ES2213359T3 - Materiales para el tratamiento de dolencias que implican mastocitos, basofilos y eosinofilos. - Google Patents
Materiales para el tratamiento de dolencias que implican mastocitos, basofilos y eosinofilos.Info
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Abstract
Utilización de un antagonista en la preparación de un medicamento para el tratamiento de dolencias mediadas por la liberación de IPGs procedentes de mastocitos, basófilos o eosinófilos, en donde el antagonista es: (a) una sustancia que es capaz de inhibir la liberación de los IPGs mediante la inhibición del enzima GPI-PLD; (b) una sustancia que es capaz de unirse específicamente a los IPGs y de inhibir la liberación de histamina provocada por los IPGs; o (c) una sustancia que es capaz de competir con los IPGs liberados de los mastocitos, basófilos o eosinófilos, pero que no provoca la estimulación alérgica de estos tipos de células.
Description
Materiales para el tratamiento de dolencias que
implican mastocitos, basófilos y eosinófilos.
La presente invención concierne a materiales y
procedimientos relacionados con el tratamiento de dolencias que
involucran a mastocitos, basófilos y eosinófilos y, en particular, a
inositolfosfoglicanos (IPGs), obtenibles a partir de mastocitos,
basófilos o eosinófilos y con las utilizaciones de antagonistas de
inositolfosfoglicano (IPG) en el tratamiento de dolencias mediadas
por la liberación de IPGs procedentes de mastocitos, basófilos o
eosinófilos, tales como alergias y asma.
La alergia afecta al veinte por ciento de la
población mundial y el alarmante incremento en su frecuencia,
morbilidad y mortalidad durante el transcurso de la última década ha
conducido a su designación como la primera enfermedad medioambiental
(Sutton and Gould, 1993). Los científicos han mostrado un creciente
interés en el mecanismo de la alergia y en los potenciales
beneficios derivados del descubrimiento de productos terapéuticos
para bloquear estos mecanismos.
El modelo tradicional de hipersensibilidad de
tipo uno (reacción alérgica aguda) conlleva la reticulación de los
receptores de IgE sobre basófilos y mastocitos, por parte del
antígeno. La reticulación conduce a un agrupamiento del receptor, a
la desgranulación de vesículas y a la liberación de mediadores
pre-formados, tales como la histamina. Además, se
generan mediadores recién formados, tales como prostaglandinas y
leucotrienos (Sampson et al., 1989). Esta reacción es rápida
y relativamente fácil de resolver con
anti-histamínicos y esteroides.
En determinados individuos, se observa una forma
de alergia más maligna después de la reducción de la reacción
alérgica aguda, caracterizada por un recrudecimiento de los síntomas
después de un período de 3 a 11 horas. Este tipo de reacción, la
Reacción de Ultima Fase (LPR), tiene lugar en enfermedades alérgicas
crónicas, tales como asma crónica y eczema (Kuna et al.,
1993). La LPR en la piel se caracteriza por edema y eritema (Solley
et al., 1976) y, en la nariz, por un incremento en la
resistencia del flujo de aire (MacLean et al., 1971). La
patogénesis de la LPR es compleja, escasamente entendida y difícil
de resolver con las terapias estándar disponibles en la
actualidad.
La investigación en le campo de la patogénesis de
la LPR reveló un incremento de ocho veces en la cantidad de
basófilos y una marcada ausencia del marcador habitual de
mastocitos, la prostaglandina 2. Se postuló, en consecuencia, que la
célula significativa en la LPR era el basófilo (Lichtenstein, 1988).
Durante los experimentos para averiguar la influencia del sistema
inmune sobre la función de los basófilos, se determinó que los
macrófagos cultivados producían un factor que afectaba a la
liberación de la histamina a partir de los basófilos humanos (Liu
et al, 1986) en ausencia de persistencia de antígeno
(Lichtenstein, 1988). Se repitió el experimento utilizando un factor
encontrado en fluidos procedentes de ampollas de piel en LPR
(MacDonald et al., 1995) y con lavados nasales procedentes de
tanto de individuos atópicos como de individuos no atópicos (Sim
et al., 1992), y se designó al factor como factor de
liberación de histamina (HRF).
Estudios experimentales subsiguientes averiguaron
que grupos de estudio, consistentes en aproximadamente el 50% de
individuos atópicos reaccionaban al HRF, si bien debía destacarse
que el porcentaje variaba en función de la naturaleza de la
enfermedad atópica (50% en rinitis atópica, comparado con el 70% en
asma atópica) (Fischer et al., 1987).
Se considera que muchas de las acciones de los
factores de crecimiento sobre células son mediadas por una familia
de segundos mensajeros de inositolfosfoglicano (IPG) (Rademacher
et al., 1994). Se considera que la fuente de IPGs es una
forma "libre" de glicosilfosfatidilinositol (GPI), situada en
las membranas celulares. Se cree que los IPGs son liberados por
medio de la acción de fosfolipasas específicas para
fosfatidilinositol, después de la unión de factores de crecimiento
con receptores sobre la superficie celular. Existe la evidencia de
que los IPGs median la acción de un gran número de factores de
crecimiento, incluyendo la insulina, el factor de crecimiento
nervioso, el factor de crecimiento de hepatocito, el factor de
crecimiento de tipo insulina I (IGF-I), el factor de
crecimiento de fibroblasto, el factor \beta de crecimiento
transformante, la acción de la Il-2 sobre linfocitos
B y linfocitos T, el señalamiento ACTH de células
corticosuprarrenales, la estimulación FSH y hCG de células
granulosas, la estimulación por tirotropina de células tiroideas, la
proliferación celular en el oído de desarrollo temprano y en
glándula mamaria de rata.
Se han obtenido fracciones de IPG solubles a
partir de una diversidad de tejidos animales, incluyendo tejidos de
rata (hígado, riñón, cerebro músculo, adiposa, corazón) e hígado
bovino. La actividad biológica de IPG ha sido también detectada en
RBC parasitizada con malaria y en micobacterias. Hemos dividido la
familia de segundos mensajeros de IPG en distintas subfamilias de
tipo A y P, en base a sus actividades biológicas. En la rata, se ha
demostrado que la liberación de mediadores de tipo A y P es
específica del tejido (Kunjara et al., 1995).
No obstante, hasta muy recientemente no resultaba
posible aislar componentes individuales purificados a partir del
tejido procedente de fracciones IPG, y mucho menos en cantidades
suficientes como para permitir la caracterización estructural. Por
consiguiente, los estudios del estado de la técnica estaban basados
en las actividades biológicas de las fracciones que contienen IPG y
las especulaciones al respecto de la identidad de los componentes
activos procedentes de fuentes no humanas de las fracciones, estaban
basadas en evidencia directa a partir de técnicas de marcado
metabólico y de rotura.
En sentido amplio, la presente invención está
basada en el hallazgo de que los IPGs pueden ser obtenidos a partir
de basófilos, eosinófilos y mastocitos y de que la estimulación por
medio de alérgenos de estas células da como resultado la liberación
de IPG. Los experimentos demuestran también que los IPGs son
segundos mensajeros para estimulación alérgica, mientras que la
adición de algunos tipos de IPGs purificados a células no
estimuladas por alérgenos daba como resultado la liberación de
histamina o desgranulación.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona un inositolfosfoglicano (IPG)
obtenible a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos, el cual
es capaz de provocar la liberación de histamina a partir de
mastocitos, basófilos o eosinófilos.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona la utilización de un inositolfosfoglicano (IPG), como el
obtenible a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos, el cual
es capaz de provocar la liberación de histamina a partir de
mastocitos, basófilos o eosinófilos, en un procedimiento de cribado
para antagonistas del citado IPG.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona la utilización de un antagonista de IPG en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de dolencias
mediadas por la liberación de IPGs a partir de mastocitos, basófilos
o eosinófilos, en donde el antagonista es una sustancia tal como se
define en la reivindicación 1.
En un nuevo aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para prevenir la liberación de IPGs a
partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos, comprendiendo el
procedimiento la exposición de mastocitos, basófilos o eosinófilos a
un antagonista de IPG.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento para tratar una dolencia mediada por la
liberación de IPGs procedentes de mastocitos, basófilos o
eosinófilos, comprendiendo el procedimiento la administración de una
cantidad eficaz de un antagonista de IPG a un paciente.
Preferiblemente, el antagonista de IPG actúa
específicamente sobre mastocitos, basófilos y/o eosinófilos. No
obstante, la actividad el antagonista puede ser proporcionada a
través de un determinado número de vías. En una realización, el
antagonista de IPG puede ser un anticuerpo capaz de unirse de manera
específica a IPGs, en particular a IPGs producidos por mastocitos,
basófilos o eosinófilos. Resulta preferido la utilización de
anticuerpos neutralizantes, por ejemplo de anticuerpos capaces de
neutralizar uno o más de las actividades de los IPGs sobre
mastocitos, basófilos o eosinófilos, por ejemplo, estimulando la
liberación de histamina.
De forma alternativa, los antagonistas de IPG
pueden actuar para inhibir o evitar la liberación de IPG en
mastocitos, basófilos o eosinófilos, por ejemplo, como respuesta a
un alérgeno. Un ejemplo de este tipo de antagonista lo constituye un
inhibidor específico del enzima GPI-PLD, el cual
está involucrado en la liberación de IPG a partir de la superficies
de los mastocitos, basófilos o eosinófilos, después de la
estimulación del alérgeno. Constituye un ejemplo adicional un
anticuerpo anti-GPI-PLD que actúa
para inhibir la liberación de IPG mediante la inhibición de la
rotura de los IPGs provocada por el enzima
GPI-PLD.
Mientras que la acción de IPGs es generalmente
específica de cada tejido, los IPGs procedentes de otros tejidos
pueden proporcionar una fuente de antagonistas competitivos para la
liberación de IPGs liberados a partir de mastocitos, basófilos o
eosinófilos, a saber, sustancias que compiten con los IPGs liberados
a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos pero que no
comparten su actividad en relación con los mastocitos, basófilos o
eosinófilos, por ejemplo, no provocan liberación de histamina. Un
ejemplo de este tipo de antagonista lo constituye el IPG de tipo A
de hígado de rata descrito en los ejemplos que siguen más adelante,
el cual, en combinación con un adyuvante (en este caso Ca^{2+})
antagonizaba la liberación de hexosaminidasa procedente de la línea
celular basófila RBL 2H3. Utilizando los ensayos descritos más
adelante pudieron cribarse otros IPGs en busca de actividad
antagonista de mastocitos, basófilos o eosinófilos.
En base a la descripción que se indica más
adelante, los expertos en la materia podrán preparar y cribar otros
antagonistas de IPG adecuados.
La presente invención resulta aplicable al
tratamiento de una banda de trastornos mediados por la liberación de
IPG a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos. Entre estos se
incluyen dolencias mediadas por los siguientes mediadores y
citoquinas, actuando los IPGs como segundos mensajeros para estos
mediadores o citoquinas:
- a)
- mediadores pre-formados, incluyendo histamina, HRF y proteasas neutras.
- b)
- Mediadores recién generados (a partir de lípidos), incluyendo prostaglandinas (PGD_{2}, PGF_{2}\alpha), tromboxanos y leucotrienos.
- c)
- Citoquinas, incluyendo IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF\alpha, INF\alpha, MIP 1\alpha/1\beta, antígeno de activación de linfocitos T.
- d)
- Otros mediadores, incluyendo PAF y RANTES.
Entre las dolencias que pueden ser evitadas o
tratadas utilizando los antagonistas IPG, se incluyen la dermatitis
atópica; la hipersensibilidad alimentaria; las alergias, incluyendo
la estacional, de contacto, frente a fármacos, al polen; las
alergias provocadas por insectos; el asma (tanto en fase inicial
como tardía); la neumonitis intersticial alérgica; el eczema; la
enfermedad pulmonar medioambiental; y otros trastornos mediados por
la infiltración de mastocitos, basófilos o eosinófilos o células
dentro de sus respectivos linajes.
Las realizaciones de la presente invención se
describirán ahora a través de ejemplos y no mediante limitación, con
relación a los gráficos que se acompañan.
La Figura 1 muestra que los IPGs obtenidos a
partir de la línea de células basófilas RBL 2H3 provocan la
liberación de histamina a partir de las células RBL 2H3. La Figura 1
muestra el % de liberación de histamina a partir de las células,
frente a la cantidad de IPG añadida.
La Figura 2 muestra que la respuesta de los
basófilos es específica de cada tejido, dado que los IPGs aislados a
partir de placenta humana no fueron capaces de provocar la
liberación de histamina (la hexosaminidasa liberada (eje y) es un
marcador sustituto de la liberación de histamina).
La Figura 3 muestra que el IPG de tipo P de
hígado de rata no tiene efectos sobre las células RBL 2H3. Por
contra, el IPG de tipo A de hígado de rata era capaz de bloquear
parte de la liberada espontáneamente. El efecto es específico, dado
que no se observó inhibición en ausencia de calcio (Figura 3, parte
baja).
La Figura 4 muestra resultados a partir de
experimentos para determinar el papel de GPI-PLD en
reacciones de hipersensibilidad de tipo uno.
Los estudios han mostrado que los mediadores de
tipo A modulan la actividad de un número de enzimas dependientes de
la insulina, tales como la proteína quinasa dependiente de
CAMP(inhibe), adenilato ciclasa (inhibe) y las
fosfodiesterasas cAMP (estimulan). Por contra, los mediadores de
tipo A modulan la actividad de los enzimas dependientes de insulina,
tales como la pirurato deshidrogenasa fosfatasa (estimula) y la
proteína quinasa dependiente de cAMP (inhibe). Los mediadores de
tipo A imitan la actividad lipogénica de la adenosina sobre los
adipocitos, mientras que los mediadores de tipo P imitan la
actividad glicogénica de la insulina sobre el músculo. Tanto los
mediadores de tipo A como los de tipo P son mitogénicos cuando son
añadidos a fibroblastos en medio libre de suero. La capacidad de los
mediadores para estimular la proliferación de fibroblastos se ve
reforzada si las células son transfectadas con el
receptor-EGF. Los mediadores de tipo A pueden
estimular la proliferación celular en ganglios cocleovestibulares de
pollitos (CVG).
Se han obtenido fracciones solubles de IPG con
actividad de tipo A y de tipo P, a partir de una diversidad de
tejidos animales, incluyendo tejidos de rata (hígado, riñón, cerebro
músculo, adiposa, corazón) e hígado bovino. Se ha detectado también
una actividad biológica de IPG de tipo A y de tipo P en el hígado
humano y en la placenta, en RBC parasitizada con malaria y
micobacterias. La capacidad de un anticuerpo
anti-inositolglicano policlonal para inhibir la
acción de la insulina sobre los citotrofoblastos y miocitos BC3H1 o
la acción de IPG procedente de bovino sobre el diafragma de rata
sugiere la conservación especie cruzada de muchas características
estructurales. No obstante, es importante destacar que si bien el
estado de la técnica incluye estos informes de actividad de IPG de
tipo A y de tipo P en algunas fracciones biológicas, la purificación
o la caracterización de los agentes responsables para la actividad
no se describen.
Las sustancias de tipo A son carbohidratos que
contienen ciclitol, las cuales contienen también ión Zn^{2+} y,
opcionalmente, fosfato y que tienen las propiedades de regulación de
actividad lipogénica y de inhibición de la proteína quinasa
dependiente de cAMP. Las mismas pueden inhibir también al adeniolato
ciclasa, ser mitogénicas cuando son añadidas a fibroblastos
transfectados por EGF en medio libre de suero, y estimular la
lipogénesis en adipositos.
Las sustancias de tipo P son carbohidratos que
contienen ciclitol, conteniendo también iones Mn^{2+} y/o
Zn^{2+} y, opcionalmente, fosfato y que tienen las propiedades de
regulación del metabolismo de glicógeno y de activación de piruvato
deshidrogenasa fosfatasa. Pueden también estimular la actividad de
glicógeno sintasa fosfatasa, ser mitogénicas cuando se añaden a
fibroblastos en medio libre de suero y de estimulación de piruvato
deshidrogenasa fosfatasa.
En Caro et al., 1997 y en WO98/11116 y
WO98/11117 se describen procedimientos para la obtención de IPGs de
tipo A y de tipo P.
Tal como se ha indicado anteriormente en la
presente invención, entre los antagonistas IPG se incluyen
sustancias que presentan una o más de las siguientes
propiedades:
- a)
- sustancias capaces de inhibir la liberación de IPGs a partir de mastocitos o basófilos, por ejemplo, en respuesta a un alérgeno;
- b)
- sustancias capaces de reducir el nivel de IPGs liberados a partir de mastocitos, basófilos y eosinófilos, a través de unión específica a los citados IPGs, y/o;
- c)
- sustancias capaces de reducir los efectos de IPGs liberados a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos, por ejemplo, sustancias que compiten con los IPGs obtenidos a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos, pero que no provocan estimulación alérgica de estos tipos de células.
En una realización, los antagonistas de IPG
pueden actuar para prevenir la liberación de IPG en mastocitos,
basófilos o eosinófilos, por ejemplo, en respuesta a un alérgeno. Un
ejemplo de este tipo de antagonista es un inhibidor del enzima
GPI-PLD, el cual esta involucrado en la liberación
de IPG desde la superficie de los mastocitos, basófilos o
eosinófilos, después de la estimulación por alérgeno. Otro inhibidor
es un anticuerpo anti-GPI-PLD, el
cual actúa para prevenir la liberación de IGP por medio de la
inhibición de la rotura de los IPGs provocada por el enzima
GPI-PLD.
Alternativamente, el antagonista IPG puede ser
un anticuerpo capaz de unirse específicamente a IPGs, por ejemplo,
para reducir los niveles de IPG en un paciente. Preferiblemente, los
anticuerpos son capaces de unirse específicamente a IPGs producidos
por mastocitos, basófilos o eosinófilos. La utilización de
anticuerpos neutralizadores resulta preferida, por ejemplo, de
anticuerpos que sean capaces de neutralizar la actividad de los IPGs
que provocan la liberación de histamina a partir de mastocitos,
basófilos o eosinófilos. Son ejemplos de anticuerpos monoclonales
capaces de unirse específicamente a IPGs, los anticuerpos producidos
por las líneas celulares de hibridoma 2F7, 2D1 y 5H6, depositados en
la European Collection of Cell Cultures (ECACC), bajo números de
acceso 98051201, 98031212 y 98030901. Los protocolos para la
obtención de anticuerpos monoclonales y anticuerpos
anti-IPG se exponen más adelante.
Dado que la actuación de los IPGs es, en general,
específica de cada tejido, los IPGs obtenidos a partir de otros
tejidos pueden proporcionar una fuente de antagonistas competitiva a
los IPGs liberados a partir de mastocitos, basófilos o eosinófilos.
Un ejemplo de este tipo de antagonista lo constituye el IPG de tipo
A de hígado de rata descrito en los ejemplos que se indican más
adelante, el cual, en combinación con un adyuvante (en esta caso,
Ca^{2+}) antagonizaba la liberación de hexosaminidasa procedente
de la línea celular basófila RBL 2H3. Productos químicos sintéticos
pueden actuar también como antagonistas de IPG. Se describen más
adelante IPGs de tipo A y P, adecuados para cribado, para ser
utilizados como antagonistas competitivos. Entre los análogos de IPG
sintéticos se incluyen el compuesto C3,
1D-6-O-(2-amino-2-desoxi-\alpha-D-glucopiranosil)-mio-inositol-1,2-(ciclofosfato),
preparado según Zapata et al, 1994, y el compuesto C4,
1D-6-O-(2-amino-2-desoxi-\alpha-D-glucopiranosil)quiro-inositol-1-fosfato,
preparado según Jaramillo et al, 1994.
En una realización, los anticuerpos son
antagonistas IPG útiles que pueden ser utilizados en la presente
invención. Los protocolos para obtener anticuerpos
anti-IPG se indican más adelante. No obstante, los
anticuerpos depositados u otros anticuerpos preparados utilizando
los protocolos indicados más adelante pueden ser sometidos a las
técnicas de tecnología de DNA recombinante para producir otros
anticuerpos o moléculas quiméricas que conservan la especificidad
del anticuerpo original. Las citadas técnicas pueden conllevar la
introducción de DNA que codifica para la región variable de
inmunoglobulina, o las regiones de determinación complementaria
(CDRs), de un anticuerpo para las regiones constantes, o regiones
constantes además de regiones marco, de una inmunoglobulina
diferente. Ver, por ejemplo, EP0184187A,
GB-A-2188638 ó EP0239400A. Un
hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal puede ser sometido a
mutación genética o a otros cambios, los cuales pueden o no alterar
la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Los anticuerpos pueden ser obtenidos utilizando
técnicas consideradas estándar. Entre los procedimientos para la
producción de anticuerpos se incluye la inmunización de un mamífero
(por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con
la proteína o un fragmento de la misma. Los anticuerpos pueden ser
obtenidos a partir de animales inmunizados utilizando cualquiera de
entre una diversidad de técnicas conocidas y cribando, utilizando
preferiblemente la unión de anticuerpo al antígeno de interés. Por
ejemplo, puede utilizarse la técnica de las manchas Western o la
inmunoprecipitación (Armitaje et al., Nature,
357:80-82, 1992). El aislamiento de anticuerpos y/o
de células productoras de anticuerpos a partir de un animal puede
estar acompañado de un paso de sacrificio del animal.
Como una alternativa o suplemento a la
inmunización de un mamífero con un péptido, puede obtenerse un
anticuerpo específico para una proteína a partir de una biblioteca
obtenida de manera recombinante de dominios variables de
inmunoglobina expresada, por ejemplo, utilizando bacteriófago lambda
o un bacteriófago filamentoso que despliega dominios de unión de
inmunoglobulina funcionales sobre sus superficies; por ejemplo, ver
WO92/01047. La biblioteca puede ser simplista, es decir construida a
partir de secuencias obtenidas a partir de un organismo que no ha
sido inmunizado con cualquiera de las proteínas (o fragmentos), o
puede ser una construida utilizando secuencias obtenidas a partir de
un organismo que ha estado expuesto al antígeno de interés.
Los anticuerpos según la presente invención
pueden ser modificados de diferentes maneras. Ciertamente, el
término "anticuerpo" debería ser construido como cubriendo
cualquier sustancia de unión que tenga un dominio de unión con la
especificidad requerida. Por lo tanto, la invención cubre fragmentos
de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de
anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma
imita la de un anticuerpo que permite su unión a un antígeno o
epítopo.
Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo
capaces de unirse a un antígeno u a otro elemento de unión se
encuentra el fragmento Fab que comprende los dominios VL, VH, C1 y
CH1; el fragmento Fd que comprende los dominios VH y CH1; el
fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de un solo brazo de
un anticuerpo; el fragmento dAb, que comprende un dominio VH;
regiones CDR aisladas y fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento
bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos a través de un
puente disulfuro en la región bisagra. Se incluyen también
fragmentos Fv de cadena sencilla.
Se encuentran también incluidos dentro de la
presente invención, los anticuerpos humanizados en los cuales CDRs
procedentes de una fuente no humana son injertados en regiones marco
humanas, habitualmente con la alteración de alguno de los restos
aminoácido, para proporcionar anticuerpos que son menos
inmunogénicos que los anticuerpos no humanos padres.
Un hibridoma productor de un anticuerpo
monoclonal, según la presente invención, puede estar sometido a
mutación genética o a otros cambios. Los expertos en la materia
entenderán que un anticuerpo monoclonal puede ser sometido a
técnicas de DNA recombinantes para producir otros anticuerpos o
moléculas quiméricas, las cuales conservan la especificidad del
anticuerpo original. Las citadas técnicas pueden conllevar la
introducción de DNA que codifique para la región variable de
inmunoglobulina o las regiones determinantes de la complementariedad
(CDRs), de un anticuerpo para las regiones constantes, o regiones
constantes además de las regiones marco, de una inmunoglobulina
diferente. Ver, por ejemplo, EP 0184187 A,
GB-A-2188638 o EP 0239400A. El
clonado y la expresión de anticuerpos quiméricos se describe en la
EP 0125023 A.
Los hibridomas capaces de producir anticuerpos
con las características de unión deseadas se encuentran dentro del
campo de la presente invención, al igual que lo están las células
huésped, eucariotas o procariotas, que contienen ácidos nucleicos
que codifican para anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo)
y que son capaces de su expresión. La invención proporciona también
procedimientos de producción de anticuerpos, incluyendo el cultivo
de una célula capaz de producir el anticuerpo en condiciones en las
cuales el anticuerpo es producido y, preferiblemente, secretado.
Los IPGs y los antagonistas de IPG de la
invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas.
Estas composiciones pueden comprender, además de uno o más de los
mediadores o antagonistas, un excipiente farmacéuticamente
aceptable, un soporte, un tampón, un estabilizador u otros
materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Los
citados materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del soporte o
de otros materiales puede depender de la vía de administración, por
ejemplo, la ruta oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal,
intramuscular e intreperitoneal.
Las composiciones farmacéuticas para
administración oral pueden adoptar la forma de comprimidos,
cápsulas, polvo o líquido. Un comprimido puede incluir un soporte
sólido, tal como gelatina, o un adyuvante. Las composiciones
farmacéuticas liquidas incluyen generalmente un soporte líquido, tal
como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o
aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica,
dextrosa u otras soluciones sacáridas o glicoles, tales como
etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea
o para inyección en el punto de dolor, el ingrediente activo se
encontrará en una forma de solución acuosa aceptable
parenteralmente, la cual esté exenta de pirógenos y tenga un pH, una
isotonicidad y una estabilidad adecuadas. Los expertos en la materia
serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por
ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro
sódico, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. En caso
necesario pueden también incluirse conservantes, estabilizadores,
tampones, antioxidantes y/o otros aditivos.
Ya se trate de un polipéptido, de un anticuerpo,
de un péptido, de una molécula pequeña o de otro compuesto
farmacéutico útil según la presente invención lo que tenga que ser
suministrado a un individuo, la administración se aplica
preferiblemente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o
"cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, si bien
la profilaxis puede ser considerada como terapia), siendo esta
suficiente para aportar beneficios al individuo. La cantidad real
administrada y la frecuencia y pauta de administración dependerá de
la naturaleza y de la gravedad de lo que esté siendo tratado. La
prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones de
dosificación, etc, pertenece al ámbito de responsabilidad de los
médicos y habitualmente se basa en el trastorno que esté siendo
tratado, en el estado en el que se encuentra el paciente, en el
punto de suministro, el procedimiento de administración y otros
factores conocidos por los médicos. En Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16Th edition, Oslo, A. (ed.), 1980, pueden encontrarse
ejemplos de las técnicas y de los protocolos mencionados
anteriormente.
Una composición puede ser administrada en
solitario o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma
simultánea o secuencial, en función de la dolencia que tenga que ser
tratada. Muchas de las dolencias que pueden ser tratadas utilizando
la invención están basadas en reacción a alérgenos. Por lo tanto, el
tratamiento propuesto en el presente documento podría ser combinado
con tratamientos conocidos para estas dolencias.
Para inmunizar a conejos New Zealand y a ratones
Balb/c, tal como se describe más adelante, se utilizó
inositolfosfoglicano (forma soluble), obtenido por medio de
tratamiento PI-PLC de GPI purificado procedente de
hígado de rata, a través de cromatografía de capa fina (TLC).
Alternativamente, IPGs humanos o los obtenidos a partir de otras
especies pueden ser obtenidos utilizando los procedimientos
descritos en Caro et al., 1997.
Dos conejos New Zealand fueron anestesiados y
después inmunizados con 750 \mug de IPG (forma soluble), mezclados
en 1 ml de PBS con 1 ml de adyuvante completo de Freund (CPA). La
emulsión antígeno-adyuvante fue administrada a razón
de 1,5 ml a través de inyección intradérmica (id) y 0,5 ml por medio
de inyección intramuscular (im). Transcurrido un mes, se repitió
este protocolo, con la excepción de que se utilizó adyuvante
incompleto de Freund (IFA), a razón de 1,5 ml a través de inyección
subcutánea (sc) y 0,5 ml por medio de inyección intramuscular (im).
Esto fue repetido de nuevo a los 60, 90, 120 y 150 días.
Cuatro ratones hembra Balb/c de 6 semanas de edad
fueron inmunizados con 60 \mug de IPG (forma soluble) en 250
\mul de PBS con 250 \mul de CFA. La emulsión
antígeno-adyuvante fue inyectada a través de
inyección intraperitoneal (ip). Después de 21 días, se repitió la
inyección con la excepción de que se utilizó IFA. A los 42 y a los
63 días, todos los animales recibieron una inyección ip de IFA. En
el día 84, el que presentó una mejor respuesta fue inyectado con
100 \mul de PBS conteniendo 60 \mug de UIPG, por vía
intravenosa (iv), y 100 \mul de PBS conteniendo 60 \mug de
IPG(ip). Después de 87 días, los esplenocitos procedentes del
que presentó mejor respuesta fueron fusionados con células de
mieloma, utilizando técnicas convencionales. Se efectuaron pruebas
sanguíneas de monitorización de forma regular.
La extracción de HNMT se llevó a cabo tal como se
discute en Verburg et al., 1983, utilizando tejido de riñón
de rata Wistar macho, no sometida a experimentación con
anterioridad. Este tejido fue homogeneizado con solución de sucrosa
0,25M (1:3 volumen/peso) y centrifugado a 40.000G por espacio de 15
minutos. Se recogió el sobrenadante y se ajustó a pH 5,0 utilizando
solución de ácido acético 2M. Se llevó a cabo una segunda
centrifugación, a 40.000G por espacio de 10 minutos y el
sobrenadante fue ajustado a pH 7,0 utilizando hidróxido amónico 1M.
Se añadió hidróxido amónico sólido (0,54 g por ml), para
proporcionar una solución saturada al 82%., la cual fue agitada
enérgicamente antes de ser sometida a centrifugación a 40.000G por
espacio de 15 minutos. El precipitado fue resuspendido en tampón
fosfato potásico 25mM frío, conteniendo EDTA 0,1mM (pH7,5) (0,44 ml
de tampón por mg de tejido original). Se llevó a cabo diálisis
durante el transcurso de la noche frente al tampón de resuspensión y
el producto enzimático fue almacenado a -20ºC durante el tiempo
necesario. Se llevaron a cabo ensayos de histamina para analizar la
actividad enzimática del producto.
El ensayo de detección de histamina se basa en la
transferencia (metilación) del grupo 3H a partir de [^{3}H]
S-adenosilmetionina ([^{3}H]SAME) a
histamina, a través del enzima HNMT, para formar
N-\pi-metilhistamina tritiada,
Verburg et al, 1983. El ensayo de detección de histamina fue
llevado a cabo tal como se anticipa en Gitomer and Tipton, 1986,
utilizando 0,1 \muCi de [^{3}H]
S-adenosil-metionina,
S-adenosil-metionina 2mM en un
volumen de reacción total de 100 \mul. La reacción se inició con
la adición de enzima y se incubó a 37ºC por espacio de 30 minutos,
finalizando con la adición de solución de borato sódico al 7%, pH
10,6. La histamina tritiada fue extraída utilizando tolueno :alcohol
isoamilo (1:1 v/v) y 800 \mul de la fase acuosa fueron añadidos a
2 ml de Ultima Gold. La radioactividad fue detectada a través de
escintilografía.
La separación en columna se efectuó tal como se
discute en Verburg et al, 1983, utilizando tampones de
fosfato de potasio que contienen EDTA 0,1 MM (pH 7,5). Se llevó a
cabo separación con DEAE Cellulose utilizando tampones 100 mM y 750
mM, seguida de separación sobre fenil Sepharose, con elución
utilizando tampones 400 mM y 10 mM. La totalidad de procedimientos
cromatográficos se llevaron a cabo utilizando tampones purgados con
gas para reducir la inactivación oxidativa del enzima y las
fracciones fueron mantenidas en hielo. El contenido proteínico de
las fracciones eluídas fue averiguado a través de espectrofotometría
a 280 nm de longitud de onda y tan solo aquellas fracciones con el
valor más elevado fueron conservadas para estudio.
A través de la utilización del sistema de
reactivo para ensayo de proteína Coomassie Plus (SIGMA), se
averiguaron las concentración de proteína de una manera ajustada y
se compararon con estándares BSA.
Este ensayo fue realizado tal como se describe en
Yasuda et al., 1995. Se añadió una alícuota de sobrenadante
celular a
p-nitrofenil-acetil-\beta-D-glucosamina
10 mM, mantenida en tampón citrato 0,1 M a pH 4,0. Las muestras
fueron incubadas a 37ºC por espacio de 30 minutos y la reacción
terminó con la adición de tampón glicina 0,4M, pH 10,6. El color
generado fue detectado a través de espectrofotometría, a una
longitud de onda de 405 nm, en un lector ELISA.
La IL-4 fue detectada utilizando
el equipo de detección de IL-4 Duost (Genzyme
Diagnostics). El procedimiento de detección fue llevado a cabo según
las instrucciones del fabricante. La totalidad de volúmenes
sugeridos fue dejada en la mitad para maximizar la utilización
económica de los reactivos proporcionados.
La línea celular RBL-2H3 fue
cultivada a los efectos de que los ensayos de detección pudieran ser
optimizados sin necesidad de retirar la sangre humana. Las células
fueron cultivadas según Gilfillan et al, 1992. Brevemente,
las células fueron mantenidas en Eagles Modified Essential Medium,
suplementado con FCS inactivado un 10% por calor, 100 unidades/ml
de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina/gentamicina y
L-glutamina 2mM a 37ºC en una atmósfera humidificada
de un 95% de aire y 5% de dióxido de carbono. La división celular se
logró utilizando depuradores celulares.
Con anterioridad a la realización de los
experimentos para determinar la variación en la liberación de
mediador después de la activación, resultó necesario determinar la
concentración total de cada uno de los mediadores por célula. Esto
permitió que la liberación de mediador pudiera ser expresada en
forma de porcentaje de la capacidad total de las células. Estas
determinaciones fueron logradas mediante lisis celular. Se
optimizaron tres procedimientos de lisis:
- (1)
- lisis por Triton: incubación con Triton X-100, 1-10%, con una duración de entre 15 y 90 minutos.
- (2)
- Lisis por calor: incubación a 85ºC, por espacio de entre 2 y 15 minutos.
- (3)
- Lisis por congelación: incubación a -20ºC por espacio de 30 minutos.
La eficacia de la lisis fue determinada por medio
de microscopía y los mediadores fueron detectados tal como se
indica.
La reticulación IgE fue llevada a cabo tal como
se describe por Gilfillan et al., 1992. Se cultivaron células
RBL-2H3 hasta confluencia y después fueron
recolocadas en una placa de 6 pocillos, a una densidad de 1x10^{6}
células por pocillo. Las células fueron cultivadas durante el
transcurso de una noche en medio suplementado conteniendo IgE
anti-DNP, lavadas dos veces con medio y una vez con
tampón HEPES (cloruro sódico 137mM; cloruro potásico 2,7mM; fosfato
disódico 0,4mM; glucosa 5,6mM; HEPES 10mM; cloruro cálcico 1,8mM;
sulfato de magnesio 1,3mM, pH 7,4). La liberación de mediador fue
desencadenada por la adición de DNP-HSA (10 ng/ml)
diluido en tampón y se efectuó incubación por espacio de 30 minutos.
La liberación de mediador fue detectada a partir del sobrenadante,
tal como se discute en la sección 2.
Se llevaron a cabo experimentos para averiguar la
concentración de anticuerpo IgE anti-DNP y
DNP-HSA para alcanzar la óptima liberación de
mediador.
Se llevó a cabo una extracción de basófilos
cruda, en base a la sedimentación de dextrano, tal como se describe
en Pruzansky and Patterson, 1981. Brevemente, se obtuvo sangre a
través de venopunción y se añadió EDTA (pH 7,5) hasta una
concentración final de 25 mM. Se añadió Dextran 70, hasta una
concentración final del 6% y se dejo sedimentar la mezcla. La capa
más elevada, conteniendo leucocitos, se extrajo y fue centrifugada a
200g por espacio de 12 minutos. El pellet celular fue lavado con
solución salina tamponada (cloruro sódico 140 mM y HEPES 10 mM, pH
7,4) y se resuspendió en HEPES AGM (HEPES 25mM, cloruro sódico 110
mM; cloruro potásico 5 mM; cloruro cálcico 2 mM; cloruro magnésico
1mM y sueroalbúmina humana 0,3 mg/ml, pH 7,4).
Se llevó a cabo un teñido con azul anciano, tal
como se discute en Gilbert and Ornstein, 1975. En resumen, 100
\mul de suspensión celular fueron diluidos con 400 \mul de EDTA
al 0,1% en solución salina, 450 \mul de solución de teñido
(cloruro de piridinio 0,076%, cloruro de lantano.6H_{2}O 0,7%,
cloruro sódico 0,9%, Tween 20, 0,21%; azul de alciano 8GN en agua
desionizada 0,143%, filtrados a través de un filtro de 1 \mul) y
50 \mul de ácido clorhídrico 1M. Después de agitación suave, las
células fueron contadas en un Haemocytometer
Fuchs-Rosenthal.
La estandarización de los experimentos precisó la
utilización de los mismos basófilos en cada uno de los casos. Por
consiguiente, resultó necesario eliminar sus IgE nativas y absorber
IgE alternativa sobre la superficie. La IgE unida a la superficie
fue disociada a partir de basófilos mediante la utilización del
procedimiento de elución con ácido láctico descrito por Sampson
et al, 1989. Los leucocitos fueron peletizados y
resuspendidos en 5 ml de solución de ácido láctico (ácido láctico
0,01M, cloruro sódico 110 mM, cloruro de potasio 5 mM, pH 3,9). La
suspensión fue incubada a 23ºC durante un período de tres horas y
media, transcurrido el cual el ácido láctico fue diluido con 30 ml
de tampón PIPES (PIPES 25 mM, cloruro sódico 110 mM, cloruro
potásico 5 mM, sueroalbúmina humana 0,03%,
D-glucosa, 0,1%, pH 7,4).
El procedimiento de sensibilización pasiva estaba
basado en lo descrito en Pruzansky et al., 1981 y en Levy and
Osler, 1966. Las células fueron incubadas con 250 ng de IgE por
millón de basófilos, a 37ºC y por espacio de 60 minutos.
Con anterioridad a efectuar una incubación a 37ºC
por espacio de 45 minutos en un bloque de calentamiento, se efectuó
una dilución en serie de 1 a 10 de HRF. El mediador elegido para el
estudio fue la \beta-hexosaminidasa.
La inactivación de la actividad de
GPI-PLD en suero bovino fetal se logró según el
procedimiento de Kung et al (Biochimica et Biophysica Acta,
1997, 1357, 329-338).
Brevemente, el FCS se ajustó a pH 11 utilizando
ácido clorhídrico concentrado y se incubó por espacio de 1 hora a
37ºC. Transcurrido este período, el pH se ajustó a 7,4 y se
determinó la actividad GPI-PLD utilizando un ensayo
enzimático (Davitz et al., 1989).
Con vistas a averiguar de que forma este suero
afectaba a la función de las células RBL-2H3, el FBS
en el medio de cultivo fue sustituido por suero inactivo y las
células fueron cultivadas del modo normal.
Las células RBL-2H3 fueron
cultivadas hasta confluencia, después de lo cual las células
adherentes fueron extraídas del recipiente de cultivo utilizando un
depurador celular. Se determinó la densidad celular, utilizando un
hemocitómetro, ajustándose a 2 x 10^{5} por ml. Las células fueron
sembradas a razón de 1 ml por pocillo en placas de cultivo de 24
pocillos y cultivadas durante el transcurso de una noche a 37ºC, con
un incubador con 5% de CO_{2} humidificado.
El medio de cultivo utilizado durante la noche
fue aspirado y sustituido por medio fresco conteniendo
anti-DNP IgE de rata a razón de 3 \mug/ml.
Transcurridas 2 horas de incubación, el medio fue aspirado y las
células lavadas dos veces con solución salina tamponada HEPES. La
reticulación se logró a través de la adición de 200 \muls de
DNP-Albúmina a razón de 100 ngs/ml (diluida en
HEPES AGM) y de incubación por espacio de 2 horas. La liberación
del contenido de mediador total de las células se logró mediante la
incubación con 200 \muls de detergente Triton
X-100 al 5%. Además, las células fueron estimuladas
para liberar, utilizando el ionóforo cálcico A23187.
La liberación de mediador fue determinada
utilizando un ensayo colorimétrico para detectar la presencia de
\beta-hexosaminidasa y se comparó con el
contenido de \beta-hexosaminidasa celular total
(Yasuda et al, Int. Inmmunol., 1995).
La Figura 1 muestra que los IPGs obtenidos a
partir de una línea células RBL 2H3 basófila provocan la liberación
de histamina a partir de las células RBL 2H3. El IPG derivado de
basófilo fue obtenido a través de reticulación de los receptores de
IgE sobre la superficie de las células RBL 2H3, lo cual estimula la
interacción de un alérgeno con el basófilo. Específicamente, las
células RBL 2H3 fueron sensibilizadas con IgE
anti-DNP (la cual se une a los receptores de IgE
presentes en la superficie basófila) y después de produjo el
desencadenamiento con el antígeno DNP-HSA. Este
desencadenamiento de antígeno (DNP-HSA) da como
resultado la liberación de histamina. Los sobrenadantes del cultivo
fueron extraídos y la Figura 1 muestra que:
- (a)
- La IPG podía ser obtenida a partir de los sobrenadantes y que la estimulación del alérgeno da como resultado la liberación de IPG.
- (b)
- Los IPGs purificados cuando son añadidos a células no estimuladas con alérgeno daban como resultado la liberación de histamina, indicando que la IPG era el segundo mensajero para la estimulación alérgica.
La Figura 2 muestra que la respuesta es
específica de cada tejido, dado que los IPGs aislados a partir de
placenta humana no fueron capaces de provocar la liberación de
histamina (la liberación de hexosaminidasa (eje y) es un marcador
sustituto para la liberación de histamina).
La Figura 3 muestra que el IPG de tipo P de
hígado de rata no desarrolla efectos sobre las células RBL 2H3. Por
el contrario, el IPG de tipo A de hígado de rata fue capaz de
bloquear parte de la liberación espontánea. El efecto es específico,
dado que no se observó inhibición en ausencia de calcio (Figura 3,
parte baja).
Se examinó después el papel de
Glycosilfosfatidil-inositol Fosfolipasa D
(GPI-PLD) en la reacción de hipersensibilidad de
tipo uno. La ración conlleva la reticulación de receptores IgE sobre
la superficie de los mastocitos, conduciendo a la liberación de
mediadores alérgicos y puede ser reproducida experimentalmente
utilizando la línea celular de leucemia basófila de rata, RBL 2H3.
Estas células, de forma natural, no han ocupado los receptores IgE
(Fc\varepsilonR1, o receptores de elevada afinidad), permitiendo
que los mismos fueran sensibilizados pasivamente con un isotipo IgE
de elección. La reacción alérgica puede ser mimetizada a través de
reticulación de la IgE.
Investigaciones anteriores indican que las
células RBL 2H3 obtienen su GPI-PLD a partir del
suero de cultivo (datos no mostrados). Por consiguiente, se deduce
que la inactivación de esta fuente externa de
GPI-PLD privaría a las células de cualquier nuevo
enzima.
Los resultados indican que el tratamiento
alcalino de FBS perjudicaba gravemente la actividad de
GPI-PLD en suero (datos no mostrados).
Cuando en el medio de cultivo se utilizó suero
inactivo, el aspecto de las células no resultaba alterado en gran
manera, si bien su adherencia parecía resultar ligeramente reducida.
No obstante, las células perdían rápidamente su capacidad de
liberación de mediadores, después de la reticulación del receptor de
FceR1 sobre la superficie de la célula, o después de la estimulación
con A23187 (Figura 4b). La pérdida de actividad era de
aproximadamente la mitad, cuando se comparaba con la liberación a
partir de células que eran cultivadas normalmente (Figura 4a).
Con vistas a averiguar si estas células
"inactivas" había resultado dañadas de manera irreparable a
través de incubación en el FBS tratado alcalinamente, las células
fueron transferidas de nuevo al medio en el cual el FBS no había
resultado alterado. Cuando las células son depuradas a baja
densidad, dejadas ganar confluencia y después utilizadas en los
experimentos de estimulación, las células volvían a ganar
parcialmente su capacidad de respuesta tanto a la reticulación
Fc\varepsilonR1 como a la estimulación A23187 (Figura 4c). Esto
indica que las células no han sido dañadas de manera irreparable por
sus condiciones de cultivo modificadas.
El tratamiento alcalino de la FBS parece afectar
a la función de un componente del suero que es esencial en la
liberación de mediadores procedentes de células
RBL-2H3, después de la estimulación utilizando dos
procedimientos.
Si bien el ensayo de GPI-PLD
indicaba una pérdida de actividad del enzima, y de que se ha
sugerido que este enzima desempeña un papel importante en la función
basófila, resulta altamente probable que existan otros componentes
del suero que resulten afectados por las condiciones alcalinas. Es
ampliamente sabido que, por ejemplo, el crecimiento del factor
TGF-\beta resultaría activado a través de este
tratamiento.
Los resultados que sugieren que la estimulación
de basófilos por parte de ionóforo resulta afectada por este
componente del suero pueden también conllevar la reducción de
GPI-PLD en este procedimiento. Hemos averiguado lo
siguiente: la reducción de GPI-PLD da como resultado
una disminución en la expresión de caveolina, un importante
componente de los caveolos; se sabe que la acción ionófora y la
absorción de calcio tienen lugar en los caveolos.
El deposito de hibridomas 2F7, 2D1y 5H6 en apoyo
de esta solicitud fue efectuado en la European Collection of Cell
Cultures (ECACC), de acuerdo con el Tratado de Budapest, por
Rademacher Group Limited (RGL) (antiguamente Hoeft Rademacher
Limited), The Windeyer Building, 46 Cleveland Street, London W1P
6DB, UK. A los depósitos, se les ha asignado los números de acceso
98051201, 98031212 y 98030901. RGL autoriza a la University College
London a que haga referencia a los materiales depositados en esta
solicitud y tanto RGL como la University College London prestan su
consentimiento irrevocablemente y sin reservas a que los materiales
estén a disposición del público, según la ley nacional relevante que
rige el depósito de estos materiales, tales como las reglas 28 y 28a
del EPC. Se solicita también la solución de experto contemplada en
la Regla 28(4) del EPC.
Las referencias mencionadas en el presente
documento son incorporadas en su totalidad.
WO98/11116 y WO98/11117 (Rademacher Group
Limited).
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Claims (11)
1. Utilización de un antagonista en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de dolencias
mediadas por la liberación de IPGs procedentes de mastocitos,
basófilos o eosinófilos, en donde el antagonista es:
- (a)
- una sustancia que es capaz de inhibir la liberación de los IPGs mediante la inhibición del enzima GPI-PLD;
- (b)
- una sustancia que es capaz de unirse específicamente a los IPGs y de inhibir la liberación de histamina provocada por los IPGs; o
- (c)
- una sustancia que es capaz de competir con los IPGs liberados de los mastocitos, basófilos o eosinófilos, pero que no provoca la estimulación alérgica de estos tipos de células.
2. Utilización de la reivindicación 1, en donde
la dolencia mediada por la liberación de IPGs es dermatitis atópica;
hipersensibilidad a los alimentos; alergias, incluyendo la
estacional, de contacto, a fármacos, al polen; alergias a insectos;
asma (en fase inicial o tardía), neumonitis intersticial alérgica,
eczema, enfermedad pulmonar medioambiental u otros trastornos
mediados por infiltración de mastocitos, basófilos o eosinófilos o
células dentro de sus respectivos linajes.
3. Utilización de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en donde el antagonista de IPG es un anticuerpo
anti-IPG.
4. Utilización de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en donde el antagonista de IPG es una sustancia
capaz de inhibir o de prevenir la liberación de IPG en mastocitos,
basófilos o eosinófilos, como respuesta a un alérgeno.
5. Utilización de la reivindicación 4, en donde
el antagonista es un inhibidor del enzima
GPI-PLD.
6. Utilización de la reivindicación 5, en donde
el antagonista es un anticuerpo capaz de inhibir la liberación de
IPG, mediante la inhibición de la rotura de los IPGs provocada por
el enzima GPI-PLD.
7. Utilización de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en donde el antagonista de IPG es un antagonista
competitivo de los IPGs liberados a partir de mastocitos, basófilos
o eosinófilos.
8. Utilización de la reivindicación 7, en donde
cuando el medicamento es utilizado para tratar un paciente humano,
el antagonista de IPG competitivo es un IPG procedente de una
especie no humana.
9. Utilización de la reivindicación 8, en donde
el antagonista es un IPG de tipo A, obtenible a partir de hígado de
rata.
10. Inositolfosfoglicano (IPG) obtenible a partir
de mastocitos, basófilos o eosinófilos que es capaz de provocar la
liberación de histamina a partir de mastocitos, basófilos o
eosinófilos.
11. Inositolfosfoglicano (IPG) obtenible a partir
de mastocitos, basófilos o eosinófilos que es capaz de provocar la
liberación de histamina a partir de mastocitos, basófilos o
eosinófilos, para ser utilizado en un procedimiento de cribado para
antagonistas del citado IPG.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9806645 | 1998-03-27 | ||
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