de la presencia de, o la predisposición a, enfermedades asociadas con un deterioro de la capacidad inmunológica. Tales pruebas pueden usarse, por ejemplo, como diagnóstico, como pronóstico y como una guía para determinar la necesidad de tratamiento preventivo o terapéutico de la enfermedad o el estado así indicado.

Más particularmente, la invención emplea una medida indirecta de la actividad de reparación del ADN basada en el estado de los tioles séricos/plasmáticos, como un marcador biológico de la salud humana. Por tanto, el método de la invención implica la medición de los tioles químicamente reactivos presentes en los aminoácidos, polipéptidos y las proteínas naturales que se encuentran en el suero o plasma humano. La concentración de estos tioles puede predecir la capacidad de reparación del ADN y la capacidad de respuesta inmunológica celular, y por tanto, son indicadores útiles de la progresión de la enfermedad cuando la alteración de la función inmunológica es un componente esencial de la enfermedad. La infección por VIH, el SIDA, el cáncer y los trastornos autoinmunes son ejemplos de enfermedades que tienen componentes inmunológicos.

La patente europea número 0 229 674, así como varios documentos publicados recientemente (Pero et al., Carcinogenesis 6:1055-58, 1985; Pero et al., Mutation Res. 142:69-73, 1985; Pero et al., Carcinogenesis 10:693-97, 1989; Pero et al., Carcinogenesis 10:1657-64, 1989) describen que la reparación del ADN en general, y específicamente la estimación cuantitativa de la adenosín difosfato ribosiltransferasa (ADPRT) es un indicador útil para valorar los riesgos para la salud en la detección, prevención y tratamiento de enfermedades crónicas humanas asociadas a la edad tales como cáncer, estados que predisponen al cáncer y enfermedades autoinmunes. En otro aspecto, se ha mostrado que la actividad ADPRT celular está relacionada con la capacidad de respuesta inmunológica celular (Scouvassi et al., Carcinogenesis 8:1295-1300, 1987; Pero et al., J. Neurosurg. 77:601-06, 1992; Johnstone y Williams, Nature 300:368-79, 1982; Johnson et al., Int. J. Biochem. 22:67-73, 1990) y se ha mostrado que ambos parámetros son modulados por el equilibrio de reducción/oxidación celular (redox) que, a su vez, parece estar mediado por el péptido glutatión que contiene tiol (Pero et al., Cancer Det. Prevent. 14:555-61, 1990; Pero et al., Cancer Res. 50:4619-25, 1990; Fidelius et al., Exp Cell Res. 170:269-75, 1987; Fidelius y Tsan, Inmunology 61:503-08, 1987; Fischman et al., J. Inmunol. 127:2257-62, 1981; Hamilos y Wedner, J. Inmunol. 135:2740-47, 1985).

El glutatión existe en el intervalo milimolar en el interior de las células (Kosower, Int. Rev. Cytol. 54:109-60, 1978; Meister, Science 220:472, 1983) y como tal se cree que es el primer reductor celular primario que protege a las células de la lesión celular por oxidación. Sin embargo, los niveles de glutatión en el suero/plasma humano (es decir, 2-27 \mu-moles/litro en Buhl et al., The Lancet, 1294-98, 2 de diciembre de 1989; Ayers et al., Anal. Biochem. 154:186-93, 1986) representan sólo una parte menor de los grupos tiol reactivos totales presentes, porque las proteínas séricas/plasmáticas constituyen la fuente principal de grupos tiol reactivos (es decir, 113-133 \mumoles/litro en Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77, 1959 y Ayers et at. Anal. Biochem. 154:186-93, 1986). Por tanto, la técnica enseña que hay al menos dos clases distintas de tioles en el suero/plasma y en otros tejidos biológicos; concretamente tioles proteicos y tioles no proteicos. Una revisión de la bibliografía apoya que los procedimientos convencionales para el análisis de los tioles séricos/plasmáticos en relación con las consecuencias para la salud humana se basan en el análisis de las fuentes no proteicas de tioles, tales como glutatión o cisteína, en las que se excluyen los tioles proteicos del análisis mediante el procedimiento de ensayo o se eliminan por precipitación usando agentes, tales como ácido tricloroacético, ácido metafosfórico, ácido sulfosalicílico o ácido perclórico antes de que se inicie cualquier análisis de tioles no proteicos (Beutler y Gelbert, J. Lab. Clin. Med. 105:581-04, 1985; Buhl et al., The Lancet, 1294-98, 2 de diciembre de 1989; Eck et al., Biol. Chem.

\hbox{Hoppe}

Seyler 370:101-81, 1989; Burgunder et al., Eur. J. Clin. Invest 18: 420-24, 1988; Burgunder y Lauterburg, Eur. J. Clin. Invest. 17 :408-14, 1987; Mimic-Oka et al., Biochem. Med. Met. Biol. 39 :48-54, 1988;

\hbox{M \ring{a} rtensson}

, Metabolism 35:118-21, 1986; Vendemiales et al., J. Hepatology 9:359-65, 1989). El análisis de los tioles no proteicos de las muestras biológicas se ha desarrollado como el procedimiento habitual de ensayo principalmente debido a la fuerte creencia científica de que el glutatión, un tiol no proteico, es el reductor celular principal que protege a las células contra los efectos nocivos sobre la salud de la lesión oxidativa (Meister, Science 220:472, 1983).

Se ha postulado que el daño celular oxidativo es un factor importante en (i) el envejecimiento (Harmon, Age 7:11-31, 1984), (ii) la diabetes (Wilson et al., Diabetologia 27:587-91, 1984), (iii) la resistencia a los fármacos (Spitz et al., J. Cell Physiol. 156:72-9, 1983), VIH+/SIDA (Baruchel y Wainberg, J. Leuk. Biol. 52:111-14, 1992), (iv) la iniciación y promoción del cáncer (Marnett, Carcinogenesis 8:1345-73, 1987; Cerutti, Science 227:375-81, 1985), (v) la etiología de las enfermedades cardiovasculares y autoinmunes (Cross et al., Ann. Int. Med. 107:526-45, 1987) y (vi) la modulación de la función inmunológica (Carson et al., J. Exp. Med. 163:746-51, 1986). La mayoría de estas pruebas surge de la evaluación del estrés oxidativo mediante comparación de células con déficit de glutatión y células con mucho glutatión. Por ejemplo, se ha mostrado que el déficit de glutatión (o de cisteína, su precursor sintético) (i) predispone a las células a un aumento de la sensibilidad al daño del ADN (Edgren et al., Int. J. Rad. Biol. 40:355-63, 1985; Valis, The Lancet 337:918-19, 1991), (ii) inhibe la reparación del ADN (Pero et al., Cancer Res. 50:4619-25, 1990; Edgren y Revesz, Int. J. Rad. Biol. 48:207-12, 1985) o (iii) induce déficit de la respuesta inmunológica celular (Hamilos y Wedner, J. Inmunol. 135:2740-47, 1985; Fischman et al., J. Inmunol. 127:2257-62, 1981; MacDermott et al., Inmunology 57:521-26, 1986; Droege et al., Inmunobiology 172:151-56, 1986; Stacey y Craig, Experienta 45:180-81, 1989). En otras palabras, la técnica enseña que el componente de tiol no proteico es el factor importante que relaciona el daño celular oxidativo con el desarrollo de enfermedad en humanos, y el componente de tiol proteico, que domina cuantitativamente en las muestras biológicas, no tiene ninguna importancia directa o reguladora en relación con las consecuencias para la salud del desequilibrio redox, y en el caso de que indicara algo, es un estimador indirecto e inespecífico comparado con el papel regulador principal del componente de tiol no proteico.

Pruebas adicionales para esta interpretación se extraen de la bibliografía médica en la que los tioles séricos/plasmáticos se han empleado para monitorizar los trastornos de la salud. Las enfermedades malignas (Beutler y Gelbert, J. Lab. Clin. Med. 105:581-84, 1985), la insuficiencia renal crónica (Mimic-Oka et al., Biochem. Med. Met. Biol. 39:48-54, 1988), la secreción de insulina mediada por glucosa (Ammon et al., Diabetologia 32:797-800, 1989), la ingestión de etanol (Burgunder et al., Eur. J. Clin. Invest. 18:420-24, 1988; Vendemiale et al., J. Hepatology 9:359-65, 1989), el ayuno (M\ring{a}rtensson, Metabolism 35:118-21, 1986), la infección por VIH (Buhl et al., The Lancet, 1294-98, 2 de diciembre de 1989), SIDA (Eck et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 370:101-08, 1989) y la cirrosis (Burgunder y Lauterburg, Eur. J. Clin. Invest. 17:408-14, 1987) representan prácticamente todas los estados médicos en los que los tioles séricos/plasmáticos se han usado con éxito para monitorizar los trastornos de la salud. En todos los casos, se evaluaron los tioles séricos/plasmáticos no proteicos tales como glutatión o cisteína y se tuvo mucho cuidado en eliminar los tioles proteicos del procedimiento de ensayo. Estos datos indican claramente que no era obvio para un experto en la técnica incluir los tioles séricos/plasmáticos proteicos en los análisis o que podían ser indicadores de las consecuencias para la salud del estrés oxidativo, tan buenos o incluso mejores que los tioles no proteicos.

La insuficiencia cardiaca congestiva (Belch et al., Br. Heart J. 65:245-48, 1991) y la artritis reumatoide (Pullar et al., Br. J. Rheumat. 26:202-06, 1987) son las únicas excepciones encontradas en la bibliografía científica en la que se incluyeron tanto los tioles séricos/plasmáticos proteicos como no proteicos en los análisis finales. Sin embargo, la lógica que se encuentra detrás de estas excepciones no indicó que los tioles séricos/plasmáticos totales proteicos y no proteicos fueran un mejor indicador de las consecuencias para la salud del daño celular oxidativo que los tioles séricos/plasmáticos no proteicos. Al contrario, se postuló en estos estudios que como la albúmina sérica/plasmática era un factor importante para estas enfermedades, y como la albúmina es el componente proteico principal del suero/plasma y contiene numerosas funciones de tiol, se dedujo que la estimación de los tioles séricos/plasmáticos totales proteicos y no proteicos era una medida indirecta eficaz del estado de oxidación de la albúmina. Por tanto, la inclusión en el ensayo de tioles séricos/plasmáticos no proteicos, tales como glutatión o cisteína, y proteínas distintas a la albúmina no añadía ninguna ventaja metodológica significativa, aunque se incluyeron en los análisis finales y contaminaron la valoración de los tioles de la albúmina.

Sumario de la invención

La presente invención contempla ampliamente proporcionar un método para probar la capacidad inmunológica de un individuo, que comprende las etapas de obtener una muestra sanguínea de un individuo que va a ser probada; determinar, a partir de la muestra, un valor de los tioles plasmáticos/séricos totales, incluyendo tanto los tioles proteicos como los tioles no proteicos, para el individuo; y comparar el valor así determinado con un valor referencia de los tioles plasmáticos/séricos totales, para averiguar si el valor así determinado es superior o inferior al valor de referencia, identificando un valor determinado inferior al valor de referencia al individuo que tiene una alteración de la función inmunológica significativa para detectar, prevenir o tratar alteraciones de la salud.

La invención abarca el descubrimiento inesperado que, cuando el análisis cuantitativo de los tioles proteicos se incluye en el procedimiento de ensayo de suero/plasma, existe una relación altamente significativa con la función de la reparación celular del ADN, estimada como la actividad ADPRT, en los leucocitos mononucleares con buena capacidad inmunológica. Como la reparación del ADN, y específicamente la actividad ADPRT, estima las funciones celulares en respuesta al daño celular oxidativo que puede predecir el riesgo de alteración de la función inmunológica y de enfermedades asociadas con la edad tal como ya se ha documentado en publicaciones tratadas anteriormente, este descubrimiento establece que los tioles séricos/plasmáticos totales (es decir, proteicos y no proteicos) sirven como un ensayo indirecto cuantitativo para la estimación de la reparación del ADN, la función inmunológica y el riesgo para la salud en la detección, prevención y terapia de las enfermedades humanas. Por tanto, los análisis de los sulfhidrilos séricos/plasmáticos totales han mejorado la sensibilidad y la importancia biológica sobre los procedimientos de ensayo que estiman sólo los tioles séricos/plasmáticos de las sustancias no proteicas tales como el glutatión.

La invención contempla medir el nivel total de grupos tiol séricos/plasmáticos presentes en los componentes proteicos y no proteicos, y relacionar el nivel de tioles con la reparación del ADN, la función inmunológica y con la detección, prevención y tratamiento de las enfermedades humanas tales como cáncer, SIDA, trastornos autoinmunes y cardiovasculares. Aunque la invención en sus aspectos más amplios no se limita a procedimientos específicos para la determinación de los tioles séricos/plasmáticos totales, en realizaciones ilustrativas de la invención los tioles séricos/plasmáticos totales pueden determinarse convenientemente mediante procedimientos espectrofotométricos o fluorométricos que implican el desarrollo de cromóforos después de la reacción con tioles usando disulfuros aromáticos tales como DTNB (ácido 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoico), oxidantes orgánicos o inorgánicos tales como ácido yodobenzoico, difenil picrilfenil hidracina, benzofuroxano, 4,4'-dimetilaminodifenil carbinol, quinonas, ácido trinitrobencenosulfónico, nitroprusida, ferricianuro, cobre cúprico, permanganato, yodo, mercuriales, ácido nitroso, maleimidas, haluros, sales de platino, iones de paladio, derivados de fluorobenzoxadiazol o reacción de p-nitroaniluro sensible a papaína-tiol (Jocelyn, Methods in Enzymology 143:44-67, 1987; Imai, Methods in Enzymology 143:6775, 1987; Ayers et al., Anal. Biochem. 154:186-93, 1986; Singh et al., Anal. Biochem. 213:49-46, 1993). La concentración de agente cromofórico, el pH, el tiempo de incubación de la mezcla de reacción y el estado de desnaturalización de la estructura de las proteínas con agentes tales como el dodecil sulfato de sodio, urea o cloruro de guanidinio son variables bien conocidas que afectan a la cuantificación de tioles y como tales, debería controlarse óptimamente cada agente cromofórico de ellos y no servirían como una base para limitar el alcance de esta invención.

En otro aspecto, esta invención propone relacionar la actividad ADPRT con el contenido de tioles séricos/plasmáticos. Esto se realiza lógica y teóricamente sacando provecho de los hechos de que la ADPRT es una proteína que contiene tioles y al menos algunos de los tioles se localizan en el dominio de unión del zinc de la enzima que, a su vez, controla su participación en la reparación del ADN (Mazen et al., Nucleic Acids Res. 17:4689-98, 1989).

Por tanto, la actividad ADPRT se regula drásticamente por incremento y por disminución mediante el equilibrio de reducción/oxidación celular que, a su vez, se regula y monitoriza mediante el estado de los tioles (Pero et al., Cancer Res. 50:4619-25, 1990). Además, se ha encontrado que hay una producción natural de inhibidores de la ADPRT mediante procesos celulares metabólicos normales que pueden inhibir la reparación del ADN y la función inmunológica celular. Estas sustancias se identificaron como HOCI y N-cloraminas que son oxidantes de tiol bien conocidos (Schraufstatter et al., J. Clin. Invest. 85:554-62, 1990). También se ha encontrado que la mayoría de los tioles séricos/plasmáticos totales reaccionan químicamente con las N-cloraminas, y como tales, este parámetro puede usarse como un indicador indirecto de laproducción celular endógena de HOCl/N-cloraminas. Debido a que HOCl/N-cloraminas producidos como subproductos del metabolismo celular también inhiben la reparación del ADN (Van Rensberg et al., Free Radic. Biol. Med. 11:258-91, 1991) y la función inmunológica, los tioles séricos/plasmáticos que reaccionan con los HOCl/N-cloraminas miden asimismo las consecuencias funcionales para la salud de las células estresadas oxidativamente que pueden tener lugar en los trastornos humanos tales como el envejecimiento, la autoinmunidad, el cáncer, la enfermedad cardiovascular, la diabetes, la resistencia a los fármacos y la infección por VIH.

Existen diferentes clases de actividad ADPRT bien conocidas; concretamente, las actividades constitutiva, inducida y activada de ADPRT. El daño del ADN es un cofactor necesario que conduce la actividad enzimática de la ADPRT (Satoh y Lindahl, Nature 356:356-58, 1992). El nivel de ADPRT constitutiva refleja la actividad enzimática intrínseca o en estado estacionario en respuesta a los niveles celulares endógenos de la inducción del daño del ADN. Sin embargo, la actividad ADPRT puede activarse mediante agentes que dañan el ADN suministrados exógenamente, tales como células que se estresan oxidativamente por la exposición a especies de oxígeno reactivo producidas por fagocitos o agentes químicos (Pero et al., Cancer Det. Prevent. 14:555-61, 1990), hasta niveles máximos de actividad ADPRT. En consecuencia, la actividad ADPRT inducida (por ejemplo, en respuesta al estrés oxidativo) puede calcularse restando la actividad ADPRT constitutiva de la actividad ADPRT activada. Esta invención también engloba el descubrimiento de que cuando la actividad ADPRT se activa mediante el daño del ADN y se mide bien como niveles de ADPRT activados o bien inducidos, los niveles de tioles plasmáticos estiman significativamente la actividad enzimática ADPRT de los leucocitos mononucleares si se determinan de forma paralela en las mismas muestras sanguíneas que se usan para obtener las muestras de plasma.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada que se expone posteriormente, junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico en el que la ADPRT inducida por PMA en 1 x 10^{6} HML y la producción celular de HOCI se representan frente a la incubación con neutrófilos.

la figura 2 es un gráfico que tiene dos partes en las que la actividad ADPRT inducida por PMA en HML se representa frente a los \muM de cloramina T y de HOCI, respectivamente;

la figura 3 es un gráfico de tres partes en el que las unidades de absorbancia a 412 nm se representan frente a la ADPRT activada por H_{2}0_{2} para los grupos tiol totales del plasma, los grupos tiol del plasma insensibles a la N-cloramina y los grupos tiol del plasma sensibles a la N-cloramina;

la figura 4 es otro gráfico similar a la figura 3; y

la figura 5 es un gráfico que ilustra una prueba de ADPRT indirecta para los tioles del suero para grupos de pacientes VIH positivos y VIH negativos.

Descripción detallada

El método de la invención para probar la capacidad inmunológica de un individuo humano comprende las etapas de obtener una muestra de la sangre del individuo que va a ser probada; someter la muestra a un ensayo para determinar un valor de los tioles séricos/plasmáticos totales (proteicos y no proteicos) para el individuo; y comparar el valor así determinado con un valor de referencia para establecer si el valor así determinado es superior o inferior al valor de referencia, identificando un valor determinado inferior al valor de referencia al individuo que tiene una alteración de la función inmunológica.

El ensayo incluye normalmente proporcionar inicialmente una muestra sérica o plasmática a partir de la muestra sanguínea obtenida y determinar el valor de los tioles totales (es decir, tanto los tioles proteicos como los tioles no proteicos) en la muestra sérica o plasmática mediante un procedimiento espectrofotométrico o fluorométrico que implica el desarrollo de cromóforos después de reaccionar con los tioles utilizando un agente cromofórico adecuado, tal como se ha tratado anteriormente. Tales procedimientos, bien conocidos en sí mismos en la técnica, proporcionan una medición o lectura, por ejemplo en unidades de absorbancia a 412 nm, que representa un valor determinado de los tioles séricos/plasmáticos totales para el individuo.

El valor determinado se compara entonces con un valor de referencia para indicar si el individuo probado tiene o no una alteración de la función inmunológica según que el valor determinado de los tioles séricos/plasmáticos totales esté por debajo o por encima del valor de referencia. Es decir, según la presente invención se ha encontrado ahora que, para cualquier procedimiento para ensayar los tioles séricos/plasmáticos totales (proteicos y no proteicos) de un individuo, existe un valor de referencia tal que un valor determinado para los tioles séricos/plasmáticos totales de un individuo por debajo de este valor de referencia identifica al individuo que tiene una alteración de la función inmunológica.

El establecimiento de un valor de referencia apropiado con respecto a la función como un indicador de la alteración de la función inmunológica será fácilmente evidente para las personas expertas en la técnica a partir de la siguiente descripción. Por ejemplo, el valor de referencia puede establecerse probando varios individuos con capacidad inmunológica conocida (alterada o no alterada) para determinar un intervalo de valores de los tioles séricos/plasmáticos totales de tales individuos e identificando el límite inferior del intervalo (o seleccionado un punto, relacionado a él, que proporcione un nivel deseado de confianza de la determinación de la alteración o no alteración de la función inmunológica) como el valor de referencia. Tal valor de referencia se ilustra en el ejemplo 5 descrito posteriormente, como el límite inferior de los tioles séricos totales de un grupo de pacientes VIH- (capacidad inmunológica normal). La figura 5, que representa los datos obtenidos en el ejemplo 5, muestra que entre los pacientes VIH+ probados, algunos tenían valores determinados de tioles séricos totales por encima de este valor de referencia y otros tenían valores determinados de tioles séricos totales por debajo del valor de referencia. Dentro del periodo de investigación, sólo tuvieron lugar fallecimientos en el último grupo (por debajo del valor de referencia) de pacientes VIH+ y no en el primer grupo (por encima del valor de referencia) de pacientes VIH+, corroborando la correlación entre la alteración de la función inmunológica y los valores determinados de tioles séricos totales por debajo del valor de referencia.

Un uso ilustrativo del presente método es una guía para decidir si se somete un paciente particular a tratamiento de su estado o consecuencias de la alteración de la función inmunológica así establecida. Por ejemplo, en el caso de pacientes VIH+ tal como se representan en el ejemplo 5, aquellos que tienen valores determinados de tioles séricos totales por debajo del valor de referencia (representados por aproximadamente 0,25 unidades de absorbancia a 412 nm) podrían ser sometidos inmediatamente a tal tratamiento, mientras que aquellos que tienen valores de tioles séricos totales por encima del valor de referencia, que indica una capacidad inmunológica todavía no comprometida, no necesitarían aún tratamiento.

En un aspecto específico, el método de la invención puede emplearse como una medida indirecta de la actividad ADPRT inducida, que es a su vez un indicador de la presencia de, o una predisposición para, enfermedades asociadas con el ADN, tal como se describe por ejemplo en la patente europea número 0 229 674.

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos que se exponen más adelante, en los que se emplearon los siguientes procedimientos específicos:

Preparación del componente sanguíneo. - Se obtuvieron muestras de sangre periférica (n = 225) de voluntarios aparentemente sanos, pacientes con predisposición al cáncer y pacientes con cáncer, mediante punción venosa y se recogieron en tubos vacutainer heparinizados (143 unidades USP (Farmacopea de los EE.UU.)/tubo de 10 ml). Las muestras sanguíneas se centrifugaron primero a 100 X G durante 10 min y se eliminó el plasma rico en plaquetas con una pipeta Pasteur. Los plasmas pobres en plaquetas que van a usarse en estos experimentos se prepararon mediante centrifugación de los plasmas ricos en plaquetas a 400 X G durante 25 min para sedimentar las plaquetas. A continuación, el volumen original de muestras sanguíneas se recuperó mediante adición de suero salino fisiológico y después, se dispuso con cuidado en capas encima de un soporte de densidad disponible comercialmente (1,077 g/ml, Organon Teknika) antes de hacerlo girar a 400 X G durante 25 min. Los leucocitos mononucleares humanos (HML) se aislaron a partir de la zona de interfase del gradiente de densidad, se lavaron mediante centrifugación usando medio RPMI 1640 y se ajustó la densidad celular para los fines de cultivo in vitro de la manera convencional. Cuando se necesitaron tanto los HML como los neutrófilos, las fracciones celulares se aislaron simultáneamente mediante deposición en capas de la muestra sanguínea encima del medio de aislamiento de neutrófilos (Cardinal Associates) y se llevaron a cabo todas las etapas en el aislamiento con gradiente de densidad usando el tampón fosfatado Krebs-Ringer con glucosa (KRPG, pH = 7,4) según el procedimiento de Nathan (J. Clin. Invest. 80:1550-60, 1987).

Citotoxicidad. - Con independencia del método de aislamiento usado para el fraccionamiento de las células sanguíneas, los HML siempre se resuspendieron en el medio RPMI 1640 enriquecido con el 10-20% de suero o plasma, sedimentaron y después, se resuspendieron de nuevo bien en suero salino fisiológico o bien en tampón KRPG para el tratamiento bien con HOCI o bien con cloramina T (Sigma). La concentración de HOCI se determinó a partir de e_{235} = 100 M^{-1}cm^{-}1. La citotoxicidad se monitorizó mediante exclusión celular con azul de tripano (disolución isotónica al 0,2% + suero al 5%) tras 15 min de incubación con el colorante a 37ºC. La citotoxicidad de HOCI y de N-cloramina se conoce bien (Schraufstatter et al., 3. Clin. Invest. 85:554-62, 1990). Sin embargo, fue importante determinar que cualquier efecto bioquímico sobre la actividad ADPRT inducido por estos agentes no estaba relacionado con la citotoxicidad aguda. Las condiciones experimentales explicadas anteriormente y usadas para recoger los datos notificados en el presente documento, no fueron citotóxicas de forma aguda.

Medición de HOCI. - Se ensayó la producción de HOCI en el medio condicionado extracelular en cultivos mixtos de HML + neutrófilos mediante eliminación de las células mediante centrifugación tras el periodo de incubación y mediante retención inmediata del HOCI producido con taurina (20 mM). Después, se cuantificó espectrofotométricamente la cloramina taurina usando la conversión de I^{-} a I^{2} (E = 2,29 X 10^{4} M^{-1}cm^{-1}). Weiss et al. (J. Clin. Invest. 70:598-607, 1982) han descrito detalles de este procedimiento.

Ensayo de ADPRT. - El procedimiento se adaptó a partir de la técnica de célula permeabilizada de Berger (Methods Cell. Biol. 20:325-340, 1988) con modificaciones tal como se han descrito anteriormente (Pero et al., Carcinogenesis 10:1657-64, 1989). Se cultivaron muestras duplicadas de 1 X 10^{6} HML en presencia de 0 a 4 X 10^{6} neutrófilos en 1 mI de tampón KRPG durante 30 min a 37ºC en presencia de PMA (forbol-12-miristato-13-acetato, 25 ng/mi). Después de esta co-incubación, las mezclas de HML + neutrófilos se recogieron mediante centrifugación, se permeabilizaron y se determino la actividad ADPRT mediante un procedimiento radiométrico tal como se describe en detalle en otro documento (Pero et al., Carcinogenesis 10:1657-64, 1989). En otros experimentos, las muestras duplicadas de HML de 1 X 10^{6} por ml de tampón KRPG se trataron directamente con intervalos de dosis de 0-100 \muM de HOCI o cloramina T durante 30 min a 37ºC, seguido después inmediatamente por el tratamiento con una dosis normalizada de PMA (25 ng/mI) durante otros 30 min antes del análisis de la actividad ADPRT tal como se ha mencionado ya anteriormente.

Determinación de los tioles séricos/plasmáticos. - Las muestras sanguíneas se extrajeron a partir de las mismas muestras sanguíneas heparinizadas que se usaron para determinar la actividad poli ADPRT de los leucocitos mononucleares. Las muestras se almacenaron bajo nitrógeno líquido hasta que se sometieron al análisis. Se descongeló cada muestra plasmática y se centrifugó a 2000 X G hasta que sedimentara cualquier fibrina precipitada. Se prepararon dos ml de plasma al 20% en agua (es decir, dilución 4:1 de plasma con agua) y se añadieron 30 \mul de 5,5'-ditiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DNTB) como una disolución de 9,5 mg/ml disuelta en K_{2}HPO_{4} 0,1 M, EDTA 17,5 mM, pH 7,5. Se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h, momento en el que se midieron las unidades de absorbancia a 412 nm (A_{412}). Después, se añadió la cloramina T (Sigma) disuelta en agua a una concentración final de 40 \muM y se leyó de nuevo la A_{412} después de 30 min. Se calcularon los tioles plasmáticos totales así como los tioles plasmáticos sensibles e insensibles a la N-cloramina mediante resta de los valores del reactivo blanco de los valores de tioles totales que reaccionan con DNTB y que reaccionan con N-cloramina. En el estudio que incluye a pacientes VIH+ (n = 15) y VIH- (n = 13) iniciados en mayo de 1993, se usó el mismo procedimiento excepto que se analizaron muestras séricas en vez de muestras plasmáticas. Las muestras séricas fueron donadas por consumidores de drogas por vía intravenosa que acudían al Aaron Diamond Research Center for AIDS (Centro de Investigaciones del SIDA Aaron Diamond). Se prepararon los sueros durante un periodo de años y se almacenaron biológicamente a –80ºC hasta que se usaron en este estudio.

Ejemplo 1

Este ejemplo establece que los fagocitos humanos (es decir, los neutrófilos) producen concentraciones fisiológicas importantes de inhibidores endógenos de la ADPRT. En condiciones que permiten el cultivo viable de células, se incubó una cantidad normalizada de HML (leucocitos mononucleares humanos, 1 X 10^{6}) junto con cantidades crecientes de neutrófilos desde 0 hasta 4 X 10^{6} células por cultivo. Los neutrófilos no responden a la inducción del daño del ADN mediante una activación de la ADP-ribosilación y, por tanto, estas células no contribuyen a la estimación de la ADP-ribosilación en este experimento (Ikai et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 77:3682-85, 1980). A continuación, estos cultivos combinados se expusieron a PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) para activar la ADP-ribosilación en los HML y para inducir la producción de productos intermedios del oxígeno reactivo por parte de los neutrófilos. Los productos intermedios abundantes del oxígeno reactivo, los radicales hidroxilados, el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno son inductores bien conocidos de la ADP-ribosilación (Pero et al, Cancer Det. Prevent. 14:555-61, 1990). Los datos de la figura 1 muestran que cuando las razones de HML + neutrófilos alcanzaron 1:2 (X 10^{6} células/ml), lo que es comparable con la proporción y concentración en la sangre, la ADP-ribosilación en los HML empezó a inhibirse gravemente. La explosión respiratoria inducida por la exposición de los neutrófilos a PMA se monitorizó mediante la producción de HOCI. Se concluyó que ni la presencia de neutrófilos ni la producción de aproximadamente 80 \muM de HOCI o N-cloramina era suficiente para producir la inhibición de la ADP-ribosilación en los HML.

Ejemplo 2

El efecto de varios niveles de dosificación de cloramina T y HOCI sobre la actividad ADPRT inducida por PMA en los HML se investigó usando los procedimientos descritos anteriormente para tales pruebas, midiendo la actividad ADPRT inducida por PMA para los HML sometidos a las diversas dosificaciones y comparando los valores obtenidos con los valores control medidos de la actividad ADPRT inducida por PMA en los HML a partir de la misma fuente pero con ninguna dosificación de cloramina T y HOCI. Los resultados, representados en la figura 2, confirman que el HOCI y la cloramina T son inhibidores naturales potentes de la ADPRT porque pueden producir > 80% de inhibición de la actividad ADPRT de los HML (leucocitos mononucleares humanos) con dosis de 80 \muM, que son niveles fácilmente alcanzables en la sangre periférica en condiciones de cultivo que ofrecen una citotoxicidad desdeñable. Este ejemplo, junto con el ejemplo 1, muestra claramente que los inhibidores de la ADPRT se producen naturalmente como un subproducto de la explosión respiratoria de los fagocitos, la cual es una función normal de este tipo celular diseñado para matar a los agentes infecciosos.

Ejemplo 3

Se determinaron valores para la actividad ADPRT activada por H_{2}0_{2} en los HML y para los tioles plasmáticos totales, los tioles plasmáticos insensibles a la N-cloramina y los tioles plasmáticos sensibles a la N-cloramina procedentes de las mismas muestras sanguíneas (n = 225), utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Los resultados se representan en la figura 3. Este ejemplo demuestra que los tioles plasmáticos predicen de manera significativa el nivel de actividad ADPRT activada por peróxido de hidrógeno determinada en los HML (leucocitos mononucleares humanos) procedentes de las mismas muestras sanguíneas. Además, este ejemplo muestra que los tioles plasmáticos sensibles a la N-cloramina ofrecen una mejor correlación que los tioles plasmáticos insensibles a la N-cloramina con respecto a la actividad ADPRT de los HML, y que la mayoría de los tioles plasmáticos sensibles a la N-cloramina son tioles plasmáticos proteicos y no sólo tioles plasmáticos no proteicos. Por consiguiente, el mejor factor de predicción indirecto de la actividad ADPRT fueron los tioles plasmáticos totales proteicos + no proteicos. El HOCI y las N-cloraminas son oxidantes eficaces de los tioles y podrían como tales, de una manera indirecta, indicar la actividad ADPRT. La actividad ADPRT de unión lógica a los tioles plasmáticos se basa en los hechos (1) de que la ADPRT puede regularse por incremento y por disminución de manera dependiente de la dosis mediante glutatión reducido y oxidado, respectivamente (Pero et al., Cancer Res. 50:4619-25, 1990) y (2) de que la ADPRT tiene constituyentes aminoácidos de tiol en el dominio de unión al ADN de la enzima que, a su vez, controla su participación en la reparación del ADN (Mazen et al., Nucleic Acid Res. 17:4689-98, 1989).

Ejemplo 4

De nuevo según los procedimientos descritos anteriormente, se realizaron pruebas para comparar los valores de ADPRT inducida por H_{2}O_{2} en los HML con valores de tioles plasmáticos totales, tioles plasmáticos insensibles a la N-cloramina y tioles plasmáticos sensibles a la N-cloramina procedentes de las mismas muestras sanguíneas. El ejemplo 4 amplía el conocimiento descrito en el ejemplo 3 para mostrar que los tioles plasmáticos también pueden predecir la actividad ADPRT de los HML (leucocitos mononucleares humanos) inducida por peróxido de hidrógeno (figura 4). Los ejemplos 3 y 4 también enseñan que como los niveles inducidos y activados de ADPRT se relacionan directamente con la reparación del ADN en general, entonces los tioles plasmáticos también pueden usarse para estimar de forma indirecta las respuestas de reparación del ADN en los HML.

Ejemplo 5

Las muestras séricas mencionadas anteriormente de individuos VIH+ y VIH- se ensayaron mediante el procedimiento de determinación de tioles plasmáticos/séricos descrito anteriormente para determinar los valores de los tioles séricos totales. Los resultados se representan en el gráfico de la figura 5.

El ejemplo 5 confirma que la estimación de los tioles séricos sensibles a la N-cloramina tiene una utilidad clínica porque los niveles reducidos indican déficit de ADPRT en los HML (leucocitos mononucleares humanos) que puede conducir a la acumulación de daño del ADN e inhibición de la función inmunológica con importancia en la progresión de la infección VIH+ a SIDA y a la muerte. Los cuadrados semi-rellenos representan las únicas muertes que tuvieron lugar en agosto de 1993. El estudio se realizó en mayo de 1993.

Claims

1. Método para probar la capacidad inmunológica de un individuo, que comprende las etapas de:

(a) determinar, en una muestra sanguínea de un individuo que va a probarse, un valor medido para los tioles plasmáticos o séricos totales, incluyendo tanto los tioles proteicos como los tioles no proteicos, para dicho individuo con el fin de proporcionar una medida indirecta que estima la actividad de reparación del ADN en dicho individuo, y

(b) comparar el valor así determinado con un valor de referencia para determinar si dicho valora así determinado es superior o inferior a dicho valor de referencia, identificando un valor determinado inferior a dicho valor de referencia a dicho individuo que tiene una actividad de reparación del ADN que indica una alteración de la función inmunológica significativa para detectar, prevenir o tratar trastornos de la salud.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende obtener una muestra de suero o plasma a partir de la muestra sanguínea y someter la muestra de suero o plasma a un ensayo para determinar los tioles totales que incluyen los tioles proteicos y los tioles no proteicos.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el ensayo comprende un procedimiento espectrofotométrico o fluorométrico que implica el desarrollo de cromóforos tras reaccionar con los tioles usando un agente cromofórico.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el individuo en VIH+ y el valor de referencia se establece determinando valores para los tioles plasmáticos/séricos totales para individuos VIH-, de manera tal que un valor determinado inferior a dicho valor de referencia identifica a dicho individuo que tiene una alteración de la función inmunológica.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la medida indirecta indica actividad activada o inducida de adenosín difosfato ribosiltransferasa (ADPRT) y el valor de referencia de los tioles plasmáticos/séricos totales corresponde a un nivel de referencia de la actividad ADPRT, en el que dicha presencia de o predisposición a una enfermedad asociada con daño del ADN está indicada si dicho valor así determinado es inferior a dicho valor de referencia.