ES2209828T3

ES2209828T3 - Un recipiente para mezclar lisados de celulas.

Info

Publication number: ES2209828T3
Application number: ES00907873T
Authority: ES
Inventors: Alvin Williams Nienow; Anthony Gordon Hitchcock; Grainne Lois Riley
Original assignee: Cobra Biologics Ltd
Current assignee: Cobra Biologics Ltd
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: AU754606B2; KR20020009566A; ATE253976T1; CN1343136A; CN1229172C; HK1042663B; JP2002537868A; HK1042663A1; DE60006496T2; DE60006496D1; CA2361699A1; EP1159062A1; PT1159062E; AU2933500A; EP1159062B1; WO2000053304A1; DK1159062T3

Abstract

Un recipiente para mezclar una suspensión de células o un lisado de células que contiene DNA cromosómico y un producto deseado, en el que el recipiente que comprende: (a) una o más hélices de un índice de potencia bajo, de un índice de potencia inferior a 2, colocadas de manera que la hélice o las hélices disipen uniformemente energía en la totalidad del contenido del recipiente; (b) una o más tuberías de alimentación que permiten añadir fluidos a una zona bien mezclada formada en torno al extremo distal de una o más de las hélices; y (c) uno o más deflectores distanciados sustancialmente por igual en torno a la superficie interior del recipiente, en el que uno o más deflectores se extienden sustancial y paralelamente al eje de rotación de la hélice o de cada hélice, en el que el índice de potencia, Po, se calcula de acuerdo con la fórmula 2NM Po N3D5 en la que 2NM es igual a la potencia (W) Po es un índice de potencia y es adimensional N es la velocidad de la hélice (rps) M es el par detorsión (Nm) es la densidad del líquido a mezclar (kg m-3) D es la longitud de la hélice (m).

Description

Un recipiente para mezclar lisados de células.

Esta invención se refiere a un recipiente para mezclar un lisado de células. La invención también se refiere a un método para usar el recipiente para mezclar un lisado de células con el fin de obtener productos de alta pureza tales como ácidos nucleicos o proteínas de uso en una variedad de aplicaciones.

La lisis alcalina de células bacterianas es una técnica de laboratorio bien establecida para recuperar DNA de plásmido de células huésped (Birnboim y otros, Methods Enzymol. 100, 243-255, 1983). El método implica la adición de un detergente, usualmente dodecilsulfato sódico (SDS), e hidróxido sódico a una suspensión de células bacterianas, a lo que sigue la adición de una solución neutralizante fuerte, usualmente acetato potásico o ácido acético glacial, después de un corto período de incubación. Esto da por resultado una solución que contiene agregados grandes, también denominados flóculos, que comprenden DNA cromosómico desnaturalizado, proteína, material de la pared y/o membrana celular. Los flóculos se eliminan de la solución por filtración grosera o centrifugación, dejando una solución que contiene DNA de plásmido que se puede purificar seguidamente por una variedad de procedimientos estándar.

El método está basado primeramente en la rotura química de las paredes y membranas celulares, seguida de la solubilización y desnaturalización de componentes celulares en una solución alcalina. La capacidad del DNA de plásmido para renaturalizarse después de la neutralización y la incapacidad del DNA cromosómico para hacerlo análogamente permite el aislamiento del DNA de plásmido.

El método de lisis alcalina y las propiedades de las soluciones producidas en varias etapas del método de lisis alcalina han tenido anteriormente sólo un interés académico. Sin embargo, con la llegada de la terapia con genes humanos, utilizando DNA de plásmido obtenido de células huésped tales como E. coli, hoy en día se requiere la producción de grandes cantidades de DNA de plásmido de muy alta pureza. El requerimiento de esta producción a gran escala ha aumentado la necesidad de nuevas técnicas de manera que pueda incrementarse la escala y robustez de las operaciones al nivel y calidad requeridos.

El DNA cromosómico se encuentra tanto en procariotes como en eucariotes y es conocido que tiene propiedades viscoelásticas, que previamente se han utilizado para determinar el tamaño de las moléculas de DNA (Chase y otros, Biophys. J. 28, 93-105, 1979). También se han reconocido propiedades viscoelásticas cuando se ha usado el procedimiento de lisis alcalina para aislar DNA de plásmido a partir de bacterias (Nienow, AIChE Annual Meeting, noviembre de 1998, Florida, USA). Una característica del procedimiento es el cambio de las propiedades reológicas de la solución en varias etapas del procedimiento. Estudios de estas propiedades reológicas han revelado que la suspensión inicial de células presenta características newtonianas. Las características de un fluido newtoniano pueden resumirse por tres criterios: (1) viscosidad constante y, cuando un fluido fluye en condiciones laminares: (2) la tensión de cizallamiento es directamente proporcional a la velocidad de cizallamiento, y (3) la única tensión generada es la tensión de cizallamiento (Barnes y otros, Introduction to Rheology, 1989, y Ciccolini y otros, Biotechnology and Bioengineering, 60, 768-770, 1998). Se ha encontrado que las suspensiones de células tienen una viscosidad que es casi constante, con un valor muy similar a la del agua, esto es, de menos de 3 mPa (Ciccolini y otros, Biotechnology and Bioenginnering, 60, 768-770, 1998). Cuando se añade la solución alcalina de detergente, las propiedades de la solución cambian espectacularmente resultando una solución que tiene una viscosidad dependiente del cizallamiento relativamente baja, con un valor máximo de aproximadamente 22 mPas a una velocidad de cizallamiento de 350 s^{-1} cuando se lisa una solución de aproximadamente 120 g de células húmedas/l. A pesar de la baja viscosidad aparente de la solución, es altamente visoelástica y da un efecto Weissenburg alto. El efecto de Weissenburg es conocido también como "barra trepante" y se define como el efecto creado cuando un eje o barra gira en una solución viscoelástica (Barnes y otros, Introduction to Rheology, 1989). Un fluido newtoniano sería forzado por inercia hacia los lados exteriores de un recipiente, mientras que un fluido elástico trepa sobre el eje como consecuencia directa de la tensión normal (una característica de un fluido viscoelástico) que actúa como un aro en torno al eje. Las propiedades viscoelásticas de la solución de lisado se han caracterizado usando un reómetro que funciona al modo oscilante. Se encontró que el ángulo de la fase de la solución era de 58º, siendo 0º el de un sólido y 90º el de un fluido inelástico. Esto demuestra las propiedades elásticas de la solución. La viscosidad aparente relativamente baja en combinación con la viscoelasticidad es muy inusual, ya que la mayoría de los fluidos viscoelásticos también presentan unas viscosidades aparentes altas. Al neutralizar, la viscoelasticidad de la solución se desmorona, de manera que nuevamente la viscosidad es baja, próxima a la del agua, sin indicios de viscoelasticidad.

Si bien actúa como etapa crítica en la recuperación y purificación de DNA de plásmido, la etapa de lisis y neutralización tiene el potencial para generar contaminantes adicionales tales como pequeños fragmentos de DNA cromosómico y DNA de plásmido irreversiblemente desnaturalizado.

Los problemas son, al menos parcialmente, el pH y los relacionados en el tiempo, específicamente con respecto al período para el que se puede incubar el DNA de plásmido en la solución alcalina de detergente. Una exposición extensa a la solución alcalina concentrada puede dar por resultado la formación de DNA de plásmido desnaturalizado (Birnboim & Doly, Nuc. Acids Res., 7, 1513, 1979 y solicitud de patente internacional WO 97/29190). El DNA de plásmido desnaturalizado no puede purificarse fácilmente del DNA de plásmido renaturalizado y, por tanto, su presencia conduce a una pérdida significativa de rendimiento de plásmido funcional. Por tanto, es importante que la mezcla se suficientemente vigorosa para asegurar que se eviten extremos localizados del pH y que se minimicen las exposiciones a estas condiciones.

Si la mezcla es demasiado vigorosa en cualquier etapa del proceso, se rompen físicamente cadenas de DNA cromosómico. El DNA cromosómico se puede fragmentar a un tamaño al que los fragmentos se pueden renaturalizar después de la neutralización y someterlos al procedimiento de recuperación y purificación. El DNA cromosómico fragmentado contaminará la solución y creará un significativo problema de purificación, ya que tiene propiedades similares a las del DNA de plásmido y no puede separarse con facilidad por técnicas tales como cromatografía al nivel requerido por las autoridades competentes de los productos clínicos. También, si la mezcla es vigorosa durante la neutralización, los flóculos formados se hacen demasiado pequeños debido a la tensión mecánica y no pueden eliminarse fácilmente por centrifugación o filtración.

Taxativamente, el proceso de mezcla debe ser capaz de lograr una mezcla rápida sin crear una lesión química o mecánica innecesaria al DNA de plásmido, además de limitar la lesión mecánica al DNA cromosómico e, idealmente, sin dañar mecánicamente el material floculado. Análogos problemas se presentan cuando se aislan proteínas de cultivos de células.

Durante el proceso se producen significativos cambios de volumen. Usualmente, el detergente alcalino añadido a la suspensión de células es igual al volumen, o dos veces el volumen, de la suspensión inicial y la solución de neutralización usualmente tiene el mismo volumen que la suspensión inicial de células. Consecuentemente, la suspensión inicial de células puede representar sólo el 25% del volumen final a mezclar.

Cualquier operación de mezcla debe tener en cuenta estos cambios de volumen de manera que se pueda mezclar eficientemente una amplia gama de volúmenes. Además de esto, y especialmente en sistemas en los que funcionan más de una hélice, preferiblemente se trabaja en etapas para minimizar el atrapamiento de aire en la solución por las hélices que cruzan la interfaz aire/líquido. Tal atrapamiento puede causar daños mecánicos y fragmentación del DNA cromosómico.

A escala de laboratorio, el proceso de lisis alcalina se logra mediante "mezcla suave", tal como la inversión de un tubo de ensayo o una botella. Esta técnica es claramente limitada en cuanto a la escala y está sometida a la influencia del operador. Sin embargo, algunas compañías realizan esta operación usando volúmenes de hasta 5 l como máximo (Oral Presentation, por Schleef M., Bio-Europe, 1997, Cambridge, Inglaterra, 1997).

Si el DNA de plásmido y otros productos derivados de células se han de producir en forma pura, adecuada para ensayos clínicos, se requiere un método de mezcla a escala variable durante el proceso de lisis para solventar los problemas detallados antes.

Se han descrito métodos usando mezcladoras estáticas, por ejemplo en la solicitud de patente international WO 97/23601, pero no han sido dirigidos a los problemas de calidad, rendimiento y pureza del plásmido.

Marquet y otros (Bio Pharm, septiembre 1995, 26-37, 1955) han discutido en general los métodos para mezclar soluciones durante el proceso de lisis, pero no proporcionan una descripción o datos de un sistema que considere los problemas detallados en lo que antecede.

Los términos "mezclar" y "agitar", tal como se usan aquí, se refieren a mezclar el contenido del recipiente de la presente invención.

La presente invención proporciona un recipiente para mezclar una suspensión de células y/o un lisado de células que contiene DNA cromosómico y un producto deseado, recipiente que comprende:

(a) una o más hélices de un índice de potencia bajo colocadas de manera que la hélice o las hélices disipen uniformemente energía en la totalidad del contenido del recipiente;

(b) una o más tuberías de alimentación que permiten añadir fluidos a una zona bien mezclada formada en torno al extremo distal de una o más de las hélices; y

(c) uno o más deflectores distanciados sustancialmente por igual en torno a la superficie interior del recipiente, de forma que uno o más deflectores se extienden sustancialmente paralelamente al eje de rotación de la hélice o de cada hélice.

Una disipación uniforme de la energía por el contenido del recipiente logra una mezcla uniforme del contenido del recipiente.

El producto deseado puede ser una proteína. Los expertos en la técnica saben bien que las proteínas se pueden aislar de cultivos de células, y se describen procedimientos químico adecuados para la extracción por Falconer y otros (Biotechnology and Bioengineering, 53, 453-458, 1997), Falconer y otros (Biotechnology and Bioengineering, 57, 381-386, 1998) y Falconer y otros (Biotechnology and Bioengineering, 62, 455-460, 1998). Las proteínas deseadas incluyen anticuerpos, hormonas citoquinas, factores de crecimiento, neurotransmisores, enzimas, factores de coagulación, apolipoproteínas, receptores, fármacos, oncogenes, antígenos tumorales, supresores de tumores, proteínas esructurales, antígenos de virus, antígenos de parásitos y antígenos de bacterias. Entre los ejemplos específicos de estas proteínas están incluidas proinsulina, hormona de crecimiento, distrofina, receptores de andrógenos, factor de crecimiento I del tipo de insulina, factor de crecimiento II del tipo de insulina, proteínas que fijan el factor de crecimiento del tipo de insulina, factor de crecimiento epidérmico TGF-\alpha, TGF-\beta, PDGF, factores angiogenésicos (factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos y angiogenina), proteínas de matriz (colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VII, laminina), fenilalanina-hidroxilasa, tirosina-hidroxilasa, oncogenes, (ras, fos, myc, erb, src, sis, jun), secuencia transformante E6 o E7, proteína p53, producto de gen Rb, citoquinas (por ejemplo, IL-1, IL-6,
IL-8) o sus receptores, proteína de cápsido viral y proteínas de organismos víricos, bacterianos y parásitos que se pueden usar para inducir una respuesta inmunológica, y otras proteínas de un significado útil en el cuerpo.

Preferiblemente, sin embargo, el producto deseado es DNA de plásmido.

El término "recipiente", tal como se usa aquí, significa cualquier receptáculo capaz de contener la suspensión de células. El recipiente puede ser de cualquier forma adecuada para mezclar y, preferiblemente, es cilíndrico. Preferiblemente, el recipiente tiene un fondo plano redondo, poco profundo, o de forma de plato, con una pared interior de forma cóncava. Alternativamente, se prefiere que el recipiente tenga un fondo liso. Preferiblemente, el recipiente está cerrado herméticamente y los recipientes cerrados herméticamente son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El recipiente de la presente invención tiene como mínimo un eje rotatorio para que giren las hélices y puede tener más de un eje rotatorio. El uso de dos o más ejes en recipientes de fermentación y otros recipientes mezcladores es bien conocido y es aplicable al recipiente actualmente reivindicado. Preferiblemente, sin embargo, el recipiente tiene sólo un eje.

El término "una suspensión de células", tal como se usa aquí, significa un medio que comprende células. El término "lisado", tal como se usa aquí, se refiere a un medio en el que se han lisado células.

Las células pueden ser cualesquiera células capaces de crecer o mantenerse en un medio, e incluyen células procarióticas y eucarióticas. Preferiblemente, las células son células bacterianas tales como E. coli, células de mamíferos tales como células HeLa, células CHO y lineas de células de mieloma, y células de insectos. Muy preferiblemente, las células son células procarióticas o células eucarióticas inferiores tales como levaduras. Las células pueden estar presentes en lechos microvehículo. Los lechos microvehículo adecuados para cultivar células son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El término "DNA cromosómico" se usa aquí para indicar DNA que forma parte del cromosoma de una célula o un fragmento de ella.

El término "DNA de plásmido" se usa aquí para indicar DNA que forma parte de un plásmido contenido en las células y abarca cualquier forma de DNA de plásmido, incluidos vectores tales como vectores episomales (esto es, BPV), ventores integradores y vectores virales tales como vectores adenovirus y vectores retrovirales, cósmidos, YACs, BACs y PACs.

El término "hélice", tal como se usa aquí, se refiere a un elemento que, al girar en un líquido, causa que se mezcle el líquido. Preferiblemente, la hélice tiene una o más paletas para mezclar el líquido. Hay numerosos tipos diferentes de hélices con diferentes tipos de paletas. Se describen hélices adecuadas para uso en la presente invención en el manual de Ekato de tecnología de mezcladura - Impeller Systems, Ekato, (publicado por Ruhr und Mischtechnik GmbH). Preferiblemente, la hélice es una hélice axial. Una hélice axial se define como una hélice que tiene un componente axial en la corriente que genera. Tal componente axial asegura que la hélice bombee el fluido en una dirección axial atrayendo el fluido axialmente e impulsándolo de manera que el flujo de líquido se mueva a lo largo de los lados del recipiente que son sustancialmente paralelos al eje de rotación de las hélices. La hélice puede ser una hélice helicoidal de tipo de cinta según se describe en el manual de Ekato de tecnología de mezcla - Impeller Systems (citado anteriormente). Una hélice de cinta helicoidal comprende una espiral de tira o paleta unida al eje rotatorio del recipiente con una o más barras. La hélice de cinta helicoidal induce un flujo axial por desplazamiento y también crea un flujo tangencial.

Las hélices usadas en la presente invención son hélices de un índice de potencia bajo. El término "hélice con un índice de potencia bajo" se refiere a una hélice que tiene un índice de potencia (Po) bajo, que es una propiedad de la configuración de hélice/recipiente calculada de acuerdo con la fórmula siguiente:

Po = \frac{2\pi NM}{\rho N^{3} D^{5}}

en la que

2\piNM es igual a la potencia (W)

Po es un índice de potencia y es adimensional

N es la velocidad de la hélice (rps)

M es el par de torsión (Nm)

\rho es la densidad del líquido a mezclar (kg m^{-3})

D es la longitud de la hélice (m).

Un índice de potencia bajo se define aquí como que es menor que 2, más preferiblemente menor que 1 y, muy preferiblemente, menor que 0,5 cuando se mide en un fluido newtoniano, específicamente agua.

Preferiblemente, las hélices son las hélices INTERMIG®, fabricadas por Ekato en Alemania. Una hélice INTER-
MIG® es una hélice de contracorriente multietapas con interferencia. La INTERMIG® tiene una paleta doble exterior en cada extremo distal y la doble paleta está situada en una posición escalonada en una dirección periférica. El efecto axial de la hélice INTERMIG® se aumenta por el escalonamiento de las paletas exteriores. En la Figura 3 se presenta una hélice INTERMIG®. Alternativamente, la hélice preferida es una hélice de cinta helicoidal según se define en el manual Etako de tecnología de mezcla - Impeler Systems (cita anterior). La hélice de cinta helicoidal puede ser una cinta helicoidal continua o puede ser modificada de manera que, después de la adición de un líquido, ninguna de las hélices corta la interfaz aire/líquido. Esto puede lograrse dividiendo la hélice de cinta helicoidal en secciones y separando las seccciones sobre el eje con separaciones entre cada sección de la hélice, formándose así una hélice helicoidal en secciones. Cada sección de la hélice de cinta helicoidal puede verse como una hélice separada. En la Figura 4 se muestra una hélice de cinta helicoidal en seccciones, adecuadamente modificada. La presente invención proporciona también una hélice de cinta helicoidal en secciones que comprende dos o más secciones de una hélice helicoidal que, cuando están presentes sobre un eje, tienen una separación entre las secciones que no contiene una paleta o parte de una paleta de una hélice.

Preferiblemente, la relación de la longitud de la hélice a diámetro interior del recipiente es mayor que 0,5, más preferiblemente mayor que 0,6.

La posición de una o más hélices en el recipiente puede ser también importante para lograr una mezcla eficiente. Las hélices preferiblemente se colocan de manera que subsiguientemente a cada adición de un líquido al recipiente, ninguna de las hélices corte la interfaz aire/líquido, con lo que se asegura que la turbulencia de la interfaz aire/líquido se reduce y también se reduce el riesgo de introducir burbujas de aire en la suspensión de células.

Dependiendo del tamaño del recipiente usado, varía el número de hélices. Por ejemplo, en recipientes que tienen un volumen de 1 a 5 litros, preferiblemente se usan como mínimo 3 hélices. Para recipientes que tienen un volumen de 5 a 60 l, preferiblemente se usan como mínimo de 3 a 5 hélices. Para recipientes que tienen un volumen entre 60 y 1000 l, preferiblemente se usan como mínimo de 4 a 6 hélices. Sin embargo, si se usa una hélice continua de cinta helicoidal, y dado que la hélice de cinta helicoidal proporciona una mezcla en la totalidad del recipiente, es posible usar sólo una hélice continua de cinta helicoidal para el recipiente. Sin embargo, opcionalmente la hélice continua helicoidal puede usarse en combinación con una o más hélices axiales de cinta no helicoidales tales como un INTERMIG® o hélice propulsora, según se define en el manual de Ekato de tecnología de mezcla - Impeller Systems, Ekato (citado anteriormente). En el recipiente de la presente invención se usan hélices con el fin de conseguir una mezcla de todo el contenido del recipiente y de evitar una compartimentación en cualquier punto dentro del recipiente. La compartimentación es la situación en la que hay una parte del contenido del recipiente que no se está mezclando con el resto del contenido del recipiente; esto es, se forma un compartimiento con una parte del contenido del recipiento que no se mezcla con el resto del contenido del recipiente. El fondo redondo o el fondo en forma de plato de muchos recipientes puede ser una zona en la que se forma compartimentación. Preferiblemente, se coloca una hélice adyacente al fondo de tales recipientes para asegurar que no se produzca compartimentación. Se prefiere más, especialmente cuando no se usa una hélice continua helicoidal, emplear una hélice separada en cada zona de adición. El término "zona de adición" se refiere a la parte del recipiente que se llena cuando al recipiente se añade una de las tres soluciones, la suspensión de células, el tampón para lisis y el tampón de neutralización. Se puede hacer un ensayo del montaje de hélices de un recipiente para determinar si las hélices atrapan aire en el líquido y si se produce compartimentación dentro de los límites de potencia a que se trabaja. El ensayo del recipiente se puede hacer usando técnicas estándar de visualización tales como la observación del movimiento de partículas trazadoras en fluidos transparentes, el decoloramiento y el uso de técnicas fotográficas con rayos X en fluidos opacos (Elson y otros, Chem. Eng. Sci., 41, 2555-2562, 1986; Cronin y otros, Food Bioprod. Proc. Trans. I. Chem. E., parte C, 72, 35-40; Smith y otros, Chem. Eng. Sci., 39, 1093, 1975; y Kuboi y otros, Chem. Eng. Comm., 22, 29, 1983).

El término "zona bien mezclada" se refiere a la zona en torno a cada hélice en la que se causa que el líquido se mezcle. La zona bien mezclada se puede determinar por técnicas estándar de visualización de corrientes, incluida la observación de partículas trazadoras en movimiento en fluidos transparentes, el decoloramiento y el uso de técnicas fotográficas con rayos X en fluidos opacos (Elson y otros, Chem. Eng. Sci., 41, 2555-2562, 1986; Cronin y otros, Food Bioprod. Proc. Trans. I. Chem. E., parte C, 72, 35-40; Smith y otros, Chem. Eng. Sci., 39, 1093, 1975; y Kuboi y otros, Chem. Eng. Comm., 22, 29, 1983). Preferiblemente, la zona bien mezclada es la zona en torno a cada hélice en la que existe el flujo mayor. La zona bien mezclada es adyacente al extremo distal de la hélice o las hélices.

El término "tubería de alimentación", tal como se usa aquí, se refiere a un elemento capaz de suministrar fluidos a una zona bien mezclada. El recipiente puede comprender una o más tuberías de alimentación que permiten añadir fluidos a una zona bien mezclada. Una zona bien mezclada se encuentra adyacente al extremo distal de una o más hélices. Las tuberías de alimentación pueden ser un tubo o una serie de tubos que están en la pared interior del recipiente y permiten el suministro de un fluido a sustancialmente el mismo nivel del recipiente al que se encuentra la hélice. El fluido se suministra por el tubo o los tubos a sustancialmente el mismo nivel del recipiente al que se encuentra la hélice y, por tanto, se considera que se ha de suministrar adyacentemente al extremo distal de una o más de las hélices y a la zona bien mezclada. Preferiblemente, el fluido se suministra por el tubo o los tubos adyacentes a los extremos distales de dos o más hélices. Se prefiere además que haya al menos una tubería de alimentación para cada hélice y/o al menos una tubería de alimentación para cada zona de adición. En los recipients más pequeños, esto es, de menos de 10 l, será suficiente un punto de adición al nivel de una o más hélices. Sin embargo, en recipientes mayores, esto es, de más de 10 l, se prefiere introducir los fluidos en el recipiente al nivel de la hélice en numerosos puntos de la pared interior del recipiente. Una manera de conseguir esto es introducir el fluido por tubos de circulación anular de manera que el fluido entre simultáneamente por un gran número de puntos de aportación colocados adyacentes al arco formado por el extremo distal de la hélice al girar ésta. Otra manera es usar múltiples puntos de aportación al nivel de cada hélice. El tubo o los tubos que forman la tubería de alimentación pueden ser movibles dentro del recipiente de manera que el nivel al que se añaden los fluidos pueda modificarse durante la mezcla.

Se prefiere además que la tubería de alimentación esté diseñada de manera que dirija hacia la hélice el fluido que se está añadiendo.

En una realización alternativa, la tubería de alimentación es un conducto dentro del eje que soporta las hélices, que pasa a través de una o más hélices para suministrar el líquido adyacente al eje distal de una o más hélices.

Preferiblemente, todas las tuberías de alimentación suministran fluido a la zona de máxima mezcla, generalmente formada en torno al eje distal de una o más hélices.

Preferiblemente, las tuberías de alimentación permiten añadir cada una de las soluciones al recipiente en menos de 2 minutos.

El término "relación de aspecto", tal como se usa aquí, se refiere a la relación de la altura del líquido dentro del recipiente a la anchura del líquido en el recipiente. Cuando el recipiente no tiene una altura o anchura uniforme, se puede usar la anchura y altura máximas para calcular la relación de aspecto. En una realización específica de la invención, el recipiente tiene una relación de aspecto en el intervalo de 0,5 a 2,5. Al tener una relación de aspecto baja, el recipiente aumenta más la eficiencia de mezcla. En una realización particularmente preferida, la relación de aspecto del recipiente es 1,0.

El término "deflector", tal como se usa aquí, se refiere a un elemento que diverge el flujo de líquido en el recipiente. Los deflectores ayudan a prevenir la rotación del líquido dentro del recipiente, favorecen los flujos secundarios desde la cabecera al fondo y previenen la formación de un torbellino central y el subsiguiente atrapamiento de aire. El desarrollo de corrientes secundarias de la cabecera al fondo es importante para mezclar totalmente el contenido del recipiente a medida que se añaden secuencialmente cantidades adicionales de fluido y cada una de las aportaciones debe homogeneizarse en todo el contenido del recipiente. El tipo más común de deflector es una tira de material que tiene una anchura de aproximadamente 10% del diámetro interior del recipiente, que se extiende a lo largo de la longitud del recipiente en una dirección sustancialmente paralela al eje de rotación de una o más hélices. El borde de los deflectores puede estar a ras de la pared interna del recipiente o puede estar distanciado de la pared en aproximadamente 0,1 a 5 cm. Sin embargo, se pueden emplear otros tipos de deflectores, tales como los descritos por Nagata (Mixing Principles and Applications, John Wiley, New York, USA, 1975). El recipiente tiene uno o más deflectores distanciados por igual en torno a la superficie interior del recipiente, en el que el deflector o los deflectores se extienden sustancialmente paralelos al eje de rotación de las hélices. Preferiblemente, en el recipiente se usan al menos dos deflectores y, más preferiblemente, al menos cuatro deflectores. Preferiblemente, los deflectores se extienden a todo lo largo del recipiente. Los deflectores tiene una anchura de, preferiblemente, 3 a 15% del diámetro interno del recip\muente, más preferiblemente de 6 a 12% del diámetro interior del recipiente y, muy preferiblemente, de 10% del diámetro interior del recipiente. El borde de cada deflector puede estar a ras de la pared interior del recipiente, o puede estar distanciado de la pared interior del recipiente. Preferiblemente, la posición de los defelectores es tal que hay una holgura estrecha entre los deflectores y el arco formado por el extremo distal de una hélice en su rotación. Preferiblemente, la holgura es de entre 0,1 y 10 cm, más preferiblemente de entre 1 y 5 cm. En una realización particularmente preferente, cuando el recipiente tiene un diámetro interior de aproximadamente 0,45 m y un volumen de 60 l, se prefiere que haya 4 deflectores, cada uno de una anchura de 10% del diámetro interior del recipiente.

El uso de deflectores en recipientes de mezcla se describe en el manual de Ekato de tecnología de mezcladura
- Impeller Systems, Ekato (citado antes) y en la obra de Nagata (Mixing Principles and Applications,Wiley, New York, 1975).

El término "fragmentación sustancial", tal como se usa aquí, se refiere a la fragmentación de DNA cromosómico a un nivel al que el nivel de DNA fragmentado en el producto purificado excede del 4% del peso del producto deseado. En particular, cuando el producto deseado es un DNA de plásmido, el término "fragmentación sustancial", tal como se usa aquí, se refiere a la fragmentación de DNA cromosómico a un nivel en el que el nivel de DNA de plásmido en el producto purificado excede del 4% en peso del contenido de DNA total cuando el DNA de plásmido se purifica de acuerdo con el método de la solicitud de patente internacional WO 97/29190. Cuando el producto deseado es una proteína, el nivel de contaminación de DNA cromosómico se mide después de que la proteína ha sido purificada de acuerdo con el método de Falconer y otros (Biotechnology and Bioengineering, 53, 453-458, 1997). Preferiblemente, cuando el producto deseado es una proteína, el nivel de contaminación de DNA cromosómico es inferior a 0,5% en peso de la proteína purificada.

Preferiblemente, el recipiente tiene un volumen entre 5 l y 1.000 l, más preferiblemente entre 50 l y 500 l y, muy preferiblemente, entre 50 l y 100 l. Fabrica recipientes adecuados para lisis, Yateson Engineering Ltd., Bolton, Reino Unido.

La presente invención proporciona también un método para usar el recipiente de la presente invención en la lisis de células de una suspensión de células que contiene DNA cromosómico y un producto deseado, en el que una o más hélices giran a una velocidad seleccionada tal, que se obtiene una mezcla eficiente sin generar unas tensiones mecánicas suficientes para producir una fragmentación sustancial de DNA cromosómico o flóculos de material agregado. Preferiblemente, el producto deseado es un DNA de plásmido.

El método de la presente invención comprende, preferiblemente, añadir la suspensión de células al recipiente, mezclar la suspensión de células, añadir una solución de lisis a la suspensión de células, mezclar la suspensión de células hasta que las células se han lisado, añadir una solución neutralizante y mezclar hasta que se logra la neutralización y se generan flóculos de material agregado. Al neutralizar, el DNA de plásmido se renaturaliza. El DNA de plásmido puede purificarse luego usando procedimientos estándar tales como filtración en saco y cromatografía, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En el método de la presente invención, se prefiere que las soluciones añadidas al recipiente se añadan usando tuberías de alimentación que están sumergidas dentro del líquido contenido en el recipiente. Preferiblemente, cada solución se mezcla en el recipiente en menos de 4 minutos, preferiblemente en menos de 2 minutos.

La suspensión de células puede ser cualquier suspensión en cualquier medio. Preferiblemente, la suspensión de las células tiene una densidad de células de 70 a 300 g peso en húmedo/l.

Preferiblemente, la suspensión de células se mezcla para generar y mantener una solución homogénea. Preferiblemente, la suspensión de células se mezcla mientras que se añade la solución de lisis. La solución de lisis es, preferiblemente, una mezcla de hidróxido sódico y SDS. Preferiblemente, la solución de lisis se añade de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente internacional WO 97/29290. La combinación de un pH alto y el detergente da por resultado la lisis de las células y la desnaturalización de DNA cromosómico así como otros componentes celulares. Preferiblemente, la solución de lisis se mezcla con la suspensión de células para generar un lisado en un período de tiempo tan corto como sea posible para minimizar la exposición a niveles altos de pH, presentes en el tampón de lisis, reduciéndose así la formación de DNA de plásmido desnaturalizado irreversiblemente, pero no tan alto como para que pueda causar un daño mecánico al DNA cromosómico.

Una vez hecha la lisis, aumentarán espectacularmente las propiedades viscoelásticas del lisado resultante, y esto puede usarse como medida de la conclusión de la lisis. El aumento de las propiedades viscoelásticas puede visualizarse directamente observando el efecto Weissenburg del fluido que trepa por el eje de la hélice. También puede medirse indirectamente, aunque no más objetivamente, controlando el par de torsión en el eje del recipiente de lisis. Por par de torsión se entiende el momento de giro ejercido por el motor del eje de la hélice.

Durante la mezcla de la suspensión de células no lisadas, que se comporta como un fluido newtoniano de baja viscosidad, se observa un nivel bajo, estable, del par de torsión. Después de la lisis, el par aumenta rápidamente hasta que finaliza la lisis, momento en que se estabiliza a un valor máximo.

La presente invención se ilustra ahora en el ejemplo anexo haciendo referencia a las figuras siguientes:

La Figura 1 es un diagrama esquemático que presenta un recipiente de 5 l de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que presenta un recipiente de 60 l de acuerdo con la presente invención.

La Figura 3 presenta la hélice InterMIG para uso en el recipiente de la presente invención.

La Figura 4 presenta en corte la hélice de cinta helicoidal para uso en el recipiente de la presente invención.

Materiales y métodos Construcción del vector pTX0161 de plásmido de expresión terapéutica

El pTX0161 es un vector de plásmido de un número de copia alto (origen de replicación ColE1) que transporta el gen de B nitrorreductasa (ntr) de Eschirichia coli guiado por el inmediato promotor precoz de citomegalovirus. El suministro de este vector a células de tumores de mamíferos permite matar células específicas con el prefármaco CB 1954 (Drabek y otros, Gene Therapy, 4, 93-100, 1997), una forma de quimioterapia intensificada del cáncer descrita como terapia dirigida por genes con enzima-prefármaco o GDEPT.

El pTX0161 se construyó por eliminación de la casete de ntr del pTX0160 (Williams y otros, Nuc. Acids Res., 26, 2120-2124, 1988) como un fragmento digerido de enzima Xbal de restricción, embotada en ApaI, que se insertó luego en pTX0003 (un vector derivado de pUC19 que codifica resistencia a la tetraciclina).

Generación de la cepa de producción; DH1 pTX0161

Se usaron 10 ng de DNA de plásmido pTX0161 para transformar células DH1 de E. coli competentes de calcio (Hanaham, Mol. Biol., 106, 557-580, 1983). Se seleccionó un transformante individual para generar un banco madre de células (MCB) de la cepa de producción bajo las condiciones de buena práctica de producción. Se crioconservaron en glicerol al 20% células cosechadas de un cultivo de crecimiento exponencial y se almacenaron a -80ºC para constituir el MCB.

Fermentación de DH1 pTX0161 Preparación del inóculo

Se tomó del MCB un vial de 1 ml de DH1 pTX0161 y se descongeló rápidamente a 37ºC. Se inoculó asépticamente el contenido de este vial en 5 ml de medio LB (Peptone 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l) suplementado con tetraciclina (12 \mug/ml) en una botella universal de 30 ml. Se incubó ésta a 37ºC en una mesa orbital de sacudidas (200 rpm). Durante la fase de crecimiento exponencial central, se usaron 4 ml de este cultivo para inocular 46 ml de caldo Terrific (Tartof y Hobbs, Focus, 9, 2-12, 1987) suplementado con tetraciclina (12 \mug/ml) en un matraz erlenmeyer de 500 ml. Se hizo crecer el cultivo como antes de ser subcultivado en dos etapas (cultivos de 200 ml y 2000 ml en caldo Terrific con tetraciclina) y se usó para inocular el fermentador una vez que el cultivo creció a una densidad de 2 OD_{600nm}.

Fermentación

Se preparó un medio rico complejo para lotes que estaba constituido por concentraciones finales de KH_{2}PO_{4} (3 g/l), Na_{2}HPO_{4} (6 g/l), NaCl (0,5 g/l), Peptone (2 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (10 g/l), propilenglicol de peso molecular 2025g (0,2%), solución de oligoelementos (0,05%) [que estaba constituida por CoCl_{2}\cdot6H_{2}O (2 g/l), CuCl_{2}\cdot2H_{2}O (1,9 g/l), H_{3}BO_{3} (1,6 g/l), MnSO_{4}\cdotH_{2}O (1,6 g/l), Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O (2 g/l), ZnCl_{2}\cdot7H_{2}O (2 g/l), Fe_{2}(SO_{4})_{3}\cdotxH_{2}O (1 g/l), CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (1 g/l) y ácido cítrico (60 g/l], CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (0,03 g/l), FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,04 g/l), ácido cítrico (0,02 g/l) y extracto de levadura (20 g/l) y se llevó a un volumen de 46 l en un recipiente de fermentación. Después de esterilizar in situ, se hicieron adiciones asépticas de glicerol (2,8%), MgSO_{4} (0,5 g/l) y solución de vitaminas (5 ml/l [constituida por biotina 0,6 g/l, ácido fólico 0,04 g/l, piridoxina-HCl 1,4 g/l, riboflavina 0,42 g/l, ácido pantotenoico 5,4 g/l, niacina 6,1 g/l] y tetraciclina (12 mg/l).

El recipiente se inoculó como se ha indicado antes. La fermentación se realizó a 37ºC, pH 6,8, con el punto de ajuste de oxígeno disuelto a 50% de saturación de aire.

Se tomaron muestras regularmente del recipiente y se registró la OD_{600nm} para poder calcular la velocidad específica de crecimiento. Se aisló DNA de plásmido de muestras durante el cultivo para efectuar análisis cualitativo y de los puntos finales de la fermentación para comparación cuantitativa (kits Qiagen Maxi de purificación de plásmidos, Qiagen Ltd.). Para estimar la biomasa se usó la determinación de peso seco.

Estimación del número de copias de plásmido

El peso molecular de pTX0161, un plásmido de base 7796, es 5,06 x 10^{6} Daltons. El rendimiento específico de plásmido recuperado puede convertirse en número de copias de plásmido recuperado sabiendo que 1 unidad de OD_{600nm} es equivalente a 2 x 10^{8} células/ml para este cultivo de fermentación (Kech y Brent, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, Eds., John Wiley Sons Inc., New York, 1.2.2, 1995).

Cosecha de células de fermentación

Las células se cosecharon en la fase exponencial tardía de fermentación por centrifugación a 5000g durante 25 minutos a 4ºC en botellas estériles de centrífugadora de 1000 ml. Se desechó el material sobrenadante clarificado y los pélets de células se congelaron a -80ºC o se extrajeron de los tarros y se pasaron a bolsas ante de congelarlos.

Procedimiento de lisis manual

El procedimiento de lisis manual usado como comparación con el procedimiento de lisis en recipiente es el del protocolo Qiagin Midi and Maxi (Qiagen Plasmid Purification Handbook 1997).

Recuperación primaria de DNA de plásmido por lisis alcalina modificada de células Preparación de una suspensión de células para lisis de 5 l de células

Se separó un total de 180 g (peso húmedo) de células del almacenamiento a -80ºC y se descongelaron a 18ºC durante aproximadamente 20 minutos. A cada botella de centrifugadora se añadió tampón de suspensión de células (Tris 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8,0) en cantidad suficiente para solubilizar el pélet de células. Se reunieron las células puestas nuevamente en suspensión y se mezclaron con una mezcladora Silverson de alto cizallamiento para generar una suspensión homogénea. Se ajustó luego el volumen (en peso) a 1 l con un tampón para suspensión de células, una concentración final de aproximadamente 180 g de células (peso en húmedo)/l de suspensión.

Preparación de una suspensión de células para lisis de 60 l de células

Se separó un total de 1800 g (peso húmedo) de células del almacenamiento a -80ºC y se descongelaron a 18ºC durante aproximadamente 20 minutos. Se extrajo de los sacos la pasta de células y se añadió a 9 l de tampón de suspensión de células (Tris 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8,0). Las células se pusieron luego en suspensión en el tampón usando una mezcladora Silverson de alto cizallamiento para generar una suspensión homogénea. Se ajustó luego el volumen de la solución (en peso) a 15 litros con tampón de suspensión de células, siendo la concentración final de células de aproximadamente 120 g de peso en húmedo de células por litro de suspensión.

Filtración en saco

El contenido de los recipientes de mantenimiento se bombeó a través de un filtro de saco de nailon (Plastoc Holdings Ltd.) antes de filtración a través de 5 \mum con un filtro Polyguard (Millipore UK Ltd. Watford, Inglaterra).

Cromatografía de adsorción con lecho expandido

Se rellenó una columna de cromatografía Streamline 50 (Pharmacia) con 480 ml de DEAD Streamline (Pharmacia). Se expandió el lecho de la columna usando NaOH 0,1 M por corriente lineal ascendente a un caudal de 105 cm/h, se paró para saneamiento durante la noche y se reexpandió en tampón equilibrante (KAc 0,8M, EDTA 10 mM a pH 5,5) para preparar la columna para la carga. El filtrado que contenía el plásmido se bombeó a la columna al mismo caudal lineal. Una vez cargada, la columna se lavó con tampón equilibrante hasta que el detector de absorbancia en línea (densidad óptica a 254 nm o OD_{254mm}) se redujo al 20% del valor máximo o menos. La columna se lavó luego con tampón de baja salinidad (acetato potásico 25 mM, EDTA 10 mM a pH 5,5) y se invirtió el sentido de la corriente de fluido. Esto permite el relleno del gel de cromatografía en la columna y reduce los volúmenes de tampón requeridos para las etapas siguientes. Se continuó el lavado hasta que se alcanzó el valor del 5% de la OD_{254nm} antes de eluir los fragmentos de RNA residual de la columna usando tampón de lavado salino 0,5 M (acetato potásico 25 mM, EDTA 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 5,5). El DNA de plásmido se eluyó luego con tampón de elución (NaCl 0,75 M, KAc 25 mM, EDTA 10 mM, pH 5,5) y se almacenó durante la noche de 4 a 8ºC.

Concentración del eluido en la línea de corriente

Se saneó un dispositivo de ultrafiltración Pelicon XL (Millipore UK Ltd., Watford, Inglaterra) con NaOH 0,1 M y se purgó con tampón de elución. El eluido de la columna Streamline, enriquecido en plásmido, se concentró aproximadamente 25 veces por ultrafiltración usando una membrana de corte de un peso molecular de 30 kilodalton. Se decantó el concentrado y el sistema se purgó con tampón para eliminar DNA residual de plásmido, que se combinó con el concentrado. El volumen combinado de aproximadamente 50 ml se almacenó a 4-10ºC durante la noche.

Cromatografía de exclusión de tamaño

Para eliminar contaminantes residuales tales como fragmentos digeridos de RNA, y con el fin de intercambiar el plásmido en un tampón adecuado de formulación, el eluido concentrado de la columna Streamline se cargó en una columna Pharmacia XK16 rellena con aproximadamente 112 ml de medio Pharmacia S500HR (altura del lecho 56 cm). La tubería de la columna había sido saneada previamente con NaOH 0,1 M y se equilibró con NaCl 0,3 M. La totalidad del concentrado se cargó en la columna a 1,2 ml/min. La OD_{254nm} del eluido de la columna se controló durante la tanda y se recogieron fracciones de 2 ml. El material del primer pico de OD_{260 nm} se consideró que era DNA de plásmido puro y se combinaron las tomas. El volumen combinado era de aproximadamente 20- 25 ml. Se extrajeron muestras para análisis de control de calidad y el resto del combinado de plásmido se repartió en alícuotas y se congeló a -80ºC.

Análisis de DNA para control de calidad Concentración del producto

La concentración total de ácidos nucleicos (fuerza de la solución) se determinó espectrofotométricamente midiendo la densidad óptica a 260 nm y convirtiendo este valor en mg/ml suponiendo que el coeficiente de extinción de una solución al 0,0005% de DNA de plásmido en una celda de un paso de longitud 1 cm era de 0,02 unidades. Las muestras altamente concentradas se diluyeron en peso de manera que la densidad óptica registrada estuviera dentro del intervalo de respuesta lineal del cromófero.

DNA cromosómico del huésped

La contaminación del DNA cromosómico del huésped se estimó por análisis de PCR utilizando cebadores nucleótidos complementarios de un elemento omnipresente del genoma de E. colli. Se insertaron patrones de pTX0161 purificado por ultracentrifugación con gradiente de densidad doble (Sambrook y otros, Molecular Cloning: a laboratory manual, Nolan y otros (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) por duplicado con percentajes variables (p/p) de DNA cromosómico de DH1 huésped. Se sometió también a la reacción una cantidad idéntica del pTX0161 y se analizó, junto con las otras muestras, por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se derivaron niveles máximos de contaminación basándose en una comparación de la densidad de los patrones insertados de DNA cromosómico del huésped frente a la muestra que se estaba ensayando.

Contaminación de la endotoxina

La contaminación de endotoxina se estimó usando el ensayo cinético cromogénico KQCL (Biowhittaker UK Ltd.). El producto se diluyó a un intervalo conocido para salvar la interferencia. Se incluyeron controles positivos del producto para confirmar que no se había producido una inhibición o una intensificación de la cascada de reacción por la muestra o los componentes del tampón.

Ejemplo 1

El recipiente (1) tiene un volumen de 5 l, un diámetro interior de 165 mm y funciona con dos tuberías de alimentación (2,3) en el recipiente (1). El recipiente (1) tiene tres hélices InterMig (4, 5, 6) situadas a 18 mm, 105 mm y 155 mm del fondo del recipiente (1). Las hélices tienen una longitud de 116 mm. La primería tubería de alimentación (2) está colocada de manera que el fluido se suministra al mismo nivel que al que está la hélice de más abajo (4). La primera tubería de alimentación (2) se usa para añadir al recipiente (1) una suspensión de células y posteriormente un tampón de lisis. La segunda tubería de alimentación (3) está situada de manera que el fluido se suministre al mismo nivel al que está la segunda hélice (5). La segunda tubería de alimentación (3) se usa para añadir un tampón de neutralización.

El recipiente (1) tiene también cuatro deflectores (7) separados por igual en torno a la pared vertical interior del recipiente (1), que son sustancialmente paralelos al eje de rotación de las hélices (4, 5, 6). Cada deflector (7) tiene una anchura de 15 mm y una longitud aproximada de 315 mm. Los deflectores (7) están a una distancia de 5 mm de la pared interior del recipiente (1). La holgura entre los deflectores y el arco formado por la rotación de las hélices es de 5 mm.

Las tuberías de alimentación (2, 3) están hechas de pipetas de 5 o 10 ml de las que se ha quitado la parte cónica del fondo y se han quitado los tapones de la parte de arriba, conectados a longitudes de tubería de una bomba peristáltica. Las tuberías de alimentación (2, 3) tienen un diámetro interno de aproximadamente 4 mm.

El recipiente (1) tiene una relación de aspecto de 1,1 (183/165).

Protocolo de lisis

Se preparó una solución de 180 g/l (peso húmedo) de células DH1 de E. Coli que contenía el plásmido pTX0161 poniendo nuevamente en suspensión 180 g de células congeladas en un tampón para suspensión de células (de base Tris 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8,0) usando una mezcladora de laboratorio Silverson de alto cizallamiento (Silverson Machines Ltd.) como se ha indicado antes. La solución se mezcló hasta obtener una solución homogénea. El volumen se ajustó luego a 1 l con tampón para suspensión de células. La solución se pasó luego al recipiente (1) de lisis y se mezcló a 75 rpm. Se añadieron luego a la solución 100 mg de RNaseA y se incubó durante 5 minutos mientras que se agitaba.

Se añadieron 2 l de tampón de lisis (NaOH 0,155 M/1% de SDS) a un caudal de 1 l/min y en este momento empezó a contarse el tiempo de lisis. Cuando se había añadido todo el tampón de lisis (2 minutos), se aumentó la velocidad del agitador a 125 rpm y se mantuvo hasta que todas las células se habían solubilizado (4 minutos desde que se inició la lisis). Entonces se desconectaron las hélices.

Al cabo de 9 minutos y 30 segundos de haber comenzado la lisis, se agitó el contenido del recipiente a una velocidad de 75 rpm. A los 10 minutos de haber comenzado la lisis, se añadió 1 l de tampón de neutralización (KAc 3M, EDTA 10 mM a pH 5,5) a un caudal de 500 ml/min. Cuando la hélice de arriba quedó completamente cubierta, se aumentó la velocidad de la hélice a 100 rpm y se mantuvo hasta que se perdió el efecto Weissenburg (12 minutos). Se consideró entonces que la lisis había sido completa y se desconectaron las hélices.

Se enfrió el contenido del recipiente durante 40 minutos haciendo circular agua fría a 5ºC en torno al recipiente para reducir el contenido a aproximadamente 10ºC. Se filtró luego el contenido del recipiente a través de un filtro de saco de 100 \mum (Plastok Holdings Ltd., Birkenhead, Inglaterra) y un filtro en copa de 5 \mum (Millipore Ltd., Watford, Inglaterra) como se ha descrito antes. El filtrado recogido se purificó luego por cromatografía de lecho extendido como se ha descrito antes.

Debe señalarse que la generación de una suspensión homogénea de células antes de la lisis se puede lograr usando el recipiente de la presente invención.

Los rendimientos y las medidas de contaminación se realizaron como se ha descrito antes.

Resultados del rendimiento en la obtención del plásmido usando diferentes combinaciones de cepas de huésped del plásmido

1

Contaminación de DNA cromosómico

2

Contaminación de endotoxina

Plásmido.	Endotoxina (Eu/mg).
PTX 0161	7,4
PTX 0161	21,2
PTX 0340	616

Ejemplo 2 Descripción del recipiente de lisis

El recipiente (8) tiene un volumen de 60 l, un diámetro interior de 455 mm y funciona con tres tuberías de alimentación (9, 10, 11). El recipiente tiene una tapa (27) que forma un cierre hermético con el cuerpo principal del recipiente. El recipiente tiene cinco hélices (12, 13, 14, 15, 16). La primera hélice (12) es una hélice del tipo de propulsor que tiene el mismo ángulo de avance que una hélice InterMIG (véase Figura 3) con las cabezas distales bifurcadas (16) que se han eliminado. La primera hélice (12) tiene una longitud de 190 mm. Las restantes cuatro hélices son hélices InterMIG como se ve en la Figura 3, y tienen una longitud de 280 mm. Las hélices están colocadas a 45 mm, 100 mm, 185 mm, 270 mm y 370 mm del fondo del recipiente, respectivamente. Las dos primeras hélices (12, 13) están, por tanto, dentro del nivel de 15 l del recipiente (8) y se usan para agitar la suspensión de células. La tercera y la cuarta hélices (14, 15) están situadas a los niveles de 15 l a 45 l del recipiente (8) y se usarán, con las dos primeras hélices (12, 13) para mezclar células con la solución de lisis. La quinta hélice está situada al nivel de 45 a 60 l del recipiente (8) y se usará, con las cuatro primeras hélices (12, 13, 14, 15) para mezclar la solución neutralizada.

La primera tubería de alimentación (9) es movible entre el nivel de las hélices primera y segunda (12, 13). En este ejemplo, la tubería de alimentación está situada para suministrar fluido al mismo nivel que la primera hélice (12). La segunda tubería de alimentación (10) es movible entre el nivel de la primera y la segunda hélice (12, 13). En este ejemplo, la tubería de alimentación está situada inicialmente para suministrar fluido al mismo nivel que la segunda hélice (13). La tercera tubería de alimentación (11) es movible entre el nivel de la segunda, tercera, cuarta y quinta helices (13, 14, 15, 16). En este ejemplo, la tubería de alimentación está situada inicialmente al nivel de la tercera hélice (14). Las tuberías (9, 10) están alimentadas por bombas peristálticas (Watson Marlow serie 600, equipadas con tubos de silicona de diámetro interior 1,75 cm; Watson Marlow Ltd., Falmouth, Inglaterra) bajo control manual.

El recipiente (8) también tiene cuatro deflectores (18), distanciados por igual en torno a la pared interior del recipiente (8), que son sustancialmente paralelos al eje de rotación de las hélices (12, 13, 14, 15, 16). Cada deflector (18) tiene una anchura de 45 mm y una longitud de aproximadamente 330 mm. Los deflectores (18) están a una distancia de 10 mm de la pared interior del recipiente (8).

El recipiente (8) tiene una relación de aspecto de 0,97 (440/455).

Protocolo de lisis

Se prepararó una solución de 15 l de una suspensión de células DH1 de E. coli que contenía plásmido pTX0161 a una concentración de 120 g/l poniendo nuevamente en suspensión 1200 g de células congeladas en un tampón de suspensión de base Tris 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8) a 4ºC. La suspensión se preparó usando una mezcladora Silverson de alto cizallamiento (Silverson Machines Ltd.) como se ha descrito antes. La solución se mezcló hasta lograr una solución homogénea y luego se ajustó el volumen en peso a 15 l usando tampón de suspensión de células. Las células se obtuvieron según el protocolo de fermentación descrito antes y se cosecharon por centrifugación; se almacenaron a -80ºC antes de su uso.

La suspensión de células se pasó al recipiente de lisis (8) y se agitó a una velocidad de 8 rpm. A la suspensión de células se añadieron 5 g de RNasa (Sigma Chemicals) como suspensión en 15 ml de un tampón de suspensión y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Se aumentó la velocidad de la hélice a 44 rpm y se añadieron a la solución 30 l de tampón de lisis (NaOH 0,155 M, 1% de SDS). Inicialmente, éste se añadió por la primera y segunda tuberías de alimentación (9, 10) a un caudal de 7,4 l/min. Cuando la tercera hélice (14) quedó completamente cubierta, el tampón de lisis se añadió también por la tercera tubería (11) a un caudal de 7,4 l/min. La adición de la solución de lisis se completó en menos de 2 minutos. La solución se agitó luego durante 2 minutos y, después de este tiempo, se pararon las hélices y se dejó incubar el lisado.

La altura de la tercera tubería de suministro (11), previamente al nivel de la tercera hélice (14), se elevó al nivel de la cuarta hélice (15).

Diez minutos después de haber iniciado la adición del tampón de lisis, se conectaron las hélices a la velocidad de 74 rpm y, por todas las tuberías de alimentación (9, 10, 11), se añadieron simultáneamente, a un caudal de 3,75 l/min, 15 l de tampón de neutralización (acetato potásico 3 M, EDTA 10 mM a pH 5,5, a 4ºC). La adición de la solución de lisis se completó en menos de 2 minutos y, después de este tiempo, la velocidad de la hélice se redujo a 26 rpm, manteniéndose estas condiciones durante 3 minutos más; luego se redujo la velocidad de las hélices a 16 rpm durante otros 6 minutos.

El contenido del recipiente se filtró a través de un filtro de saco de 100 \mum (Plastok Holdings Ltd., Birkenhead, Inglaterra) y un filtro de copa de 5 \mum (Millipore Ltd., Watford, Inglaterra) como se ha descrito antes. Los filtrados recogidos se purificaron mediante cromatografía con lecho expandido según se ha descrito antes.

Las medidas de rendimiento y contaminación se hicieron como se ha descrito antes.

Resultados

Rendimiento de la obtención de plásmido	344 \mug/g de peso húmedo
Contenido de endotoxina	13 Eu/mg
DNA cromosómico	4%

Ejemplo 3

El recipiente de lisis era como el descrito en el Ejemplo 1 con las modificaciones siguientes. La mezcla se hizo con tres hélices INTERMIG colocadas a intervalos de 50 mm desde la base del recipiente, o por dos cintas helicoidales, estando la hélice del fondo a 3,8 cm de la base del recipiente y separadas 5,8 cm las dos hélices.

Protocolo de lisis

Se prepararó una suspensión de 120 g/l de células de cepa huésped DH1 usando una mezcladora de alto cizallamiento y luego se pasaron al recipiente de lisis y se mezcló a 125 rpm. A esta solución se añadieron 2 l de tampón de lisis a un caudal de 1 l/min y la velocidad de mezcla se mantuvo a 125 rpm a lo largo de las etapas de lisis, incubación y neutralización. Al terminar la lisis, se añadió 1 l de tampón de neutralización a un caudal de 1 l/min.

Se entenderá, obviamente, que la presente invención se ha descrito únicamente a modo de ejemplo, y que el ámbito de la invención se define en las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un recipiente para mezclar una suspensión de células o un lisado de células que contiene DNA cromosómico y un producto deseado, en el que el recipiente que comprende:

(a) una o más hélices de un índice de potencia bajo, de un índice de potencia inferior a 2, colocadas de manera que la hélice o las hélices disipen uniformemente energía en la totalidad del contenido del recipiente;

(c) uno o más deflectores distanciados sustancialmente por igual en torno a la superficie interior del recipiente, en el que uno o más deflectores se extienden sustancial y paralelamente al eje de rotación de la hélice o de cada hélice,

en el que el índice de potencia, Po, se calcula de acuerdo con la fórmula

Po = \frac{2\pi NM}{\rho N^{3} D^{5}}

en la que

2\piNM es igual a la potencia (W)

Po es un índice de potencia y es adimensional

N es la velocidad de la hélice (rps)

M es el par de torsión (Nm)

\rho es la densidad del líquido a mezclar (kg m^{-3})

D es la longitud de la hélice (m).

2. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto deseado es DNA de plásmido.

3. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto deseado es una proteína.

4. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la hélice o hélices son hélices InterMIG.

5. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la hélice o hélices son hélices de cinta helicoidal.

6. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la hélice o hélices de cinta helicoidal son hélices de cinta helicoidal seccionada.

7. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las tuberías de alimentación son un tubo o una serie de tubos presentes en la superficie interior del recipiente que suministran fluido a sustancialmente el mismo nivel en el recipiente que el de una hélice.

8. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las tuberías de alimentación son movibles dentro del recipiente de manera que el nivel al que se añaden los fluidos puede alterarse durante la mezcla.