ES2224696T3 - Procedimiento microbiologico de eliminacion de un compuesto nitroaromatico. - Google Patents
Procedimiento microbiologico de eliminacion de un compuesto nitroaromatico.Info
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Abstract
Procedimiento microbiológico de eliminación de al menos un compuesto nitroaromático presente en una solución o en un suelo, caracterizado porque comprende una etapa de puesta en contacto de dicha solución o dicho suelo con una biomasa de una cepa Penicillium en condiciones adecuadas para una mineralización de dicho compuesto nitroaromático por la cepa Penicillium, en presencia de una fuente de carbono para la cepa de Penicillium en la que la cepa de Penicillium es la cepa Penicillium sp. LCM depositada con el número I-2081 en el CNCM mantenido por el Instituto Pasteur de Francia.
Description
Procedimiento microbiológico de eliminación de un
compuesto nitroaromático.
La presente invención se refiere a un
procedimiento microbiológico de eliminación de un compuesto
nitroaromático presente en una solución o en un suelo, y a una cepa
de microorganismo capaz de mineralizar dicho compuesto
nitroaromático.
El procedimiento de la invención es muy
utilizado, por ejemplo, para tratar una solución como, por ejemplo,
un efluente industrial o un suelo, contaminado con un compuesto
nitroaromático, por ejemplo, dinitrotolueno (DNT) o trinitrotolueno
(TNT).
Han sido exploradas diferentes vías de
degradación de compuestos nitroaromáticos en la técnica anterior.
Estas vías son esencialmente biológicas o bien químicas.
Por ejemplo, en 1998, KALAFUT y col. estudiaron
la transformación del TNT por tres bacterias aerobias:
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp., y Staphylococcus
sp. Se ha demostrado que estas tres cepas transformaban el TNT
pero no podían utilizarlo como la única fuente ni para carbono ni
para nitrógeno. El estudio está recogido en el documento de
KALAFUT, y col., "Biotransformation patterns of
2,4,6-trinitrotoluene by aerobie bacteria", Cur.
Microbiol., 1998, 36, 45-54.
En 1998, BOOPATHY y col. desarrollaron un
biorreactor aerobio/anóxico a escala de laboratorio para la
descontaminación de un suelo contaminado con TNT. Este procedimiento
puede ser realizado en un sistema "discontinuo" o
semi-continuo. El tratamiento discontinuo permite
una transformación del TNT, pero se acumulan ciertos metabolitos.
Por el contrario, en semi-continuo (cambio de 10%
del suelo regularmente) la degradación del TNT (8 g/kg de suelo) es
completa. El balance, después de 14 horas de incubación, indica que
solamente un 23% de TNT ha sido mineralizado, 27% asimilado y un 8%
se encuentra adsorbido sobre el suelo. El porcentaje restante
corresponde a la formación de metabolitos como
amino-dinitrotoluenos (4%),
2,4-diamino-6-nitrotolueno
(3%) y 2,3-butanodiol procedentes de la escisión
del ciclo (3%). Las adiciones sucesivas de suelo una, dos o tres
veces a la semana no afectan a la velocidad de degradación del TNT.
Además, este reactor permite un mantenimiento de la población
bacteriana, con 0,3% de melazas como único
co-sustrato necesario. Utilizando el mismo
procedimiento, es posible eliminar otros contaminantes del suelo,
como
hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,4-triazina
(RDX),
octahidro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocina
(HMX), trinitrotolueno y 2,4-dinitrotolueno. Estos
resultados están recogidos por BOOFATHY, R. y col. "A laboratory
study of the bioremediation of
2,4,6-trinitrotoluene-contaminated
soil lusing aerobic/anoxic soil slurry reactor", Water
Environment Research, 1998.
En 1998, VORBECK y col. estudiaron la reducción
microbiológica de los grupos nitro del TNT y la hidrogenación
microbiológica del ciclo aromático. Por motivo de la deficiencia de
electrones debida a la presencia de los grupos nitro atractores de
electrones, la primera transformación microbiana del TNT es una
nitro-reducción. La hidrogenación del ciclo
aromático descrita para el ácido pícrico permanece minoritaria. Han
sido aisladas dos bacterias de un medio aerobio, enriquecido en TNT
como la única fuente de nitrógeno: la cepa TNT-8
(gram-) y la cepa TNT-32 (gram+). Estas catalizan la
nitro-reducción del TNT. Por el contrario, las
cepas Rhodococcus erythropolis HL PM-1 (que
crece sobre ácido pícrico) y Mycobacterium sp. HL
4-NT-1 (que crece sobre 4-
nitrotolueno) poseen sistemas enzimáticos que catalizan la
hidrogenación del TNT y, como consecuencia, la adición de un ion
hidruro sobre el ciclo aromático. El complejo
hidruro-Meisenheimer del TNT (H-TNT)
así formado es seguidamente convertido en un metabolito amarillo no
degradable, identificado por RMN. En este caso, no se observó
ninguna desnitración reductora del TNT. La mineralización del TNT
no ha sido estudiada. Estos resultados son recogidos por VORBECK, C.
y col., "Initial Reductive reactions in aerobic microbial
metabolism of 2,4,6-trinitrotolu\thetane",
Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64(1),
246-252.
Pero ninguno de los microorganismos descritos en
estos documentos permite una mineralización total o casi total del
TNT.
Las vías químicas de degradación presentan como
tales numerosos inconvenientes asociados a la utilización de
reactivos químicos. Estos inconvenientes son particularmente el
coste de los reactivos químicos y la contaminación producida por
estos reactivos en las soluciones y los suelos tratados.
El documento de Ofrichter, M., Scheibner K.,
Fritsche W.: "The role of soil funghi in contaminant degradation
Rolle der Bodenpilze beim Fremdstoffabbau" Terratech, vol. 4, nº
3, 1995, páginas 69-71 describe un procedimiento
microbiológico de tratamiento de terrenos contaminados. En este
procedimiento, las sustancias orgánicas como los nitrotoluenos son
eliminados con hongos del género Penicillium en presencia de
azúcar. Se observa una mineralización muy baja del
2,4,6-TNT, inferior a 0,5%, después de cuatro
semanas.
Los documentos de Bennet, J.W., Hollrah P.,
Waterhouse A, Horvath K: "Isolation of Bacteria and Fundhi form
TNT contaminated Composts and Preparation of
14C-ring Labeled TNT" Internacional
Biodeterioration & Biodegradation, vol. 35 nº 4, 1995, páginas
421-430 y el documento DE 19707883A
(Industrieanlagen Betriebsges), de 3 de septiembre de 1998
describen un procedimiento de descontaminación biológica de
terrenos y agua contaminadas, en el que la eliminación de las
sustancias nocivas, compuestos nitroaromáticos en productos finales
inertes tiene lugar por microorganismos del género
Penicillium.
La presente invención tiene precisamente como
objetivos suministrar un procedimiento que permite la eliminación
total o casi total de un compuesto nitroaromático en una solución o
en un suelo, mediante la mineralización de dicho compuesto.
Por tanto, el procedimiento de la presente
invención es un procedimiento que puede ser utilizado para tratar
una solución o un suelo que contiene uno o varios
compuesto(s) nitroaromático(s) no deseable(s)
por contaminante(s).
El procedimiento de la invención es un
procedimiento según la reivindicación 1.
Por "el compuesto nitroaromático" o por
"solución de compuesto nitroaromático" se entenderá en lo
sucesivo "el o los compuesto(s)
nitroaromático(s)" y "solución del o de los
compuesto(s) nitroaromático(s)"
respectiva-
mente.
mente.
Según la invención, la solución del compuesto
nitroaromático puede ser, por ejemplo, una solución de laboratorio,
un efluente industrial o un agua de superficie, que contiene uno o
varios compuesto(s) nitroaromático(s) y en la que, o
en el que, preferentemente, la cepa Penicillium puede
metabolizar el compuesto nitroaromático. Ventajosamente, según el
procedimiento de la invención, esta solución es una solución
acuosa.
Según la invención, el compuesto nitroaromático,
que es al menos uno, puede ser un compuesto que comprende al menos
un ciclo aromático que comprende al menos un grupo nitro, y
eventualmente al menos una función escogida entre el grupo que
comprende -OH, -COOH, un halógeno, -NH_{2}, un derivado oso
cíclico o lineal, un alquilo lineal o ramificado que comprende de 1
a 12 átomos de carbono o un arilo, no sustituidos o sustituidos con
al menos una función escogida entre el grupo que comprende -OH,
-COOH, un halógeno, -NH_{2} o -OH.
Por ejemplo, el compuesto nitroaromático que es
al menos uno puede ser un compuesto escogido entre nitrotolueno,
dinitrotolueno, trinitritolueno, o sus derivados, o una mezcla de
estos compuestos.
Según la invención, el procedimiento de la
presente invención puede comprender además, antes de la etapa de
puesta en contacto, una etapa de neutralización del pH de la
solución de compuesto nitroaromático o del suelo de forma que la
puesta en contacto con la biomasa, por ejemplo, una cepa de
Penicillium, pueda ser efectuada a un pH de 4,5 a 6,5.
Según la invención, la puesta en contacto puede
ser efectuada, por ejemplo, en presencia de glucosa a una
concentración de 0,5 a 50 g de glucosa/l de dicha solución.
Según la invención, la cepa de Penicillium
es la cepa de Penicillium sp. LCM depositada con el número
I-2081 en la Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos (CNCM) mantenida por el Instituto Pasteur de
Francia.
Según la invención, la biomasa de la cepa
Penicillium puede ser obtenida a partir de procedimientos
clásicos de la microbiología para formar una biomasa, por ejemplo,
por cultivo del Penicillium en un medio de cultivo
preferentemente rico, sólido o líquido, preferentemente líquido, a
una temperatura y a un pH adecuados para permitir un metabolismo
óptimo de la cepa de Penicillium.
Un medio de cultivo utilizable para desarrollar
la biomasa se proporciona en los ejemplos posteriores.
Cuando se obtiene una cantidad suficiente de
biomasa, y cuando el medio de cultivo es líquido, esta biomasa puede
ser recuperada, por ejemplo, por filtración o por centrifugación,
ventajosamente por filtración.
Preferentemente, en el procedimiento según la
presente invención, la biomasa es utilizada fresca (de obtención
reciente), lo que no excluye cualquier otra utilización.
La biomasa puesta en contacto con la solución o
el suelo debe ser en una cantidad suficiente para permitir la
mineralización de dicho compuesto nitroaromático. La cantidad de
biomasa puede ser determinada, por ejemplo, en función de la
cantidad de compuestos nitroaromáticos que van a ser mineralizados
o de la velocidad de mineralización deseada. Esta cantidad de
biomasa puede ser determinada, por ejemplo, a partir de muestras de
la solución de compuesto nitroaromático mezcladas con cantidades
variables de biomasa, a una temperatura y un pH adecuados para
permitir un metabolismo preferentemente óptimo de la cepa de
Penicillium.
Según la invención, la puesta en contacto puede
ser realizada mediante la mezcla de la biomasa y la solución del
compuesto nitroaromático, ya sea por el paso de dicha solución a
través de la biomasa, y dicha biomasa es retenida en el interior o
sobre un soporte de manera que pueda ser atravesada por dicha
solución, para permitir la mineralización del compuesto
nitroaromático que contiene.
Cuando la puesta en contacto es realizada
mediante la mezcla de la biomasa con la solución del compuesto
nitroaromático, esta puesta en contacto puede ser realizada, por
ejemplo, en un reactor clásico como un fermentador, que comprenda,
por ejemplo, particularmente un dispositivo de agitación o mezcla de
la solución y la biomasa y un dispositivo de calentamiento. Este
tipo de puesta en contacto es útil, por ejemplo, para un sistema
semi-continuo, o un sistema "discontinuo", de
tratamiento de una solución de compuesto nitroaromático utilizando
el procedimiento de la presente invención.
Cuando la puesta en contacto es realizada
mediante el paso de la solución de compuesto nitroaromático a través
de la biomasa, la biomasa puede ser retenida en el interior o sobre
un soporte. En efecto, ventajosamente, el Penicillium en
cultivo forma agregados o granulados ("pelets" en inglés), lo
que permite separarlo fácilmente de una solución, por ejemplo, por
filtración.
Según la invención, el soporte puede ser, por
ejemplo, una columna o un reactor clásico que permita un paso en
continuo de la solución del compuesto nitroaromático a través de la
biomasa, sin arrastrar esta última. La biomasa puede ser retenida,
por ejemplo, por medio de una rejilla, un tejido o una malla de
fibras orgánicas o inorgánicas que deje pasar la solución, pero no
la biomasa. Esta columna o este reactor puede comprender igualmente
un dispositivo de agitación de la solución y la biomasa y un
dispositivo de calentamiento. Este tipo de puesta en contacto es
útil, por ejemplo, para un sistema de tratamiento continuo de una
solución de un compuesto nitroaromático utilizando el procedimiento
de la presente invención.
Cuando la solución que va a ser tratada es un
agua de superficie, esta puesta en contacto puede ser efectuada
mediante la simple dispersión de la biomasa de la cepa de
Penicillium en el agua de superficie.
Según la invención, durante la puesta en contacto
con una solución de compuesto nitroaromático, la biomasa puede ser
mezclada con la solución de dicho compuesto por medio de un
agitador clásico, por ejemplo, un agitador rotatorio, y a una
velocidad de agitación adecuada, por ejemplo, de 50 a 250 rpm. La
agitación puede ser mantenida durante todo el período de puesta en
contacto entre la biomasa de Penicillium y la solución del
compuesto nitroaromático de forma que se optimice esta puesta en
contacto.
Según la invención, la etapa de puesta en
contacto es efectuada en condiciones adecuadas para una
mineralización del (de los) compuesto(s)
nitroaromático(s) por la cepa de Penicillium. Unos
ensayos clásicos previos de crecimiento de Penicillium sobre
muestras de la solución del compuesto nitroaromático a diferentes
temperaturas, siendo constantes los demás parámetros, por ejemplo el
pH, permiten determinar esta temperatura permisiva. Debe apreciarse
que el Penicillium puede desarrollarse incluso a una
temperatura de aproximadamente 4ºC. Por tanto, el procedimiento de
la presente invención presenta particularmente la ventaja de ser
utilizable en un amplio intervalo de tempera-
turas.
turas.
Esta temperatura permisiva puede ser, por
ejemplo, de aproximadamente 10 a 35ºC, por ejemplo, de 15 a 35ºC.
Los inventores han apreciado una buena mineralización a una
temperatura de 20 a 30ºC, en particular a una temperatura de 25 a
28ºC. Ventajosamente, la temperatura puede ser mantenida
sensiblemente constante en el transcurso de la puesta en contacto
de forma que se optimice la mineralización.
Según la invención, la etapa de puesta en
contacto es efectuada preferentemente a un pH permisivo para el
metabolismo de la cepa de Penicillium. Pueden ser realizados
ensayos como los anteriormente citados, pero a temperatura constante
y a diferentes valores del pH, para determinar este pH permisivo.
Generalmente, este pH puede ser de 5 a 7,5, por ejemplo de 5 a 6,
por ejemplo de aproximadamente 5,5.
Naturalmente, el pH de la solución varía en el
transcurso del procedimiento de la invención ya que los grupos
nitro del compuesto nitroaromático pueden ser reducidos durante la
mineralización de este último. Esta variación del pH no es
perjudicial para el procedimiento de la presente invención.
No obstante, según una variante de la presente
invención, el pH de la solución puede ser mantenido sensiblemente
constante en el transcurso de la etapa de puesta en contacto, a los
valores anteriormente citados, por medio de un tampón clásico como
un tampón de fosfato o citrato. Este tampón puede ser añadido al
suelo o a la solución antes o en el transcurso de la etapa de puesta
en contacto del procedimiento según la presente invención.
Según la invención, la puesta en contacto puede
ser efectuada en presencia de una fuente de carbono para la cepa de
Penicillium. Esta fuente carbono es un inductor del
metabolismo general de Penicillium, y favorece la
mineralización del compuesto nitroaromático por este microorganismo.
Esta fuente de carbono puede ser añadida en una cantidad suficiente
para optimizar el metabolismo del Penicillium, en particular
la mineralización del compuesto nitroaromático. Esta fuente de
carbono puede ser escogida, por ejemplo, entre el grupo que
comprende glucosa, polímeros de glucosa, melazas, hidrolizados de
maíz, etc. Los polímeros de glucosa comprenden, por ejemplo,
almidón. La fuente de carbono puede ser añadida, por ejemplo, a la
solución que va a ser tratada en el reactor o, cuando se trata de
un agua de superficie o de un suelo, directamente en dicha agua o
sobre dicho suelo.
En sistema de tratamiento de una solución en
continuo, el reactor puede comprender además un dispositivo de
alimentación de la fuente de carbono al reactor.
Según la invención, cuando la fuente de carbono
es glucosa, y la solución del compuesto nitroaromático es una
solución saturada de este compuesto, por ejemplo, una solución
saturada de TNT, DNT, un derivado de estos o una mezcla de estos o
sus derivados, la concentración de glucosa durante la puesta en
contacto, en la solución, puede ser ventajosamente de 2 a 25 g/l,
por ejemplo, 15 g/l.
Una concentración óptima de la fuente de carbono
puede ser determinada, por ejemplo, mediante ensayos del
procedimiento de la invención sobre muestras de la solución del
compuesto nitroaromático como los anteriormente citados.
Según la invención, las condiciones adecuadas
anteriormente enunciadas pueden comprender igualmente la adición de
aditivos reguladores o inductores del metabolismo de
Penicillium en la solución o sobre el suelo que va a ser
tratado, como sulfato de magnesio, nitrato de sodio, cloruro de
potasio, sulfato de hierro, etc., oligoelementos y, de manera
general, cualquier aditivo conocido que favorezca el metabolismo de
Penicillium.
Ventajosamente, según el procedimiento de la
invención, la puesta en contacto es realizada de manera que haya un
contacto óptimo entre Penicillium y la solución y se hará
preferentemente bajo agitación cuando se realice en un reactor.
Un exceso de biomasa de Penicillium puede
suponer la formación de un agregado, o "torta", que puede
perjudicar un contacto óptimo entre el microorganismo y la
solución.
Ventajosamente, según la presente invención, la
biomasa de Penicillium es puesta en contacto con la solución
del compuesto nitroaromático a una concentración de 50 a 800 g en
peso fresco de biomasa por litro de solución de dicho compuesto,
por ejemplo, aproximadamente 150 g/l.
Cuando el procedimiento de la presente invención
se refiere a un procedimiento de eliminación de un compuesto
nitroaromático presente en un suelo, las condiciones adecuadas para
una mineralización del al menos un compuesto nitroaromático
presente en dicho suelo por la cepa de Penicillium debe
entenderse que son las condiciones favorables para el metabolismo de
la cepa de Penicillium para mineralizar el compuesto
nitroaromático que va a ser eliminado. Estas condiciones son
particularmente las descritas con anterioridad.
Debe apreciarse además que la cepa de
Penicillium se desarrolla mejor en medio húmedo.
También, ventajosamente, este procedimiento de la
invención puede comprender además, antes, durante o después de la
etapa de puesta en contacto del suelo que va a ser tratado con la
biomasa, una etapa de inundación de dicho suelo con una solución
acuosa, de manera que se forma una solución del compuesto
nitroaromático.
Puede ser seguidamente aplicado el procedimiento
de mineralización de un compuesto nitroaromático en solución según
la invención como se describió con anterioridad.
El experto en la técnica comprenderá fácilmente
que la humidificación de un suelo puede ser natural,
particularmente por las aguas de las lluvias. En este caso, la
etapa de inundación de dicho suelo con una solución acuosa se hará
de forma natural con el agua de lluvia.
Según la invención, la puesta en contacto del
suelo o de la solución formada por inundación del suelo puede ser
efectuada mediante la dispersión de una cepa de Penicillium
sobre el suelo que va a ser tratado, ventajosamente de una biomasa
de la cepa de Penicillium, antes o después de la inundación
de dicho suelo. Debe entenderse que el suelo puede ser inundado con
una solución acuosa que contenga la biomasa de
Penicillium.
Una fuente de carbono, un tampón del pH y un
aditivo como los anteriormente citados pueden ser igualmente
dispersados sobre el suelo antes o durante la puesta en contacto
con la cepa de Penicillium.
El procedimiento de la invención es muy ventajoso
con respecto a los procedimientos de la técnica anterior. En efecto,
los inventores han mostrado particularmente que la cepa de
Penicillium permite mineralizar fácilmente más de 75% de un
compuesto aromático como los citados con anterioridad, por ejemplo
TNT, DNT y sus derivados, mientras que los procedimientos
microbiológicos de la técnica anterior raramente sobrepasaban un 10%
de mineralización de estos compuestos. Esta mineralización
corresponde a una degradación, o biodegradación, total o casi total
del compuesto nitroaromático.
Además, de forma inesperada, el procedimiento de
la invención permite tratar una solución con los resultados
anteriores incluso aunque esté saturada de compuesto nitroaromático,
es decir, que contenga aproximadamente 100 mg/l y hasta 120 mg/l de
compuesto nitroaromático, por ejemplo TNT, DNT y sus derivados. Esta
concentración es muy elevada y se opone a priori a la utilización
de un microorganismo para eliminar estos compuestos.
Además, el procedimiento de la invención es un
procedimiento no contaminante ya que genera poco o nada de
metabolitos intermedios a partir del (de los) compuesto(s)
nitroaromático(s), no necesita productos químicos
contaminantes y utiliza un microorganismo que es inofensivo.
Además, el procedimiento de la invención es un
procedimiento muy económico, ya que utiliza una cepa de
microorganismo que no es cara, que está disponible en el comercio y
que se desarrolla fácilmente, incluso a temperaturas de
aproximadamente 4ºC.
Además, el Penicillium tiene una tendencia
a formar granulados ("pelets" en inglés), que pueden ser
extraídos muy fácilmente de una solución, por ejemplo por simple
filtración, lo que facilita los tratamientos de las soluciones, como
los efluentes industriales, por ejemplo en continuo.
Otras numerosas ventajas y características de la
presente invención podrán incluso ser captadas por un experto en la
técnica mediante la lectura de los ejemplos ilustrativos y no
limitativos que siguen, en referencia a las Figuras adjuntas.
- Las Figuras 1A y 1B son representaciones
gráficas que ilustran el efecto de la glucosa sobre la
mineralización de TNT mediante el procedimiento de la presente
invención, el gráfico 1A representa la mineralización de TNT sin
glucosa y el gráfico 1B la mineralización de TNT en presencia de
glucosa.
- Las Figuras 1C y 1D son representaciones
gráficas de cinéticas de formación de nitritos en presencia (Figura
1D) o ausencia (Figura 1C) de glucosa;
- La Figura 2 es una representación gráfica del
efecto de la concentración de TNT en la solución sobre la
mineralización de este último mediante el procedimiento de la
presente invención en función del tiempo en días;
- La Figura 3 es una representación gráfica de la
degradación de TNT en una solución según el procedimiento de la
invención; y
- La Figura 4 es un esquema que ilustra una
identificación de metabolitos extraíbles formados durante la
mineralización de TNT mediante el procedimiento de la invención,
por un análisis efectuado sobre una capa delgada de sílice acoplada
a un escáner de radioactividad sobre placas.
El medio de cultivo utilizado para la preparación
de la biomasa está constituido por 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,1
g/l de K_{2}HO_{4}, 30 g/l de glucosa y 10 g/l de hidrolizado
de maíz de la marca registrada Corn Steep (distribuida por la
Société des Produits de Maïs), 0,5 g/l de MgSO_{4}, 2 g/l de
NaNO_{3}, 0,5 g/l de KCl y 0,02 g/l de FeSO_{4}.
La cepa de Penicillium utilizada,
denominada Penicillium sp. LCM por los presentes inventores,
fue depositada con el número I-2081 en la CNCM
(Instituto Pasteur, Francia).
Los cultivos fueron realizados en matraces
erlenmeyers y se agitaron durante tres días a 250 revoluciones por
minuto a una temperatura de 27ºC.
La biomasa formada fue seguidamente recuperada
por filtración.
Los compuestos nitroaromáticos en este ejemplo
son trinitrotolueno (TNT), 2,4-dinitritolueno y
2,6-dinitrotolueno. Una solución de TNT de 62 g/l en
acetona fue suministrada por la Société Nationale des Poudres et
Explosifs (Ver-Le-Petit,
Francia).
El TNT uniformemente marcado con C^{14} procede
de la empresa Chemisyn Science Laboratoires, EE.UU. y presenta las
siguientes características: 21,5 mCi/mmol-100
\muCi/ml en agua.
El 2,4-dinitritolueno procede de
la empresa Rhône-Poulenc (Francia) y el
2,6-dinitrotolueno de la empresa Aldrich (catálogo
Aldrich).
La degradación de los compuestos nitroaromáticos
se efectuó con la biomasa fresca preparada en el Ejemplo 1, sobre
una tabla de agitación rotatoria a 250 rpm, en un recinto sometido
a control termostático a 27ºC.
El compuesto nitroaromático se añadió a una razón
de 0,05 ó 0,1 g/l en 7,5 g de biomasa fresca puesta en suspensión en
50 ml de agua destilada glucosada al 1,5% (15 g de glucosa/litro de
solución). La biomasa fresca tiene por tanto una concentración de
150 g para 1 litro de solución.
En el ámbito del estudio de la mineralización del
compuesto nitroaromático, los experimentos se realizaron en
presencia de trazadores radiomarcados (50 \mul).
El seguimiento de la degradación del TNT
radiomarcado o no radiomarcado, o de los dinitrotoluenos 2,4 ó 2,6
se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
a \lambda = 254 nm sobre una columna de grafito poroso Hypercab
(marca registrada) suministrada por la Société Shandon, Francia,
eluída con 80% de acetonitrilo, 0,05% de ácido trifluoroacético y
agua.
El sistema cromatográfico está compuesto por un
inyector Waters 717 (marca registrada), una bomba Waters 600E (marca
registrada) (caudal 1 ml/minuto), un detector UV Waters 486 (marca
registrada) que funciona a 220 nm, suministrado por la Société
WATER, Francia y un detector de radioactividad Monitor LB 506
C-1 (marca registrada) suministrado por la Société
Berthold, FRANCIA.
La radioactividad total es medida mediante
recuento por medio de un detector de centelleo líquido LKB 1214
Rackbeta (marca registrada) suministrado por la empresa Wallac.
La concentración de nitrilo es determinada
mediante el método de Gries. En placas Elisa de 96 pocillos, 50
\mul de la muestra que va a ser dosificada son mezclados con 50
\mul de reactivo de Gries (5% de sulfonilamida en HCl 2 M + 0,5%
de N-1-naftilidenodiamina en HCl 2
M, porcentajes expresados en v/v) en microplacas.
Después de 20 minutos a temperatura ambiente, se
mide la absorbancia a 540 nm mediante un lector de placas Elisa
suministrado por la empresa Dynatech.
Los nitrilos y nitratos fueron igualmente
analizados por HPLC sobre una columna Hypersyl ODS (marca
registrada) suministrada por la empresa Shandon: 5 mm, 4,6 x 250
mm) por emparejamiento de iones: 10% MeOH/PiC A (Waters) 5 mM, a
210 nm. El tiempo de retención es de 4,9 minutos para los nitritos y
de 6,0 minutos para los nitratos. Las concentraciones fueron
evaluadas con respecto a una curva de calibración a 200 \muM.
El TNT fue analizado por cromatografía sobre capa
fina (TLC) sobre una capa de sílice, en presencia del eluyente
acetato de etilo (Rf = 0,87). La radioactividad asociada a las
diferentes tareas de TLC se midió por medio de un analizador lineal
automático de capa fina Tracemaster 20 (marca registrada)
suministrado por la empresa
Berthold.
Berthold.
El medio de incubación se centrifuga 15 minutos a
10.000 rpm a 4ºC y seguidamente se extrae tres veces con acetato de
etilo. La fase orgánica recuperada se seca sobre MgSO_{4}.
Después de filtrar, el disolvente se elimina en un evaporador
rotatorio. Se realiza una purificación sobre placa de sílice
semi-preparativa sobre soporte de gel de sílice. Las
diferentes fracciones de sílice con contenidos de productos de
transformación se recuperan y se recogen en acetato de etilo. La
sílice se elimina por filtración y el filtrado se evapora y se
seca. Las fracciones así recuperadas son seguidamente
analizadas.
Los ensayos se realizaron en soluciones que
comprenden 100 mg/l de TNT, 150 g/l de biomasa fresca y una
concentración de glucosa en g/l variable. Se midió en cada ensayo
la radioactividad al cabo de 5 días.
Las Figuras 1A y 1B adjuntas son gráficos que
ilustran los resultados de estas mediciones en las que el eje de
ordenadas representa la radioactividad al cabo de 16 horas en
recuentos por minuto (Cpmx 10^{3})/ml en la solu-
ción.
ción.
En las Figuras 1A y 1B,
\sqdddsonerepresenta la radioactividad inicial en la solución,
\sqprepresenta la radioactividad total,
\sqpprepresenta la radioactividad total en presencia de HCl,
\sqdsonerepresenta la radioactividad asociada a la materia sobrenadante y
\sqddsonerepresenta la radioactividad asociada a la biomasa.
Estas Figuras 1A y 1B muestran que la glucosa
favorece la mineralización del TNT: un 46,7% de mineralización en
ausencia de glucosa frente a 66,7% en presencia de glucosa en 16
días de incubación en las condiciones previamente citadas. La
radioactividad inicialmente asociada al TNT es asimilada de forma
más considerable en un medio no enriquecido en fuente de carbono.
Por tanto, la glucosa favorece la mineralización del TNT.
Durante estos experimentos, se midió la
concentración de nitrito. La presencia de glucosa en el medio de
incubación inhibe totalmente la formación de NO_{2}^{-}. Por el
contrario, en ausencia de glucosa, se obtienen concentraciones de
nitritos próximas a 230 \muM correspondientes a un 17,4% de
nitritos susceptibles de formarse a partir del TNT por
desnitrificación.
Por tanto, parece que la desnitrificación que
tiene lugar en condiciones oxidativas, es decir, en ausencia de
equivalentes reductores, es decir de glucosa, no es forzosamente
propicia a la mineralización que parece estar favorecida en
condiciones reductoras, es decir, en presencia de glucosa.
Se realizaron mediciones de la cinética de la
formación de nitritos en presencia o ausencia de glucosa sobre las
soluciones anteriormente descritas.
Los resultados de estas mediciones se recogen en
las Figuras 1C y 1D adjuntas: la Figura 1C ilustra la cinética de
formación de nitritos en \muM en la solución en ausencia de
glucosa en función del tiempo en días, y la Figura 1D ilustra la
cinética de formación de nitritos en \muM en la solución en
presencia de glucosa en función del tiempo en
días.
días.
A partir de estos resultados, parece por tanto
que la desnitrificación, que tiene lugar en condiciones oxidativas,
es decir en ausencia de glucosa, no es forzosamente propicia a la
mineralización que parece estar favorecida en las condiciones
reductoras, es decir, en presencia de glucosa.
A partir del quinto día de incubación, la
mineralización de TNT por Penicillium sp. LCM se estabiliza.
Esta estabilización es súbita y se produce en un momento en que la
biomasa parece poco deteriorada. Un déficit de nutrientes, una
toxicidad del TNT o de sus metabolitos frente al microorganismo, o
incluso una pérdida de viabilidad de la cepa pueden conducir a una
disminución de la actividad catalítica y explicar esta
inhibición.
La solubilidad máxima del TNT en agua a
temperatura ambiente es de 100 mg/l (saturación a temperatura
ambiente). Con el fin de verificar si esta concentración no es
demasiado elevada para permitir una mineralización total del TNT o
de sus derivados el 2,4- y 2,6-DNT, se realizaron
incubaciones a 50 mg/ml y a 100 mg/ml de TNT. Los ensayos se
realizaron a 27ºC, bajo agitación a 150 rpm, en presencia de 150
g/l de biomasa fresca de Penicillium y de 15 g/l de
glucosa.
Los resultados de estas mediciones se recogen en
la Tabla II siguiente.
| tiempo en días | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 7 | |
| solución de 50 mg TNT/l | Cpm* 10^{3}/ml | 48 | 41 | 44 | 19 | 14 | 15 |
| solución de 100 mg TNT/l | Cpm* 10^{3}/ml | 46 | 47 | 44 | 29 | 16 | 15 |
| Cpm* = recuentos por minuto - determinado mediante una medición de la radiactividad |
La Figura 2 adjunta es un gráfico realizado a
partir de estas mediciones en el que el eje de abscisas representa
el tiempo en días y el eje de ordenadas es la medición de la
radioactividad en recuentos por minuto (Cpm) x 10^{3}/ml. Estos
resultados muestran que a 50 mg de TNT/l (curva de referencia 2A en
la Figura 2) y que a 100 mg de TNT/l (curva de referencia 2B en la
Figura 2), el porcentaje de mineralización de TNT por
Penicillium es igual después de 7 días de incubación y se
estabiliza a aproximadamente 70%.
Se realizaron ensayos como anteriormente, con una
solución que comprende 100 mg/ml de TNT en presencia de TNT
radiomarcado en todos los átomos de carbono del ciclo. Esta solución
comprendía además 150 g/l de biomasa fresca de Penicillium
como en el Ejemplo 1 anterior, y 15 g/l de glucosa. La puesta en
contacto se realizó a una temperatura de 27ºC, bajo agitación a 150
rpm.
La Tabla III siguiente recoge las mediciones
efectuadas para estos ensayos.
| tiempo en días | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 7 | 8 | 10 |
| 100 mg/l de TNT (Cpm* x 10^{3}) | 52 | 21 | 19 | 7 | 8 | 9 | 10 | 10 |
| Cpm*: véase la tabla II |
La Figura 3 adjunta es un gráfico realizado a
partir de estas mediciones en el que el eje de abscisas representa
el tiempo en días y el eje de ordenadas es la medición de la
radioactividad en recuentos por minuto (Cpm).
Estos resultados muestran una mineralización del
79% del TNT en 10 días.
Una cromatografía líquida de alta resolución
permitió mostrar una desaparición total del TNT en 24 horas, sin la
aparición de los metabolitos conocidos como dinitritolueno,
amino-dinitritolueno,
diamino-nitrotolueno derivados del TNT a partir de
una solución de 100 mg/l de TNT. Esta observación fue confirmada
mediante el análisis de los extractos (acetato de etilo) del medio
de incubación por cromatografía sobre capa fina de sílice acoplada
a un escáner de radioactividad sobre placas. La Figura 4 adjunta es
un esquema que ilustra este análisis. En efecto, en el disolvente
CCM utilizado, la radioactividad residual después de 24 horas se
encuentra totalmente asociada al depósito. Solamente representa un
25 a 30% de la radioactividad inicial, y no corresponde ni al 2,4-
ni al 2,6-DNT que en este sistema tienen valores de
Rf de aproximadamente 0,8.
Teniendo en cuenta el porcentaje considerable de
mineralización del TNT, superior al 70%, la radioactividad residual
en las materias sobrenadantes es baja y limita la detección de
metabolitos eventuales. Por tanto, se realizaron experimentos
preparativos sobre 1 litro de TNT a una concentración de 100 mg/l
con el fin de extraer los eventuales compuestos residuales en una
cantidad suficiente para caracterizarlos. Al final de la reacción y
a pesar de las diversas extracciones, el rendimiento global es de
solamente un 20% aproximadamente. Se aisló un compuesto mayoritario
(7%) con un peso molecular p.m. 182. Este producto no visible sobre
la placa radioactiva (Rf = 0,4) anteriormente descrita está
presente a una concentración demasiado baja para ser detectada por
el escáner. Aunque este peso molecular es idéntico al de los DNT.
el producto aislado no es DNT ya que los valores de Rf en CCM son
diferentes.
El hongo filamentoso de Penicillium sp LCM
permite por tanto una degeneración completa del TNT y sus derivados
como los 2,4- y 2,6-DNT en solución en 100 mg/l en
menos de 24 horas, asociada a una mineralización de más de 70% en 5
días. Este porcentaje de mineralización a 100 mg/l de TNT y sus
derivados como los 2,4- y 2,6-DNT, según los
conocimientos del solicitante, no ha sido nunca descrito
anteriormente en la bibliografía. El estudio de la influencia de
diversos factores ha permitido mostrar que la ausencia de glucosa
inhibe ligeramente la mineralización del TNT, pero favorece la
desnitrificación de este último, y que la temperatura y el pH
tengan un efecto sobre la mineralización del TNT y sus derivados
como los 2,4- y 2,6-DNT.
Un suelo que contiene TNT podrá ser inundado con
una solución acuosa que contenga un tampón de fosfato 50 mM y
almidón como fuente de carbono.
Puede ser preparada una biomasa de
Penicillium como el ejemplo 1 y seguidamente se reparte
sobre el suelo.
En otro ensayo, la solución destinada a inundar
el suelo puede contener al mismo tiempo el tampón de fosfato 50 mM,
el almidón y la biomasa.
Claims (13)
1. Procedimiento microbiológico de eliminación de
al menos un compuesto nitroaromático presente en una solución o en
un suelo, caracterizado porque comprende una etapa de puesta
en contacto de dicha solución o dicho suelo con una biomasa de una
cepa Penicillium en condiciones adecuadas para una
mineralización de dicho compuesto nitroaromático por la cepa
Penicillium, en presencia de una fuente de carbono para la
cepa de Penicillium en la que la cepa de Penicillium
es la cepa Penicillium sp. LCM depositada con el número
I-2081 en el CNCM mantenido por el Instituto Pasteur
de Francia.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 de
eliminación de al menos un compuesto nitroaromático presente en un
suelo, que comprende además una etapa de inundación de dicho suelo
con una solución acuosa, de manera que se forme una solución de
compuesto nitroaromático.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 de
eliminación de al menos un compuesto nitroaromático presente en una
solución, en el que la puesta en contacto es realizada mediante la
mezcla de la biomasa y la solución del compuesto nitroaromático, o
bien mediante el paso de dicha solución a través de la biomasa,
siendo retenida la biomasa en el interior o sobre un soporte de
forma que pueda ser atravesada por dicha solución, para permitir la
mineralización del compuesto nitroaromático que contiene.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 3 de
eliminación de al menos un compuesto nitroaromático presente en una
solución, en el que la solución de compuesto nitroaromático es una
solución acuosa de este compuesto.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, 3 ó
4, en el que la solución de compuesto nitroaromático es una solución
de laboratorio, un efluente industrial o un agua de superficie.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de puesta en contacto es
efectuada a una temperatura permisiva para el metabolismo de la
cepa de Penicillium.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la fuente de carbono es escogida entre el grupo que comprende
glucosa, polímeros de glucosa, melazas e hidrolizados de maíz.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la puesta en contacto es
efectuada en presencia de glucosa a una concentración de 0,5 a 50 g
de glucosa/l de dicha solución.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la biomasa de Penicillium
es puesta en contacto con la solución de compuesto nitroaromático a
una concentración de 50 a 800 g en peso fresco de biomasa por litro
de solución de dicho compuesto.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que al menos un compuesto
nitroaromático es un compuesto que comprende al menos un ciclo
aromático que comprende al menos un grupo nitro, y eventualmente al
menos una función escogida entre el grupo que comprende -OH, -COOH,
un halógeno, -NH_{2}, un derivado oso cíclico o lineal, un
alquilo lineal o ramificado que comprende de 1 a 12 átomos de
carbono o un arilo, no sustituidos o sustituidos con al menos una
función escogida entre el grupo que comprende -OH, -COOH, un
halógeno, -NH_{2} o -OH.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que al menos un compuesto
nitroaromático es un compuesto escogido entre nitrotolueno,
dinitritolueno, trinitrotolueno y sus derivados, o una mezcla de
estos compuestos.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende además, antes de la etapa de
puesta en contacto, una etapa de neutralización del pH de la
solución de compuesto nitroaromático o del suelo de forma que la
puesta en contacto con la cepa de Penicillium pueda ser
efectuada a un pH de 4,5 a 6,5.
13. Cepa de tipo Penicillium sp.,
depositada con el número I-2081 en el CNCM
mantenido por el Instituto Pasteur de Francia.
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