ES2211044T3 - Sistemas para realizar ensayos en una gotita sometida a la accion de un levitador. - Google Patents

Abstract

Un sistema para la realización de ensayos de pequeño volúmen, el cual comprende: i. un levitador para la suspensión de una gotita; ii. un dispensador para el suministro de una substancia que hace posible la realización de un ensayo en la superficie de la gotita suspendida; y iii. un sistema detector para la detección de cambios en la gotita, en el que se proporcionan medios para el suministro de cualquier substancia adecuada para contrarrestar los efectos de la evaporación en la superficie de la gotita suspendida con un dispensador y/o para la suspensión de la gotita en una atmósfera saturada con agua, de manera tal que durante su uso, las gotitas se mantienen de manera estable mediante la compensación de la evaporación procedente de la gotita.

Description

Sistema para realizar ensayos en una gotita sometida a la acción de un levitador.

La presente invención se refiere a un sistema para la realización de ensayos de pequeño volumen y al uso del sistema.

Con el fin de reducir el volumen de reactivos usados en la realización de ensayos, especialmente cuando se usan reactivos costosos, es deseable reducir el volumen en el cual ha de realizarse el ensayo.

Otras ventajas obtenidas a partir de la reducción del volumen de un ensayo, incluyen una reducción en la generación de residuos y un incremento en la correcta dirección del ensayo, debida en parte a la capacidad para llevar a cabo reacciones con objetivos y concentraciones de ligando/substrato superiores.

Un problema con la realización de ensayos que usan volúmenes pequeños, es que, cuando la muestra entra en contacto con las paredes del recipiente, pueden producirse alteraciones de la composición de la muestra debido a la adsorción de la muestra sobre la pared o debido a la desorción de substancias interfirientes procedentes de la pared. Otros problemas con el uso de pequeños volúmenes incluyen la manipulación del líquido, evaporación del tampón y sensibilidad de detección.

El uso de "levitadores" para la suspensión de gotitas se conoce desde hace un cierto número de años. Existe un cierto número de tipos diferentes de levitadores que se han usado para suspender gotitas, incluyendo levitadores electrostáticos y magnéticos, los cuales dependen de las características particulares de la gotita tal como la carga, y levitadores acústicos, los cuales no dependen de las características particulares de la gotita.

Los levitadores se han usado para suspender gotitas para el estudio de haces de gotas (Yuren y otros, J. Aerosol Sci., vol. 27, págs. 721-737, (1996)), para la realización de análisis micro y traza usando mediciones fotométricas de gotitas suspendidas individuales (Welter y otros, J. Anal. Chem., vol. 357, págs. 345-350, (1997)), para medir la dependencia del tiempo de una reacción ácido-base en una gotita levitada individual (Trunk y otros, Chem. Phys. Lett., vol. 264, págs. 233-237, (1997)) y para detectar una molécula de rodamina 6G individual en una gotita levitada (Barnes y otros, Anal. Chem., vol. 65, págs. 2360-2365, (1993)).

En la Patente WO 97/01085, se describe una célula de toma de muestra de flujo en movimiento para la extracción de una cantidad de muestra precisa, la cual puede usarse para la generación de pequeñas gotas. Se describe el uso de la célula de muestra para formar muestras para electroforésis.

Al mejor saber y entender de los autores de la presente invención, ninguno de estos sistemas de la técnica anterior se han usado para realizar ensayos completos bioquímicos o basados en células, especialmente los dirigidos hacia el descubrimiento de nuevos candidatos para medicamentos en un medio ambiente de rastreo.

Un problema con estos sistemas de la técnica anterior para la suspensión de gotitas, es que se produce la evaporación de las gotitas. La evaporación de las gotitas conduce a cambios en la concentración de los componentes de la gotita y, por ello, afecta a las condiciones del ensayo. En los sistemas de la técnica anterior, con el fin de reducir la evaporación, las gotitas suspendidas están recubiertas con un aceite u otro material con el fin de reducir la evaporación, o la gotita está suspendida en una atmósfera saturada con agua.

La presente invención proporciona un sistema, el cual evita, al menos en parte, los problemas de los sistemas de la técnica anterior y permite realizar ensayos en pequeños volúmenes.

La presente invención proporciona un sistema para la realización de ensayos de volúmenes pequeños tal como se define en las reivindicaciones.

El sistema de la presente invención puede usarse para la realización de un ensayo en el que se agrega una substancia a la gotita suspendida y se mide la interacción de la substancia agregada con los contenidos de la gotita.

El sistema de la presente invención tiene un cierto número de ventajas para la realización del ensayo:

1. El uso de volúmenes pequeños, aproximadamente 1000 veces menores de lo posible con la instrumentación convencional. Esto es una economía de materiales y de tiempo necesario para cada ensayo. Igualmente, permite llevar a cabo estudios en los cuales los componentes son escasos tal como la dificultad para expresar proteínas.

2. La no necesidad de un recipiente elimina los problemas asociados con la unión no específica y la contaminación procedente de las superficies del recipiente y reduce los residuos.

3. Se obtiene una sensibilidad mejorada ya que el volumen de muestra es pequeño y puede ensayarse la muestra entera.

4. El dispensador para suministrar una substancia a la superfice de la gotita suspendida permite dispensar reactivos comunes usando el mismo dispensador, puesto que este nunca toca la mezcla de ensayo completa. Por ejemplo, pueden inyectarse compuestos usando un sistema de flujo en movimiento continuo, de volumen muerto pequeño (J. Nilsson y otros, Anal. Meth. Instr., Special Issue \muTAS, vol. 96, págs. 88-91, (1996)). Esto permite una dispensación rápida y reduce los residuos. Otro dispensador comercialmente disponible adecuado para esta aplicación es el dispositivo "PixSys" de montaje remoto, de la Cartesian Engineering, 17781 Skypark Circle, Irvine, CA 92714. Otro dispositivo, recientemente descrito en la literatura (Genetic Engineering News, vol. 18, (no. 4), págs. 16-17, (1998), de la Packard Instruments (Meriden, CT), sería igualmente apropiado.

5. El mantenimiento estable de la gotita mediante la compensación de la evaporación procedente de la gotita, permite la realización de ensayos en un medio anbiente fisológicamente estable, evitando, de esta forma, ensayos erróneos debidos a cambios fisiológicos en la gotita suspendida, tal como un incremento en la concentración de tampón debido a la evaporación.

El levitador usado en el sistema de la presente invención, puede ser cualquier levitador que suspenda una gotita, incluyendo levitadores electrostáticos, magnéticos y acústicos tal como se han mencionado anteriormente. Preferiblemente, el levitador es un levitador acústico. Un levitador adecuado es el levitador acústico APOS BA 19 con una frecuencia estándar de 58 kHz (Martinson Elektronic AB, Hagersten, Suecia).

El dispensador usado en el sistema de la presente invención puede ser cualquier dispensador que sea capaz de suministrar una substancia a la superficie de una gotita suspendida. El dispensador puede ser una jeringa tal como una jeringa para cromatografía de gases. Preferiblemente, el dispensador es un dispensador piezoeléctrico, tal como el dispensador descrito por Hoffmann y otros (Rev. Sci. Instrum., vol. 63, págs. 823-824, (1992)) y lo más preferiblemente, el dispensador es la célula de toma de muestra de flujo en movimiento descrita en la Patente WO 97/01085 y por Nilsson y otros, en Anal. Meth. Instr., Special Issue \muTAS, vol. 96, págs. 88-91, (1996). Dichos dispensadores piezoeléctricos pueden projectar gotitas dentro del intervalo de 50-100 picolitros a una velocidad de una gotita a varios cientos de gotitas por segundo. Más adelante, se describen otros dispensadores útiles.

El sistema de la presente invención puede comprender uno o más dispensadores, en el que uno o más dispensadores pueden usarse para formar una gotita y/o agregar una o más substancias a una gotita.

La substancia a agregar a la gotita puede ser cualquier substancia que permita la realización de un ensayo. La substancia puede ensayarse por sí misma o puede ayudar en la realización del ensayo. La substancia puede ser un péptido, ligando, receptor, enzima o compuesto de un medicamento, opcionalmente marcada con, por ejemplo, un fluoróforo. En una realización preferida, la substancia agregada a la gotita es un substrato sobre el cual actúa un componente (p. ej., una enzima) presente en la gotita para producir un cambio detectable.

La gotita se mantiene de manera estable compensando la evaporación procedente de la gotita. El término "mantenida de manera estable" significa que la gotita suspendida tiene estabilidad fisiológica, en donde por estabilidad fisiológica se entiende que las variaciones en el pH, concentración de iones, concentración de tampón, etc., dentro de la gotita suspendida, son suficientemente pequeñas como para que no afecten significativamente el resultado del ensayo. La estabilidad fisiológica es particularmente importante para enzimas y otras substancias que tienen un marco de actividad fisiológica estrecho. Un ejemplo de una enzima particular que tiene un marco de actividad fisiológica estrecho es la endonucleasa de restricción BamH1, la cual, bajo condiciones de baja concentración iónica, alta concentración de enzima, elevado pH (>8,0) o alta concentración de glicerol (>5%), puede mostrar actividades nuevas, menos específicas (New England BioLabs, catálogo 1996/7 y referencias en él citadas (véase página 241)). De manera similar, los ensayos basados en células requieren el mantenimiento de una regulación estrecha de las condiciones medioambientales para asegurar tanto la fidelidad de los episodios fisológicos inducidos bajo estudio, como la viabilidad de las propias células (exigencias generales descritas en Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2nd. ed., R. Ian Freshney, (1987), Alan R. Liss, Inc., NY.

En una realización preferida, la gotita suspendida se mantiene de manera estable suspendiendo la gotita en una atmósfera saturada con agua. En una realización preferida adicional, la gotita suspendida se mantiene de manera estable suministrando agua a la gotita suspendida, contrarrestando, de esta forma, los efectos de la evaporación. En una realización preferida adicional, la gotita suspendida se mantiene de manera estable mediante una combinación de suspensión de la gotita en una atmósfera saturada con agua y suministro de agua a la gotita suspendida.

La velocidad de adición de agua a la gotita suspendida depende de un cierto número de factores tales como la velocidad de evaporación a partir de la gotita, así como del tamaño estable deseado de la gotita. Una vez alcanzado el equilibrio entre la velocidad de adición de agua a la gotita suspendida y la velocidad de evaporación a partir de la gotita, en ese momento, la gotita se mantiene en un tamaño estable.

La substancia a agregar a la gotita puede ser igualmente cualquier substancia adecuada para compensar la evaporación. Preferiblemente, la substancia es agua.

Más adelante, se aporta información adicional referente a las substancias que pueden suministrarse a las gotitas suspendidas cuando se describen los formatos de ensayo adecuados.

En una realización preferida, se usan uno o más dispensadores para suministrar a la gotita suspendida una o más substancias a ensayar o substancias que ayudan a la realización del ensayo, y son usados igualmente para suministrar agua a la gotita suspendida con el fin de compensar la evaporación procedente de la gotita. Preferiblemente, se usa un dispensador para suministrar a la gotita suspendida una o más substancias a ensayar o substancias que ayudan a la realización del ensayo, y otro dispensador se usa para suministrar agua a la gotita suspendida.

Preferiblemente, el dispensador para suministro de la substancia a la superficie de la gotita suspendida es un dispensador piezoeléctrico y, más preferiblemente, el dispensador para suministro de la substancia a la superficie de la gotita suspendida es la célula de toma de muestras de flujo en movimiento descrita en la Patente WO 97/01085. El uso de dispensadores que suministran una substancia a la superficie de una gotita, tiene la ventaja de que reduce el riesgo de contaminación puesto que no existe contacto entre el dispensador y la gotita suspendida.

El dispensador para suministro de una substancia a una gotita suspendida puede usarse igualmente para formar la gotita suspendida. El dispensador puede formar una gotita que ha de suspenderse o puede conformar la gotita por fases mediante la adición secuencial de los componentes, formando, de esta manera, una gotita suspendida. Como alternativa, la gotita suspendida puede formarse usando una aguja y un capilar untado con aceite de girasol u otro aceite adecuado. La gotita de muestra se retira de la punta de la aguja mediante el capilar aceitado y, a continuación, se deposita en el levitator. Una ventaja del uso del dispensador para formar la gotita es que puede lograrse un mayor control del tamaño de la gotita, haciendo posible, de esta manera, la obtención de tamaños de gotitas más consistentes.

En una realización preferida, la substancia suministrada a la gotita suspendida usando el sistema de la presente invención, es agua.

Durante su uso, pueden usarse diferentes dispensadores cuando se agregan diferentes substancias y la velocidad de uso de los dispensadores se controla, preferiblemente, de manera tal que la evaporación se contrarresta de forma que el tamaño de la gotita permanezca el mismo. Por ejemplo, cuando se agrega a la gotita una substancia tal como una enzima o substrato, el tamaño de la gotita cambia y, con ello, cambian las concentraciones de los reactantes en la gotita. De acuerdo con ello, la velocidad a la cual se agregan las diferentes substancias, es decir, la enzima, substrato o agua, suele controlarse de manera tal que se contrarreste la evaporación y que se mantengan estables las concentraciones de los diversos reactantes en la gotita.

El sistema de la presente invención puede comprender más de un levitator. Cuando el sistema de la presente invención comprende más de un levitator, los dispensadores para la formación o suministro de substancias a las gotitas suspendidas pueden usarse para más de un levitator. Sin embargo, se prefiere que cada levitator tenga un dispensador de agua asociado con él, de manera tal que el agua pueda suministrarse continuamente a la superficie de la gotita suspendida para contrarrestar los efectos de la evaporación.

El sistema detector de la presente invención puede ser cualquier sistema detector adecuado para la detección de un cambio en la gotita suspendida. El sistema detector puede usarse para detectar cambios de fluorescencia, radioactividad, quimioluminiscencia o colorimétricos.

Los sistemas detectores adecuados para uso en la presente invención son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Cuando han de detectarse cambios de fluorescencia o colorimétricos, el sistema detector comprende, preferiblemente, un espectrofotómetro dispuesto para la irradiación de la gotita suspendida con luz y la detección de la luz emitida o reflejada. Los espectrofotómetros adecuados incluyen el modelo MPF-2A de Perkin-Elmer, USA.

En una realización alternativa de la presente invención, cuando han de detectarse cambios de fluorescencia o colorimétricos, el sistema detector comprende una lámpara de mercurio para la irradiación de la gotita suspendida y una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Un sistema detector adecuado que comprende una cámara CCD y una lámpara de mercurio, es el descrito por Nilsson, S. y otros, en J. Capillary Electrophor., vol. 2, pág. 46, (1995), y por Johansson, J. y otros, en Anal. Chem., vol. 68, pág. 2766, (1996).

Cuando ha detectarse quimioluminiscencia, el sistema detector comprende, preferiblemente, una imagen CCD como anteriormente, o un tubo fotomultiplicador para la detección de un único punto.

Cuando ha de detectarse radioactividad, el sistema detector podría ser similar al usado para quimioluminiscencia (véase más arriba), realizándose la generación de fotones mediante la adición de un agente de centelleo a la gota, preferiblemente en forma de una esférula SPA (Amersham, Plc.) para medir las interacciones de unión.

Preferiblemente, la gotita suspendida tiene un volumen de 1fl a 1 ml, preferiblemente 1 fl a 100 \mul y, más preferiblemente, 1 pl a 1 \mul.

La gotita suspendida puede contener cualquier substancia. Las substancias preferidas incluyen proteínas tales como enzimas, substratos de enzimas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv), péptidos, proteasas, receptores, ligandos, hormonas, y moléculas candidatas para medicamentos, así como carbohidratos y otros polímeros y/o sus ligandos. Otros materiales preferidos para inclusión en la gota son células o fragmentos de células.

La gotita suspendida puede contener igualmente células enteras. Las células adecuadas incluyen cualquier célula que pueda suspenderse en medio de cultivo. Las células particularmente adecuadas incluyen células bacterianas tales como células de E. coli, células de mamíferos tales como células de ovario de hamster chino (CHO) y células NIH 3T3, y células de levaduras tales como células de S. cerevisiae. Si es necesario, la gotita suspendida puede contener soportes de microesferas a los cuales están unidos las células. Los soportes de microesferas adecuados para unión a las células son bien conocidos para los expertos en la técnica y pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, CultiSpher.

La gotita suspendida puede contener esférulas impregnadas o recubiertas con substancias para la inmovilización de componentes específicos tales como receptores o ligandos. Además, las esférulas pueden impregnarse con fluoróforos u otros componentes que pueden detectar componentes unidos. Dichas esférulas impregnadas han sido descritas por Udenfriend y otros, en Anal. Biochem., vol. 161, págs. 494-500, (1987), las cuales se incorporan aquí como referencias.

En una realización preferida, el sistema de la presente invención comprende:

1. una fuente de iluminación central;

2. uno o más dispensadores para la formación de una gotita suspendida y/o para el suministro de una substancia a la superficie de una gotita suspendida;

3. uno o más levitatores posicionados adjacentes a la fuente de iluminación y en una posición en la que la gotita suspendida puede ser iluminada mediante rotación de la fuente de iluminación; y

4. detectores posicionados para la medición de cambios en las gotitas suspendidas.

Preferiblemente, la fuente de iluminación está asociada con un espejo u otro medio reflector, el cual puede usarse para dar lugar a que la luz emitida rote alrededor de la fuente de iluminación central. Preferiblemente, el espejo u otro medio reflector es un prisma de rotación de una vía.

Preferiblemente, la fuente de iluminación es un láser.

Preferiblemente, se usan un cierto número de levitadores de manera que se formen un cierto número de gotitas suspendidas alrededor de la fuente de iluminación central, en una posición tal que cada gotita suspendida pueda ser iluminada por la luz rotatoria.

Preferiblemente, los detectores son para la detección de la absorbancia o fluorescencia de luz procedente de las gotitas suspendidas. De acuerdo con ello, los detectores están posicionados en diferentes posiciones con relación a las gotitas suspendidas, dependiendo de si son detectadas mediante absorbancia o fluorescencia.

Preferiblemente, el sistema comprende igualmente un extractor para retirar las gotitas suspendidas después de que han sido ensayadas, permitiendo un uso en serie, rápido, de cada canal detector.

La presente invención proporciona además el uso del sistema de la presente invención en la realización de un ensayo.

Preferiblemente, el sistema de la presente invención se usa en la realización de un ensayo de rastreo de candidatos para medicamentos.

En una realización preferida de la presente invención, el sistema de la presente invención está diseñado para realizar ensayos secuenciales, rápidos, sin la necesidad de cubetas, cavidades o capilares.

Tal como se ha indicado anteriormente, el sistema se basa en atrapar y mantener gotitas, preferiblemente en nodos de presión de un campo ultrasónico constante. Preferiblemente, los dispensadores piezoeléctricos se usan para dispensar gotitas dentro del campo, usando múltiples inyecciones para obtener el volumen de ensayo deseado. Otras veces, los dispensadores se usan para agregar componentes adicionales a la gotita suspendida. Preferiblemente, un dispensador agrega agua para compensar la evaporación. Las reacciones en la gotita suspendida pueden medirse usando técnicas ópticas, tal como mediante el uso de un láser, para producir la emisión de fluorescencia a partir de la muestra. Como un ejemplo de un ensayo típico, se inyecta una enzima en un tampón apropiado dentro del campo ultrasónico, creándose una gotita del volumen deseado. A continuación, un segundo dispensador agrega a la gotita un substrato que proporciona una señal fluorescente cuando actúa sobre la enzima. A continuación, se lee la actividad de la enzima iluminando la gotita entera con un láser y detectando la emisión usando o bien un PMT o bien un CCD para detectar fluorescencia, absorbancia, polarización, etc.

El sistema de la presente invención es particularmente útil en el rastreo de medicamentos, en los cuales un dispensador adicional inyecta un compuesto de interés y se observan sus efectos sobre la enzima. Después del análisis, la gota se separa con un extractor o una corriente de aire y se realiza el ensayo siguiente.

A continuación, se exponen los ensayos preferidos a realizar usando el sistema de la presente invención.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

Esta es una técnica usada para monitorizar la actividad de proteasas (véase, Matayoshi y otros, Science, vol. 247, pág. 954, (1990) y Wang y otros, Tetrahedron Lett., vol. 31, pág. 6493, (1990)). Un substrato péptido se marca con un par pareado de fluoróforos donante y aceptor. Antes de la escisión, se interrumpe la fluorescencia debida a la FRET, ya que la emisión fluorescente del flúor donante es absorbida de manera eficaz por el colorante aceptor. Una vez realizada la escisión del péptido marcado, se produce la separación espacial de los fluoróforos, lo que da como resultado un incremento de 40-50 veces en la fluorescencia del donante. Para este tipo de ensayo, la principal ventaja del uso del sistema de la presente invención, es que los volúmenes de reacción pueden reducirse por un factor de aproximadamente 1000 en comparación con los instrumentos existentes. De manera similar, puede usarse la FRET para seguir la interacción de dos materiales marcadores (proteína-proteína, proteína-ligando, etc.), así como el efecto de substancias adicionales sobre el par marcador (Patel, L.R. y otros, PNAS USA, vol. 91, págs. 7360-7364, (1994)).

Por ejemplo, el péptido KRPLGLARC puede ser escindido por la matriz metaloproteinasa, matrilisina, entre los restos alanina (A) y leucina (L). La cisteína C-terminal puede marcarse con AEDENS (un fluoróforo excitable mediante luz en el intervalo de 300-400 nm, disponible de Molecular Probes, Eugene, OR) y el N-terminal puede marcarse con DABCYL (un cromóforo capaz de absorber la salida fluorescente de AEDENS, cuando se ponen en íntima proximidad). Esto da como resultado una fuerte interrupción de la fluorescencia AEDENS. Cuando se encuentra presente matrilisina, la intensidad fluorescente de AEDENS aumenta de una manera que depende del tiempo que se ha escindido el péptido. Esto se basa en la distancia entre estas dos moléculas y, en consecuencia, de la presencia o ausencia de actividad de la enzima (véase, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª ed., págs. 225-234, (1996), por Richard P. Haugland, Molecular Probes, Eugene, OR).

De acuerdo con ello, el sistema de la presente invención puede usarse para detectar la presencia de matrilisina o cualquier otra proteinasa.

Polarización por fluorescencia (FP)

La FP es una poderosa tecnología para el estudio de interacciones moleculares en solución. Véase, Jolley y otros, Biomol. Screening., vol. 1, págs. 33-38, (1996), y Dandliker y otros, Lab. Res. Methods Biol. Med., vol. 4, págs. 65-88, (1980). Esta tecnología ha sido extensamente usada en estudios de unión de pequeños ligandos a sus receptores y puede usarse igualmente para estudiar la conversión de grandes moléculas a pequeñas. Es el único entre los procedimientos usados para analizar la unión molecular, ya que proporciona una medida directa de la relación unido/libre sin la separación física del trazador unido del trazador libre (no unido). La FP mide la rotación de moléculas fluorescentes debida a cambios en la polarización de la luz emitida. Si la luz polarizada se usa para excitar un fluoróforo estacionario, este emitirá igualmente luz a una polarización particular. Sin embargo, si el fluoróforo rota en el tiempo en que este absorbe y el tiempo que fluoresce, la polarización cambiará. De acuerdo con ello, la velocidad de giro está relacionada con la polarización de la luz emitida. Cuando un ligando fluorescente se une a una macromolécula, su rotación se vuelve más lenta en gran medida y la polarización de la luz emitida es más similar a la del haz incidente. Cuando se encuentran presentes muchas moléculas, el giro aleatorio da lugar a que la luz polarizada esté menos polarizada en ausencia de la macromolécula, pero retendrá más de su polarización en su presencia.

En la práctica, se mide un ligando marcado tanto en presencia como en ausencia de su receptor y un incremento de la FP indica unión. Además de a receptores solubles, puede llevarse a cabo la unión de ligandos marcados a receptores de membranas mediante la inyección de gotitas que contienen células o membranas y, a continuación, la levitación de estas gotitas. Una ventaja fundamental para el uso de ensayos mediante FP en el sistema de la presente invención, es la ausencia de superficies. La unión no específica del fluoróforo a las superficies del recipiente da lugar a incrementos no específicos en la FP.

Por ejemplo, la unión de estrógeno marcado fluorescentemente al receptor de estrógeno, puede medirse usando la técnica. El incremento de polarización conforme el ligando se une al receptor, proporciona una lectura directa de la unión.

Fluorescencia resuelta en tiempo homogéneo

Un instrumento para la realización de este procedimiento es el comercialmente desarrollado por Packard Instruments, entre otros. Este procedimiento es una forma más especializada del FRET descrito anteriormente (véase, Kolb y otros, J. Biomol. Screening, vol. 1, (no. 4), págs. 203-210, (1996), Documento US-A-5.527.6847 y Documento US-A-5.534.622). La técnica usa criptato de Eu(3+)trisbipiridina (Eu(K)) como el donante y aloficocianina modificada como el aceptor. El donante tiene un tiempo de vida fluorescente muy largo, en tanto que el tiempo de vida del aceptor es relativamente corto. Estos componentes resueltos en el tiempo dan como resultado un gran incremento en la relación de señal a ruido. Esto es ideal para la búsqueda de la interacción entre un ligando marcado y su receptor marcado, puesto que las distancias eficaces promedio que pueden examinarse para transferencia de energía son relativamente grandes (>10 nm), lo que permite la rápida construcción de ensayos.

Por ejemplo, la Src quinasa es capaz de fosforilar el péptido LCKVEKIGEGTYGVVYK sobre una o ambas de las tirosinas (Y). Igualmente, este péptido puede biotinilarse sin afectar su utilidad como un substrato para Src. En primer lugar, se lleva a cabo la reacción para fosforilar el péptido. A continuación, se agrega anticuerpo anti-fosfotirosina marcado con Eu(K) y acoplado con aloficocianina a esteptavidina. Si el péptido está fosforilado, los dos componentes se unen al péptido y puede medirse la transferencia de energía. El uso de este ensayo en el sistema de la presente invención tiene la ventaja de ser capaz de realizar adiciones rápidas, sin pipetas, de todos los componentes, usando volúmenes muy pequeños de estos costosos reactivos.

Quimioluminiscencia

Las técnicas de quimioluminiscencia similares a las comercializadas por Tropix, son adecuadas para uso en el sistema de la presente invención. La técnica se basa en ciertas moléculas que emiten luz visible al romperse. Esto puede estar emparejado con ciertas modificaciones enzimáticas y, de esta forma, proporciona una lectura de la actividad de la enzima.

Por ejemplo, el Glucton® comercializado por Tropix es un substrato para \beta-galactosidasa. Debido a la escisión por \beta-galactosidasa, el producto es inestable y, debido a la desintegración, emite luz. Esto puede seguirse fácilmente usando un PMT.

Espectroscopía de correlación con fluorescencia (FCS)

La FCS está descrita por Sterrer y Henko, en J. Recept. Signal Trans. Res., vol. 17, págs. 511-520, (1997). La FCS mide fluctuaciones de la fluorescencia cuando las moléculas se mueven dentro y fuera de un pequeño volumen. Típicamente, se iluminan pequeños volúmenes y conforme las moléculas se difunden dentro de la región iluminada estas fluorescen. La difusión dentro de la región iluminada (es decir, la región de toma de muestra) es una función del número de moléculas y del tiempo de difusión por translación. Las mediciones se toman dentro de un tiempo determinado y el número de moléculas en el volumen de muestra y el tiempo de difusión pueden computarse usando una función de autocorrelación. La clave es que las moléculas más pequeñas se difunden más rápidamente que las grandes y pueden distinguirse fácilmente. Un ejemplo podría ser la detección de la relación de ligando libre a ligando unido a los receptores. En la instrumentación de la técnica anterior, esto requería placas de microvaloración de alta calidad óptica y la necesidad de agitar las placas. El sistema de la presente invención minimiza ambos inconvenientes dado que no se usa una cubeta y que los pequeños volúmenes permiten la rápida difusión a lo largo de la gota entera en un corto plazo de tiempo.

Por ejemplo, el ensayo de unión del receptor de estrógeno descrito bajo la sección de FP puede ensayarse igualmente usando este procedimiento.

Ensayos de proximidad de centelleo (SPA)

Esta técnica está comercializada por Amersham, la cual ha creado esférulas que detectan la proximidad de tritio o de ^{125}I (Udenfriend y otros, Anal. Biochem., vol. 16 (no. 2), págs. 494-500, (1987) y Cook, Drug Discovery Today, vol. 1, (no. 7), págs. 287-294, (1996)). En la práctica, las esférulas se recubren con membranas que contienen el receptor de interés. Cuando un ligando marcado se une al receptor, está en una proximidad suficientemente íntima como para excitar los fluoróforos de dentro de las esférulas y se emite luz. El sistema de la presente invención es útil para un procedimiento de este tipo, dado que no es un problema la levitación de esférulas dentro de gotitas. La principal ventaja es que, puesto que no existen placas para mantener las muestras, la cantidad de residuo radioactivo llega ser mínimo.

Por ejemplo, pueden usarse esférulas SPA recubiertas con aglutinina de gérmen de trigo para inmovilizar células de neuroblastoma humano que expresan el receptor neuropéptido Y. Cuando este se mezcla con neuropéptido Y marcado con ^{125}I, puede detectarse la unión por los aumentos de emisión procedentes de esférulas SPA.

Ensayos de células enteras

La capacidad para dispensar y levitar células enteras permite muchos tipos de ensayos. Cualquier ensayo basado en células que tenga una lectura óptica puede usarse en este sistema. Además, pueden usarse células que dependen del anclaje conjuntamente con soportes de microesferas.

Por ejemplo:

1. Liberaciones de ácidos grasos inducidas por ligandos. Esto puede usarse como un procedimiento general para la detección de interacciones ligando/receptor. Se transfectan células NIH 3T3 con el receptor de interés y proteínas G qiméricas, que se emparejan a la vía apropiada. Después de diferenciación dentro de adipocitos, las células liberan ácidos grasos libres en respuesta al ligando. Dado que los volúmenes en esta instrumentación son bajos, el pH de la gotita completa cambia como resultado de ello y puede medirse usando colorantes sensibles al pH estándar, tal como el ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico (HPTS).

2. Movilización de Ca^{2+} en células inducida por ligandos. Las células que expresan el receptor de interés y previamente cargadas con el quelador de Ca^{2+} fluorescente, se levitan y se monitoriza la liberación del calcio en respuesta a los ligandos.

3. Liberación extracelular de productos oxidativos. Se levitan neutrófilos en presencia de OxyBURST Geen H_{2}HFF BS (Molecular Probes) y se mide mediante fluorescencia la liberación de productos oxidativos en respuesta a los ligandos. Una vez más, la ventaja de volúmenes pequeños mejora grandemente la sensibilidad de esta técnica sobre los procedimientos convencionales.

Procedimientos colorimétricos

La mayoría de los ensayos colorimétricos de alta sensibilidad usados actualmente podrían usarse en este sistema, incluyendo ensayos de serina proteasa o ensayos \beta-galactosidasa colorimétircos.

Poe ejemplo, el ensayo de proteasas mediante diazotización de p-nitroanilina en microplacas es un ensayo colorimétrico. El ensayo de proteasa consiste en la diazotización de p-nitroanilina, liberada a partir de cualquier substrato p-nitroanilida, con dihidrocloruro de naftiletilenodiamina, para formar un complezo azo de color púrpura, el cual puede medirse a 540 nm. Por ejemplo, las actividades de tripsina, quimotripsina, aminopeptidasa y proteasa tipo elastasa, pueden medirse usando benzoil-Arg-p-nitroanilida, succinil-Ala2-Pro-Phe-p-nitroanilida, Leu-p-nitroanilida y succinil-Ala3-p-nitroanilida, a concentraciones de enzima más bajas que las previamente detectables con estos substratos. La base de este ensayo es la reacción de Bratton-Marshall, la cual permite una sensibilidad mejorada del ensayo al incrementar la absorción máxima del producto. Este ensayo puede tener aplicaciones clínicas en la medición de leucina aminopeptidasa en muestras de suero (véase, Lee y otros, Anal. Biochem., vol. 218, (no. 2), págs. 480-482,
(1994)).

De manera similar, la presencia o inducción de la expresión de enzimas glicolíticas o de otro tipo puede seguirse mediante la formación de productos fluorescentes o altamente coloreados como consecuencia de la actividad de la enzima. Los ejemplos de estas enzimas y substratos incluyen \beta-galactosideasa y 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (cromogénico) o fluoresceíno diagalactosido (fluorogénico). Muchos otros pares enzima/substrato adecuados se encuentran descritos en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª ed., (1996), por Richard P. Haugland, Molecular Probes, Eugene, OR.

A continuación, se describe con detalle la presente invención con referencia a las Figuras y Ejemplos siguientes. Se observará que la invención se describe únicamente a modo de ejemplo pudiendo realizarse modificaciones de detalle sin apartarse el alcance de las reivindicaciones.

La Figura 1 muestra el dispositivo instrumental para mediciones de fluorescencia con una lámpara de mercurio y una cámara CCD, en la que (1) es un obturador electromecánico, (2) es un filtro infrarrojo, (3) es un filtro NG, (4) es una lente cilíndrica, (5) es un filtro de interferencia (405 ó 435 nm), (6) es una abertura, (7) es un filtro de interferencia (510 nm), (8) es un sistema de lente, (9) es un microdispensador continuo (CMD) y (10) es un inyector.

La Figura 2 muestra dos dispositivos alternativos para mediciones de fluorescencia (Figura 2a y 2b, respectivamente).

La Figura 3 muestra un levitador y tres dispensadores, en la que el Dispensador I suministra una única o varias células y puede igualmente suministrar microsoportes para desarrollo de células. El Dispensador II suministra agua para mantener la gotita levitada a un tamaño constante y el Dispensador III se usa para suministrar tipos diferentes de analitos, por ejemplo, candidatos para medicamentos.

La Figura 4 muestra las intensidades de fluorescencia (medidas como altura de pico en mm) durante la evaporación de la gotita medidas con espectrofotómetro de fluorescencia (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de
valoración).

La Figura 5 muestra la relación de intensidad de fluorescencia durante la evaporación de la gotita medida con espectrofotómetro de fluorescencia (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración).

La Figura 6 muestra las intensidades de fluorescencia (medidas como altura de pico en mm) durante la lipólisis medidas con espectrofotómetro de fluorescencia (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de aproximadamente 1 \mul de isoprenalina e insulina a la gotita después de 2 y 7 minutos, respectivamente.

La Figura 7 muestra la relación de intensidad de fluorescencia durante la lipólisis medida con espectrofotómetro de fluorescencia (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de aproximadamente 1 \mul de isoprenalina e insulina a la gotita después de 2 y 7 minutos, respectivamente.

La Figura 8 muestra las intensidades de fluorescencia durante la evaporación de la gotita medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Resultados evaluados con WinView 1.3.

La Figura 9 muestra las intensidades de fluorescencia durante la evaporación de la gotita medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Resultados evaluados con WinView 1.3.

La Figura 10 muestra las relaciones de intensidad de fluorescencia durante la evaporación de la gotita medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Resultados evaluados con WinView 1.3.

La Figura 11 muestra las intensidades de fluorescencia durante la adición continua de agua con un CMD (operando a 10 Hz) a la gotita medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Resultados evaluados con Drop.

La Figura 12 muestra las intensidades de fluorescencia durante la adición continua de agua con un CMD operando con frecuencias a 10, 50 y 100 Hz, medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Resultados evaluados con Drop.

La Figura 13 muestra las intensidades de fluorescencia durante la lipólisis en gotitas medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de
1 \mul de isoprenalina 300 nM y 1 \mul de insulina 1 nM después de 2 y 7,8 minutos, respectivamente. Resultados evaluados con Drop.

La Figura 14 muestra las relaciones de intensidad de fluorescencia durante la lipólisis en gotitas medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de 1 \mul de isoprenalina 300 nM y 1 \mul de insulina 1 nM después de 2 y 7,8 minutos, respectivamente.

La Figura 15 muestra las intensidades de fluorescencia durante la lipólisis en gotitas con adición continua de agua con un CMD (frecuencia de operación a 10 Hz), medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de 1 \mul de isoprenalina 300 nM y 1 \mul de insulina 1 nM después de 2 y 5,5 minutos, respectivamente. Resultados evaluados con Drop.

La Figura 16 muestra las relaciones de intensidad de fluorescencia durante la lipólisis en gotitas con adición continua de agua con un CMD (frecuencia de operación a 10 Hz), medidas con lámpara de mercurio y cámara CCD (HPTS 0,1 mM y PCV al 1,3% en tampón de valoración). Adición manual de 1 \mul de isoprenalina 300 nM y 1 \mul de insulina 1 nM después de 2 y 5,5 minutos, respectivamente. Resultados evaluados con Drop.

La Figura 17 muestra las relaciones de intensidad de fluorescencia de dos experimentos durante 80 segundos con gotitas de 0,5 \mul que contenían 14 adipocitos cada una y HPTS 10 nM en el tampón de valoración. Uno de los experimentos muestra la evaporación de gotitas y el otro el control de volumen usando el CMD (a una frecuencia de 10 Hz) para agregar agua a la gotita. El dispositivo instrumental incluía lámpara de mercurio y cámara CCD y los resultados se evaluaron con Drop.

La Figura 18 muestra las relaciones de intensidad de fluorescencia de dos experimentos con lipólisis en gotitas de 0,5 \mul con adición continua de agua usando el CMD (frecuencia de operación a 10 Hz), medida con lámpara de mercurio y cámara CCD. Las gotitas contenían 12 adipocitos cada una y HPTS 10 nM en el tampón de valoración. El CMD se usó para agregar isoprenalina 300 nM a la gotita en ambos experimentos después de 35 segundos. El CMD se usó posteriormente para agregar insulina 1 nM a la gotita en uno de los experimentos después de 65 segundos. El dispositivo instrumental incluía lámpara de mercurio y cámara CCD y los resultados se evaluaron con Drop.

Parte experimental Ejemplo

En este ejemplo, los adipocitos y el procedimiento de lipólisis han sido el objeto del examen. La adición de substancias adrenérgicas, en este caso isoprenalina, a la gotita realzó el procedimiento de lipólisis en las células. Cuando como consecuencia de la misma se liberan ácidos grasos libres de las células, disminuye el pH del tampón que las rodea. La adición de insulina interrumpe la lipólisis y, por tanto, interrumpe igualmente la disminución de pH. Mediante la irradiación de fluoróforos dependientes del pH en el tampón con luz de longitud de onda específica, los cambios de pH pueden seguirse monitorizando contínuamente la gotita con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).

El fluoróforo usado en el ejemplo es la sal trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico (HPTS), el cual es un indicador impermeabilizante de la membrana, altamente soluble en agua, con un pK de alrededor de 7,3 en tampones acuosos (dependiendo de la concentración iónica). Este está en el valor medio del intervalo de pH fisiológico, lo que hace al HTPS un fluoróforo ideal para mediciones de pH fisiológicos (7-10). Muestra un cambio de absorción dependiente del pH y un máximo de emisión a 511 nm, lo que permite mediciones cuantitativas de relaciones, usando una relación de excitación de 435/405 nm. La fluorescencia de HPTS se incrementa con el pH cuando se excita a 435 nm y disminuye con el pH cuando se excita a 405 nm. Sin embargo, una desventaja es la sensibilidad del procedimiento frente a la luz solar, por lo que las valoraciones suelen realizarse, preferiblemente, en luz difusa o en la oscuridad. Durante los experimentos, los adipocitos se mantuvieron en un tampón de valoración con HPTS y una baja capacidad de tamponación.

Usando una lámpara de mercurio y una cámara CCD, el límite de detección de concentración de fluoróforo se igualó a una concentración de HPTS en una gotita de 1 nM. La evaporación de la gotita se encontró que influye en las intensidades de fluorescencia, dado que esta aumenta cuando disminuye el volumen de la gotita. Para evitar esto, se usó un microdispensador continuo (CMD) para agregar de manera continua pequeñas cantidades de agua a la gotita con el fin de compensar la evaporación. Cuando se introdujeron aditivos en la gotita, y por tanto aumentó el volumen de la gotita, esto afectó igualmente a las intensidades. El procedimiento de lipólisis fue detectable tanto durante la evaporación como cuando se compensaron los efectos de la evaporación mediante la adición de agua. Sin embargo, el trabajo con CMD proporcionó los mejores y más claros resultados.

Adipocitos y tampones

Los adipocitos aislados, procedentes de ratas macho Sprague-Dawley, preparados mediante digestión en colagenasa, fueron suministrados amablemente por Eva Degerman, MD, PhD, Section for Molecular Signalling, Department of Cell and Molecular Biology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund.

Las células se mantuvieron suspendidas en un tampón de Krebs-Ringer-HEPES, pH 7,40 (NaCl 118,6 mM; KCL 4,74 mM; CaCl_{2} 2,54 mM; KH_{2}PO_{4} 1,19 mM; MgSO_{4} 1,19 mM; HEPES 25 mM) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1,75% (p/v), glucosa 2 mM y adenosina 200 nM (tampón de almacenamiento). Cada dos horas, el tampón de almacenamiento se retiró y las células se lavaron con nuevo tampón de almacenamiento.

Inmediatamente antes de las valoraciones a pH estabilizado levitadas, se retiró el tampón de almacenamiento y se reemplazó por un tampón de Krebs-Ringer modificado con baja capacidad de tamponación y pH 7,40 (NaCl 131 mM; KCL 4,74 mM; CaCl_{2} 2,54 mM; KH_{2}PO_{4} 1,19 mM; MgSO_{4} 1,19 mM) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1,75% (p/v), glucosa 2 mM y adenosina 200 nM (tampón de almacenamiento). Este medio contenía también HPTS.

Para fines experimentales, 100 \mul de volumen de células empaquetadas (PCV) al 13% (v/v) se diluyeron hasta 1 ml en tampón de valoración que contenía HPTS, proporcionando una suspensión de PCV al 1,3%. (Un ml de PVC contenía alrededor de 10^{7} células). Puesto que se usaron 2,5 \mul de gotitas, esto significa que el número de células por gotita fue aproximadamente de 325 células. El número real de células se contó para algunas de las gotitas. Conforme las gotitas se retiraron del campo ultrasónico mediante el capilar, estas se colocaron sobre un cristal del objetivo y, a continuación, se contaron en un microscopio. En general, esto mostró que la estimación de 325 células por gota fue exacta, aunque se produjeron desviaciones.

Aditivos para valoraciones

Para iniciar la lipólisis en los adipocitos, se usó 1 \mul de isoprenalina 300 nM. La isprenalina se obtuvo de Sigma, St Louis, Illinois, USA.

La insulina humana fue un amable regalo de Novo Nordisk, Gentofte. Se inyectó 1 \mul de insulina 1 nM dentro de las gotitas para interrumpir el proceso de lipólisis. Se entiende que la insulina sirve igualmente como un control para asegurar que las células no han sido dañadas durante los experimentos previos, ya que si lo hubieran sido, el pH del tampón de valoración no interrumpiría su disminución cuando se agregara la insulina, puesto que todos los ácidos grasos de la células se hubieran perdido.

Con el fin de comprobar los cambios en la emisión de fluorescencia del HPTS debido a diversos valores de pH, se usaron 1 \mul de concentraciones de hidróxido sódico 1 mM y 0,5 mM, respectivamente, y 1 \mul de concentraciones de ácido acético 1 mM y 0,5 mM, respectivamente.

El levitador ultrasónico

Para las valoraciones levitadas se usó un levitador ultrasónico. El levitador es un dispositivo que genera una onda estacionaria con nodos y antinodos espaciados por igual mediante reflexiones múltiples entre un radiador ultrasónico y un reflector sólido. El levitador opera con una frecuencia estándar de 58 kHz, lo cual significa que la distancia entre el transmisor ultrasónico y el reflector es aproximadamente de 1,7 cm, lo cual da como resultado cinco puntos nodales de la onda estacionaria.

Despliegue de gotitas y aditivos

Para posicionar la gotita en el campo ultrasónico, se usó una aguja de 0,8x40 mm. La gotita de muestra se retiró de la punta de la aguja mediante un capilar (TSP 025 375, Polymicro Tecnologies Inc., Phoenix, Arizona, USA) untado con aceite de girasol, después de lo cual se depositó en el campo ultrasónico.

Las gotitas se posicionaron siempre en el nodo directamente encima del medio del levitador. Esto tenía únicamente razones prácticas y operacionales. Con respecto a la forma de la gota, el objetivo fue siempre el mantener la gotita tan esférica como fuera posible.

El tamaño promedio de las gotitas usadas fue aproximadamente de 2,5 \mul. Esto se estableció pesando un gran número de gotitas de agua y calculando el volumen.

Los aditivos se introdujeron manualmente dentro de la gotita levitada mediante una jeringa de 5 \mul de cromatografía de gas con una aguja de sílice fundida capilarmente (diámetro exterior 0,17 mm, 5A-SOC-100SA, Scientific Glass Engineering Inc., Austin, Texas, USA).

El agua se agregó de manera continua a la gotita mediante un microdispensador continuo (CMD), el cual fue amablemente proporcionado por el Department of Electrical Measurements, Lund Institute of Technology, Lund. Conectado a un inyector, este se usó igualmente para introducir isoprenalina dentro de la gotita. El dispensador usado es el descrito por Nilsson y otros (Anal. Meth. Instr., Special Issue \muTAS, vol. 96, págs. 88-91, (1996)).

Mediciones de fluorescencia

Con el fin de seguir la liberación de protones de las células y los cambios en el pH, se usó HPTS (obtenido de Molecular Probes, a través de LabKemi, Lund).

El espectrofotómetro de fluorescencia

El espectrofotómetro de fluorescencia usado fue un modelo MPF-2A de PERKIN-ELMER, USA, diseñado para mediciones de excitación y espectros de emisión por fluorescencia. Incluye dos monocromadores de retícula, uno para la irradiación de una muestra con luz monocromática en el intervalo de 200 a 700 nm (monocromador de excitación) y el otro para permitir la medición selectiva de la intensidad de la luz emitida por la muestra en el intervalo de 220 a 800 nm (monocromador de emisión). Igualmente, incluye dos lentes para enfocar la luz en la célula de muestra y otras lentes para enfocar la luz emitida dentro del monocromador de emisión.

El espectrofotómetro de fluorescencia consiste en un espectrofotómetro (el cual contiene los monocromadores, dos fotomultiplicadores y una fuente de lámpara de xénon), un suministrador de potencia para la fuente de lámpara, un amplificador y un registrador. El compartimento de muestra del espectrofotómetro con soportes para cubetas y lentes de enfoque se retiraron y reemplazaron por el levitador. Las lentes de enfoque se desmontaron, se reajustaron, y se ajustaron dentro del levitador. Las lentes se posicionaron exactamente a la distancia correcta a partir del centro de la gotita en el levitador (la distancia medida a partir de la posición de la lente original al centro de la cubeta).

Las mediciones de fluorescencia de la gotita se realizaron a longitudes de onda de excitación de 405 y 450 nm y la intensidad de emisión se leyó a 511 nm. Durante las mediciones, se usaron la rendija "16", el filtro "43", la sensibilidad de muestra "1" y la velocidad de barrido "alta".

Las intensidades de fluorescencia se midieron como altura de pico en mm.

Lámpara de mercurio y cámara CCD

En la Figura 1 se muestra el dispositivo de la lámpara de mercurio y la cámara CCD. El dispositivo consiste en una lámpara de mercurio procedente de OPSIS y una fibra de cuarzo óptico de 600 \mum. Un obturador electromecánico conectado a un obturador de control, un generador de impulsos PM5705 de Philips, y un sistetizador de BF PM15190, también de Philips. El sistetizador se conectó igualmente al controlador CCD.

El obturador estaba seguido de un filtro de infrarrojos (BG38), filtros NG, una lente cilíndrica (5 cm de diámetro, 5 cm de distancia focal), filtros de interferencia y una abertura. Con el fin de evitar los efectos negativos de la evaporación de la gotita, se usó un microdispensador continuo (CMD). El CMD se conectó a un generador de impulsos/función 8111AA y a una unidad de suministro de potencia E3612A de la Hewlett Packard. El CMD se conectó finalmente a un inyector, haciendo posible, de esta forma, introducir cantidades lo suficientemente pequeñas de isoprenalina como para que no cambiara el volumen de la gotita y, por tanto, las intensidades de fluorescencia, drásticamente.

Al otro lado del levitador, en un ángulo de 90º, se colocó un filtro de interferencia (510 nm) y un sistema de lentes (75 mm de distancia focal), seguido de una cámara CCD de Princeton Instruments Inc., que tenía 1100x330 píxels y enfriada con elementos Peltzier. El dispositivo se conectó a un ordenador que recogió la información.

Para evaluar los resultador, se usó primeramente el programa de ordenador WinView 1.3. Los valores de intensidad máximos de la intensidad de fluorescencia de la gotita se usaron como una aproximación de las intensidades totales.

Los valores de intensidad total se calcularon posteriormente.

Resultados y exposicion Despliegue manual de gotitas y aditivos

Para el despliegue manual de las gotitas en el campo ultrasónico se usó una jeringa y una aguja del tamaño apropiado. Para los adipocitos en solución, se eligió una aguja de 0,8x40 mm con el fin de evitar la lisis mecánica de las células.

Con el fin de facilitar la separación de una gotita de la aguja, se usó un capilar untado con aceite de girasol. Este aceite de color pálido se eligió de forma que no interfiriera con las mediciones mediante la fluorescencia de fondo. La gotita de muestra se retiró de la punta de la aguja mediante el capilar aceitoso y, a continuación, se depositó en el campo ultrasónico. Para facilitar adicionalmente el posicionado de la gotita, la distancia del reflector del levitador puede cambiarse ligeramente. El despliegue de las gotitas en el campo ultrasónico puede hacerse más fácil también mediante el uso de la potencia ultrasónica máxima.

Después del despliegue en el campo ultrasónico, la gotita puede experimentar oscilaciones. La gotita puede estabilizarse ajustando la distancia del reflector o disminuyendo la potencia ultrasónica. Cuando se usa la potencia máxima, la gotita será siempre plana y deformada, por lo que, con el fin de que la gotita sea esférica, la potencia ultrasónica necesita ser baja. La potencia ultrasónica alta puede inducir igualmente un tipo de fenómeno de ebullición en la gotita, es decir, que las burbujas de aire hacen que el líquido parezca como si estuviera hirviendo. Una vez formadas, estas burbujas son difíciles de eliminar, de manera que si esto ocurre, es mejor separar la gotita y bajar la potencia ultrasónica antes de volver a ensayar nuevamente, o bien con la misma gotita o bien con otra nueva. Las burbujas desaparecen rápidamente una vez que la gotita está fuera del campo ultrasónico y, puesto que estas no parecen afectar a la gotita o a su contenido de ninguna manera medible, es frecuentemente más fácil usar la misma gotita cuando se vuelve a ensayar nuevamente.

Los aditivos pueden introducirse manualmente dentro de la gotita levitada mediante una jeringa de cromatografía de gas (aunque, preferiblemente, un dispensador piezoeléctrico o similar introduce los aditivos). La aguja capilar no molesta o atrae la gotita de su nodo. Este procedimiento funciona igualmente bien para la adición tanto de líquidos como de sólidos. Si han de introducirse sólidos, la aguja capilar suele sumergirse ligeramente dentro de la substancia de interés antes de ser introducida dentro de la gotita.

El espectrofotometro de fluorescencia Mediciones de fluorescencia de fondo

Los experimentos sin gotitas en el levitador no mostraron picos en ambas longitudes de onda de excitación. Una gotita de agua (sin ningún fluoróforo presente) no mostró ningún pico, y no hubo diferencia cuando la gotita de agua se colocó en el nodo medio o en los nodos por encima o por debajo del nodo medio, o cuando la potencia ultrasónica fue alta o baja.

Determinación del límite de detección de concentración de fluoróforo

Se ensayaron diferentes concentraciones de HPTS y se encontró que 0,1 mM (en el medio de valoración) era la mejor para estas mediciones. Aunque la concentración de 10 \muM fue igualmente detectable, esta proporcionó picos muy bajos que mostraron ser difíciles de evaluar adecuadamente.

Las concentraciones superiores a 0,1 mM proporcionaron picos de gran altura así como gran anchura, pero puesto que la concentración de HPTS 0,1 mM había mostrado ser satisfactoria, no se continuó más esta línea de experimentación. Si la concentración del fluoróforo se mantiene tan baja como sea posible, es menos probable que la célula y las reacciones sean afectadas en aspectos no deseables por el fluoróforo.

Experimentos ácido/base y gotita

Con el fin de ensayar la dependencia del HPTS por cambios en el pH, se introdujo ácido acético e hidróxido sódico en la gotita (HPTS 1 mM en agua) en diversas cantidades y relaciones. En la Tabla 1 se enumeran los resultados. La intensidad de fluorescencia, medida como altura del pico, disminuye al disminuir el pH cuando se usa la longitud de onda de excitación de 435 nm. Cuando esta longitud de onda es de 405 nm, la intensidad de fluorescencia aumenta al disminuir el pH.

La relación de intensidad (435/405) disminuye al disminuir el pH y aumenta al aumentar el pH.

TABLA 1 Intensidades (medidas como altura de pico en mm) y relaciones de intensidades después de la adición de ácido acético (CH_{3}COOH) e hidróxido sódico (NaOH) a gotitas de 2,5 \mum (concentración de HPTS en agua, 1mM)

Aditivos	Intensidad_{435} (mm)	Intensidad_{405} (mm)	Relación de
			intensidad_{(435/405)}
Ninguno	51	84	0,61
1 \mulCH_{3}COOH 1 mM	34,5	98	0,35
2 \mulCH_{3}COOH 1 mM	29	111	0,26
2 \mulCH_{3}COOH 1 mM	67	106	0,63
y 1 \mul NaOH 1 mM
2 \mulCH_{3}COOH 1 mM	86	104	0,84
y 2\mul NaOH 1 mM

Evaporación de la gotita

Se encontró que las intensidades de fluorescencia resultaban afectadas por la evaporación continua de la gotita. La Figura 4 muestra que las intensidades (medidas como altura de pico en mm) a ambas longitudes de onda, disminuyen con el tiempo y la evaporación. Esta disminución es mayor y más marcada para la longitud de onda de excitación de 405 nm, pero la disminución afecta también a la longitud de onda de 435 nm.

Esta disminución es debida al hecho de que la concentración de HPTS de 0,1 mM es demasiado alta para ser útil. Cuando se produce la evaporación de la gotita, la concentración de fluoróforo se incrementa hasta un punto en el cual induce la auto-absorción. Incluso aunque se aumente la concentración de fluoróforo, los instrumentos detectarán menos intensidad.

La evaporación da lugar igualmente a un incremento en las relaciones de intensidad con el tiempo y la evaporación (Figura 5). Esto presentaría un problema real cuando han de medirse pequeños cambios de pH, puesto que sería muy difícil establecer si la subida o caída de intensidad era debida al cambio de volumen o al cambio de pH.

Lipólisis en gotita

Se realizaron experimentos para establecer si el procedimiento de lipólisis en las células en la gotita era detectable. La Figura 6 muestra las intensidades de fluorescencia (medidas como altura de pico en mm) durante dicho experimento. A la gotita, se agregaron 1 \mul de isoprenalina e insulina después de 2 minutos y 7 minutos, respectivamente.

La intensidad de excitación a la longitud de onda de 405 nm disminuye uniformemente durante aproximadamente 6 minutos, al cabo de cuyo tiempo la intensidad salta hacia arriba hasta que la adición de insulina la hace disminuir de manera visible nuevamente. Sin embargo, la intensidad suele aumentar al disminuir el pH (es decir, después de la adición de isoprenalina). Cuando se ha agregado la insulina, la intensidad suele interrumpir su aumento, puesto que se interrumpe el proceso de lipólisis. Para la excitación a la longitud de onda de 435, suele ocurrir lo contrario.

Claramente este no es el caso para las intensidades a cualquier longitud de onda. Probablemente, parece que esto es, al menos parcialmente, un efecto de la evaporación de la gotita; tal como muestra la Figura 4, la intensidad a 405 nm disminuye con el tiempo y volúmenes decrecientes. No obstante, es difícil explicar el repentino salto hacia arriba de intensidad a los 6 minutos de tiempo. Obviamente, esto no está relacionado de ninguna manera con la adición de isoprenalina o insulina y los consiguientes cambios de volumen. Más probable es la explicación de que la alta concentración de fluoróforo hace imposible alcanzar ningún resultado fiable.

En la Figura 7 se demuestran las relaciones de intensidad de fluorescencia a partir del mismo experimento. Cuando únicamente está implicada la evaporación, la relación aumenta uniformemente con el tiempo (Figura 5), pero este no es el caso presente. Existe una nivelación defenida de los valores de las relaciones a lo largo del tiempo cuando la lipólisis suele producirse dentro de la gotita. Esto es lo que sería de esperar, de acuerdo con la teoría, aunque considerando el comportamiento de los valores de intensidad y el hecho de que la alta concentración de fluoróforo da lugar a la auto-absorción, esto no es suficiente como para concluir que el proceso de lipólisis sea detectable con este procedimiento.

Mediciones con lampara de mercurio/camara CCD Mediciones de fluorescencia de fondo

Con el fin de obtener la intensidad de fondo, se realizaron experimentos sin gotita en el levitador a la longitud de onda de excitación de 405 nm. Prácticamente no fue posible obtener imágenes de fondo a ambas longitudes de excitación durante una serie de mediciones. No obstante, el valor de fondo obtenido cuando se excitó a 435 nm no difiere significativamente del obtenido a 405 nm.

Posición, forma y tamaño de la gotita

Como regla, las gotitas se posicionaron siempre en el nodo directamente encima del nodo medio del levitador (el segundo nodo). Esto fue únicamente por razones prácticas y operacionales.

La gotita se mantuvo tan esférica como fue posible, ajustando la potencia ultrasónica del levitador.

El tamaño promedio de las gotitas usadas fue aproximadamente de 2,5 \mul, aunque las gotitas colocadas manualmente en el levitador fueron de tamaños ligeramente diferentes. Esto ocasiona algunos problemas, tal como se mostrará más adelante; por ello, es preferible posicionar la gotita usando un dispensador piezoeléctrico o similar, de manera que las gotitas tengan exactamente el mismo volumen cada vez.

Los experimentos se realizaron procurando minimizar el tamaño de la gotita, dejando evaporar parcialmente la gotita y, a continuación, usando el CMD para mantener este volumen más pequeño constante. Este camino fue únicamente parcialmente satisfactorio. Para que la minimización del volumen de la gotita se lleve a cabo bien, surgieron otros problemas. Fue simplemente imposible introducir manualmente aditivos dentro de estas gotitas pequeñas, puesto que se agarraron por sí mismas al capilar de la geringa de GC mucho más fácilmente que a las gotitas más grandes. Una vez agarradas al capilar, no hubo forma de volverlas a posicionar en el campo ultrasónico. Sin embargo, este camino es adecuado cuando los aditivos se introducen con un dispensador piezoeléctrico, un CMD o un dispositivo similar.

Determinación del límite de detección de concentración de fluoróforo

Los experimentos muestran que las concentraciones nanomolares del fluoróforo son detectables con este procedimiento. Hasta ahora, las concentraciones de fluoróforo de 100 nM, 10 nM y 1 nM han mostrado ser apropiadas. Mediante el uso de diferentes filtros y ajustando el foco de la luz de excitación, pueden optimizarse las intensidades resultantes de las diferentes concentraciones. Por las razones anteriormente mencionadas, se eligió la concentración de fluoróforo más baja de 1 nM para experimentos posteriores. No obstante, es posible que incluso con concentraciones menores el fluoróforo pueda ser detectable.

Igualmente, se realizaron experimentos usando una concentración de fluoróforo de 0,1 mM (Figura 8) para comparar con los resultados procedentes de las mediciones de evaporación con el espectrofotómetro de fluorescencia (Figura 4). Los resultados muestran que esta concentración podría usarse bien en esta disposición experimental; sin embargo, es demasiado alta para ser de cualquier interés real, excepto cuando se comparan resultados del espectrofotómetro.

Experimentos ácido/base con gotita

Con el fin de ensayar la dependencia del HPTS con los cambios en el pH, se introdujo ácido acético e hidróxido sódico de diferentes concentraciones dentro de la gotita (HPTS 10 \muM en agua). Los resultados, enumerados en la Tabla 2, muestran que las relaciones de intensidad (435/405) varían con el pH de acuerdo con la teoría, mientras que las intensidades de fluorescencia para cada longitud de onda son más complicadas de evaluar.

La intensidad de fluorescencia a 435 nm se incrementa al disminuir el pH de la gotita tal como se esperaba, pero para la longitud de onda de excitación de 405 nm, el cuadro es más complicado. La intensidad cuando se agrega 1 \mul de hidróxido sódico 100 nM es mayor que cuando se agrega 1 \mul de ácido acético 100 mM, y esto no está de acuerdo con la teoría. Es probable que este efecto sea debido a diferentes volúmenes de las gotitas. La excitación a la longitud de onda de 405 nm ha mostrado ser más sensible que a la de 435 nm y podría resultar favorablemente afectada en este sentido igualmente por cambios muy pequeños en el volumen y tamaño de la gotita. En cualquier caso, la información importante se encuentra en las relaciones de intensidad, y estas se han comportado totalmente como se esperaba.

TABLA 2 Intensidades y relación de intensidades después de la adición de ácido acético (CH_{3}COOH) e hidróxido sódico (NaOH) a gotitas de 2,5 \mum (concentración de HPTS en agua, 10 mM) Resultados evaluados con WinView 1.3.

Aditivos	Intensidad_{435} (mm)	Intensidad_{405} (mm)	Relación de
			intensidad_{(435/405)}
1 \mulNaOH 100 mM	1611	1442	1,12
2 \mulCH_{3}COOH 100 mM	0	1289	0
1 \mulCH_{3}COOH 10 mM	651	2027	0,32

Evaporación de la gotita y el microdispensador continuo

Las intensidades de fluorescencia resultaron afectadas por la evaporación continua de la gotita en esta disposición instrumental. La Figura 9 muestra que las intensidades a ambas longitudes de onda aumentan con el tiempo y la evaporación; este fenómeno es el opuesto al encontrado con el espectrómetro de fluorescencia (Figura 4). Las intensidades aumentan para ambas longitudes de onda de excitación, aunque el incremento es mayor para la longitud de onda de excitación a 405 nm.

Este aumento es debido al hecho del incremento de concentración del fluoróforo producido por la evaporación del agua, y esto afecta igualmente a las relaciones de intensidad (Figura 10). La relación de intensidad aumenta con el tiempo y la evaporación, tal como sucedió cuando se usó el espectrofotómetro de fluorescencia, dando esto lugar a la aparición del mismo problema en esta aplicación. Cuando la lipólisis se está produciendo en los adipocitos en la gotita, es decir, cuando el pH del tampón está disminuyendo, la relación de intensidad suele igualmente disminuir. Pero, puesto que este, de hecho, aumenta con el tiempo, esto protegería el cambio esperado de intensidad de ambas longitudes de onda de excitación y de la relación de intensidad igualmente.

El incremento en las intensidades de fluorescencia debido a la evaporación de la gotita puede evitarse si se agrega continuamente agua a la gotita en pequeñas cantidades. La Figura 11 muestra intensidades de fluorescencia durante 10 minutos cuando se usó un microdispensador continuo (CMD) para mantener el volumen de la gotita tan próxima o un volumen constante como fuera posible. El CMD operó con una frecuencia de 10 Hz, lo cual es igual a una adición de agua de aproximadamente 1 nl/s. Los resultados se evaluaron con el programa de ordenar Drop, e hicieron posible el uso de los valores de intensidad totales. Los resultados se compararon con los mostrados en la Figura 6 (evaluados con WinView 1.3).

La Figura 11 muestra que el aumento de la intensidad de fluorescencia al disminuir el volumen de la gotita ha cesado realmente para ambas longitudes de onda de excitación. Esto significa que la detección de cambios en la intensidad de fluorescencia debidos a pequeños cambios de pH, pueden detectarse con este procedimiento.

La Figura 12 muestra intensidades de fluorescencia para las longitudes de onda de excitación de 405 nm durante la adición continua de agua a una gotita de 2,5 \mul de HPTS 1 nM y PCV al 1,3%. El CMD se operó con las diferentes frecuencias de 10, 50 y 100 Hz. Cuando se usó la frecuencia más baja, los valores de intensidad forman una línea recta, pero al aumentar la frecuencia, los valores de intensidad disminuyen, en respuesta al cambio de volumen de la gotita cuando se agrega más y más agua. Esto muestra la importancia de elegir la frecuencia de CMD correcta y lo que sucedería si se agregara demasiado o poco agua a la gotita.

El tamaño original de la gotita afecta igualmente a la elección de la frecuencia de CMD apropiada. Las gotitas pequeñas se evaporan a una velocidad superior que las gotitas más grandes y, por ello, precisan la adición de agua con mayores frecuencias que las gotitas más grandes. Por otra parte, una frecuencia de DMD demasido alta hace aumentar más lentamente el volumen de la gotita.

Esto problema se resuelve de manera fácil simplemente eligiendo una frecuencia a usar y, a continuación, dejando estabilizar el volumen de la gotita por sí mismo. Si la frecuencia elegida es demasiado alta para la gotita en cuestión, el volumen de la gotita aumentará hasta un punto en el que el CMD se mantendrá constante a la frecuencia admitida. Si la frecuencia elegida es demasiado baja, en ese caso, la gotita se evaporará hasta que alcance el punto en el cual el volumen se corresponde con la frecuencia de DMD. Una vez logrado esto, los valores de intensidad de fluorescencia se estabilizarán.

La Figura 17 muestra una comparación entre la evaporación de la gotita y el control del volumen de la gotita usando el CMD durante 80 segundos. Durante el experimento de control del volumen, el CMD se operó con una frecuencia de 10 Hz, agregando aproximadamente 1 nl/s. Resulta evidente a partir de la Figura 17, que el CMD estabiliza el volumen de la gotita y la fluorescencia.

Sin embargo, subsiste aún otro problema. Incluso si puede evitarse el cambio de volumen ocasionado por la evaporación, la adición de la isoprenalina y la insulina afecta igualmente el volumen de la gotita. No solamente los valores de intensidad disminuirán en respuesta al drástico cambio de volumen de la gotita, sino que además la frecuencia de CMD no estará ya optimizada, con lo cual se producirá nuevamente la evaporación. La solución es introducir aditivos en cantidades muy pequeñas con un CMD o en forma sólida, ninguno de los cuales ocasionaría ningún cambio drástico de volumen.

Con el fin de permitir la inyección de isoprenalina en cantidades pequeñas, se conectó un inyector al CMD. Este no se comportó demasiado bien, en gran parte debido a que lleva tiempo el lavar el CMD con la solución de isoprenalina, tiempo en el cual puede producirse, y de hecho así sucede, la evaporación de la gotita. Esto significa que antes de que el CMD pueda aplicarse para agregar isoprenalina a la gotita, la evaporación ha comenzado ya hasta un punto en el que debería cambiarse la frecuencia de CMD, solamente que ahora no existe modo de determinar qué frecuencia sería la apropiada. La solución de isoprenalina proporciona agua adicional a la gotita, pero igualmente proporciona isoprenalina que pone en marcha la lipólisis de las células en la gotita y, por ello, es imposible estabilizar los valores de intensidad antes de la realización de las mediciones. Es preferible usar un CMD para ajustar el agua y uno para cada aditivo, cerrándose los CMD que no se usen, mientras que el necesario para el momento proporciona tanto el agua como el aditivo en cuestión. De esta manera, no transcurre nada de tiempo entre el cierre del CMD que agrega el agua justa y la apertura del CMD que proporciona el aditivo.

Si los reactivos han de introducirse en forma de sólidos, surgen otros problemas. Es absolutamente fácil introducir sólidos dentro de la gotita usando un capilar sumergido en la substancia de interés y, a continuación, colocarlo dentro de la gotita levitada. Es igualmente un procedimiento rápido, que escasamente consume el tiempo suficiente como para causar problemas con la evaporación y la frecuencia de CMD. Pero, con este procedimiento, es imposible determinar la cantidad de reactivo sobre el capilar y la concentración de los reactivos una vez que han entrado en la gotita. La disolución del reactivo en la gotita sería diferente cada vez, puesto que el procedimiento de mezclado está afectado por características de la gotita tales como forma, giros y corrientes dentro de la gotita.

Lipólisis en la gotita

La Figura 13 y la Figura 14 muestran las intensidades de fluorescencia y las relaciones de intensidad (435/405), durante un procedimiento en el que el proceso de lipólisis en las células en la gotita de 2,5 \mul se inició mediante la adición de alrededor de 1 \mul de insulina 1 nM. La concentración de fluoróforo usada fue de HPTS 1 nM en tampón de valoración con PCV al 1,3%. Durante este experimento, no se usó CMD; es decir, no se agregó agua adicional a la gotita excepto la que estaba presente en las soluciones de isoprenalina e insulina.

Después de la adición de isoprenalina, las intensidades para ambas longitudes de onda de excitación disminuyeron inmediatamente. Esto fue causado por el aumento de volumen de la gotita y la subsiguiente disminución de la concentración de fluoróforo. El mismo fenómeno ocurre después de la adición de insulina, y está causado por el mismo hecho. Los efectos muestran igualmente que, cuando se midió la relación de intensidad, la relación disminuye cuando el volumen aumenta.

Para la longitud de onda de excitación a 405 nm, las intensidades continúan aumentando después de la adición de isoprenalina. Este caso se produciría de cualquier modo, incluso si no se produjera reacción en la gotita, debido a la evaporación, pero es probable que el aumento de intensidad en este caso fuera más lento. Si esto fuera únicamente un efecto de la evaporación, las intensidades no formarían una línea pronunciada de este tipo. Cuando el volumen de la gotita aumenta, la velocidad de evaporación normalmente disminuye.

La comparación de la Figura 13 con la Figura 14 muestra que, en ambos casos, los valores de intensidad para la longitud de onda de excitación de 405 varían alrededor de aproximadamente 100.000 unidades, una dispersión que podría sugerir que el aumento real de los valores de intensidad en la Figura 13 no es de hecho un aumento verdadero. Sin embargo, la concentración de fluoróforo no fue la misma en estos dos experimentos. La Figura 13 muestra los resultados procedentes de un experimento cuando se usó una concentración de fluoróforo de 1 nM, en tanto que la Figura 11 muestra los resultados obtenidos con una concentración de fluoróforo de 10 nM. La concentración de fluoróforo más baja da lugar a unos valores de intensidad más bajos que a concentración más alta, haciendo que sea difícil una comparación de los resultados en las Figuras 13 y 11.

Para la longitud de onda de excitación de 435 nm, el cuadro el completamente diferente. Después de la adición de isoprenalina, las intensidades forman una línea recta. Si se ha producido lipólisis, sería de esperar que las intensidades disminuyeran. Pero, por otra parte, si la evaporación fuera aquí el único fenómeno, las intensidades aumentarían lentamente con el tiempo. Puesto que este no es el caso, debe concluirse que la línea aparentemente recta es, de hecho, una disminución de intensidad que está protegida por los efectos de la evaporación.

Las relaciones de intensidad (Figura 14) disminuyen después de la adición de isoprenalina y, posteriormente, continúan haciéndolo hasta la adición de insulina. Esta disminución no es grande, pero considerando los pequeños cambios de pH en la gotita, esto no es más de lo que podría esperarse.

La Figura 15 y la Figura 16 muestran un experimento similar, pero, en este caso, con adición continua de pequeñas cantidades de agua con el CMD, con el fin de evitar los efectos de la evaporación. El CMD se operó a una frecuencia de 10 Hz (aproximadamente, agregando agua a una velocidad de 1 nl/s). El procedimiento de lipólisis en los adipocitos se inició en la gotita de 2,5 \mul mediante la adición de aproximadamente 1 \mul de isoprenalina 300 nM a la gotita y, a continuación, interrumpiéndole mediante la adición de alrededor de 1 \mul de insulina 1 nM. La concentración de fluoróforo usada fue 10 nM de HPTS en tampón de valoración con PCV al 1,3%.

Antes de la adición de isoprenalina, las intensidades para ambas longitudes de onda de excitación suelen formar una línea recta. Este no es enteramente el caso para ninguna de ellas, aumentando ligeramente las intensidades a pesar de la presencia del CMD. Esto sugiere que los efectos de la evaporación no estuvieron totalmente ausentes cuando se llevó a cabo este experimento, y que la estabilización de los valores de intensidad y del volumen de la gotita deberían sido permitidos actuar durante algún tiempo más largo. La adición de isoprenalina e insulina afecta, igualmente, al volumen de la gotita, de manera que las intensidades en ambos casos disminuyen inmediatamente después de una adición, tal como podría esperarse.

Después de la adición de isoprenalina y de la disminución inicial de intensidad, las intensidades para la longitud de onda de excitación de 405 nm comenzaron a aumentar. Para la longitud de onda de excitación de 435 nm, la intensidad disminuye igualmente inicialmente en respuesta al volumen agregado y, a continuación, continúa disminuyendo en tanto que perdura la estimulación con isoprenalina. Esta disminución no es marcada, pero es claramente visible. Para ambas longitudes de onda de excitación, estos son efectos que indican que la disminución en el pH se realzó mediante la adición de isoprenalina y la subsiguiente iniciación de la lipólisis.

Es importante recordar que el CMD en los presentes experimentos no puede esperarse que prevenga completamente los efectos de la evaporación una vez que se ha llevado a cabo la adición de reactivos, puesto que estos cambian el volumen drásticamente. Puede ser que las gotitas de mayor tamaño se evaporen más lentamente que las pequeñas, pero, sin embargo, la evaporación se producirá. Después de la adición de isoprenalina, la frecuencia de CMD de 10 Hz no es ya lo bastante larga como para mantener el volumen constante (especialmente desde que este no parece ser haber sido totalmente el caso incluso antes de la adición de isoprenalina, aunque en un grado menor). Esto significa que incluso considerando que se ha usado el CMD, la evaporación se ha producido, protegiendo parte de los cambios de intensidad dependientes del pH.

Los mismos efectos podrían esperarse después de la adición de insulina, y probablemente en un grado mayor, puesto que es la segunda vez en un corto plazo mientras que el volumen de la gotita aumenta drásticamente. Para la longitud de onda de excitación de 405 nm, este no parece ser el caso, pero para la longitud de onda de 435 nm, no existen dudas de que las intensidades comienzan a aumentar después de la adición de insulina.

Las relaciones de intensidad (Figura 16) disminuyen de acuerdo con la teoría cuando se agrega isoprenalina y comienzan a aumentar cuando se agrega insulina. Esto último es, probablemente, un efecto de la evaporación.

La Figura 18 muestra el cambio en las relaciones de intensidad de dos experimentos en los que se usó un CMD para mantener el volumen de la gotita constante y otros dos CMD se usaron para la adición del reactivo. Se estudió la lipólisis de 12 adipocitos en gotitas de 0,5 \mul. La concentración de fluoróforo usada fue de 10 nM de HPTS en tampón de valoración. Inicialmente, las relaciones de intensidad formaron líneas rectas que disminuyeron cuando se agregó isoprenalina 300 nM. En uno de los experimentos, se agregó posteriormente insulina 1 nM y, de esta forma, se estabilizaron las relaciones de intensidad, formando nuevamente una línea recta. En el otro experimento, no se realizaron otras adiciones y la disminución en las relaciones de intensidad continuó a lo largo del experimento. Esto muestra claramente que el uso del CMD elimina el problema con los cambios de volumen en la gotita levitada.

Conclusiones

Se ha mostrado que el procedimiento de lipólisis en adipocitos en una gotita de tampón levitada es detectable mediante este procedimiento. Las ventajas del procedimiento son las pequeñas cantidades de todo lo esencialmente necesario para los experimentos, tal como fluoróforo, células, reactivos, etc. Igualmente, es un procedimiento rápido, una vez que se han optimizado los procedimientos. La ausencia de superficies de contacto es igualmente una ventaja fundamental, ya que la gotita de hecho es un pequeño recipiente sin paredes.

El uso del CMD en el estudio para evitar la evaporación de las gotitas ha probado ser ventajoso. Se ha mostrado que, con este dispositivo, los valores de intensidad de fluorescencia se estabilizan, una característica importante cuando se realizan estos experimentos. En todo momento, es necesario un CMD para mantener la evaporación bajo control. Preferiblemente, se usa otro CMD para la adición de reactivos a la gotita, ya que esto supondría que podrían agregarse volúmenes mucho más pequeños de reactivos, suficientemente pequeños como para no producir efectos de volumen no deseados.

Claims (20)

1. Un sistema para la realización de ensayos de pequeño volumen, el cual comprende:

i. un levitador para la suspensión de una gotita;

ii. un dispensador para el suministro de una substancia que hace posible la realización de un ensayo en la superficie de la gotita suspendida; y

iii. un sistema detector para la detección de cambios en la gotita,

en el que se proporcionan medios para el suministro de cualquier substancia adecuada para contrarrestar los efectos de la evaporación en la superficie de la gotita suspendida con un dispensador y/o para la suspensión de la gotita en una atmósfera saturada con agua, de manera tal que durante su uso, las gotitas se mantienen de manera estable mediante la compensación de la evaporación procedente de la gotita.

2. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el levitador es un levitador acústico.

3. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en el que el dispensador es un dispensador piezoeléctrico.

4. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en el que la substancia que hace posible que para la realización de un ensayo sea suministrada a la superficie de la gotita suspendida es un péptido, ligando, receptor, enzima o componente de fármaco, opcionalmente marcado.

5. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la substancia adecuada para contrarrestar los efectos de la evaporación es agua.

6. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que existen más de un dispensador y más de una substancia es suministrada a la superficie de la gotita suspendida.

7. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema de detección detecta cambios en la absorbancia, fluorescencia, radioactividad, quimioluminiscencia o colorimetría.

8. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la gotita está dentro del intervalo de 1 fl a 100 \mul.

9. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la gotita contiene una proteína, una enzima, un substrato de enzima, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, péptidos, proteasas, receptores, ligandos, hormonas o una molécula fármaco.

10. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que la gotita contiene células.

11. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que la gotita contiene esférulas.

12. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 1, el cual comprende:

1. una fuente de iluminación central;

2. uno o más dispensadores para la formación de una gotita suspendida y/o para el suministro de una substancia a la superficie de una gotita suspendida;

3. uno o más levitatores posicionados adjacentes a la fuente de iluminación y en una posición en la que la gotita suspendida puede ser iluminada mediante rotación de la fuente de iluminación; y

4. detectores posicionados para la medición de cambios en las gotitas suspendidas.

13. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que la fuente de iluminación está asociada con un espejo u otro medio reflector, el cual da lugar a que la luz emitida rote alrededor de la fuente de iluminación central.

14. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 12 o la Reivindicación 13, en el que la fuente de iluminación es un láser.

15. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 14, en el que existe un cierto número de levitadores dispuestos de manera tal que las gotitas suspendidas están posicionadas alrededor de la fuente de iluminación central, de forma que cada gotita suspendida pueda ser iluminada por la luz rotatoria.

16. El uso del sistema de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 en un ensayo.

17. El uso del sistema de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 en un ensayo de rastreo de candidatos para fármacos.