ES2217978A1

ES2217978A1 - Utilizacion del acido oleanolico como agente vasodilatador y restaurador de la disfuncion endotelial.

Info

Publication number: ES2217978A1
Application number: ES200300985A
Authority: ES
Inventors: Valentina Ruiz Gutierrez; Javier Sanchez Perona; Rosalia Rodriguez Rodriguez; Maria Dolores Herrera Gonzalez
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Sevilla
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Sevilla
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: WO2004096203A1; ES2217978B1

Abstract

Utilización del ácido oleanólico como agente vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial. El ácido oleanólico (ácido 3b-hidroxiolean-12-en-28-oic) es un ácido triterpénico pentacíclico presente en un amplio número de plantas medicinales. El objeto de la invención es la aplicación farmacológica del ácido oleanólico en la terapeútica como agente vasodilatador y su posible función restauradora de la función endotelial, así como la dilucidación del mecanismo de acción de dichos efectos.

Description

Utilización del ácido oleanólico como agente vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial.

Objeto de la invención

El objeto de la invención es la aplicación farmacológica del ácido oleanólico en la terapéutica como agente vasodilatador y su posible función restauradora de la función endotelial, así como la dilucidación del mecanismo de acción de dichos efectos.

Estado de la técnica

El ácido oleanólico (ácido 3\beta-hidroxiolean-12-en-28-oic) es un ácido triterpénico pentacíclico presente en un amplio número de plantas medicinales, en forma de ácido libre o bien como aglicona de saponinas triterpenoideas (Liu J. 1995, J Ethnopharmacol, 49:57-68), llegándose a aislar de más de 120 especies vegetales, destacando su presencia en Olea europaea.

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Existen publicaciones desde el año 1906 (Canzoneri F. 1906, Gazz chim ital, 36:372) que reconocen al ácido oleanólico como constituyente permanente de hojas y frutos del olivo. En el olivo, se halla principalmente en hojas, frutos verdes, especialmente en la cutícula, y en las lejías residuales procedentes del aderezo de las aceitunas. Se encuentra además en aceitunas maduras, aceite de oliva virgen y aceite de orujo. En un trabajo presentado por Vioque y Morris (1961, J Am Oil Chem Soc, 38:485-8), se obtuvo a partir del aceite de orujo, el ácido oleanólico en concentraciones significativas, junto con su 2-hidroxiderivado, posteriormente llamado ácido maslínico.

Desde los años 60, existen trabajos que plantean las posibles propiedades terapéuticas beneficiosas de este ácido. Son numerosas las publicaciones sobre los efectos biológicos y farmacológicos de los ácidos triterpénicos, en particular del ácido oleanólico. Varias revisiones científicas recogen actividades farmacológicas de éste, entre las que destacan: actividad hepatoprotectora (Liu Y et al. 1998, Toxicology Letters, 95:77-85), antiinflamatoria (Singh GB et al. 1992, J Pharm Pharmacol, 44:456-8; Mañez S et al. 1997, Eur J Pharmacol, 334:103-5), antitumoral, antibacteriana y antifúngica (Liu J. 1995, J Ethnopharmacol, 49:57-68), anti-VIH (Zhu YM et al. 2001, Bioorg Med Chem Lett, 11:3115-8; Kashiwada Y et al. 1998, J Nat Prod, 61:1090-5), hipoglucemiante (Yoshikawa M et al. 2000, Biofactors, 13:231-7), antiulcerosa e hipolipemiante (Ma BL. 1986, Traditional Medicine and Pharmacology, 2:28-29).

La presente invención describe una nueva aplicación farmacológica del ácido oleanólico como agente vasodilatador.

Explicación de la invención

El objeto de la presente invención es la utilización del ácido oleanólico como agente de efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial. Dicho efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial se manifiesta a través de la inhibición de contracciones provocadas por fenilefrina en aorta de ratas Wistar. La respuesta relajante al ácido oleanólico se reduce en presencia de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Inhibición de las contracciones provocadas por fenilefrina en aorta de ratas Wistar por efecto de ácido oleanólico.

Figura 2: Inhibición de las contracciones provocadas por fenilefrina en aorta de ratas Wistar por efecto de ácido oleanólico, en presencia de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa.

Figura 3: Inhibición de las contracciones provocadas por fenilefrina en aorta de ratas Wistar por efecto de ácido oleanólico en presencia de un inhibidor de la ciclooxigenasa.

Descripción detallada de la invención

La nueva aplicación farmacológica del ácido oleanólico como agente vasodilatador se ha observado en aorta aislada de ratas Wistar (10-12 semanas de edad). Este compuesto triterpénico natural aislado del aceite de orujo fue capaz de inhibir las contracciones provocadas por fenilefrina (10^{-6}M), recuperando casi el tono basal inicial en aortas con endotelio funcional (E(+): IC50=5.58x10^{-6}M) a diferencia de aquellas donde el endotelio no se encontraba presente (E (-): IC50=7.36x10^{-6}M) (Fig. 1).

Con la intención de dilucidar el mecanismo de acción de este compuesto y a su vez caracterizar la participación de los factores endoteliales en el efecto vasodilatador, los anillos aórticos con endotelio presente, fueron expuestos a un inhibidor de la de la óxido nítrico sintasa (L-NAME, 300\muM) (Fig.2) o un inhibidor de la enzima ciclooxigenasa (indometacina, 10\muM) (Fig.3). En presencia de L-NAME, la respuesta relajante al ácido oleanólico fue significativamente inhibida, sin embargo indometacina no afectó dicha relajación.

Los resultados obtenidos sugieren que la vasorelajación inducida por el ácido oleanólico en aorta de rata es dependiente de endotelio y que el óxido nítrico es partícipe en el mecanismo de la vasodilatación producida. Por lo tanto, este triterpeno contenido en el aceite de orujo podría tener efectos protectores vascular efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial es relacionados con el óxido nítrico endotelial a la vez que podría inducir una mejora de la disfunción endotelial presente en la hipertensión y otras alteraciones cardiovasculares.

Modo de realización de la invención Animales de experimentación

Para la realización de las experiencias sobre los anillos de aorta aislada de rata se han empleado ratas albinas de raza Wistar, machos de 10-12 semanas de edad.

Los animales se han mantenido en jaulas con lecho de viruta, alimentándolos con una dieta de piensos especial para animales de laboratorio (Panlab), con un consumo variable en función del peso y la edad del animal, agua ad libitum, temperatura constante de 20-24°C y humedad relativa de 60\pm20%, y expuestos a un ciclo de luz de 12h/día (8.00 a.m.-8.00 p.m.) (Consejo de Comunidades Europeas, 1986).

Reactivos utilizados

Los siguientes productos químicos empleados en las experiencias fueron proporcionados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA): fenilefrina hidrocloruro (Phe), acetilcolina cloruro (Ach), indometacina (INDO) y N^{\omega}-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME). El compuesto natural ácido oleanólico fue suministrado por Cymit Química S.L. (Barcelona, Spain).

El triterpeno pentacíclico, ácido oleanólico, así como indometacina fueron inicialmente disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO), y el resto de los agentes químicos utilizados en agua bidestilada, para preparar una solución stock de 10^{-2} M. Las posteriores diluciones del triterpeno también se realizaron en DMSO. La concentración final de DMSO alcanzada en el baño (inferior al 0.001%) no afectó significativamente a los resultados. Todas las concentraciones fueron expresadas como la concentración final de cada fármaco en el baño de órgano.

Ensayos sobre aorta aislada de rata Descripción de la técnica

Los animales se sacrifican por traumatismo retrocervical y se procede a su exanguinación total por arteriotomía carotídea. Seguidamente se extrae la aorta torácica descendente por toracolaparotomía media y se limpia cuidadosamente del exceso de grasa y de tejido conectivo. Una vez limpia, se procede a cortar la arteria en anillos de 2-3 mm de longitud.

Los anillos se suspenden entre dos soportes de alambre de tungsteno, con cuidado de no dañar el endotelio, y se disponen en baños de órgano de 10 ml, termostatizados a 37°C, con oxigenación constante de carbógeno (mezcla de 95% de 0_{2} y 5% de CO_{2}) y conteniendo solución salina fisiológica Krebs-Henseleit (PSS). La composición mM de esta solución nutricia es: NaCl 118, KCI 4.75, NaHCO_{3} 25, MgSO_{4} 1.2, CaCl_{2} 1.8, KH_{2}PO4 1.2 y Glucosa 11.

El montaje se conecta a transductores isométricos Pioden UF-1 acoplados al sistema de adquisición de datos PowerLab(r) (AD-Instrument), para registrar los cambios de tensión. Los anillos de aorta se ajustan inicialmente a una tensión basal de 2 g, manteniéndolos en estas condiciones durante una hora para su equilibración.

Tras los 60 minutos de incubación, se comprueba la función vascular y endotelial de los anillos aórticos mediante la adición de fenilefrina (Phe) 10^{-6} M y posteriormente de acetilcolina (Ach) 10^{-6} M. En los experimentos en los que fue necesaria la ausencia de endotelio, éste se eliminó frotando delicadamente la superficie interna del anillo de aorta. Para devolver el órgano a su estado basal y poder iniciar el procedimiento experimental, se le somete a lavados sucesivos con solución Krebs-Henseleit, cada 20 minutos durante una hora.

Desarrollo de la experiencia

El efecto vasodilatador de ácido oleanólico, se puso de manifiesto mediante la adición de dosis acumulativas de este compuesto (10^{-7}-10^{-4} M), cada 20 minutos, sobre anillos de aorta precontraídos hasta el 80% de su contracción máxima con fenilefrina 10^{-6} M. Esta experiencia fue realizada en presencia y en ausencia de endotelio funcional.

Estudio de la influencia de los factores liberados por el endotelio en el efecto de ácido oleanólico

Con la finalidad de estudiar la influencia del óxido nítrico (NO) en el efecto relajante, los anillos de aorta se incubaron durante 20 min. con N\omega-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) (3x10^{-4} M). Este compuesto es un análogo de L-Arginina que bloquea la enzima NO-sintasa, quedando así inhibida la síntesis de NO.

Para estudiar la influencia de los productos derivados de la vía de la ciclooxigenasa, se empleó indometacina (INDO) (10^{-5} M), bloqueante no selectivo y reversible de dicha enzima.

En ambos casos, tras un período de incubación de 20 minutos con el inhibidor correspondiente, el órgano se contrajo hasta un nivel submaximal por adición de Phe (10^{-6} M) sobre el que se estudió el efecto de la adición acumulativa ácido oleanólico.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como porcentaje de la contracción máxima inducida por el agonista, con su correspondiente error (\pmSEM). Cada aorta aislada se dividió en 8 fragmentos, sobre cada uno de los cuales se realizó un ensayo diferente.

Para poner de manifiesto la existencia o no de diferencias significativas, se realiza un análisis de varianza (ANOVA), seguida de una prueba de la mínima diferencia significativa (LSD o Least Significant Difference) propuesta por Fisher. La diferencia entre los valores experimentales se ha considerado significativa desde p< 0.05.

Claims

1. Utilización de ácido oleanólico caracterizado porque se emplea para la preparación de un medicamento de efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial.

2. Utilización de ácido oleanólico para la preparación de un medicamento de efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial se manifiesta a través de la inhibición de contracciones provocadas por fenilefrina en aorta de ratas Wistar.

3. Utilización de ácido oleanólico para la preparación de un medicamento de efecto vasodilatador y restaurador de la disfunción endotelial según las reivindicaciones 1y 2, caracterizado porque la respuesta relajante al ácido oleanólico se reduce en presencia de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa.