ES2224234T3 - Proceso para produccion de plantas con caracteristicas de crecimiento mejoradas. - Google Patents
Proceso para produccion de plantas con caracteristicas de crecimiento mejoradas.Info
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Abstract
SE PRESENTAN Y REIVINDICAN UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS CON UNAS CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO MEJORADAS MEDIANTE LA EXPRESION PREDETERMINADA DE LA SINTETASA DE ASPARAGINAS BACTERIANAS EN LOS CLOROPLASTOS O PLASTIDOS, Y LAS PLANTAS OBTENIDAS SEGUN EL MISMO, ASI COMO LOS ELEMENTOS INTERMEDIOS PARA LLEVARLO A CABO.
Description
Proceso para la producción de plantas con
características de crecimiento mejoradas.
La invención se refiere a: mejorar el crecimiento
de las plantas por expresión de al menos una
asparagina-sintetasa bacteriana en el cloroplasto
y/o plasto de las células de la planta; métodos para mejorar así el
crecimiento de las plantas que incluyen introducir una molécula de
ácido nucleico que codifica la asparagina-sintetasa
bacteriana en el genoma de la planta (v.g., en las células de la
planta y cultivar y/o regenerar las células en las plantas) en
donde la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a
una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias reguladoras
para la expresión y para importación de la
asparagina-sintetasa bacteriana en el cloroplasto
y/o el plasto; y a plantas que exhiben dicho crecimiento
mejorado.
En el texto que sigue se citan varios documentos.
Los documentos citados en esta memoria se incorporan por la
presente en esta memoria por referencia.
El nitrógeno es a menudo el elemento limitante de
la velocidad en el crecimiento de las plantas. La mayor parte de
las cosechas de campo tienen una dependencia fundamental de los
fertilizantes nitrogenados inorgánicos. Los fertilizantes minerales
son una fuente principal de contaminación de las aguas
subterráneas. Por esta razón, sería beneficioso que las plantas
pudieran utilizar el nitrógeno existente de modo más eficiente.
El nitrógeno es absorbido por la planta como
compuestos inorgánicos, a saber nitrato y amoniaco. La mayor parte
de este nitrógeno se asimila en compuestos orgánicos como
aminoácidos. La enzima glutamina-sintetasa juega un
papel fundamental, dado que cataliza la asimilación de amoniaco en
glutamina. La glutamina, junto con la asparagina son las formas
principales de transporte del nitrógeno en las plantas. Como se
describe en el documento EP 511 979, la expresión de una
asparagina-sintetasa bacteriana conduce a
características de crecimiento incrementado que pueden mejorarse
por el tratamiento adicional de las plantas con el herbicida
glufosinato, un inhibidor de la
glutamina-sintetasa. Por otra parte, el documento WO
95/09911 describe la producción de una planta con características
agronómicas o nutricionales aumentadas por
sobre-expresión de una o varias enzimas del
metabolismo del nitrógeno. Los solicitantes han conseguido hallar
ahora una vía muy diferente para aumentar las características de
crecimiento de las plantas.
Sorprendentemente, se ha encontrado que es
posible aumentar las capacidades de crecimiento de las plantas por
la expresión dirigida de al menos una
asparagina-sintetasa bacteriana en el
cloroplasto.
La presente invención está dirigida a un proceso
para la producción de plantas con características de crecimiento
incrementado que comprende los pasos siguientes:
- -
- transferencia e integración de una secuencia de DNA que codifica una asparagina-sintetasa bacteriana en el genoma de la planta
- -
- en donde dicha secuencia de DNA está enlazada a secuencias reguladoras, lo que asegura la expresión de dicho gen en una célula vegetal conduciendo a la importación de la proteína derivada en el cloroplasto y/o los plastos de dichas células vegetales y
- -
- regeneración de plantas intactas y fértiles a partir de las células transformadas.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión características de crecimiento incrementadas debe
entenderse en el sentido de que abarca un crecimiento mejorado o
más rápido y más vigoroso así como más rendimiento y/o floración
más temprana. El proceso de acuerdo con la presente invención
conduce también a órganos reproductores mayores o en mayor número
como por ejemplo semillas u órganos de almacenamiento mayores o en
mayor número como por ejemplo tubérculos.
De acuerdo con la presente invención, las
asparagina-sintetasas bacterianas pueden ser
expresadas también directamente en el cloro plasto por integración
del gen directamente en el genoma del cloroplasto y/o los plastos
mediante, por ejemplo, el procedimiento de transformación biolística
(véase la Patente U.S. No. 5.451.513 que se incorpora en esta
memoria por referencia).
Por consiguiente, la presente invención está
dirigida también a un proceso para la producción de plantas con
características de crecimiento incrementadas que comprende los
pasos siguientes:
- -
- transferencia e integración de una secuencia de DNA que codifica una asparagina-sintetasa bacteriana en el genoma del cloroplasto y/o los plastos de una célula vegetal,
- -
- expresión de dicho gen bajo el control de elementos reguladores apropiados y
- -
- regeneración de plantas intactas y fértiles a partir de las células transformadas.
Sorprendentemente, ha sido posible mejorar el
efecto de aumento del crecimiento aún más por reducción del nivel
de la glutamina-sintetasa expresada en la célula
vegetal.
De acuerdo con ello, la presente invención está
dirigida también a procesos para la producción de células vegetales
en los cuales dichas células vegetales expresan un constructo de
gen adicional que conduce a un nivel reducido de su actividad de
glutamina-sintetasa endógena.
Una "secuencia de DNA", tal como se utiliza
la expresión en esta memoria, puede significar una molécula de
ácido nucleico, v.g., una molécula de ácido nucleico aislada; y,
una "secuencia reguladora", tal como se utiliza la expresión
en esta memoria, puede significar una molécula de ácido nucleico que
funciona para regular la expresión y/o importación, v.g.,
importación en un cloroplasto y/o plasto.
Así pues, la invención proporciona una célula
vegetal que contiene DNA codificante de
asparagina-sintetasa procariota, v.g., bacteriana,
v.g., asparagina-sintetasa
amonio-específica, tipo A, enlazada operativamente a
una secuencia reguladora para la expresión del DNA e importación de
la asparagina-sintetasa en el cloroplasto y/o el
plasto de la célula, en donde la célula expresa la
asparagina-sintetasa. Así pues, la célula vegetal
expresa la asparagina-sintetasa en su cloroplasto
y/o plasto. La célula vegetal puede contener también un constructo
que proporciona niveles reducidos de expresión de
glutamina-sintetasa endógena, v.g., el gen endógeno
para ella puede estar deleitando o interrumpido.
La invención proporciona adicionalmente un método
para aumentar el crecimiento de una planta que comprende:
transformar una célula vegetal de tal modo que la célula contiene
DNA codificante de asparagina-sintetasa procariota,
v.g., bacteriana, v.g., asparagina-sintetasa
amonio-específica, tipo A, enlazada operativamente
a una secuencia reguladora para la expresión del DNA e importación
de la asparagina-sintetasa en el cloroplasto y/o el
plasto de la célula, en el cual la célula expresa la
asparagina-sintetasa (v.g., en su cloroplasto y/o
plasto); y regenerar la planta a partir de la célula. La planta es
preferiblemente intacta y fértil.
La célula vegetal en el método puede tener
también el gen endógeno para glutamina-sintetasa
deleitando o interrumpido, o expresado de cualquier otro modo a un
nivel reducido. Así pues, el método puede incluir transformar una
célula vegetal que tiene un nivel reducido de expresión de
glutamina-sintetasa endógena (v.g., por
interrupción o deleción del gen para la misma) y de tal modo que la
célula contiene DNA codificante de
asparagina-sintetasa procariota, v.g., bacteriana,
v.g., asparagina-sintetasa
amonio-específica, tipo A, enlazada operativamente
a una secuencia reguladora para la expresión del DNA e importación
de la asparagina-sintetasa en el cloroplasto y/o el
plasto de la célula, en donde la célula expresa la
asparagina-sintetasa (v.g., en su cloroplasto y/o
plato); y regenerar la planta a partir de la célula. La planta es
preferiblemente intacta y fértil.
Los métodos pueden comprender adicionalmente
tratar la planta con un inhibidor de la
glutamina-sintetasa.
El DNA codificante de la
asparagina-sintetasa puede ser de E. coli.
Sin embargo, a partir de esta exposición, y los documentos citados
en esta memoria, y del conocimiento de la técnica, un experto en la
técnica puede descubrir otros genes codificantes de
asparagina-sintetasa, es decir, genes
asn-A, procedentes de otros microorganismos, v.g.,
por cualquier procedimiento rutinario, por ejemplo:
- 1.
- Descubrimiento de una actividad de producto génico asn-A por ensayos de rutina para la asparagina-sintetasa tipo A con purificación subsiguiente de la enzima, v.g., de acuerdo con Cedar & Schwartz 1969, J. Biol. Chem., 244, 4112-21 y 4122-4127, Humbert & Simoni, 1980, J. Bacteriol., 142, 212-220, y Reitzer & Magasanik, 1982, J. Bacteriol., 151, 1299-1313; véase también Herrmann y Somerville, "Amino Acids, Biosynthesis and Genetic Regulation", pp. 137-145 (Addison-Wesley Pub. Co. 1993).
- 2.
- Producción y purificación de anticuerpos policlonales contra el producto del gen asn-A de acuerdo con métodos inmunológicos bien conocidos. Y,
- 3.
- Escrutinio de genotecas de expresión de microorganismos con anticuerpos aislados contra la asparagina-sintetasa tipo A de acuerdo con métodos de biología molecular bien conocidos.
Los procedimientos arriba descritos establecen
claramente que un técnico experto puede obtener secuencias del gen
asn-A a partir de otros microorganismos por métodos
rutinarios. La asparagina-sintetasa preferida
utiliza iones amonio como donante de amida para la producción de
asparagina; y por ello, el DNA preferido codifica dicha
asparagina-sintetasa. Adicionalmente, la secuencia
reguladora puede ser para un péptido conductor cloroplástico; y, el
DNA codificante de asparagina-sintetasa y la
secuencia reguladora pueden codificar por tanto una
asparagina-sintetasa procariota, v.g., una
asparagina-sintetasa bacteriana tal como
asparagina-sintetasa de E. coli, con un
péptido cloroplástico en su terminal N.
En los métodos que se describen en esta memoria,
el crecimiento de la planta se incrementa con relación a las
plantas no transformadas.
La invención abarca adicionalmente una planta,
semillas, propágulo o material de propagación, procedente(s)
de los métodos que anteceden, o que contienen las células que
anteceden.
Adicionalmente, la invención abarca un constructo
génico que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una asparagina-sintetasa procariota, v.g.,
bacteriana, v.g., asparagina-sintetasa
amonio-específica, tipo A, enlazada operativamente
a una secuencia reguladora activa en plantas para expresión de la
molécula de ácido nucleico e importación de la
asparagina-sintetasa en el cloroplasto y/o plasto de
células vegetales, v.g., un péptido conductor cloroplástico; y por
consiguiente, en una realización la invención puede proporcionar un
constructo génico que comprende una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica una asparagina-sintetasa
procariota, v.g., bacteriana, tal como
asparagina-sintetasa de E. coli con un
conductor cloroplástico en su término N. La invención abarca
también vectores que contienen los constructos génicos de
inventiva. El vector puede ser útil para transformar células
vegetales. Así pues, la invención abarca una célula vegetal
transformada con el constructo o vector génico, así como plantas,
semillas y propágulos o materiales de propagación que contienen
dichas células.
Asimismo, la invención abarca constructos y
vectores génicos para reducir la expresión de
glutamina-sintetasa endógena, v.g., por inserción de
codones de terminación después de las secuencias reguladoras y antes
de las secuencias codificantes, o para interrumpir de otro modo el
gen correspondiente a la glutamina-sintetasa
endógena, así como células transformadas con tales constructos o
vectores génicos, y plantas, semillas y propágulos o materiales que
propagación que contienen tales células.
Estas y otras realizaciones se exponen o son
evidentes a partir de la Descripción Detallada siguiente y están
abarcadas por la misma.
Un método preferido de introducción de los
segmentos de ácido nucleico en células vegetales consiste en
infectar células vegetales con A. tumefaciens portador de un
constructo de DNA insertado. Los segmentos o constructos de ácido
nucleico pueden introducirse en células vegetales apropiadas, por
ejemplo, por medio del plásmido Ti de A. tumefaciens. El
T-DNA se transmite a las células vegetales después
de la infección por A. tumefaciens, y se integra de manera estable
en el genoma vegetal. En condiciones apropiadas conocidas en la
técnica, las células transformadas se desarrollan ulteriormente en
plantas.
Las cepas de Agrobacterium empleadas
habitualmente en la técnica de transformación se describen, por
ejemplo, véanse especialmente la Patente U.S. No. 5.188.958 y EP 0
270 615 B1, que se incorporan en esta memoria por referencia.
Los plásmidos Ti contienen dos regiones
esenciales para la producción de células transformadas. Una de
éstas, denominada DNA de transferencia (T DNA), induce a la
formación de tumores. La otra, denominada región virulenta, es
esencial para la introducción del T DNA en las plantas. La región de
DNA de transferencia, que se transfiere al genoma de la planta,
puede incrementarse en tamaño por la inserción de la secuencia de
ácido nucleico extraña sin que se vea afectada su capacidad de
transferencia. Por eliminación de los genes causantes de tumores de
tal manera que los mismos ya no pueden causar interferencia, el
plásmido Ti modificado ("vector Ti desarmado") puede utilizarse
luego como vector para la transferencia de los constructos génicos
de la invención en microsporas apropiadas. En el sistema binario,
para poseer carácter infectivo, son necesarios dos plásmidos: un
plásmido que contenga T-DNA y un plásmido vir
(véanse especialmente los documentos EP 116 718 B1 y EP 120 516
B1).
Además de la transformación utilizando
Agrobacterias, están disponibles muchas otras técnicas para la
introducción de DNA. Estas técnicas incluyen, v.g. la
transformación de protoplastos (véase el documento EP 164 575), la
micro-inyección de DNA, la introducción de DNA por
electroporación, así como métodos biolísticos e infección mediada
por virus. A partir de las células transformadas, aplicando medios
y técnicas adecuados, pueden regenerarse plantas enteras (véase
McCormick et al. (1986) en Plant Cell Reports 5:
81-84). Las plantas regeneradas pueden utilizarse
preferiblemente para cruzarlas con líneas reproductoras existentes
a fin de aumentar asimismo sus características de crecimiento.
Los constructos de DNA utilizados en la presente
invención están constituidos por una región de iniciación de la
transcripción y, bajo el control de la región de iniciación de la
transcripción, una secuencia de DNA a transcribir. La secuencia de
DNA puede comprender un marco de lectura abierta natural que
incluye secuencias flanqueantes 5' y 3' transcritas.
Alternativamente, aquélla puede comprender una secuencia
anti-sentido que codifica el complemento de una
molécula de RNA o porción de la misma (como se describe en los
documentos EP 140 308 B1 y EP 223 399 B1) con objeto de suprimir la
expresión de las glutamina-sintetasas expresadas
interna-
mente.
mente.
Las regiones de iniciación pueden utilizarse en
una diversidad de contextos y en combinación con una diversidad de
secuencias. Las secuencias de un gen codificadas por RNA pueden ser
las de un gen natural, con inclusión del marco de lectura abierta
para codificación de proteínas y frecuentemente las secuencias 5' y
3' no traducidas. Las secuencias de iniciación de la traducción de
RNA se incluyen en los constructos, sea a partir del dominio
promotor o a partir de las secuencias codificantes unidas.
Unidas a las secuencias anteriores se encuentran
secuencias apropiadas de terminación de la transcripción y
poliadenilación.
Los constructos de DNA utilizados en el proceso
de transformación de acuerdo con la presente invención pueden
comprender secuencias codificantes de péptidos de tránsito
existentes naturalmente o modificados genéticamente (véase por
ejemplo el documento EP 189 707 B1).
Ejemplos de secuencias expresadas adicionalmente
o genes a expresar por los constructos de la presente invención
incluyen:
- -
- especialmente genes antisentido o de sentido (para supresión o cosupresión de genes); así como adicionalmente
- -
- proteínas nutricionalmente importantes: factores promotores del crecimiento;
- -
- genes o factores mejoradores del rendimiento, v.g. un gen de invertasa, una citrato-sintasa, una polifosfato-quinasa;
- -
- proteínas que proporcionan protección a la planta en ciertas condiciones ambientales, v.g. proteínas que confieren resistencia a los metales u otro tipo de toxicidad;
- -
- proteínas relacionadas con el estrés que confieren tolerancia a extremos de temperatura, heladas, etc;
- -
- proteínas de valor comercial específico;
- -
- genes que causan un nivel incrementado de proteínas, v.g. enzimas de caminos metabólicos,
- -
- genes causantes de niveles incrementados de productos de valor estructural para un hospedador de planta, v.g., resistencia a herbicidas, resistencia a hongos, v.g. genes de quitinasa, genes de glucanasa, genes inhibidores de la síntesis de proteínas, genes de proteínas inhibidoras de ribosomas, resistencia a virus, v.g. ribozimas, genes de proteínas de la cubierta de virus.
Los presentes constructos se prepararán empleando
vectores de clonación, donde las secuencias pueden ser existentes
naturalmente, secuencias mutadas, secuencias sintéticas, o
combinaciones de las mismas. Los vectores de clonación son bien
conocidos y comprenden sistemas de replicación procariotas,
marcadores para selección de células hospedadoras transformadas, y
sitios de restricción para inserción o sustitución de secuencias.
Para transcripción y expresión óptimas, el DNA puede transformarse
en células vegetales para integración en el genoma, donde el
constructo en cuestión está unido a un marcador para selección o
está co-transformado con DNA codificante de un
marcador para selección.
La selección de células transformadas está
permitida por el uso de un gen marcador seleccionable que se
transfiere también. La expresión del gen marcador confiere un rasgo
fenotípico que hace posible la selección. Ejemplos de tales genes
son aquéllos que codifican resistencia a los antibióticos o
herbicidas, v.g. genes que causan resistencia contra los
inhibidores de la glutamina-sintetasa, v.g.
resistencia a bialaphos o fosfinotricina conferida por genes
aislados de Streptomyces hygroscopicus o viridocromogenes
(BAR/PAT). Otros ejemplos son el gen de
neomicina-fosfotransferasa o el gen de
glucuronidasa.
La clase de plantas transgénicas que están
cubiertas por esta invención es generalmente tan amplia como la
clase de plantas superiores susceptibles de transformación, con
inclusión tanto de plantas monocotiledóneas como de plantas
dicotiledóneas. Es sabido que teóricamente todas las plantas pueden
regenerarse a partir de células totipotentes cultivadas, con
inclusión, pero sin carácter limitante, de todas las especies
principales de cosechas de cereales, caña de azúcar, remolacha
azucarera, algodón, árboles frutales y de otras clases, legumbres y
hortalizas.
Ejemplos de familias que presentan interés
especial son Poáceas, pero también Solanáceas, Malváceas, y
Brasicáceas.
Algunas especies adecuadas incluyen, por ejemplo,
especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis,
Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot,
Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum,
Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis,
Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus,
Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum,
Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia,
Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura.
Ejemplos de especies de interés comercial que
pueden protegerse incluyen:
- tabaco, Nicotiana tabacum L.
- tomate, Lycopersicon esculentum
Mill,
- patata, Solanum tuberosum L.,
- canola/colza,
- Brassica napus L.,
- col, brócoli, col rizada, etc.,
- Brassica oleracea L.,
- mostazas Brassica juncea L.,
- Brassica nigra L.,
- Sinapis alba L. (Brasicáceas),
- petunia, Petunia hibrida
(Solanáceas),
- remolacha azucarera, Beta vulgaris
(Quenopodiáceas),
- pepino, Cucurbita sp.
(Cucurbitáceas),
- algodón, Gossypium sp. (Malváceas),
- girasol, Helianthus annuus,
- lechuga, Lactuca sativa (Asteráceas =
Compuestas),
- guisante, Pisum sativum,
- soja, Glycine max y alfalfa,
Medicago sp. (Fabáceas = Leguminosas),
- espárrago, Asparagus officinalis;
- gladiolo, Gladiolus sp. (Liláceas);
- maíz, Zea mays;
- arroz, Oryza sativa (Poáceas);
- trigo, Triticum aestivum (Poáceas);
y
- cebada, Hordeum vulgare (Poáceas).
En una realización preferida, la invención abarca
patata, tabaco, maíz, remolacha azucarera, algodón, colza, soja,
altramuz, arroz y trigo, transformados. Son especialmente
preferidas las patatas.
La invención se refiere adicionalmente a patatas
transformadas que se han regenerado a partir de diferentes tipos de
células y que se han transformado de acuerdo con la presente
invención.
La transformación puede llevarse a cabo como se
describe en los ejemplos siguientes, proporcionados únicamente a
modo de ilustración.
En general, la preparación de DNA plasmídico, la
digestión con enzimas de restricción, la electroforesis en gel de
agarosa del DNA, transferencias Southern, ligación de DNA y
transformación bacteriana se llevaron a cabo utilizando métodos
estándar. (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), al que se hace
referencia en esta memoria como "Maniatis" y se incorpora en la
presente por referencia).
Basándose en la secuencia de nucleótidos completa
del gen ASN-A de E. coli (Nakamura et
al. (1981) o EP 511 979) el gen se clonó como un fragmento Hga
1/Pst 1 en el vector pUC18. Por medio de mutagénesis in vitro
basada en PCR se creó un sitio SphI en el codón de comienzo de la
traducción ATG que cambiaba la secuencia de nucleótidos desde
AAA ATG AAA ACC GCT (SEQ ID No: 1) en GGC GCATG CAG
AAA ACC GCT (SEQ ID No: 2). Esta mutación introducía un codón
adicional para ácido glutámico en el gen inmediatamente siguiente
al codón de comienzo de la traducción ATG.
La secuencia de nucleótidos para un péptido de
tránsito modificado a partir de la subunidad pequeña de
Ribulosabisfosfato-Carboxilasa de guisante se aisló
a partir del vector pNi6/25 (Wasmann, C.C. et al. (1986) Mol.
Gen. Genet. 205: 446-453) como un fragmento
Hind3/Sph1. Este péptido de tránsito contiene una duplicación de 20
aminoácidos comparado con el péptido de tránsito natural.
La secuencia del péptido de tránsito duplicado y
el gen ASN-A se fusionaron por ligación de los
sitios Sph1 dando como resultado tpASN. El gen tpASN se cortó como
un fragmento Hind3/Pst1 y, después de cambiar el sitio Hind3 en un
sitio Kpn1, se clonó entre el promotor y el terminador CaMV 35S del
vector pDH51 ^{\delta};Kpn.
La casete promotor 35S/gen tpASN/terminador 35S
de pDH51 ^{\delta}Kpn se aisló como un fragmento EcoR1, se
añadieron enlazadores Hind3 y el fragmento se clonó en el sitio
Hind3 del vector pHOE6/Ac, que confiere a las plantas resistencia a
la fosfinotricina. El vector resultante se denominó pHOE6Ac/tpASN.
Este vector se transformó en la cepa C58 de Agrobacterium,
MP9ORK (Koncz et al., Mol. Gen. Gen., 204,
383-396 (1986)).
Se transformaron plantas de tabaco y colza
siguiendo procedimientos publicados. Las plantas se regeneraron en
medios basados en Murashige y Skoog.
Las plantas transformadas se seleccionaron debido
a su resistencia al herbicida fosfinotricina (PPT). Las plantas
resistentes a PPT se analizaron en cuanto a la presencia del gen de
asparagina-sintetasa bacteriana. En un análisis por
Transferencia Northern, se detectó RNA específico de
ASN-A en las plantas. Con anticuerpos policlonales
se demuestra que la proteína estaba direccionada en los
cloroplastos.
La casete promotor 35S/gen tpASN/terminador 35S
de pDH51 ^{\delta}Kpn se aisló como un fragmento EcoR1, se
añadieron enlazadores Hind3 y el fragmento se clonó en el sitio
Hind3 del vector pB2/35SAc dando como resultado pB35SAc/tpASN. Este
vector se utilizó para transformar protoplastos de maíz de acuerdo
con procedimientos publicados (EP 511 979 o EP 164 575). Se
regeneraron plantas en medios basados en Murashige y Skoog. Las
plantas transformadas se seleccionaron por su resistencia al
herbicida fosfinotricina (PPT). Las plantas resistentes a PPT se
realizaron en cuanto a la presencia del gen de
asparagina-sintetasa bacteriana. En un análisis por
transferencia Northern se detectó RNA específico de
ASN-A en las plantas. Con anticuerpos policlonales
se demuestra que la proteína estaba direccionada en los
cloroplastos.
Las secuencias codificantes para las isoenzimas
cloroplásticas de Nicotiana sylvestris y Brassica
napus se clonaron por métodos PCR a partir del DNA genómico de
las plantas respectivas. Los fragmentos resultantes se clonaron
como fragmentos ApaI en orientación antisentido entre el promotor y
el terminador 35S procedentes de CaMV localizados en el vector
pRT100. Las casetes promotor 35S/GS antisentido/terminador 35S se
aislaron como fragmentos Pst1 y se clonaron en el sitio Pst1 del
vector pHOE6/AcK3. Este vector se transformó en la cepa C58 de
Agrobacterium MP9ORK (Koncz et al. supra
(1986)). Las plantas de tabaco y colza se transformaron siguiendo
procedimientos publicados. Las plantas re regeneraron en medios
basados en Murashige y Skoog con cantidades reducidas de amoniaco
como se describe.
Las plantas transformadas se seleccionaron por su
resistencia al herbicida fosfinotricina (PPT). Las plantas
resistentes a PPT se escrutaron con hibridación por transferencia
Southern en cuanto a la presencia del gen ASN-A.
Las plantas positivas en la transferencia Southern se analizaron
respecto a la desactivación del gen de
glutamina-sintetasa cloroplástica por transferencias
Northern. Se seleccionaron plantas con el nivel de RNA de GS más
reducido.
Las secuencias codificantes para las isoenzimas
cloroplásticas de Zea mays se clonaron por métodos PCR a
partir del DNA genómico. El fragmento resultante se clonó como
fragmento ApaI en orientación antisentido entre el promotor y el
terminador 35S procedentes de CaMV localizado en el vector pRT100.
La casete promotor 35S/GS antisentido/terminador 35S se aisló como
fragmento Pst1 y se clonó en el vector pB2/AcK3.
Este vector se utilizó para transformar
protoplastos de maíz de acuerdo con procedimientos publicados. Las
plantas se regeneraron en medios basados en Murashige y Skoog con
cantidades reducidas de amoniaco como se ha descrito. Las plantas
transformadas se seleccionaron por su resistencia al herbicida
fosfinotricina (PPT). Las plantas resistentes a PPT se escrutaron
con hibridación por Transferencia Southern en cuanto a la presencia
del gen ASN-A. Las plantas positivas en el ensayo
Southern se analizaron en cuanto a la desactivación del gen de
glutamina-sintetasa cloroplástica por transferencias
Northern. Se seleccionaron las plantas con el nivel más reducido de
RNA de GS.
Un material de hojas procedente de plantas de
tipo salvaje y diferentes plantas transgénicas que expresan
asparagina-sintetasa se homogeneizó en tampón. Los
extractos se ensayaron en un analizador de aminoácidos Biotronic. Se
determinó la concentración del aminoácido asparagina y se da en
pmol/\mul de extracto.
| NT-WT | NT-TPASN-2 | NT-TPASN-3 | NT-TPASN-5 | NT-TPASN-11 | |
| ASN | 586,855 | 890,26 | 3338,5551 | 1506,6314 | 992,0319 |
La concentración de asparagina estaba en
correlación con la expresión del gen de
asparagina-sintetasa como se mide en las
transferencias Northern y Western.
El constructo arriba mencionado se utilizó para
transformar plantas de patata (Solanum tuberosum L. cv.
Desiree 25). El control, material de planta no transformada se
sometió a un proceso de regeneración in vitro comparable al
de los transformantes. Los tejidos de tubérculo se transformaron de
acuerdo con el proceso que se ha descrito arriba utilizando la
tecnología de Agrobacterium.
La presencia del gen de asnA bacteriano se
demostró por hibridación de DNAs genómicos de plantas con un
fragmento específico del gen quimérico. Los experimentos
confirmaron que los transformantes expresaban el gen transferido en
tanto que las plantas de control carecían de la enzima.
Se llevó a cabo el análisis Northern por
hibridación de RNA total procedente de las líneas de patata
transformadas, y el experimento de hibridación indicó la presencia
de mRNA específico en los transformantes, mientras que, una vez
más, las líneas de plantas de control no exhibían señal detectable
alguna.
Plantas transgénicas que expresaban
asparagina-sintetasa y plantas transgénicas que
expresaban asparagina-sintetasa con actividad
reducida de glutamina-sintetasa se cultivaron unas
al lado de otras con plantas de tipo salvaje en el invernadero. Las
plantas transgénicas exhibían un crecimiento más vigoroso y
florecían antes que las plantas de tipo salvaje.
Experimentos en campo con plantas transgénicas de
patata portadoras del gen de asparagina-sintetasa
bacteriana
Experimento
A
| Genotipo | Peso de tubérculos por planta (gramos) | % del control |
| Planta de control | 135,0 | 100,0 |
| As1 trans. | 168,6 | 124,0 |
| As2 trans. | 182,3 | 135,0 |
Experimento
B
| Genotipo | Peso de tubérculos por cuadro (kg) | % del control |
| Planta de control | 8,16 | 100,0 |
| As1 trans. | 11,39 | 139,5 |
| As2 trans. | 10,94 | 127,0 |
Una vez descritas en detalle las realizaciones
preferidas de la presente invención, debe entenderse que la
invención definida por las reivindicaciones adjuntas no debe
considerarse limitada a los detalles particulares expuestos en la
descripción anterior, dado que son posibles muchas variaciones
obvias de la misma sin apartarse del espíritu o alcance de la
presente invención.
Claims (8)
1. Un proceso para la producción de plantas con
características de crecimiento incrementado, que comprende los
pasos siguientes:
- -
- transferencia e integración de una secuencia de DNA que codifica una asparagina-sintetasa procariota amonio-específica, tipo A (asnA) en el genoma de una célula vegetal,
- -
- en donde dicha secuencia de DNA está enlazada a una secuencia reguladora para la expresión de dicho DNA e importación de la asparagina-sintetasa en cloroplastos o plastos de una célula vegetal, y
- -
- regeneración de plantas intactas y fértiles a partir de las células transformadas.
2. Una célula vegetal obtenida por un proceso de
acuerdo con la reivindicación 1.
3. Una célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 2, que contiene un constructo génico que confiere un
nivel de expresión reducido de actividad de
glutamina-sintetasa endógena, como p.ej. teniendo el
gen endógeno para GS delecionado o interrumpido o comprendiendo una
secuencia antisentido complementaria para una molécula de RNA o
porción de la misma con objeto de suprimir la expresión de las
glutamina-sintetasas expresadas internamente.
4. Una planta, semillas y material de propagación
que contienen células de acuerdo con las reivindicaciones 2 y
3.
5. Un constructo génico que comprende un gen que
codifica una asparagina-sintetasa procariota
amonio-específica, tipo A (asnA) enlazado
operativamente a una secuencia reguladora para la expresión de dicho
DNA e importación de asnA en los cloroplastos o plastos de una
célula vegetal.
6. Un constructo génico de acuerdo con la
reivindicación 5, en el cual el gen de
asparagina-sintetasa procariota
amonio-específica es un gen de
asparagina-sintetasa de E. coli que tiene un
DNA que codifica una secuencia peptídica cloroplástica conductora
unida a su término N para importación en los cloroplastos o plastos
de una célula vegetal.
7. Un vector que contiene un constructo génico de
acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, comprendiendo dicho
constructo génico una secuencia que codifica un péptido
cloroplástico conductor en su término N.
8. Una célula vegetal transformada con el
constructo génico de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 o con
un vector de acuerdo con la reivindicación 7.
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