ES2217931A1 - Metodo de diagnostico de la evolucion de la masa intestinal absortiva en un individuo. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico de la evolución de la masa intestinal absortiva en un individuo. Conlleva el someter muestras de suero y/o plasma provenientes de la sangre del paciente a un inmunoensayo para determinar la cantidad de apolipoproteína humana apoA-IV, usando un anticuerpo específico obtenido a partir de apoA-IV intestinal, humana y purificada, de apoA-IV humana recombinante, o de un fragmento activo de apoA-IV humana. Se pueden usar ensayos de inmunodifusión por electroforesis, ELISA o Western blot. Comparado con los métodos clínicos habituales (endoscopia y biopsia en ayuno), es ventajoso porque no es invasivo para el paciente y porque puede ser fácilmente industrializado. Es útil para la diagnosis de desórdenes funcionales del intestino causados por un nivel anormal de masa intestinal funcionalmente efectiva, tales como la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia.
Description
Método de diagnóstico de la evolución de la masa
intestinal absortiva en un individuo
Esta invención trata sobre nuevos métodos de
diagnóstico y kits en el área de la gastroenterología clínica, los
cuales se basan en la determinación de una proteína natural de
origen intestinal en el plasma y/o suero obtenido de un
paciente.
Ciertas alteraciones funcionales del intestino
que están causadas total o parcialmente por la ausencia (debido
p.ej. a una pérdida o a falta de madurez) de masa absortiva
intestinal funcionalmente efectiva son la malabsorción, la
enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del
intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia, siendo la
malabsorción una de las más frecuentes. La malabsorción (o sea, el
empeoramiento de la absorción intestinal de nutrientes,
principalmente azúcares y lípidos) es una patología intestinal que
está asociada a determinadas condiciones fisiológicas como la
malnutrición, la aerofagia, las alteraciones gastrointestinales y
el malestar general. Una de las principales causas de la
malabsorción es la atrofia intestinal o disminución de la superficie
de la mucosa intestinal (es decir, la disminución de la masa total
absortiva de las vellosidades intestinales).
En relación con la terapia de las diferentes
alteraciones funcionales del intestino, es interesante diagnosticar
el estatus de la masa total absortiva funcionalmente efectiva de un
individuo dado, tanto en diferentes etapas de su desarrollo
individual (o sea, a diferentes edades), como a lo largo del
tratamiento terapéutico del daño intestinal. Sin embargo, en la
actualidad la mayoría de los métodos de diagnóstico usados con
dicha finalidad son agresivos y están basados o en la endoscopia o
en el análisis de muestras de biopsia yeyuna.
La mayoría de clínicos diagnostican los síndromes
de malabsorción mediante endoscopia y biopsia intestinal, pero
dichas prácticas presentan ciertos inconvenientes y limitaciones.
Así, en algunas ocasiones la biopsia intestinal no es
representativa del estado de todo el intestino y se pueden observar
áreas con mucosa mosaico, alternando áreas de vellosidades
atrofiadas y normales (cf. S.C. Tawil et al., "Scalloping of the
valvulae conniventes and mosaic mucosa in tropical sprue;"
Gastrointest. Endosc. 1991, vol. 37, pp.
365-367). Además, la orientación de la biopsia puede
ocasionalmente enmascarar el diagnóstico, no pudiendo ser detectada
una atrofia intestinal parcial (cf. M. Cassaro et al., "The dark
sida of the gastric biopsy", Hum. Pathol. 1999, vol. 30,
pp. 741-744). Alrededor de la mitad de los casos de
enfermedad celíaca (intolerancia al gluten de la dieta) no pueden
ser diagnosticados como tales ya que no presentan los síntomas
característicos de malabsorción; y lo mismo ocurre con el esprúe
tropical (estomatitis tropical). Estudios de cromoendoscopia, que
permiten la magnificación de la mucosa intestinal durante la
endoscopia, revelan que un número importante de atrofias parciales
no se habrían detectado mediante la endoscopia clásica (cf. L.M.
Siegel et al., "Evaluation of latino expatriates for evident of
tropical sprue (abstract)"; Gastroenterology 1995, vol.
108, p. A324). Por lo tanto, sería útil encontrar marcadores en
suero y/o plasma que indiquen el estatus clínico de la mucosa
intestinal, particularmente la atrofia intestinal, y obviar así el
uso general de métodos invasivos como la biopsia yeyuna y la
endoscopia.
En la clínica, con la finalidad de diagnosticar
la malabsorción intestinal, se han sugerido algunos métodos de
determinación en el suero y/o plasma que difieren da la biopsia y
la endoscopia clásicas. De acuerdo con uno de ellos, en pacientes
con pancreatitis crónica la malabsorción lipídica se diagnostica
por un test indirecto que mide la apolipoproteina
B-48 (apoB-48) en plasma después de
una ingesta rica en lípidos (cf. B. Saviana et al., "Diagnosis
of lipid malabsorption in patients with chronic pancreatitis: a new
indirect test using postprandial plasma apolipoprotein
B-48", Am. J. Gastroenterol. 1999, vol.
94, pp. 3229-3235). La apoB-48 se
sintetiza en el intestino junto con los quilomicrones
(lipoproteínas); además la obtención de anticuerpos a partir de
esta lipoproteína es dificultosa dada la similitud molecular con
otra apolipoproteína hepática, la apoB-100. Este
método requiere el aislamiento previo de las lipoproteínas, lo que
es una fuente de limitaciones en el ámbito clínico (gran volumen de
muestra sanguínea, equipos técnicos especiales y caros, pérdida de
dicha apolipoproteína durante el aislamiento de los quilomicrones,
etc.). Otro método está basado en la medida de la citrulina
circulante mediante HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia)
como marcador de la malabsorción en los casos de síndrome de
intestino corto (cf. P. Crenn et al., "Postabsorptive plasma
citrulline concentration is a marker of absorptive enterocyte mass
and intestinal failure in humans;" Gastroenterology 2000,
vol. 119, pp. 1496-1505). Una gran limitación de
este método es que se puede usar sólo en adultos, pues el inicio de
la síntesis de citrulina en el enterocito tiene lugar después del
destete del mamífero (cf. G. Wu et al., "Synthesis of citrulline
from glutamine in pig enterocytes;" Biochemical J. 1994,
vol. 299, pp. 115-121). También se ha propuesto,
para estudiar la malabsorción en adultos y niños, la medida en
orina y suero por HPLC de azúcares (Iactulosa, manitol, lactosa,
D-xilosa ...) después de una sobrecarga oral de los
mismos (cf. S. Travis et al.; "Intestinal permeability:
functional assessment and significante"; Clin. Sci. 1992,
vol. 82, pp. 471-488. J.A. Kynaston et al.,
"Simultaneous quantification of mannitol,
3-0-methyl glucose, and lactulose in
urine by HPLC with pulsed electrochemical detection, for use in
studies of intestinal permeability"; Clin. Chem. 1993,
vol. 39, pp. 453-456). Pero resulta frecuentemente
molesto para el paciente, y depende además de otros factores tales
como el vaciado gástrico y la velocidad de recolección de la orina.
En pacientes pediátricos, otros métodos más indirectos, que también
resultan molestos y además dan falsos positivos, son por ejemplo
los test del aliento que implican la medición del hidrógeno expirado
producido por la fermentación bacteriana de los azúcares no
absorbidos, o la medición del ^{14}CO_{2} radiactivo expirado
producido por el metabolismo de la
^{14}C-trioleína ingerida, que está relacionado
con la malabsorción de lípidos (cf. F.
Fernández-Bañares et al., "Procedimientos
diagnósticos en gastroenterología y hepatología", in P. Humbert
& M.A. Gassull (eds.), Capítulo 8, pp. 71-79;
Mosby-Dioma Libros S.A.; Madrid 1995).
Así pues, resulta de interés clínico encontrar
nuevos métodos de diagnóstico que, en un determinado paciente,
indiquen el estatus de toda la masa intestinal absortiva
funcionalmente activa, particularmente en relación con determinadas
disfunciones intestinales.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método de diagnóstico de una disfunción intestinal
en un paciente causada por un nivel anormal de masa total absortiva
funcionalmente efectiva que comprende someter una muestra de suero
y/o plasma de la sangre del paciente a un inmunoensayo para evaluar
la cantidad de apolipoproteína apoA-IV humana. El
inmunoensayo implica un anticuerpo específico contra la
apoA-IV humana obtenido a partir de dicha proteína
intestinal ya purificada, o a partir de apoA-IV
humana recombinante, o a partir de un fragmento activo de la
apoA-IV humana.
La apoliproteína A-IV
(apoA-IV) es una proteína de aproximadamente 45 KDa
sintetizada por los enterocitos (las células más abundantes del
epitelio intestinal), que se libera a la linfa unida a
quilomicrones (lipoproteínas sintetizadas después de una ingesta
rica en lípidos), y que desde allí se libera a la sangre, donde se
presenta principalmente en forma libre. La apoA-IV
se expresa en los humanos desde la semana 20 de la gestación, lo
que significa que puede ser cuantificada en el nacimiento y durante
edades prenatales. En la actualidad se conocen cuatro isoformas
(variantes genéticamente determinadas) de la
apoA-IV humana. Dependiendo de la población
examinada, la frecuencia alélica de la isoforma primaria es
alrededor del 94%; la abundancia de la segunda isoforma es del 6%
aproximadamente. Las otras dos isoformas identificadas tienen
frecuencias muy bajas. Por ápoA-IV se entiende aquí
cualquiera de las isoformas o sus mezclas.
El método de la presente invención usA ensayos
conocidos para la detección y cuantificación de la
apoA-IV humana en el suero y/o en el plasma. Los
ensayos de inmunodifusión mediante electroforesis, tal y como se
describen en EP 282.412 B1 para otras apolipoproteínas, también
pueden usarse en el método de la presente invención. No obstante, se
prefieren las técnicas de ELISA (ensayos inmunosorbentes unidos a
enzimas, en inglés "enzyme-linked immunosorbent
assays") y los ensayos Western blot.
La masa absortiva intestinal funcionalmente
efectiva en el paciente se refiere a la parte de su mucosa
intestinal que está formada principalmente por enterocitos (células
absorbentes). Un nivel anormal de masa intestinal absortiva,
funcionalmente efectiva, puede ser el resultado de una pérdida de
enterocitos (p.ej. por la ingesta de etanol), o puede ser causada
por la falta de madurez de dichas células (p.ej. en neonatos
prematuros). Por anticuerpo específico contra
apoA-IV humana se entiende cualquier anticuerpo
monoclonal o policlonal que interactúe únicamente con la
apoA-IV intestinal humana. Este anticuerpo puede
obtenerse por cualquiera de los métodos estándar, conocidos por los
expertos en la materia, usando como inmunógeno o bien la
apoA-IV humana purificada (en cualquiera de sus
isoformas o mezclas de las mismas), o bien una
apoA-IV humana recombinante, o bien un fragmento
activo de la apoA-IV humana.
En una realización preferida, el inmunoensayo
usado en el método de la presente invención es del tipo ELISA
sandwich. En una realización más preferida, el inmunoensayo ELISA
sandwich implica el pretratamiento de la muestra con un tampón
específico (tampón clarificante, en inglés "clearing buffer")
que contiene una colesterol-esterasa pancreática
para disminuir la interferencia de los lípidos circulantes de la
muestra, en la cuantificación de la apoA-IV. En
otra realización preferida, el inmunoensayo es un Western blot
(especialmente preferido con un control interno). Y en otra
realización preferida, el inmunoensayo es de inmunodifusión.
Entre los desórdenes de la función intestinal
causados por un nivel anormal masa intestinal absortiva
funcionalmente efectiva que pueden ser diagnosticados por el método
de la presente invención, están la malabsorción, la enfermedad
celíaca (o sea, la intolerancia al gluten de la dieta), la atrofia
intestinal vellositaria, el síndrome del intestino corto, la
diarrea crónica y la flatulencia. Entre las diferentes causas de
dichos desórdenes intestinales están: la predisposición genética,
la malnutrición, el ayuno, la nutrición parenteral, la cirugía
intestinal, la quimioterapia, la prematuridad al nacer, la
infección bacteriana intestinal, etc.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un kit in vitro para el diagnóstico de un
desorden de la función intestinal causado por un nivel anormal de
masa intestinal absortiva funcionalmente efectiva (incluyendo
cualquiera de las condiciones mencionadas anteriormente) en un
paciente dado. El kit tiene un anticuerpo específico contra la
apoA-IV humana, obtenido a partir de una
apoA-IV humana intestinal purificada, a partir de
una apoA-IV humana recombinante, o a partir de un
fragmento activo de la apoA-IV humana, junto con
otros materiales y/o componentes para evaluar por inmunoensayo la
cantidad de apoA-IV humana. En realizaciones
preferidas, el kit tiene materiales y/o componentes para un
inmunoensayo de tipo ELISA, o para un ensayo Western blot, o para un
ensayo de inmunodifusión. Para un experto en la materia será fácil
seleccionar los materiles y/o los componentes para preparar los kits
in vitro apropiados para el inmunoensayo seleccionado: p.
ej., una microplaca con pocillos para el ELISA, o un film cubierto
con gel para el Wester blot o para el ensayo de inmudifusión.
\newpage
La determinación de la cantidad de
apolipoproteína A-IV humana puede ser más o menos
cuantitativa dependiendo del tipo de inmunoensayo empleado y de la
disponibilidad de la proteína pura apoA-IV humana
como estándar, tal y como se ilustra en los ejemplos adjuntos.
Es de destacar que algunos factores tales como la
dieta grasa, la malabsorción lipídica por causas pancreáticas, la
inflamación aguda y la disfunción hormonal pueden alterar las
concentraciones plasmáticas de apoA-IV en los
humanos. Así, hay unas pocas patologías asociadas con el
metabolismo lipídico en las que esas concentraciones plasmáticas
están alteradas. En pacientes con esas patologías, el experto en la
materia debe usar el método de la presente invención con cierta
precaución, tomando la muestra de sangre después de un ayuno de la
noche anterior, como mínimo. Aunque los niveles absolutos de
apoA-IV en pacientes con esas patologías pueden
diferir significativamente respecto a los valores medios de la
población control, la evolución de los niveles de
apoA-IV para un mismo paciente seguirá siendo
significativa. Entre esas patologías se encuentran las siguientes:
la enfermedad coronaria, la obesidad, la diabetes mellitus, la
insuficiencia renal, la pancreatitis crónica y la malnutrición
severa.
Hasta ahora la apoA-IV humana ha
recibido muy poca atención en el ámbito de la diagnosis y la
terapia clínica, siendo una excepción la 5 sugerencia de administrar
apoA-IV humana a pacientes, mediante una
formulación inyectable, con el propósito de controlar el apetito y
de reducir la ingesta y el peso corporal (cf. WO 94/27629 Al ).
En comparación con los métodos clínicos
habitualmente empleados en la técnica (endoscopia y biopsia
yeyuna), la invención es ventajosa en el sentido de que proporciona
un método de diagnóstico que no es invasivo para el paciente y que
puede ser fácilmente industrializado con muestras de plasma y/o
suero separadas del paciente.
En comparación con la posible determinación de
otras proteínas intestinales, otra ventaja de esta invención deriva
del hecho de que la apoA-IV puede ser determinada a
cualquier edad del individuo, incluyendo edades prenatales. El
hecho de que la vida media de la apoA-IV humana sea
baja y su concentración en plasma se correlacione significativamente
con su velocidad de liberación desde el enterocito, y no con su
velocidad de degradación, hace que la determinación de la
apoA-IV humana sea muy indicativa del estatus
funcional y morfológico de la mucosa. Una ventaja adicional, en
comparación con la determinación de otras lipoproteínas, deriva del
hecho de que la apoA-IV humana se libera a la sangre
principalmente en forma libre (o sea, no asociada a proteínas), lo
que tiene como resultado que el método de la presente invención
sufre menos de interferencias de los lípidos circulantes.
A lo largo de la descripción y de las
reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no
pretenden excluir otros aditivos, componentes, elementos o fases.
La descripción en el resumen se incorpora aquí como referencia. La
siguiente descripción detallada y los dibujos se presentan a título
de ilustración, y no se pretende que limiten a la presente
invención.
La Fig. 1 ilustra la detección de la
apoA-IV humana en plasma y en biopsia intestinal
mediante el ensayo Western blot.
La Fig. 2 muestra una inmunolocalización
histológica de la apoA-IV en una biopsia intestinal
humana de duodeno-yeyuno proximal.
La Fig. 3 incluye dos gráficas de un ELISA
sandwich para detectar apoA-IV humana en
plasma.
La Fig. 4 corresponde a dos ensayos de Western
blot de apoA-IV purificada y plasma humano, a lo
largo del desarrollo pre y postnatal.
La Fig. 5 muestra los niveles de
apoA-IV mediante el ensayo de ELISA sandwich, en el
suero de cordón umbilical de humanos recién nacidos, procedentes de
madres alcohólicas y de controles, según la distribución del peso
corporal.
La Fig. 6 corresponde a un ensayo Western blot
para detectar la apoA-IV del suero del cordón
umbilical de humanos recién nacidos, procedentes de madres
alcohólicas y de madres control.
La Fig. 7 muestra la detección y la
cuantificación por Western blot de apoA-IV en
plasma, en niños celíacos en diferentes fases de su enfermedad.
La Fig. 8 muestra la detección y la
cuantificación por Western blot de apoA-IV en
plasma, en pacientes con nutrición parenteral después de una
cirugía abdominal.
La Fig. 9 muestra la detección y la
cuantificación por Western blot de apoA-IV en
plasma, en pacientes bajo alimentación parenteral y sucesiva
alimentación enteral después de cirugía gástrica.
El método de la presente invención se ilustra a
continuación mediante el empleo de ensayos tipo ELISA sandwich y
Western blot, en dos patologías pediátricas representativas de
desórdenes intestinales (los efectos del alcohol en el feto y la
enfermedad celíaca) y en dos modelos de atrofia intestinal en
adultos (alimentación parenteral y alimentación parenteral). En un
modelo en rata, los inventores han mostrado previamente que el
consumo de etanol durante la gestación por parte de la madre causa
alteraciones intestinales en el feto y el recién nacido (cf. L.
Camps et al., "Effects of prenatal exposure to ethanol on
intestinal development of rat fetuses;" Journal Pediatric
Gastroenterol. Nutr. 1997, vol. 24, pp.
302-311, y sus referencias), y también se han
publicado algunos casos clínicos en humanos (cf. S. Tourtet et al.,
"Small intestine atresia and abnormal insertion of the umbilicus
in a child with fetal alcohol syndrome;" Archives de
Pediatrie 1997, vol. 4, pp. 650-652, y sus
referencias). La enfermedad celíaca (intolerancia al gluten de la
dieta) es una patología bien establecida de atrofia severa o
moderada de la vellosidad intestinal, donde el diagnóstico
definitivo se hace hasta ahora mediante biopsia intestinal. Se sabe
bien que cualquier alimentación parenteral y un estado ayunado en
general desarrollan la alteración de la mucosa, con cierta atrofia
de la vellosidad intestinal.
Niños recién nacidos de madres que habían
consumido alcohol durante la gestación fueron distinguidos de niños
recién nacidos procedentes de madres control: Una mujer era
catalogada como alcohólica si había tomado alcohol durante la
gestación y antes del parto, y tenía la alcoholuria positiva
(etanol en orina) en el momento del alumbramiento.
Los niños diagnosticados como celíacos tenían en
el suero los anticuerpos antiendomisio y tomaban una dieta que
incluía el gluten. Los niños celíacos a los que se les realizó una
biopsia yeyuna (casi el 80%) tenían atrofia intestinal en todos los
casos. La edad del estudio fue entre 1-6 años.
La nutrición parenteral fue realizada en
pacientes adultos y ancianos (entre 30-80 años de
edad) sometidos a cirugía abdominal (resección del colon). Todos
los pacientes fueron seleccionados en base a los siguientes
criterios: que no presentaran enfermedades renales o hepáticas, ni
carcinomastosis peritoneal o metástasis conocida, ni malnutrición,
ni pérdida de peso, ni enfermedad metabólica o endocrina. Después
de la intervención los pacientes recibieron soporte nutricional con
alimentación parenteral, sin ningún tipo de ingesta oral hasta el
día siete.
Otros grupos de pacientes (sometidos a resección
gástrica) y seleccionados con el mismo criterio estuvieron bajo
nutrición parenteral (tres o cinco días después de la operación) y
sucesivamente bajo nutrición enteral (con dieta líquida y blanda
durante cuatro días después).
Los plasmas y/o los sueros de los pacientes
fueron tomados después del ayuno de la noche anterior, excepto para
los neonatos. En el nacimiento las muestras de suero fueron
recolectadas desde el cordón umbilical, en los Departamentos de
Obstetricia y Ginecología correspondientes. Los plasmas fueron
obtenidos con EDTA disódico y centrifugados y congelados a
-30°C.
Un pequeño fragmento de biopsia intestinal era
colocada a 4°C en PBS (tampón fosfato salino, pH 7.5), y procesada
lo más rápidamente posible para los estudios de Western blot y/o de
inmunolocalización histológica. Las biopsias para los análisis de
Western fueron procesados previamente a 4°C y a una dilución de
1/25 con PBS con Tritonx100 al 1% (v/v).
Los estudios clínicos fueron realizados con
consentimiento de los Comités Éticos de los diferentes Hospitales
implicados: Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Sant Joan de Déu
en Barcelona, y Hospital Vall d'Hebron en Barcelona.
Los ensayos de Western blot para la detección de
apoA-IV se realizaron a partir de las proteínas
separadas en SDS-PAGE (dodecilsulfato
sódico-electroforesis en gradiente de
poliacrilamida) al 10% y transferidas sobre membranas de
"Inmovilon-P" Millipore®. Alícuotas de suero
y/o plasma diluídos (1/100) fueron cargadas con tampón de muestra,
resultando por pocillo 0.2 \mul de suero y/o plasma. Se utilizó
como anticuerpo primario IgG contra apoA-IV humana
(desarrollado en el laboratorio de los inventores) y obtenido en
conejo a la dilución 1/500; y como anticuerpo secundario un anti
IgG de conejo comercial obtenido en cerdo (marcado con peroxidasa
de rábano, HRP) a la dilución 1/15,000 (Dako®, Glostrup,
Dinamarca). Otras diluciones especiales de los anticuerpos están
descritas en las correspondientes figuras. El bloqueo de las uniones
inespecíficas se realizó con BSA (albúmina sérica bovina) al 2%,
w/v. Para el revelado del Western blot se utilizó el sistema
comercial ECL (luminol de quimioluminiscencia aumentada, en inglés
"enhanced chemiluminiscence luminol") (Amersham Pharmacia
Biotech, Little Chalfont Buckinghamshire, Inglaterra) or el
sustrato quimioluminiscente con detección por HRP SuperSignal West
Pico (Pierce®, Rockford, Illinois, USA).
La concentración plasmática de
apoA-IV se determinó mediante un ELISA sandwich
puesto a punto en el laboratorio de los inventores. En una placa de
poliestireno de 96 pocillos se inmunoabsorbían 500 ng por pocillo
del anticuerpo captador (IgG contra apoA-IV humana,
desarrollado en el laboratorio de los inventores) obtenido en
conejo, y diluído en 100 \mul de tampón
carbonato-bicarbonato (Na_{2}CO_{3} 6.9 g/l,
NaHCO_{3} 10.5 g/l, pH 9.6). Después de incubar la placa toda la
noche a 4°C en una cámara húmeda, se lavaba cinco veces con
PBS-T (phosphate buffer salina pH:7.4 con
Tween-20 0.05%, v/v) a temperatura ambiente. Para
bloquear la unión inespecífica, cada pocillo se incubaba con 360
\mul de la solución de bloqueo que contenía albúmina sérica
bovina (PBS y bovina serum albumine 0.5%, w/v) durante 1 hora a
37°C en una cámara húmeda con agitación. Posteriormente, se
realizaban cinco lavados con PBS-T, y se incubaban
100 \mul de las muestras, la estándar y el control interno (para
los controles inter- e intra-ensayo, ver párrafos
inferiores) ya diluídos en
PBS-T-BSA (PBS con BSA al 0.5% y
Tween-20 al 0.05%) durante 1 hora a 37°C en una
cámara húmeda. Posteriormente, se realizaron cinco lavados con
PSB-T.
Seguidamente se incubaba la placa durante 2 horas
a temperatura ambiente en la cámara húmeda con el anticuerpo
detector, es decir las mismas IgG contra apoA-IV
humana obtenidas en conejo, pero unidas a biotina (0.5 mg/ml, 12,4
mol biotina/mol IgG), y diluídas 1/500 en 100 \mul
PBS-T-BSA. Una vez completada la
incubación, se realizaron 5 lavados con PSB-T.
Seguidamente se incubaba la placa durante 20 minutos a temperatura
ambiente en la cámara húmeda con una solución de avidina unida a
peroxidasa 0.2 mg/I y diluída en
PBS-T-BSA (100 \mul por pocillo).
Se realizaron cinco lavados con la solución de
PBS-T. Seguidamente se pipeteaban 100 \mul por
pocillo de la solución OPD (O-fenilendiamina 0.4
g/l, ácido cítrico 7.3 g/l, Na_{2}HPO_{4} 9.6 g/l, y
H_{2}O_{2} 0.2 \mul/ml) preparada en el momento de su
utilización. El revelado o aparición del color del producto se
realizaba a temperatura ambiente. Transcurrido un tiempo máximo de
20 minutos se paraba la reacción añadiendo 50 \mul por pocillo de
HCI 2.5 M. La placa se agitaba unos segundos en un agitador orbital
y se leía a 492 nm con el lector de ELISA "Titertek
Multiskan".
En los experimentos preliminares de la puesta
apunto del ELISA no se obtuvieron resultados totalmente
satisfactorios: el volumen de las muestras no presentaba linealidad;
y la repetitividad inter- e intraensayo no era aceptable. Fue
necesario realizar un pretratamiento de las muestras con colesterol
esterasa pancreática para obtener resultados más satisfactorios,
evitando la posible interferencia de los lípidos plasmáticos en la
cuantificación de la apoA-IV. Las muestras de
plasma y el control interno (para los controles inter- e
intraensayo) se diluyeron 1/10 en PBS, seguidamente se incubaron a
37°C con un tampón aclarador usado para nefelometría que contenía:
ácido aspártico 87.2 g/l, colato sódico 17.5 g/l, Tween 20 1.2%,
colesterol-esterasa 0.4 g/l, y Tris 0.1 M, pH 7.7
en la proporción (1:1) (v:v). La reacción se paraba a los diez
minutos con hielo, posteriormente se añadía
PBS-T-BSA, hasta completar, la
dilución final de la muestra (1/150 y 1/300). El tampón aclarador
se procesaba sin suero y/o plasma como blanco. La estándar se
realizaba a partir de una solución de apoA-IV
purificada previamente en el laboratorio de los inventores. La
concentración de proteínas se determinó mediante el kit comercial
"BCA Protein assay reagent" (Pierce®, Rockford, Illinois)
utilizando BSA como estándar. La estándar de apoA-IV
se diluía en PST-T-BSA y se utilizó
un intervalo de concentraciones de 1 a 2,000 ng por pocillo. Se
verificó que no había interferencia del tampón aclarador en la
estándar, y por tanto ya no se utilizó con dicho tampón.
El ajuste de la curva patrón se realizó mediante
análisis de regresión polinómica. Se ensayaron dos diluciones de
cada muestra (1/150 y 1/300), y la concentración de
apoA-IV se calcularon realizando la media de las
dos diluciones. Las diluciones de la muestra y de las diferentes
concentraciones de la estándar se ensayaron por duplicado. El
control interno fue el de un plasma de adulto ayunado toda la noche,
con una concentración de apoA-IV de 13.14 mg/100
ml, y fue ensayado por cuadruplicado. El control intra- e
inter-ensayo fue respectivamente 4.2% y 9.1%.
La especificidad de los anticuerpos (IgG de
conejo) obtenidos por los inventores, para detectar la
apolipoproteína A-IV en plasma y biopsia intestinal
humanos, se ilustra en los resultados de las Figs. 1, 2 y 3.
La Fig. 1 ilustra los resultados obtenidos por
electroforesis SDS-PAGE y Western blot. En la Fig.
A fueron cargadas en los pocillos 30 \mug de proteína de plasma
(de origen humano y de rata). Uno de los pocillos se cargó con 20
ng de apoA-IV humana purificada. El anticuerpo
primario fue diluído 1/200, y el anticuerpo secundario (contra IgG
de conejo unido a HRP, peroxidasa de rábano) a 1/2000. La detección
se realizó con DAB (diaminobenzidina). Se demostraba que el
anticuerpo primario no marcaba la apoA-IV
procedente de la rata. En la Fig. B fueron cargadas 22 ng de
apoA-IV humana purificada y 5 \mug de proteína de
plasma humano. Cantidades diferentes de proteínas de biopsia
intestinal (18 \mug and 9 \mug) fueron cargadas en diferentes
pocillos. Los anticuerpos primario y secundario fueron procesados
idénticamente a los resultados de la Fig. A. La detección se
realizó con ECL. Con el ECL se mostró una mayor marca que con la
detección por DAB. Los símbolos de la Fig. 1A son los siguientes.
Pr: plasma de rata. Ph: plasma humano. La ApoA-IV es
una proteína purificada en el laboratorio de los inventores. Los
símbolos de la Fig. 1B son los siguientes: lh significa biopsia
intestinal humana (procedente de duodeno-yeyuno
proximal).
La Fig. 2 muestra la inmunolocalización de la
apoA-IV en intestino humano mediante microscopía
cofocal (Laica TCS 4D, Serveis Científico-Técnics,
Parc Científic de Barcelona, UB). El anticuerpo primario (IgG de
conejo) fue diluído a 1/40 en PBS-FCS (suero fetal
de ternero al 10%, v/v); como anticuerpo secundario se usó anti IgG
de conejo obtenido de cabra y unido a rojo de Texas que fue diluído
a 1/200 en PBS-FCS. Las imágenes mostraban que la
proteína estaba localizada a lo largo del epitelio de la mucosa
intestinal (ver a 50 y 25 \mum), y específicamente en los
enterocitos, no mostrando ninguna marca en otros tipos celulares. La
apoA-IV estaba localiza principalmente en el área
supranuclear del enterocito (ver a 10 y 5 \mum). Se demostró la
localización celular y la especificidad del anticuerpo de los
inventores (IgG de conejo) para detectar la apoA-IV
humana, la cual estaba sintetizada básicamente por el enterocito.
Estos datos se complementan con los resultados previos obtenidos
con el ensayo Western blot en la Fig. 1 B.
La Fig. 3 muestra diferentes resultados del
método de ELISA sandwich. La Fig. 3A ilustra la especificidad del
anticuerpo de los inventores para detectar concentraciones
crecientes de apoA-IV humana. La
apoA-I comercial (también sintetizada por la mucosa
intestinal) y la albúmina humana no fueron detectadas usando el
mismo ELISA sandwich. En la Fig. 3B volúmenes crecientes de la
muestra (ensayo de dilución) se correlacionaban con cantidades
variadas de apoA-IV de diferentes plasmas humanos:
niveles bajos para neonatos, altos para un niño de
5-6 años, y niveles adultos para un adulto de 20
años de edad. El valor obtenido de recuperación de la
apoA-IV purificada en diferentes muestras fue entre
90.5 y 106.2%. En la Fig. 3A los símbolos son los siguientes:
cuadrados para la apoA-IV humana, triángulos para la
apoA-I humana y círculos para la albúmina humana.
En la Fig. 3B los símbolos son los siguientes: triángulos para el
plasma de un niño de 5-6 años, círculos para el
plasma de un adulto de 20 años y rombos para un plasma de un recién
nacido a término.
La Fig. 4 muestra diferentes marcas de plama
humano con diferentes cantidades de apoA-IV de
acuerdo con la etapa de desarrollo (desde nacimiento hasta la edad
adulta). El ensayo Western blot puede ser usado como método
alternativo a la cuantificación por ELISA. El límite de detección
del Western blot en las condiciones experimentales que se detallan
es alrededor de 5-2 ng de proteína y 0.2 \mul de
muestra de suero y/o plasma. El índice de correlación de 59
muestras medidas paralelamente mediante ambos análisis fue de
0.841. Aunque el ensayo Western blot es una técnica
semicuantitativa comparada con el ELISA, su principal ventaja es
falta de la interferencia de los lípidos plasmáticos. Los símbolos
de la Fig 4 A son los siguientes. N: suero de cordón umbilical de
neonatos (de 30 y 31 semanas de gestación); A: plasma de un adulto
(de 20 años). La Fig. 4B se refiere a plasmas de diferentes
momentos de la gestación en humanos (25 semanas, 36 semanas y 38
semanas); niños lactantes de diferentes periodos de lactancia (2 y
8 meses de edad) y niños de diferentes edades (1.5 y 10 años)
La Tabla 1 presenta el peso corporal y los
niveles de apoA-IV, de triacilglicéridos y de
colesterol, en el suero del cordón umbilical de neonatos de 36 a 42
semanas de gestación. La apoA-IV de dichas muestras
fue cuantificada mediante ELISA sandwich (Fig. 3). Para la
determinación de triacilglicéridos y colesterol en suero se
utilizaron kits comerciales (Medical Analysis Systems and
Boehringer Mannheim GmbH respectivamente). El etanol in
utero redujo significativamente en el nacimiento la
apoA-IV en suero de cordón umbilical,
independientemente del peso corporal de neonato. Este resultado
podría estar relacionado con las alteraciones morfológicas y
funcionales encontradas por los inventores en el intestino de fetos
experimentales (de rata) afectados por la ingesta de alcohol por
parte de la madre, probablemente relacionadas con la presencia de
etanol en el líquido amniótico y en el lumen intestinal del feto
durante la gestación. Los datos vienen expresados como la media
\pm SEM de n individuos. Se aplicó el test de
Mann-Whitney U. Neonatos C = neonatos de madres
control. Neonatos A = neonatos de madre alcóholica. NS = no
significativo.
| Neonatos C | Neonatos A | p-values | |
| n = 139 | n = 78 | ||
| Peso corporal (g) | 3140 \pm 29 | 3220 \pm 32 | NS |
| ApoA-IV (mg/100ml) | 1.66 \pm 0.09 | 1.14 \pm 0.11 | < 0.001 |
| triacilglicéridos (mg/100ml) | 40.43 \pm 1.51 | 41.22 \pm 2.17 | NS |
| Colesterol (mM) | 1.75 \pm 0.04 | 1.78 \pm 0.05 | NS |
La Fig. 5 presenta los datos de
apoA-IV en suero (Tabla 1) en relación a la
distribución de pesos de los neonatos. Los neonatos de las madres
alcohólicas siempre tienen menos apoA-IV en
comparación con los neonatos control (especialmente en neonatos que
pesan entre 2.5 y 3.5 Kg). Los datos se expresan como la media
\pm SEM de n individuos. Barras oscuras = neonatos de
madres control. Barras claras = neonatos de madres alcohólicas.
La Fig. 6 muestra un Western blot de
apoA-IV analizado en suero de algunos recién
nacidos de madres control y alcohólicas con diferentes edades
gestacionales. Se observa que la intensidad de la marca es menos
detectable en el suero de la descendencia del grupo alcohólico
comparada con la de los sueros de los neonatos controles de la
misma edad gestacional. Estos resultados se complementan con los
datos de la Tabla 1 y de la Fig. 5. Suero de cordón en neonatos de
35, 36, 40 y 41 semanas de gestación. C = neonatos de madres
control. A = neonatos de madres alcohólicas.
La Tabla 2 muestra la concentración plasmática de
apoA-IV, trialcilglicéridos y colesterol en niños
celíacos activos (con ingesta de gluten) de edades entre
1-6 años, y controles de la misma edad. La
apoA-IV de dichas muestras fueron cuantificadas
mediante ELISA sandwich (Fig. 3). Para determinar los
triacilglicéridos y el colesterol en plasma se usaron kits
comerciales (Medical Analysis Systems and Boehringer Mannheim GmbH
respectively). Los valores de triacilglicéridos fueron
significativamente más altos en los niños celíacos que en los
controles. Los valores de colesterol fueron significativamente más
bajos en niños celíacos que en los controles. Los valores de
apoA-IV en niños celíacos estaban por debajo de los
controles, aunque no se encontraron diferencias significativas
entre grupos. Los datos se expresan como la media \pm SEM de
n individuos. Se aplicó el test Mann-Whitney
U. NS = no significativo.
| Celíacos | Controles | p-values | |
| n = 40 | n = 173 | ||
| ApoA-IV (mg/100ml) | 7.87 \pm 0.80 | 9.58 \pm 0.70 | NS |
| Triacilglicéridos (mg/100ml) | 89.53 \pm 6.81 | 55.93 \pm 2.54 | < 0.01 |
| Colesterol (mM) | 3.23 \pm 0.11 | 3.97 \pm 0.26 | < 0.01 |
El ensayo de Western blot de la
apoA-IV plasmática en niños celíacos en diferentes
momentos de su enfermedad se presenta en la Fig. 7. En la Fig. 7A
se cargaron muestras de plasma de un niño celíaco y otro control, y
80 ng de apoA-IV purificada. El niño celíaco en fase
activa de su enfermedad [con marcadores positivos en suero (+):
anticuerpos IgA-AGA y IgA-AEA]
tenía una marca de apoA-IV menos intensa comparada
con la del mismo niño alimentado con una dieta sin gluten
(\diameter), y significativamente más baja que las marcas de los
controles de su misma edad (Fig. 7B) (unidades arbitrarias de seis
individuos). Los símbolos de la Fig. 7 son los siguientes: C = niño
control; Ce = niño celíaco; [ + o + + 1 = niños celíacos en fase
activa con marcadores positivos en suero (anticuerpos
IgA-AGA y IgA-AEA ); [\diameter] =
los mismos niños celíacos pero alimentados con una dieta sin gluten
(celíacos tratados). En la Fig. 7B las unidades arbitrarias se
expresan como la media \pm SEM para n = 6 individuos (C
and Ce). Se aplicó el test de Mann-Whitney U (p <
0.01 * *, y p < 0.1 * son significativamente diferentes frente a
C).
Los bajos niveles de apoA-IV en
plasma encontrados mediante Western blot en niños celíacos revela
una alteración del metabolismo de dicha proteína, probablemente
relacionada con la atrofia de la mucosa intestinal y la
malnutrición en esos niños. Los niños celíacos de edades
comprendidas entre 1 y 6 años presentan alterado el metabolismo
lipídico caracterizado por una bajada de la concentración
plasmática de colesterol y apoA-IV y un aumento de
los triacilglicéridos en plasma. Estas alteraciones pueden estar
directamente relacionadas con la malabsorción y la malnutrición
asociadas a la enfermedad celíaca.
El Western blot de apoA-IV
plasmática en pacientes (diferente sexo y edad) nutridos
parenteralmente después de cirugía abdominal (resección del colon)
se presenta en la Fig. 8. Las muestras de plasma en cada paciente
fueron cargadas según la Fig. 8A. Los días de estudio fueron: tres
días antes de la cirugía (ayuno de noche anterior); durante la
intervención (con 24-48 h de ayuno); y 2, 4 y 7 días
después de la cirugía (recibiendo un aporte nutricional por vía
parenteral). La Fig. 8B muestra las unidades arbitrarias
cuantificadas como porcentaje respecto a la marca obtenida de un
control interno (plasma de un adulto sano ayunado de la noche
anterior) que se cargaba en el mismo gel. Estos resultados
mostraban claramente los sucesivos y profundos cambios
significativos en la marca de la apoA-IV plasmática
a lo largo de los días de alimentación parenteral a la que estaban
sometidos los individuos. Los símbolos de la Fig. 8A son los
siguientes: -3 = tres días antes de la cirugía; 0 = el mismo
momento de la intervención; + 2, + 4 , + 7 = 2, 4 y 7 días después
de la cirugía. En la Fig. 8B las unidades arbitrarias fueron
cuantificadas como el porcentaje respecto a la marca obtenida de un
control interno. Los datos se expresaron como la media \pm SEM de
n = 21 individuos. Se aplicó el test de Wilcoxon (p <
0.001 * * * significa que hay diferencias significativas respecto
los valores del preoperatorio del mismo paciente, -3).
Los resultados de la alimentación
parenteral-enteral en pacientes después de cirugía
abdominal (resección gástrica) se corresponden con los datos de la
Fig. 9. En la Fig. 9A se presentan los resultados del ensayo Western
blot de apoA-IV plasmática en sucesiva alimentación
parenteral-enteral de uno de dichos pacientes. Se
utilizaron los mismos criterios clínicos de selección que para los
pacientes del estudio de la Fig. 8. Los días de estudio fueron:
justo antes de la intervención quirúrgica (mínimo 18 horas de
ayuno); justo antes del inicio de la dieta oral (con tres días como
mínimo bajo alimentación parenteral); y después de cuatro días
recibiendo nutrición enteral (con exclusión de dieta grasa). En la
Fig. 9B se muestran la unidades arbitrarias cuantificadas como
porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno
(plasma de un adulto sano ayunado de la noche anterior) que se
cargaba en el mismo gel. Estos resultados mostraban claramente en
este grupo de individuos que hay un incremento de la marca cuando
la dieta cambia de parenteral a enteral en el mismo paciente. Los
símbolos de la Fig. 9A son los siguientes: 0 = justo antes de la
intervención quirúrgica; \diameter = justo antes del inicio de la
dieta oral y con 3-4 días bajo alimentación
parenteral; y 4 = cuatro días recibiendo sólo nutrición enteral. En
Fig. 9B las unidades arbitrarias fueron cuantificadas como el
porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno. Los
datos se expresan como media \pm SEM de n = 6
individuos.
Claims (17)
1. Método de diagnóstico de un desorden de la
función intestinal causado por un nivel anormal de masa absortiva
funcionalmente efectiva en un paciente dado, que comprende someter
muestras de suero y/o plasma de la sangre del paciente a un
inmunoensayo para determinar la cantidad de apolipoproteína humana
apoA-IV, donde dicho inmunoensayo conlleva un
anticuerpo específico contra la apoA-IV humana
obtenido a partir de una proteína seleccionada entre el grupo que
consiste en apoA-IV humana intestinal purificada,
una apoA-IV humana recombinante, y un fragmento
activo de proteína apoA-IV humana.
2. Método según la reivindicación 1, donde el
inmunoensayo es del tipo ELISA sandwich.
3. Método según la reivindicación 2, donde el
inmunoensayo ELISA sandwich conlleva el pretratamiento de la
muestra con un tampón clarificante que contiene
colesterol-esterasa pancreática.
4. Método según la reivindicación 1, donde el
inmunoensayo es un ensayo Western blot.
5. Método según la reivindicación 1, donde el
inmunoensayo es un ensayo de inmunodifusión.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde el desorden de la
función intestinal se selecciona entre el grupo que consiste en la
malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el
síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la
flatulencia.
7. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es la malabsorción.
8. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es la enfermedad celíaca.
9. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es la atrofia vellositaria.
10. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es el síndrome del intestino corto.
11. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es la diarrea crónica.
12. Método según la reivindicación 6, donde el
desorden intestinal es la flatulencia.
13. Kit in vitro para el diagnóstico de un
desorden de la función intestinal causado por un nivel anormal de
masa absortiva funcionalmente efectiva en un paciente dado, que
comprende: (i) un anticuerpo específico contra la
apoA-IV humana obtenido a partir de una proteína
seleccionada entre el grupo que consiste en apoA-IV
humana intestinal purificada, una apoA-IV humana
recombinante, y un fragmento activo de proteína
apoA-IV humana; y (ii) otros materiales y/o
componentes para determinar la cantidad de apolipoproteína
apoA-IV humana mediante inmunoensayo.
14. Kit según la reivindicación 13, donde el
inmunoensayo es del tipo ELISA sandwich.
15. Kit según la reivindicación 13, donde el
inmunoensayo es un ensayo Western blot.
16. Kit según la reivindicación 13, donde el
inmunoensayo es un ensayo de inmunodifusión.
17. Kit según la reivindicación 13, donde el
desorden de la función intestinal se selecciona entre el grupo que
consiste en la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia
vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y
la flatulencia.
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