ES2201283T3 - Microparticulas secadas por pulverizacion como vehiculos terpeuticos para su utilizacion en terapia genica. - Google Patents
Microparticulas secadas por pulverizacion como vehiculos terpeuticos para su utilizacion en terapia genica.Info
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Abstract
SE PRESENTAN MICROPARTICULAS, QUE SON LISAS Y ESFERICAS, Y AL MENOS EL 90% DE LAS MISMAS TIENEN UN TAMAÑO MEDIO DE PARTICULA DE ENTRE 1 Y 10 MI M, LAS MICROPARTICULAS COMPRENDEN UNA MEZCLA BASICAMENTE UNIFORME DE UN AGENTE PARA TERAPIA GENETICA Y UN EXCIPIENTE. POR EJEMPLO, DE ESTA FORMA PUEDE ADMINISTRARSE UN GEN DESNUDO O ENCAPSULADO, UTILIZANDO UN INHALADOR DE POLVO SECO.
Description
Micropartículas secadas por pulverización como
vehículos terapéuticos para su utilización en terapia génica.
La presente invención se refiere a
micropartículas secadas por pulverización y su utilización como
vehículos terapéuticos. En particular, la invención se refiere a
medios para la administración de agentes para terapia génica.
Entre los métodos actuales de aerosolización de
fármacos para inhalación se incluyen nebulizadores, inhaladores de
dosis controlada y sistemas de inhaladores de polvo seco. La
nebulización de soluciones acuosas y suspensiones requiere grandes
volúmenes de fármacos e implica la utilización de dispositivos
aparatosos y no portátiles.
El método más habitual de administración de
agentes terapéuticos al pulmón es mediante el uso de dispositivos
basados en propelentes volátiles, habitualmente denominados
inhaladores de dosis controlada. Se utiliza una solución de
propelente, habitualmente CFC 11, 12 ó 114, que contiene fármaco
disuelto, o una suspensión del fármaco en un cartucho presurizado.
Se consigue la dosificación apretando un accionador el cual libera
un aerosol propelente de una suspensión o solución del fármaco que
se transporta hasta las vías respiratorias. Durante su camino hacia
los pulmones, el propelente se evapora, proporcionando precipitados
microscópicos de la solución o partículas libres de la suspensión.
La dosificación es bastante reproducible y barata, y existe una
presión medioambiental creciente para reducir el uso de los CFC.
Los CFC pronto serán sustituidos por propelentes no destructivos de
ozono, denominados hidrofluoroalcanos. Además, la utilización de
disolventes CFC sigue siendo, en gran parte, incompatible con muchos
fármacos, debido a su susceptibilidad a la desnaturalización y baja
estabilidad.
Al mismo tiempo, la tendencia actualmente es
utilizar inhaladores de polvo seco (DPI) que contienen fármacos,
habitualmente mezclados con un portador, tal como manitol, lactosa
o glucosa, lo que facilita la aerosolización y dispersión de las
partículas de fármaco. La energía para la desagregación a menudo la
suministra el aliento o inspiración de aire a través del
dispositivo por parte del paciente.
En la actualidad los fármacos están micronizados,
con el fin de reducir el tamaño de partícula. Este enfoque no es
aplicable a productos biotecnológicos. En general, éstos están
disponibles en cantidades pequeñas y, además, son susceptibles a los
métodos utilizados actualmente para secar y micronizar los
fármacos, previamente a la mezcla con el portador. Además, es
especialmente difícil proporcionar mezclas de fármaco y portador que
sean suficientemente fluidas para fluir y dosificarse
reproduciblemente en los inhaladores de dosificación múltiple
modernos, tal como el Turbohaler (Astra) y el Diskhaler
(Glaxo).
La patente
WO-A-9116882 describe la utilización
del secado por pulverización para producir polvos de lípido/fármaco
de medicamentos convencionales para el asma, los cuales,
supuestamente, mostraban un efecto de liberación sostenida debido a
la presencia del lípido. Las condiciones dadas para el secado por
pulverización producen polvo seco de distribución bimodal, con
picos en 1 \mum y en 7-10 \mum.
La patente
WO-A-8806441 describe la utilización
del secado por pulverización de formulaciones de liposoma estable.
Se seca por pulverización un aditivo conservante tal como un azúcar
junto con el material lipídico. Tras la reconstitución, los
liposomas conservan su distribución de tamaños e integridad. Los
liposomas estabilizados pueden contener un agente terapéutico,
aparentemente para su utilización después del almacenamiento de los
liposomas y la extracción del aditivo conservante.
El tamaño óptimo de partícula para la penetración
en las regiones alveolares es de 1-5 \mum. La
región alveolar ofrece la mayor superficie para la adsorción y
acceso al flujo sanguíneo, y por tanto, es deseable que una
formulación de polvo seco contenga una gran mayoría de partículas
con estas dimensiones. Ha mostrado ser difícil producir partículas
en este rango de manera reproducible mediante técnicas de
micronización. Aunque preliminarmente se haya dado a conocer la
utilización del secado por pulverización para producir polvos
inhalables, la primera descripción de las condiciones precisas de
un procedimiento que proporciona partículas para su utilización
terapéutica, con rangos intercuartiles satisfactoriamente
estrechos, en el rango de 1-5 \mum, se encuentra
en la patente WO-A-9609814
(Andaris).
Aunque las micropartículas en el rango de
1-5 \mum son de tamaño óptimo para la penetración
alveolar cuando se aerosolizan como partículas discretas, no siempre
poseen las propiedades principales de flujo de polvos que son
necesarias para el rellenado de dispositivos DPI y para la
dispensación de dosis. Las partículas de este tamaño son altamente
cohesivas y generalmente requerirán partículas de tamaño mayor para
conferir las propiedades de flujo en masa requeridas; las partículas
de tamaño mayor fluyen mejor. Para los fármacos de poca potencia,
la dispensación y mezcla con un portador convencional; por ejemplo
lactosa, presentan pocos problemas en términos de reproducibilidad y
precisión. Para los fármacos altamente potentes, sin embargo, la
mezcla y dispensación exacta se convierte en un verdadero problema.
Cuando la dosis de fármaco requerida sea de sólo 1 \mug,
contenida en una masa emitida de 12-25 mg, el
problema de la dosificación exacta se convierte en un verdadero
impedimento al desarrollo de tales fármacos altamente potentes.
Las micropartículas de acuerdo con la presente
invención, de las cuales por lo menos el 90% tienen un tamaño de
1-10 \mum, están destinadas a su utilización en
terapia génica, y comprenden un material catiónico y una mezcla
sustancialmente uniforme de ADN, como agente de terapia génica, y
un excipiente.
Las micropartículas de la presente invención
pueden formularse con un portador ("portador" se utiliza en
este documento para distinguirlo del "excipiente" en las
micropartículas). La formulación puede administrarse, por ejemplo,
desde un inhalador de polvo seco. Al administrarlo, el portador se
dispersa en el flujo de aire; debido a su gran tamaño, se deposita
en la boca y garganta. Las micropartículas más pequeñas se dirigen
a las vías respiratorias periféricas; al alcanzar el pulmón, el
excipiente se disuelve y se pierde su efecto de dilución. El agente
terapéutico dispersado se dosifica reproduciblemente en el lugar
deseado de administración.
Las micropartículas de la presente invención
pueden obtenerse mediante secado por pulverización bajo las
condiciones descritas en la patente
WO-A-9609814. Las formulaciones que
las contienen solucionan alguno de los problemas fundamentales
asociados con polvo seco para DPI, en concreto, mezcla pobre de los
polvos y limitada exactitud de mezcla y dosificación en el caso de
fármacos altamente potentes.
Las partículas del mismo tamaño también son
adecuadas para su administración intravenosa, por ejemplo para la
administración dirigida al hígado, y para la terapia génica. Las
micropartículas solubles preparadas mediante secado por
pulverización pueden reticularse, por técnicas conocidas, con este
fin. En comparación con, por ejemplo, la administración intravenosa
de adenovirus, mediante la invención se consigue una administración
dirigida.
Con mayor generalidad, un procedimiento para la
preparación de microcápsulas de la invención comprende pulverizar
una solución (o dispersión) de excipiente y agente terapéutico, el
cual es un material formador de pared, o se utiliza conjuntamente
con un material formador de pared. En particular, se ha descubierto
que, bajo las condiciones descritas en este documento, y
descritas con mayor generalidad en la patente
WO-A-9218164, pueden producirse
micropartículas esféricas notablemente lisas de diversos
materiales. El tamaño de partícula y la distribución de tamaño del
producto puede controlarse reproduciblemente dentro de un rango
estrecho. Por ejemplo, según análisis Coulter, el 98% de partículas
pueden ser menores de 6 \mum, dentro de un rango intercuartil de
2 \mum, y con una variación media del tamaño entre lotes menor a
0,5 \mum. Además, al ensayarse en un inhalador de polvo seco, se
consiguió la dosificación reproducible, y la aerosolización
posterior, bajo condiciones habituales pero de poco flujo (30
litros/minuto) resultó en una separación excelente de las
micropartículas del portador.
El agente terapéutico utilizado en la presente
invención está concebido para la terapia génica. Puede ser un gen
desnudo o encapsulado. Alternativamente, puede ser una partícula
vírica estabilizada por la presencia del excipiente. Son agentes
adecuados para su utilización en terapia génica los complejos
dirigidos a receptores, adenovirus, virus
adeno-asociados, retrovirus, parvovirus, virus
vaccinia, virus herpes y virus Sindbis. Pueden utilizarse complejos
de lípido catiónico-ADN.
También pueden administrarse oligonucleótidos
antisentido mediante la presente invención. Por ejemplo, puede
seleccionarse el oligonucleótido para reducir la actividad de molde
de los ARN molde. Nyce y Metzger demostraron que los
oligonucleótidos antisentido fosforotioato aerosolizados dirigidos
al receptor adenosina A_{1} desensibilizaban a conejos frente a
desafíos posteriores con adenosina o alérgeno del ácaro del polvo, y
es por tanto, potencialmente útil en el tratamiento del asma,
Nature 385:721-5 (1997).
Debido a que el ADN es aniónico, las
micropartículas de la invención pueden comprender un material
catiónico. En particular, los lípidos catiónicos capaces de formar
liposomas cargados positivamente tienen la capacidad de unirse a ADN
y pueden utilizarse para la administración de genes a células de
mamífero in vitro e in vivo. A modo de ejemplo, el
ADN puede encapsularse mediante su unión a dominios lipídicos en una
lactosa u otro portador. Idealmente, los dominios lipídicos
deberían ser de <1 \mum, y las microcápsulas del orden de
2-5 \mum, para su deposición en las vías
respiratorias periféricas. Se ha ensayado el principio utilizando
lípidos de control y ADN de control, y aplicando la metodología con
el fin de producir una microcápsula activa de plásmido de
ADN/lípido/lactosa utilizando los lípidos DC-Chol y
DOPE y plásmido marcador.
Otros materiales catiónicos adecuados son el
quitosano y la lisina. La lisina tiene una cadena lateral muy polar
que está cargada positivamente a pH neutro y que es altamente
hidrofílica. Estas propiedades la hacen adecuada para el secado por
pulverización conjuntamente con HSA (albúmina de suero humana) con
el fin de formar microcápsulas. Se ha conseguido la unión de ADN
con éxito en micropartículas que contienen un 5% p/p de 25%
lisina:75% HSA.
El quitosano es un polisacárido natural adecuado
para aplicaciones biomédicas. La lisozima biodegradará el quitosano
in vivo. Mediante la reticulación de la matriz del polímero
utilizando calor o métodos químicos, por ejemplo, glicolaldehído, el
quitosano se hace menos susceptible a la degradación lisosomal y,
de esta manera, adecuado para la administración prolongada de
fármacos. El carácter catiónica del quitosano ha demostrado su
capacidad de unión al ADN.
El excipiente habitualmente se seleccionará sobre
la base de su capacidad de diluir/estabilizar el agente
terapéutico, y por sus propiedades como formador de pared. Puede
formularse para su secado por pulverización. Entre los excipientes
adecuados se incluyen hidratos de carbono, por ejemplo azúcares,
tal como glucosa, lactosa y manitol. La
\alpha-lactosa y el manitol pueden tener la
propiedad particularmente deseable de resistir la absorción de
humedad. Ver también la patente
EP-A-0372777.
Habitualmente, se seleccionará la cantidad de
excipiente en la mezcla de las micropartículas teniendo en cuenta
el grado deseado de, por ejemplo, dilución o estabilización. Puede
ser de por lo menos el 50% en peso de la mezcla y, a menudo, de por
lo menos 70% u 80%.
Puede utilizarse también otro material inerte
formador de pared, si se desea, para formar las micropartículas.
Tales materiales adecuados son solubles en agua.
Deberían seleccionarse el material formador de
pared y las condiciones durante el procedimiento de tal manera que
el producto sea suficientemente no tóxico y no inmunogénico bajo las
condiciones de utilización, las cuales claramente dependerán de la
dosis administrada y de la duración del tratamiento. El material
formador de pared puede ser un derivado de almidón, un polímero
sintético, tal como
tert-butiloxi-carbonilmetil poliglutamato
(patente US-A-4888398), o un
polisacárido, tal como polidextrosa. En general, el material
formador de pared puede seleccionarse entre la mayoría de polímeros
hidrofílicos biodegradables y fisiológicamente compatibles, como se
describe en mayor detalle en la patente
WO-A-9218164.
Las micropartículas son preferentemente solubles
en especial para la administración a los pulmones, y
preferentemente comprenden un excipiente de hidrato de carbono. Un
azúcar puede facilitar la disolución de las micropartículas sobre la
superficie pulmonar.
Las micropartículas preferentemente están
estabilizadas, en especial para su administración parenteral, por
ejemplo se reticulan, por medios químicos o por calor. En este
caso, un material formador de pared a utilizar para terapia génica
puede ser proteináceo. Por ejemplo, podría ser colágeno, gelatina o
(suero) albúmina, en cada caso preferentemente de origen humano (es
decir, derivado de humanos, o correspondiente en estructura a la
proteína humana). Con la mayor preferencia, es HSA derivado de
donaciones sanguíneas o, idealmente, derivado por recombinación a
partir de la fermentación de microorganismos (incluyendo líneas
celulares), las cuales han sido transformadas o transfectadas con
el fin de expresar suero de albúmina recombinante. Se proporcionan
detalles adicionales en la patente
WO-A-9218164.
Para su utilización en un DPI, pueden mezclarse
las micropartículas de la invención con un portador convencional,
tal como manitol, lactosa o glucosa (el cual puede ser igual al
excipiente). El portador tendrá un tamaño de partícula, y estará en
una cantidad, seleccionadas de acuerdo con la utilización aprobada
del dispositivo. A modo de ejemplo, pueden mezclarse
micropartículas de la invención de 3 \mum, con partículas de
lactosa de 80 \mum.
Existen diversas consideraciones al determinar un
porcentaje apropiado del agente sobre el total de sólidos en el
medio de secado por pulverización. Estos criterios incluyen la
dosis del agente en una administración del dispositivo; el peso
dispensado de la formulación, es decir, la cantidad de polvos en
una administración; y la razón de micropartícula:portador, es
decir, la proporción entre microcápsulas y portador.
El procedimiento de secado por pulverización
puede controlarse con el fin de obtener microesferas de las
características deseadas. De esta manera, puede variarse la presión
a la cual se suministra la solución inicial al pulverizador, por
ejemplo entre 1,0 x 10^{5} y 10,0 x 10^{5} Pa, preferentemente
entre 2 x 10^{5} y 8 x 10^{5} Pa, y con la mayor preferencia,
aproximadamente 7,5 x 10^{5} Pa. Pueden variarse otras variables,
como se da a conocer posteriormente.
Más del 30%, preferentemente más del 40%, 50%, ó
60%, de las microesferas tienen un diámetro dentro de un rango de 2
\mum, y por lo menos 90%, preferentemente 95% ó 99% como mínimo,
tienen un diámetro dentro del rango 1,0-8,0 \mum.
El rango intercuartil puede ser de 2 \mum, con una mediana de
diámetro de 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ó
6,5 \mum.
6,5 \mum.
De esta manera, por lo menos 30%, 40%, 50% ó 60%
de las microesferas pueden tener diámetros dentro del rango
1,5-3,5 \mum, 2,0-4,0 \mum,
3,0-5,0 \mum, 4,0-6,0 \mum,
5,0-7,0 \mum, 6,0-8,0 \mum.
Preferentemente, uno de los mencionados porcentajes de microesferas
tienen diámetros dentro de un rango de 1,0 \mum, tal como
1,5-2,5 \mum, 2,0-3,0 \mum,
3,0-4,0 \mum, 4,0-5,0 \mum,
5,0-6,0 \mum, 6,0-7,0 \mum ó
7,0-8,0 \mum.
Un producto de la invención puede estar en la
forma de microesferas huecas, en las cuales por lo menos 90%,
preferentemente 95% ó 99% como mínimo, de las microesferas tienen
un diámetro en el rango de 1,0-8,0 \mum.
Para el secado por pulverización, una solución,
suspensión, emulsión o dispersión contiene preferentemente 0,1 a
50% p/v, con mayor preferencia aproximadamente
5,0-25,0% de los materiales de las microcápsulas.
Aproximadamente 20% es óptimo.
La solución o dispersión (preferentemente
solución), a la cual se hace referencia en este documento como
"solución inicial", se pulveriza y seca por pulverización por
cualquier técnica adecuada que resulte en microesferas o
microcápsulas discretas de 1 a 10 \mum de diámetro. Estos valores
se refieren a, como mínimo, el 90% de la población de
microcápsulas, según mediciones de diámetros con un Coulter
Multisizer II. El término "microcápsulas" se refiere a
partículas huecas que delimitan un espacio, el cual está lleno de un
gas o vapor, pero de ningún material sólido.
La pulverización comprende formar un aerosol de
la preparación mediante, por ejemplo, el forzado bajo presión de la
preparación a través del interior de, como mínimo, un orificio, o
mediante la utilización de un pulverizador centrífugo en un cámara
de aire, u otro gas inerte, templado. La cámara debería ser
suficientemente grande para que las gotas eyectadas de mayor tamaño
no colisionasen contra las paredes antes de su secado. El gas o
vapor en la cámara debería estar limpio (es decir, preferentemente
estéril y libre de pirógenos), y no ser tóxico al administrarlo al
flujo sanguíneo en las cantidades que resultan de la administración
de las microcápsulas al utilizarlas. La tasa de evaporación del
líquido de la preparación debería ser suficientemente elevada como
para formar microcápsulas huecas, pero no tan elevada como para
hacer explotar a éstas. Puede controlarse la tasa de evaporación
variando la tasa de flujo de gas, la concentración de fármaco y
excipiente en la solución inicial, la naturaleza del portador
líquido, la tasa de alimentación de la solución y, siendo de mayor
importancia, la temperatura del gas con la que se encuentra el
aerosol. Con una concentración de albúmina de 15-25%
en agua, una temperatura de gas de entrada de, como mínimo,
aproximadamente 100ºC, es generalmente suficiente para asegurar que
sean huecas, y la temperatura puede alcanzar los 250ºC sin que
exploten las cápsulas. Es óptima una temperatura de,
aproximadamente, 180-240ºC, con preferencia de,
aproximadamente, 210-230ºC, y con la mayor
preferencia de, aproximadamente, 220ºC, por lo menos en el caso de
la albúmina. Debido a que la temperatura del gas con la que se
encuentra el aerosol dependerá también de la tasa a la que se
administración el aerosol y del contenido líquido de la preparación
proteinácea, la temperatura de salida puede seguirse para asegurar
una temperatura adecuada en la cámara. Se ha descubierto que una
temperatura de salida de 40-150ºC es adecuada. El
control de la tasa de flujo se ha descubierto que es útil para el
control de otras variables, tal como el número de partículas huecas
intactas.
Debido a la naturaleza termosensible del ADN,
sería ventajoso el secado por pulverización con una temperatura de
salida baja. Al reducir la temperatura se ha observado un
incremento de tamaño. Este incremento de tamaño puede ser debido al
mayor contenido en vapor de agua de las microcápsulas, lo cual
resulta, a su vez, en la aglomeración de las partículas. Para
evitar tal aglomeración es favorable una temperatura de salida de
70ºC.
Más concretamente, las micropartículas de la
invención tienen un rango intercuartil máximo de, preferentemente,
3 \mum, más preferentemente de 2 \mum, y con la mayor
preferencia, de 1,5 \mum, con respecto a la mediana del tamaño en
volumen de partícula. Éste se determina utilizando un contador
Coulter. Esto se consigue secando por pulverización en una
combinación de tasa de flujo de carga de alimentación baja y altos
niveles de pulverización y aire secante. El efecto es el de producir
microcápsulas de tamaño muy definido y distribución de tamaño
estrecha.
Varios autores han diseñado ecuaciones para
definir el tamaño medio de gotita de los pulverizadores neumáticos;
una versión simple de las diversas variables que afectan al tamaño
medio de gotita es la siguiente:
D = A/(V^{2}\cdot d) ^{a} +
B\cdot
(M_{aire}/M_{liq})^{-b}
donde
- D = Tamaño medio de gotita
- A = Constante relacionada con el diseño del pulverizador
- B = Constante relacionada con la viscosidad del líquido
- V = Velocidad relativa del aire entre líquido y pulverizador
- d = Densidad del aire
- M_{aire} y M_{liq} = Masa de aire y de líquido
- a y b = Constantes relacionadas con el diseño del pulverizador
Claramente, para cualquier diseño dado de
pulverizador, el tamaño de gotita se ve más afectado por la
velocidad relativa en el pulverizador y, a la vez, por la relación
másica entre aire y líquido. En su uso más habitual de secado, la
relación de aire a líquido está en el rango de
0,1-10 y, con estas relaciones, el tamaño medio de
gotita es de 15-20 \mum. Para la producción de
micropartículas en el rango de tamaños descrito en este documento,
la relación de aire a líquido es de, preferentemente, 20:1 a 1000:1.
El efecto es la producción, a las relaciones elevadas, de
partículas extremadamente pequeñas, en términos comparativos, con
distribuciones de tamaño muy estrechas. En el caso de las
micropartículas, producidas a las relaciones más bajas de aire a
líquido, se producen partículas ligeramente más grandes, aunque,
aún así, todavía tienen distribuciones de tamaño estrechas, las
cuales son mejores a las de micropartículas producidas mediante
técnicas emulsivas.
\newpage
La invención permite la manipulación de la
naturaleza de las microcápsulas secas, con el fin de optimizar el
flujo o propiedades del vehículo, cambiando y reduciendo las
fuerzas cohesivas y de adhesión dentro de la preparación de
microcápsulas. Por ejemplo, si así se requiere, las microcápsulas
pueden hacerse predominantemente positivas o negativas mediante la
utilización de materiales monoméricos o poliméricos altamente
cargados, por ejemplo, de lisina o polilisina, y de glutamato o
poliglutamato, en sistemas sin HSA o en sistemas heterogéneos con
HSA y principios activos.
En los Ejemplos, se prepararon formulaciones de
polvo seco de vectores génicos adecuados para la administración
pulmonar, mediante secado por pulverización utilizando dispositivos
de inhalación de polvo seco. Las micropartículas resultantes
comprendían el vector génico (complejos de lípidos catiónicos: ADN,
o adenovirus) dispersados en el interior de la cáscara del
excipiente de azúcar. El componente excipiente de azúcar de las
micropartículas permite su disolución sobre la superficie pulmonar,
liberando, de esta manera, el vector génico en el sitio óptimo
dentro del pulmón.
Los vectores génicos portaban genes
"informadores" que codificaban para luciferasa de
\beta-galactosidasa para investigar la actividad
de ADN mediante el procedimiento de secado por pulverización. Se
llevaron a cabo ensayos de transfección génica sobre las
formulaciones de polvo seco de ambos tipos de vectores, utilizando
métodos de cultivo celular in vitro.
Se reconstituyó el plásmido pCMVLuc (gen promotor
CMV:luciferasa) con los lípidos DC-Chol/DOPE a una
relación de carga de 5:1.DC-Chol es
3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol;
DOPE es dioleoil fosfatidiletanol-amina.
Se preparó una carga de alimentación para el
secado por pulverización que contenía 1 mg de plásmido ADN, 8 mg de
DC-Chol, 8 mg de DOPE y 700 mg de lactosa como
excipiente, en 7 ml de agua. La solución de alimentación se secó por
pulverización utilizando un secador por pulverización de
laboratorio, bajo las siguientes condiciones:
Temperatura de entrada | 130ºC |
Temperatura de salida | 70,1ºC |
Presión de pulverización | 3,0 bar |
Tasa de alimentación | 0,75 g/minuto |
Se obtuvieron 200 mg de producto secado por
pulverización, equivalente a una recuperación del 35%. El análisis
del producto acabado con un Coulter LS230 Laser Sizer demostró que
las micropartículas de lactosa:lípido catiónico:ADN tenían una
mediana de diámetro de partícula (volumen) de 3,8 \mum.
Típicamente, los dominios de lípido catiónico:ADN tenían un tamaño
inferior a 200 nm.
El análisis de restricción del plásmido ADN
extraído de las micropartículas utilizando procedimientos estándar
demostró que el patrón de restricción del ADN secado por
pulverización era idéntico al del plásmido de control.
Se prepararon dos de tales muestras (1A y 1B).
También se prepararon microcápsulas que comprendían solo lactosa
(1C) y lactosa:lípido catiónico (1D).
Se cultivaron células A549 (derivadas de un tumor
pulmonar humano) en placas de cultivo celular de 60 mm de diámetro.
Se sembraron con 5 x 10^{5} células el día antes de la
transfección. Para imitar la administración a los pulmones, es
decir, la utilización de aerosolización
intra-traqueal de polvos, se pulverizaron las
micropartículas/microcápsulas como polvo seco sobre la superficie de
las células utilizando una jeringa, tras aspiración de medio de
cultivo tisular. Se estimó que se había añadido menos de 10 \mug
de pCMVLuc ADN a cada placa. Después de 30 minutos, se añadieron 2
ml de medio fresco de cultivo celular. 48 horas después de la
transfección, se lisaron las células en 500 \mul de tampón de
lisis (Promega), y se midió la actividad luciferasa en alícuotas de
20 \mul de lisado celular.
Los controles positivos fueron
DC-Chol/DOPE (40 \mug):pCMVLuc (10 \mug) en el
Experimento 1, y Espermidina-Chol/DOPE (40
\mug):pCMVLuc (10 \mug) en el Experimento 2. En la Tabla 1 se
muestran los datos de transfección génica, expresados en términos
de actividad luciferasa (RLU/minuto). Se proporcionan dos valores en
los casos en los que se midió la actividad luciferasa en dos placas
independientes.
Muestra | Experimento 1 (RLU/minuto) | Experimento 2 (RLU/minuto) |
Células de control | 826 | 792 |
776 | ||
Lactosa | 830 | |
736 | ||
pCMVLuc | 760 | |
810 | ||
Control positivo | 8636412 | 4192473 |
9896528 | 3490039 | |
1A | 125984 | 32084 |
180776 | 241805 | |
1B | 2051592 | 7505 |
31604 | ||
1C | 1392 | |
1394 | ||
1D | 878 | 771 |
Se reconstituyó un plásmido que portaba el gen de
la \beta-galactosidasa (promotor CMV) como
"informador" con el lípido DOTAP, es decir, con
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
metilsulfato, y se secó por pulverización con manitol como
excipiente. La carga de alimentación contenía 2 mg de plásmido ADN,
10 mg de DOPE y 388 mg de manitol, en 4 ml de diluyente. La
solución de alimentación se secó por pulverización utilizando un
secador por pulverización de laboratorio bajo las condiciones
siguientes:
Temperatura de entrada | 130ºC |
Temperatura de salida | 78ºC |
Presión de pulverización | 3,0 bar |
Tasa de alimentación | 0,72 g/minuto |
Se obtuvieron 175 mg de producto secado por
pulverización, equivalentes a una recuperación del 43,8%. Los
análisis del producto secado por pulverización, utilizando un
Coulter LS230 Laser Sizer demostraron que las micropartículas tenían
una mediana de diámetro (volumen) de 3-6
\mum.
Se utilizaron procedimientos estándar para
evaluar la eficiencia de transfección génica. Se sembraron 10^{5}
células de melanoma de ratón B16 por pocillo y se incubaron durante
24 horas. Se disolvieron en agua muestras de micropartículas de
lípido catiónico:plásmido ADN:manitol que contenían 2 \mug de
plásmido ADN y se utilizaron para transfectar las células
confluyentes. Los controles fueron 2 \mug de plásmido ADN solo y
DOTAP/ADN a 2 \mug de ADN. Se incubaron las células en la solución
de transfección durante 4 horas y, a continuación, se cultivaron
durante 48 horas adicionales antes de su recolección. Se
prepararon extractos de proteínas y se midió en éstos la
actividad \beta-galactosidasa. Se muestran las
eficiencias de transfección en términos de actividad
\beta-galactosidasa en la Tabla 2.
Muestra | Actividad \beta-galactosidasa | Media | Desviación estándar |
(mU/mg proteína) | |||
Plásmido ADN solo | 3,41 | ||
2,32 | 2,60 | 0,71 | |
2,08 | |||
DOTAP/ADN | 10000,18 | ||
9803,90 | 9982,33 | 170,21 | |
10142,92 | |||
Micropartículas de | 6530,99 | ||
DOTAP/ADN/manitol | 5043,20 | 5546,01 | 853,08 |
5063,85 |
Se preparó un medio nutritivo que contenía un
vector adenoviral (gen luciferasa como molécula indicadora
-"informadora"-) a una concentración de 5,3 x 10^{10} IU/ml
(7,8 x 10^{10} PFU/ml) en Tris 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, Tween 80
(54 mg/ml) 150 mM, y sacarosa 1 M, a pH 8,5. El medio nutritivo (50
ml), a una concentración de 0,352 g/ml, se secó por pulverización
utilizando un secador por pulverización de laboratorio, bajo las
condiciones siguientes:
Temperatura de entrada | 56ºC |
Temperatura de salida | 39,9ºC |
Presión de pulverización | 3,0 bar |
Tasa de alimentación | 0,75 g/minuto |
En la Tabla 3 se resume la recuperación de
producto tras el secado por pulverización.
Antes del secado por | Después del secado | Recuperación | |
pulverización | por pulverización | ||
Masa (g) | 17,62 | 6,46 | 36,6% |
Concentración (IU/ml) | 5,3 x 10^{10} | 2,6 x 10^{10} | 49,0% |
Se midió la actividad de transfección génica en
la formulación de micropartículas de polvo seco de adenovirus, en
un ensayo de cultivo celular in vitro con células A549. Se
disolvieron las micropartículas en agua, y se utilizaron muestras
equivalentes a 0,5 mg, 2 mg, 5 mg y 20 mg de polvo seco para
transfectar las células. Como control se utilizaron adenovirus a
una MOI (multiplicidad de infección) de 100 PFU/célula. Todas las
muestras se ensayaron por duplicado. Se muestra en la Tabla 4 la
eficiencia de transfección génica medida como actividad
luciferasa.
Muestra | Actividad luciferasa (RLU/minuto) | |
Control adenovirus | 17473732 | 17949356 |
Control adenovirus | 26138380 | 27845016 |
+20 mg polvo seco | 42104272 | 42878048 |
+2 mg polvo seco | 13697072 | 13401940 |
+0,5 mg polvo seco | 5214460 | 5816246 |
+5 mg polvo seco | 24963076 | 24989568 |
Control | 760 | 574 |
Control | 203 | 183 |
Estos datos demuestran que el adenovirus conserva
una actividad significativa de transfección génica.
Claims (13)
1. Micropartículas, las cuales son lisas y
esféricas, de las que por lo menos el 90%, tienen un tamaño de
partícula de 1 a 10 \mum, y que comprenden un material catiónico
y una mezcla sustancialmente uniforme de ADN como agente para
terapia génica, y un excipiente.
2. Micropartículas según la reivindicación 1, en
las que el excipiente constituye la mayor parte de la mezcla.
3. Micropartículas según la reivindicación 1 ó 2,
susceptibles de ser obtenidas por secado por pulverización de una
solución del material catiónico, el agente y el excipiente.
4. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en las que dicho tamaño de partícula
es de 1 a 5 \mum.
5. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que tienen un rango intercuartil
máximo de 3 \mum.
6. Micropartículas según la reivindicación 5, que
tienen un rango intercuartil máximo de 2 \mum.
7. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, susceptibles de ser obtenidas mediante
un procedimiento aséptico.
8. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en las que el excipiente comprende un
hidrato de carbono.
9. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en las que dicho agente es un gen
desnudo o encapsulado, o una partícula vírica.
10. Micropartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en las que el material catiónico
comprende dominios lipídicos.
11. Composición en partículas de flujo libre que
comprende micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, y partículas relativamente grandes de un material
portador, el cual puede ser igual o diferente al excipiente.
12. Dispositivo inhalador adaptado para la
administración de un agente terapéutico a través de las vías
respiratorias pulmonares, que comprende una composición según la
reivindicación 11.
13. Utilización de ADN capaz de realizar terapia
génica, para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de una dolencia en el que dicho agente actúa desde su
administración a través de las vías respiratorias pulmonares,
caracterizado porque el medicamento está en forma de
micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o
en forma de una composición según la reivindicación 11.
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