ES2201437T3 - Celda de flujo. - Google Patents

Abstract

La invención tiene por objeto una cuba de circulación. Esta cuba comprende un mezclador que tiene unas entradas, primera y segunda, para recibir unos fluidos a mezclar. Dicha cuba también comprende una salida común de fluidos mezclados, así como también un cuerpo que define una cámara dotada de una entrada, unida a la salida del mezclador, y de una salida, así como también de medios para suministrar los fluidos a las entradas del mezclador, según caudales predeterminados. En al menos una pared de la cámara, está formada una ventana, a cuyo través se pueden observar los fluidos mezclados en el interior de esta última cámara. Las entradas y la salida del mezclador están interconectadas en una unión común y están dimensionadas de forma tal que, a los caudales predeterminados, el flujo del fluido presenta una turbulencia inmediatamente aguas arriba y aguas abajo de la unión, y la entrada de la cámara se define por una diversidad de conductos que se comunican en paralelo con partes separadas dela cámara y que están dimensionados de forma tal que, a los caudales predeterminados, el flujo del fluido es laminar, inmediatamente aguas arriba de la cámara.

Description

Celda de flujo.

La presente invención se refiere a una celda de flujo para la observación de reacciones biológicas y químicas, y, en particular, para la detección de reacciones mediante la dispersión de rayos X.

Las celdas de flujo suelen utilizarse para obtener medidas de magnitudes temporales relacionadas con la dinámica de las reacciones que se producen entre muestras y reactivos. Por regla general, se juntan y mezclan una muestra con un reactivo para formar una mezcla de reacción que se bombea, a unos pocos milisegundos de iniciarse la mezcla, en una cámara de observación. La dinámica de las reacciones entre la muestra y el reactivo se mide detectando la dispersión de rayos X que produce la mezcla de reacción, o bien detectando otros fotones menos energéticos que se dirigen asimismo hacia una ventana de la cámara de observación.

El tiempo transcurrido entre la mezcla de los reactivos y el bombeo de la mezcla de reacción a una cámara de observación (tiempo conocido como "tiempo muerto") impone un límite sobre el funcionamiento de una celda de flujo. Siempre que las reacciones presenten escalas temporales iguales o inferiores al tiempo muerto de una celda de flujo, no se podrá medir con precisión la dinámica de las reacciones con dicha celda de flujo. Existe así pues el deseo de poder disponer de una celda de flujo que mezcle adecuadamente una muestra con un reactivo, y transporte los reactivos a una cámara de observación en un tiempo muerto mínimo.

Se utilizan dos procedimientos distintos para bombear una muestra y un reactivo en las celdas de flujo actualmente existentes. El primer procedimiento utiliza jeringas accionadas con aire comprimido para impulsar la muestra y el reactivo. Sin embargo, la inercia de los componentes móviles de las jeringas y la inercia de los reactivos son aditivos, y, por consiguiente, las presiones que se alcanzan en las celdas durante su funcionamiento son elevadas (típicamente de 350.000 Pa o 3,5 bar). A consecuencia de las presiones ejercidas en una celda accionada por jeringa, las ventanas de una cámara de observación tienen que ser gruesas (son generalmente de cuarzo), lo que implica una atenuación importante de los rayos X al atravesarlas. Esta atenuación se traduce en una reducción de la intensidad de los rayos X dispersados desde las ventanas, reduciéndose así la sensibilidad de las medidas, lo que implica a su vez tener que repetir más medidas para poder obtener un análisis satisfactorio. Por esta razón, el procedimiento de propulsión de reactivo mediante jeringa no es el que suele preferirse para las celdas de flujo que han de utilizarse en conjunción con la dispersión de rayos X.

Un procedimiento alternativo para reunir una muestra con un reactivo consiste en mantenerlos a presión (generalmente a una presión de aproximadamente 100.000 Pa o 1 bar) en unos depósitos separados que se conectan con un punto de mezcla por medio de válvulas electromagnéticas. Las válvulas electromagnéticas se disparan durante un lapso de tiempo predeterminado, en el que la muestra y el reactivo pueden fluir por el punto de mezcla y pasar a una cámara de observación. A diferencia del procedimiento que utiliza válvulas de jeringa, la inercia de los reactivos y la de las válvulas están en este caso casi totalmente desacopladas. Las presiones que se producen en una celda de flujo, que utiliza una simple válvula electromagnética, pueden mantenerse así pues a niveles muy inferiores a los alcanzados en un dispositivo de jeringas, por lo que las ventanas utilizadas en la cámara de observación pueden ser más delgadas, p.ej., pueden consistir en ventanas de mica de 20 \mum de espesor, reduciéndose en consecuencia la atenuación de los rayos X dispersados. Otra ventaja de la reducción de la presión en la celda de flujo es que se reduce también la tensión a la que se encuentran sometidas las ventanas de la cámara de observación. Esto es especialmente importante en el caso de medidas sensibles a la polarización de los rayos X, ya que la tensión producida por presiones elevadas causará la birrefringencia de las ventanas y, por consiguiente, influirá sobre las medidas.

Uno de los aspectos más importantes de las celdas de flujo es la eficacia con la que se mezclan los reactivos, y la velocidad con la que una mezcla de reacción resultante pasa subsiguientemente de un flujo turbulento a uno laminar. Una mezcla de reacción cuyo flujo sea sustancialmente laminar al llegar a una cámara de observación, llenará dicha cámara de forma uniforme, lo cual es muy deseable.

Se utilizan actualmente varios tipos de mezcladores en las distintas celdas de flujo. En el caso de un primer mezclador, conocido como "mezclador en T", una muestra y un reactivo fluyen por unos tramos de entrada en direcciones opuestas, se encuentran enfrentados, y son forzados a cambiar de dirección para entrar en un tramo de salida. Los mezcladores en T son eficaces siempre que el caudal de los fluidos en el mezclador sea lo suficientemente grande como para producir un flujo suficientemente turbulento. La eficacia de esta forma de realizar la mezcla sugiere que se podría construir una buena celda de flujo de un modo muy sencillo, montando directamente una cámara de observación sobre un mezclador de tal tipo. Sin embargo, esto no es posible debido a que la ventana de observación se llenaría entonces siempre de forma no uniforme, al producirse un frente de flujo de una mezcla de reacción de una muestra y un reactivo que avanzan con un perfil convexo. Una forma de evitar este inconveniente consiste en montar un mezclador convencional de 4 vías entre la "T" y la cámara de observación. Un mezclador convencional de 4 vías, que se puede adquirir en el mercado, es el denominado mezclador de Durrum-Gibson que consiste en una única entrada que se subdivide en otras cuatro entradas menores para recombinarse posteriormente en una única salida. El mezclador de 4 vías presenta la desventaja inherente de que introduce un mayor volumen corriente arriba de la cámara de observación, aumentando así el tiempo muerto de una celda de flujo a la que se ha asociado. Unas celdas de flujo que incorporan un mezclador en T y un mezclador de 4 vías han sido desarrolladas por Fowler et al., en 1983, en J. Biochem. Biophys. Meth. 7:317; y por Berthet-Colominas et al., en 1984, en Revue Phys. Appl. 19:769. La celda de flujo de Berthet-Colominas incluye también un conjunto paralelo de cinco conductos que transportan la muestra y el reactivo desde el mezclador de 4 vías a una cámara de observación. Esta disposición presenta el inconveniente de que produce "corrientes" de mezclas de reacción que atraviesan la cámara de observación, donde una mezcla de reacción no llega a llenar apropiadamente la cámara, sino que pasa directamente de una entrada a una salida, cruzando únicamente una región central de la cámara de observación.

Nagamura et al. propusieron, en 1985, en J. Biochem. Biophys. Meth. 11:277, una forma distinta de eliminar el frente de inyección convexo, basándose la propuesta en el uso de un mezclador de "rendija". En este caso, una muestra y un reactivo circulan por unos tramos de entrada con secciones transversales rectangulares y se encuentran en una zona lineal en lugar de en una zona puntual. El flujo de una mezcla de reacción desde el mezclador de rendija es sustancialmente laminar cuando la mezcla entra en una cámara de observación, por lo que el llenado de la cámara de observación es mucho más uniforme que cuando se utiliza un mezclador en T. Sin embargo, el mezclador de rendija adolece en la práctica de no ser capaz de proporcionar el flujo turbulento necesario para que se realice una buena mezcla. Nagamura et al. solventaron este problema disponiendo junto a un mezclador de rendija un conjunto de 14 mezcladores en T. Si bien este arreglo da buenos resultados según los datos publicados, el conjunto complejo de entradas y salidas muy pequeñas, que constituyen el mezclador, limitan el caudal final, y, por lo tanto, el tiempo muerto alcanzable. Las entradas y salidas son además propensas a obturarse, por lo que se reduce la fiabilidad del mezclador.

Es un objeto de la presente invención el proporcionar un flujo que supere o mitigue sustancialmente las desventajas mencionadas anteriormente.

Según la presente invención, se proporciona una celda de flujo que comprende un mezclador, presentando el mezclador unas primera y segunda entradas para la recepción de fluidos a mezclar y una salida común para fluidos mezclados, un cuerpo que define una cámara dotada de una entrada conectada con la salida del mezclador y de una salida, y medios para suministrar, a caudales predeterminados, fluidos a las entradas del mezclador, estando formada una ventana en al menos una pared de la cámara a través de la cual se pueden observar los fluidos mezclados en la cámara, donde las entradas y salida del mezclador están interconectadas en una unión común y están dimensionadas de manera tal que, a los caudales predeterminados, el flujo del fluido sea turbulento inmediatamente corriente arriba e inmediatamente corriente abajo de la unión, caracterizada porque la entrada de la cámara está definida por un canal que interconecta una pluralidad de conductos (8) que se comunican en paralelo con partes separadas de la cámara (4) y que están dimensionados de manera tal que, a los caudales predeterminados, el flujo del fluido sea laminar inmediatamente corriente arriba de la cámara (4), y el canal de entrada de la cámara se encuentra conectado a la salida (7) del mezclador inmediatamente corriente abajo de la unión.

La pluralidad de conductos, que definen la entrada de la cámara, comprenden preferentemente cinco conductos dispuestos en forma de abanico por los que los fluidos mezclados que fluyen desde la salida del mezclador son distribuidos en puntos esparcidos a través de la cámara.

La salida de la cámara presenta preferentemente dimensiones similares a las de la entrada de la cámara, dirigiéndose los conductos de la salida hacia un punto de reunión a partir del cual fluyen los fluidos mezclados por un conducto de salida, presentando el conducto de salida unas dimensiones tales que, al caudal predeterminado, el flujo en el conducto de salida será turbulento y una transición de los fluidos mezclados de flujo laminar a turbulento en el conducto de salida implicará la aparición de una contrapresión que actuará hacia atrás a través de la salida y hacia dentro de la cámara.

Los fluidos a mezclar se mantienen convenientemente en unos depósitos y fluyen hacia el mezclador al activar unas válvulas dispuestas en las entradas del mezclador, produciéndose el flujo a consecuencia de la presión existente en los depósitos.

Las válvulas se activan convenientemente a consecuencia de unas señales emitidas por un controlador electrónico, pudiéndose controlar de forma independiente el tiempo durante el cual se encuentra cada válvula abierta y, por consiguiente, variar las relaciones de mezcla. La apertura de una válvula puede retrasarse con respecto a la de otra a fin de poder detener sincronizadamente el flujo.

La presión en los depósitos que contienen los fluidos a mezclar es preferentemente inferior a 300.000 Pa (3 bar).

La presión en los depósitos que contienen los fluidos a mezclar es, con más preferencia aún, inferior a 100.000 Pa (1 bar).

La invención presenta la ventaja de que los fluidos fluyen turbulentamente antes de llegar al mezclador, favoreciéndose así una buena mezcla de los fluidos en el mezclador. La disposición de los conductos que se dirigen a la cámara de observación, así como el hecho de que el flujo de los fluidos mezclados en los conductos es laminar, aseguran que los fluidos lleguen a la cámara con un perfil uniforme a través de la ventana. La distribución de los fluidos mezclados proporciona un llenado uniforme de la cámara, eliminándose así el problema debido a "corrientes" de mezcla de reacción que atraviesan una zona central de la cámara.

A continuación, se describe una forma de realización específica de la presente invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la Figura 1 consiste en una vista esquemática de una celda de flujo según la presente invención y de los depósitos asociados;

la Figura 2 consiste en una ilustración esquemática de los impulsos de disparo utilizados para activar las válvulas de la celda de flujo representada en la Figura 1; y

la Figura 3 consiste en una vista del mezclador y de la cámara de observación de la Figura 1 representados a una escala mayor.

Con referencia a la Figura 1, una celda de flujo comprende depósitos 1 que contienen respectivamente una muestra y un reactivo que fluyen a través de las válvulas 2 a un mezclador 3. La mezcla de reacción resultante se transfiere del mezclador 3 a una cámara de observación 4, en la que se observa la dispersión de los rayos X procedentes de una fuente (no ilustrada) por la mezcla de reacción.

El reactivo y la muestra se mantienen en sus respectivos depósitos 1 a un exceso de presión de aproximadamente 100.000 Pa (1 bar). Los conductos 5, que parten de la base de cada depósito 1, transportan el reactivo y la muestra hacia las válvulas accionadas por solenoide 2, que se encuentran normalmente en estado cerrado. Un controlador electrónico (no ilustrado) de válvulas abre y cierra cada una de las válvulas 2 a fin de proporcionar en el mezclador 3 una relación entre muestra y reactivo deseada. Para tener en cuenta las distintas viscosidades de muestras y reactivos así como distintas relaciones entre muestra y reactivo, el controlador de válvulas permite temporizar apropiadamente la apertura y el cierre de las válvulas 2 a fin de suministrar al mezclador volúmenes seleccionados de muestra y reactivo.

El controlador de válvulas genera un impulso disparador en respuesta a la recepción del flanco anterior de un impulso procedente de un sistema de adquisición de datos (no ilustrado). La válvula del reactivo se abre en respuesta al flanco anterior del impulso disparador, la válvula de la muestra se abre en respuesta al flanco posterior del impulso disparador, y ambas válvulas se cierran transcurrido un período de tiempo predeterminado después del flanco posterior del impulso disparador. Por consiguiente, variando la longitud del impulso disparador se puede retrasar la apertura de una válvula 2 con respecto a la apertura de la otra, mientras que las dos válvulas se cierran simultáneamente. La Figura 2 ilustra un ejemplo de los impulsos utilizados para accionar las válvulas 2 durante un solo disparo de flujo anulado. Mediante el ajuste de la longitud del impulso disparador se puede controlar la apertura y el cierre de cada válvula 2 de modo que se alcance una relación deseada entre reactivo y muestra en la mezcla suministrada a la
cámara 4.

La Figura 3 ilustra con más detalle el mezclador 3 y la ventana de observación 4. Cuando las válvulas accionadas por solenoide 2 se encuentran abiertas, la muestra y el reactivo fluyen desde los depósitos 1, que se encuentran a una presión de 100.00 Pa (1 bar), al mezclador 3 pasando por los tramos de entradas 6. El mezclador 3 es un mezclador en "T", en el que la muestra y el reactivo entran en direcciones opuestas por los respectivos tramos de entrada 6, se encuentran enfrentados, y se desvían seguidamente 90 grados hacia una sola salida 7.

Una sección de cada tramo de entrada 6 inmediatamente adyacente al mezclador 3 tiene un diámetro reducido. Este diámetro reducido hace que el reactivo y la muestra fluyan más rápidamente, asegurando que su flujo se vuelva turbulento antes de llegar al mezclador en T 3 (se alcanza generalmente un número de Reynolds de 3000 o incluso algo mayor). La muestra y el reactivo se aproximan mutuamente de manera enfrentada y, a continuación, se desvían 90 grados a lo largo de la salida 7. El diámetro de la salida 7 es lo suficientemente pequeño para asegurar que el flujo sea también turbulento por dicho tramo de salida. El que el flujo sea turbulento inmediatamente corriente arriba e inmediatamente corriente abajo desde el mezclador 3 es lo más importante, debido a que se consigue de esta forma asegurar que la muestra y el reactivo se mezclen completamente para formar una mezcla de reacción.

Justo por encima del mezclador 3, se amplia la salida 7 para formar un canal de distribución que alimenta un "abanico" formado por cinco conductos 8 que se dirigen a la cámara de observación 4. El diámetro de los conductos 8 es tal que la velocidad de circulación de la mezcla de reacción por cada uno de los conductos 8 es suficientemente pequeña como para que el flujo sea laminar, llegando así también la mezcla de reacción a la cámara de observación en forma de flujo laminar. Mediante el abanico de conductos 8 se consigue que la mezcla de reacción se distribuya uniformemente por toda la cámara de observación, a diferencia de otras celdas de flujo, en las que la mezcla tiende a "fluir" a través de una parte central de una cámara de observación. Al llegar la mezcla a la cámara de observación 4, se inicia la observación de la dinámica de las reacciones, que se producen en la mezcla de reacción, mediante la detección de la dispersión de un haz de rayos X, provocada por la mezcla, que se dirige a través de una ventana de mica 9 dispuesta en una pared de la cámara 4.

La mezcla de reacción se extrae de la cámara de observación 4 haciéndola pasar por un segundo abanico de cinco conductos 10 que es idéntico al abanico de conductos 8 utilizado para distribuir la mezcla en la cámara 4. Los cinco conductos 10 convergen en un punto de reunión 11 desde el cual se introduce la mezcla en una salida 12 de diámetro pequeño. El diámetro pequeño de la salida 12 hace que el flujo de la mezcla de reacción pase de laminar a turbulento. Este cambio en el flujo crea una contrapresión que actúa a través del abanico de conductos 10 hacia la cámara de observación 4, impidiéndose así la cavitación de la mezcla de la reacción (es decir, la formación de burbujas) en la cámara de observación 4.

Con esta forma de realización de la invención, el tiempo que se ha medido desde que se realiza la mezcla de la muestra y el reactivo hasta que llega la mezcla de reacción a la cámara de observación 4 (tiempo muerto) es de 0,8 milisegundos. Este tiempo muerto tan corto se consiguió en parte al disponer el abanico de conductos 8, que transporta la mezcla hacia la cámara de observación 4, a aproximadamente 1 mm corriente abajo desde el mezclador 3.

La velocidad a la que se llena la cámara de observación 4 depende de la presión con la que se propulsa la mezcla de la reacción. En la presente forma de realización, se consiguió aumentar la velocidad de llenado al incrementar la presión de 75.000 a 100.000 Pa (de 0,75 a 1 bar). Aumentos adicionales en la presión presentaban un efecto despreciable sobre la velocidad de llenado.

Se encontró que la forma de realización ilustrada de la presente invención era apropiada para realizar mezclas de muestras y reactivos en cualquier proporción desde 1:1 a 1:9.

Se pueden utilizar por supuesto también sistemas de control de válvulas alternativos a los descritos anteriormente. Lo esencial es que las válvulas puedan activarse independientemente la una de la otra, o disponerse de forma que se disparen y abran simultáneamente, o se cierren simultáneamente. Se puede controlar por supuesto también el tiempo durante el cual se encuentra una válvula abierta. Esta variación se consigue disparando las válvulas con el flanco ascendente de un impulso cuadrado o disparando una válvula con el flanco ascendente y la otra con el flanco descendente. La longitud del impulso cuadrado y el tiempo de apertura de las válvulas se ajustan para obtener el efecto deseado. La razón por la que se requiere esta flexibilidad es la necesidad de poder controlar las proporciones de mezcla (por ejemplo, de 1:1 a 20:1) teniendo en cuenta una amplia gama de viscosidades de muestra y reactivo. La cantidad de mezcla que fluye por la celda es mayor que el volumen de la celda, sirviendo el flujo inicial principalmente para extraer el contenido anterior de la celda, contenido que puede no corresponder a la relación entre reactivos requerida. La medida se inicia a la que se detiene el flujo. La proporción de mezcla puede fijarse fuera de línea, antes de realizar el experimento, utilizando un procedimiento de tanteos. Esto puede efectuarse mezclando un colorante con la muestra o bien con el reactivo y midiendo seguidamente la concentración final del colorante, que se encuentra en la celda de observación, por medio de la absorbancia que presenta a una luz de longitud de onda apropiada para dicho colorante.

Aunque la descripción anterior se refiere a una célula de flujo anulado a utilizar en conjunción con rayos X, la célula de flujo puede utilizarse también apropiadamente con luz ultravioleta a fin de realizar, por ejemplo, estudios de dicroísmo circular. Si se va a utilizar con luz ultravioleta, habrá que cambiar entonces las ventanas de la cámara de observación por unas ventanas de "spectrosil". La invención puede encontrar también aplicación en condiciones de flujo continuo, si bien entonces habría que tomar las precauciones necesarias para que la mezcla de los componentes sea constante. En las aplicaciones con flujo anulado, la mayor parte del fluido, que pasa por las válvulas, se mezcla completamente como consecuencia del flujo turbulento que se produce en el dispositivo, a la vez que la relación de mezcla puede determinarse con precisión a partir de los volúmenes de fluido que han pasado por las válvulas.

Claims (8)

1. Celda de flujo que comprende un mezclador (3), presentando el mezclador unas primera y segunda entradas (6) para la recepción de fluidos a mezclar y una salida común (7) para fluidos mezclados, un cuerpo que define una cámara (4) dotada de una entrada conectada con la salida del mezclador (7) y de una salida (12), y medios (2) para suministrar, a caudales predeterminados, fluidos a las entradas del mezclador (6), estando formada una ventana (9) en al menos una pared de la cámara (4) a través de la cual se pueden observar los fluidos mezclados dentro de la cámara (4), donde las entradas (6) y salida (7) del mezclador están interconectadas en una unión común y dimensionadas de manera tal que, a caudales predeterminados, el flujo del fluido sea turbulento inmediatamente corriente arriba e inmediatamente corriente abajo de la unión, caracterizada porque la entrada de la cámara está definida por un canal que interconecta una pluralidad de conductos (8) que se comunican en paralelo con partes separadas de la cámara (4) y que están dimensionados de manera tal que, a los caudales predeterminados, el flujo del fluido sea laminar inmediatamente corriente arriba de la cámara (4), y el canal de entrada de la cámara (4) se encuentra conectado a la salida (7) del mezclador inmediatamente corriente abajo de la unión.

2. Celda de flujo según la reivindicación 1, en la que la pluralidad de conductos (8) que definen la entrada de la cámara comprenden conductos que divergen desde el canal de entrada de la cámara a puntos distribuidos a través de la cámara.

3. Celda de flujo según la reivindicación 1 ó 2, en la que la salida (10, 11, 12) de la cámara presenta la misma configuración que la entrada de la cámara.

4. Celda de flujo según la reivindicación 1, 2 o la reivindicación 3, en la que la salida (10,11,12) de la cámara está dimensionada de manera tal que, a los caudales predeterminados, el flujo en el conducto de salida (12) será turbulento.

5. Celda de flujo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la muestra y el reactivo se encuentran almacenados en unos depósitos (1) y fluyen hacia el mezclador a la que se activan las válvulas (2) dispuestas en las entradas (6) del mezclador.

6. Celda de flujo según la reivindicación 5, en la que las válvulas (2) se accionan como consecuencia de señales procedentes de un controlador electrónico, pudiéndose controlar independientemente los tiempos de apertura de las válvulas (2) a fin de controlar las relaciones de mezcla y el retardo entre la apertura de una válvula (2) y la de la otra.

7. Celda de flujo según la reivindicación 5 ó 6, en la que los depósitos (1) están presurizados.

8. Celda de flujo según la reivindicación 7, en la que el exceso de presión en los depósitos (1) que contienen la muestra es de 100.000 Pa (1 bar).