ES2201109T3 - Conjugados de selenio para la preparacion de agentes farmaceuticos basados en radicales libres. - Google Patents
Conjugados de selenio para la preparacion de agentes farmaceuticos basados en radicales libres.Info
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Abstract
EN LA INVENCION SE PRESENTA UN METODO PARA LA PREPARACION DE UN CONJUGADO DE SELENIO Y SOPORTE QUE CONSISTE EN UNIR COVALENTEMENTE (I) UN COMPUESTO DE SELENIO ORGANICO SELECCIONADO DEL GRUPO QUE CONSISTE EN RSEH, RSER, RSER'', RSESER Y RSESER'', DONDE R Y R'' SON CADA UNO UN RESIDUO ALIFATICO QUE CONTIENE AL MENOS UN GRUPO REACTIVO SELECCIONADO DEL GRUPO QUE CONSISTE EN GRUPOS REACTIVOS ALDEHIDO, AMINO, ALCOHOLICOS, CARBOXILICOS, FOSFATO, SULFATO, HALOGENO O FENOLICOS Y COMBINACIONES DE LOS MISMOS A (II) UN SOPORTE QUE TIENE UN CONSTITUYENTE CAPAZ DE FORMAR UN ENLACE COVALENTE CON DICHOS GRUPOS REACTIVOS DE DICHO COMPUESTO DE SELENIO PARA OBTENER UN CONJUGADO DE SELENIO Y SOPORTE CAPAZ DE ENLAZARSE DE FORMA ESPECIFICA A UN PUNTO SELECCIONADO.
Description
Conjugados de selenio para la preparación de
agentes farmacéuticos basados en radicales libres.
La presente invención se refiere a compuestos de
selenio y, más específicamente, a compuestos de selenio que, cuando
se unen covalentemente a moléculas y dispositivos funcionales y de
localización dirigida, producen superóxido y otros compuestos
reactivos en presencia de tioles.
El selenio (Se) se encuentra entre los minerales
más tóxicos de todos los conocidos. Es muy probable que Marco Polo
describiera sus síntomas de toxicidad en caballos mientras viajaba
por la ruta de la seda en China. En los años 20, las pérdidas de
ganado en ciertas partes del oeste y del centro de los Estados
Unidos fueron severas. Estas pérdidas de ganado se investigaron por
el Departamento de la Estación Experimental de Agricultura de
Estados Unidos en Dakota del Sur. En 1934, según indicó la Estación
Experimental, la causa de la pérdida de ganado era el elemento
selenio, que se encontraba en altas proporciones en ciertos suelos
y secundariamente en plantas de diversas especies de los géneros
Astragalus (arveja), Xylorrhiza (aster leñoso),
conopsis (vara de oro) y Stanleya (pluma de
príncipe). La ingestión de estas y de otras plantas que contenían Se
por el ganado solía tener resultados fatales.
A lo largo del período de tiempo transcurrido
entre el descubrimiento de la toxicidad del selenio en el ganado en
1934 y 1988, se crearon muchas hipótesis para explicar el mecanismo
por medio del cual eran tóxicos muchos pero no todos los compuestos
de selenio. Ninguna de estas teorías de la toxicidad del selenio
resultó satisfactoria para explicar totalmente por qué era tóxico el
selenio. En 1989, Seko, Y.E., Saito, Y. Kitahare, J. y Imura, N.,
"Active oxigen generation by the reaction of Selenite with
reduced glutathione in vitro", en: Proceedings of the
fourth international symposium on selenium and medicine (ed.,
Wendel, A.) páginas 70-73,
Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania, (1989),
indicaron que la selenita, (SeO_{3}), una forma inorgánica de Se,
reaccionaba con un tiol, glutatión, (GSH), para producir superóxido
(O_{2}^{.-}). Como el superóxido es un agente tóxico conocido,
esto sugirió la posibilidad de que todos los compuestos de selenio
que son tóxicos pudieran generar superóxido. Por medio del ensayo de
muchos compuestos de selenio, se descubrió que los compuestos
inorgánicos SeO_{3} y dióxido de selenio (SeO_{2}) podían
generar O_{2}^{.-} y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2})
cuando se presentaban con un tiol, tal como glutatión, cisteína
(CysSH) o ditiotreitol D(SH_{2}). Además, se descubrió que
todos los diselenuros de la composición RSeSeR ensayados de forma
similar generarían O_{2}^{.-} y H_{2}O_{2} cuando se
presentaran con cualquiera de los tioles mencionados
anteriormente.
En 1947, Feigl, F. y West, P.W. "Test for
selenium based on a catalytic effect", Analytical
Chemistry, vol. 19, páginas 351-353 (1947),
notificaron que el selenio podía catalizar una reacción redox que
implicaba la oxidación de sulfuro. Esto pronto se convirtió en un
ensayo común para el selenio usando azul de metileno. Esta reacción
se estudió adicionalmente por otros autores usando diferentes
compuestos de selenio y tioles, demostrando la catálisis para
algunos pero no todos los compuestos de selenio. Véase, West, P.W.
y Ramakrishna, T.V. "A catalytic method for determining traces of
selenium", Analytic Chemistry, vol. 40, páginas
966-968 (1968); Levander, O.A., Morris V.C., y
Higgs, D.J. "Selenium as catalyst for the reduction of cytochrome
C by glutathione", Biochemistry, vol. 12, páginas
4591-4595 (1973), Rhead, N.J. y Schrauzer, G.N.,
"The selenium catalyzed reduction of methylene blue by
thiols", Bioorganic Chemistry, vol. 3, páginas
225-242 (1974). En 1958 se notificó la capacidad
catalítica del selenio de la selenocistina (RSeSeR) en presencia de
tioles. Ahora se cree que todas las reacciones anteriores de los
compuestos de selenio producen superóxido. Véase Xu, M., Zhang, L.,
Sun, E. y Fan, H., "Studies on the interaction of trace element
selenium with oxygen free radical, "Advances in Free Radical
Biology and Medicine, vol. I, páginas 35-48
(1991); Xu, H., Feng, Z., y Yi, C., "Free radical mechanism of the
toxicity of selenium compounds", Huzahong Longong Daxus
Xuebao, vol. 19, páginas 13-19 (1991); Kitahara,
J., Seko, Y. e Imura, N., "Possible involvement of active oxygen
species in selenite toxicity in isolated rat hepatocytes",
Archives of toxicology, vol. 67, páginas
497-501 (1993); Chaudiere, J., Courtin, O. y
Ledaire, J., "Glutathione oxidase activity of
seleno-cystamine: a mechanistic study",
Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 296, páginas
328-336 (1992).
Como se sabe desde principios de los años 70, el
selenio y varios de sus compuestos poseen propiedades contra el
cáncer. En general, se ha reconocido que la selenita y el dióxido
de selenio son buenos agentes contra el cáncer in vitro y en
animales experimentales y que los compuestos también son
citotóxicos tanto para las células cancerosas como para las células
normales in vitro. La Patente de Estados Unidos Nº 5.104.852
de Kralick et al. describe el uso de selenodiglutatión y otros
selenoditioles de la configuración (GSSeSG) para tratar el cáncer.
El selenodiglutatión es el producto de la reacción entre selenita o
dióxido de selenio con glutatión. El compuesto, selenodiglutatión,
se ha aislado. Sin embargo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.104.852 no describe el mecanismo de acción por medio del cual el
selenodiglutatión y compuestos similares son útiles en el
tratamiento del cáncer.
En 1982, Hu, M.L., y Spallholz, J.E., "In
vitro hemolysis of rat erythrocytes by selenium compounds",
Biochemical Pharmacology, vol. 32, páginas
857-961 (1983), describieron la interacción de
selenita y selenocistina con glutatión en la citotoxicidad y lisis
de membranas de eritrocitos de rata. Esta citotoxicidad, como se
revela por microscopía electrónica de barrido de eritrocitos de
rata, hizo que las membranas de los eritrocitos se deterioraran, que
el tamaño de las células se cuadruplicara y que se lisaran de una
forma similar a la descrita por Kellogg, E. y Fridovich, I.,
"Liposome oxidation and erythrocyte lysis by enzymatically
generated superoxide and hydrogen peroxide", J. Biol.
Chem., vol. 252, páginas 6721-6728 (1977). Sin
embargo, esta toxicidad no se expresó por la selenometionina, un
compuesto que poseía la configuración RSeR. En 1991, un artículo de
Yan, L. y Spallholz, J. E., "Free radical generation by selenium
compounds", FASEB J., vol. 5, p.A581 (1991), mostró una toxicidad
que respondía a la dosis de varios compuestos de selenio contra una
línea de células de tumor mamario humano. Otras investigaciones
realizadas usando quimioluminiscencia de lucigenina y
quimioluminiscencia de luminol revelaron una respuesta a la dosis
en la quimioluminiscencia generada por O_{2}^{.-} y
H_{2}O_{2} por selenita, dióxido de selenio y todos los
compuestos de selenio ensayados de la configuración RSeSeR. Además,
se descubrió que los compuestos de selenio en presencia de células
tumorales o glutatión solo producían superóxido y H_{2}O_{2}.
La quimioluminiscencia de las reacciones de lucigenina con
O_{2}^{.-} o luminol con H_{2}O_{2} podría inactivarse por
las enzimas nativas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CT) o
glutatión peroxidasa (GSHPx). Las enzimas desnaturalizadas no
inactivaron estas reacciones, lo cual confirmó la generación del
radical libre (O_{2}^{.-}) y H_{2}O_{2} por compuestos de
selenio y tioles. Toda esta química de radicales libres de selenio
se ha revisado por Spallholz, J.E. "On the nature of selenium
toxicity and carcinostatic activity", Free Radical Biology
and Medicine, vol. 17, páginas 45-64,
(1994).
A continuación se proporciona un resumen de este
gran conjunto de datos experimentales sobre la toxicidad del
selenio, la catálisis y la actividad carcinostática:
- 1)
- Los compuestos de selenio, SeO_{2} y SeO_{3}, reaccionan con tioles para producir un selenoditiol de la configuración (RSSeSR). Este compuesto no es tóxico per se ni es carcinostático. La forma carcinostática tóxica de RSeR es el anión selenuro reducido, Rse^{-}.
- 2)
- Los compuestos de selenio de la configuración (RSeSeR) o (RSeSeR) reaccionan con tioles para producir el anión de selenita reducido Rse^{-} o R'Se^{-}. Esta forma de selenopersulfuro del Se es catalítica, como se muestra por la inhibición tanto de la catálisis como de la generación de superóxido por el ácido yodoacético y el ácido mercaptosuccínico.
- 3)
- Los catalizadores de selenio orgánico, por la configuración RSe- del anión de selenopersulfuro, son catalíticos en presencia de tioles y el Rse^{-} continúa generando ion superóxido (O_{2}^{.-}) siempre que estén presentes suficientes concentraciones de O_{2}^{.-} y tiol en el medio. Los compuestos de selenio derivados de selenita o dióxido de selenio que reaccionan con glutatión (GSH) se convierten en selenio elemental (Se.) como se indica a continuación; SeO_{3} o (SeO_{2}) + 2GSH \rightarrow 2GSSeSG \rightarrow 2GSSG + Se\cdot'. El selenio elemental (Se.) no es catalítico y no es tóxico.
- 4)
- Los compuestos de selenio de la configuración Rse^{-} son tóxicos debido a la aceleración catalítica de la oxidación de tiol que produce O_{2}^{.-}, H_{2}O_{2} y el radical libre más toxico, el radical hidroxilo (^{.}OH). Esta química se ha descrito por Misra, H.P., "Generation of superoxide free radical during the auto-oxidation of thiols", J. Biol. Chem., vol. 249, páginas 2151-2155 (1974) para la oxidación espontánea de tioles. La asociación de la catálisis rápida de tiol por compuestos de selenio de la configuración Rse^{-} y la toxicidad por la que producía radicales libres y productos de oxígeno tóxicos reactivos se reconoció en 1992 por uno de los inventores.
El uso de selenio para el tratamiento del cáncer
experimental en animales y del cáncer en seres humanos in
vivo se ha descrito ampliamente por muchos autores tales como
Milner, J.A., Greeder, G.A., Poirier, K.A., "Selenium and
transplantable tumors", (Spallholz, J.E. Martin, J.L., Ganther,
H.E., eds.) Selenium in Biology and Medicine, AVI Publishing
Co. (1981); Ip, C. y Ganther, J.E., "Relationship between the
chemical form of selenium and anticarcinogenic activity", CRC
Press, Inc., páginas 479-488 (1992); Caffrey,
P.B. y Frenkel, G.D. "Selenite cytotoxicity in drug resistant and
non-resistant human ovarian tumor cells",
Cancer Research, vol. 52, páginas 4812-4816
(1992); Schrauzer, G.N., "Selenium: Mechanistic aspects of
anticarcinogen action", Biol. Trace Elem. Res., vol. 33,
páginas 51-62 (1992); Yan, L. y Spallholz, J.E.
"Generation of reactive oxygen species from the reaction of
selenium compounds with thiols and mammary tumor cells",
Biochemical Pharmacology, vol. 45, páginas
429-437 (1993). El artículo de Yan y Spallholz
describe la capacidad de ciertos compuestos de selenio de generar
superóxido por la oxidación de glutatión y otros tioles en ausencia
y presencia de ciertas líneas de células tumorales. Sin embargo, el
artículo describe sólo compuestos de selenio no conjugados que se
sabía que eran tóxicos para las células. La Patente de Estados
Unidos Nº 5.225.182 usa selenometionina como agente de vector para
suministrar un agente terapéuticamente activo a un sistema diana
deseado. El compuesto de selenio se usa como el agente terapéutico.
En la Patente de Estados Unidos Nº 5.104.852 se ha descrito el uso
de selenio como agente citotóxico tanto para células normales como
para células cancerosas in vitro para la inyección de
selenodiglutatión en una masa tumoral para destruir células
tumorales. En la Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958, Rodwell et
al. describieron muchos fármacos antibacterianos, 3 fármacos
antivirales, 1 fármaco antifúngico, 7 fármacos antineoplásicos, 3
agentes radiofarmacéuticos, 3 metales pesados y 2 antimicoplasmas
como fármacos para la liberación mediada por anticuerpos. En
general, se entiende la farmacología de todos estos fármacos, que se
indican en la tabla 1 de la Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958.
La tabla 1 de la patente de Rodwell et al. no contiene selenio
debido a su acción farmacológica como generador de radicales libres
de (O_{2}^{.-}) y en ese momento no se entendían o no se
conocían otras moléculas de oxígeno reactivas.
Las infecciones virales son difíciles de tratar
porque los virus carecen de un mecanismo de absorción por medio del
cual los agentes destinados a destruir o dañar al virus puedan
entrar en el virus. Aunque se sepa que una persona se ha infectado
con un virus, hasta ahora ha sido necesario esperar a que el virus
infecte a las células del hospedador para reproducirse en las
células. Las células, que tienen un mecanismo de absorción,
absorberán el agente. Entonces, la reproducción viral sólo puede
bloquearse. En la práctica, la infección viral normalmente se
extiende a lo largo del tiempo hasta que es posible el tratamiento.
Esto es particularmente devastador con las infecciones por el virus
VIH, el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA). A menudo, una persona infectada sabe que se ha expuesto al
virus pero no se puede detener la extensión del virus hasta que las
células de la persona se hayan infectado.
Están apareciendo antibióticos con una fiabilidad
inmediata para el tratamiento de infecciones bacterianas. Con la
aparición de muchas cepas de bacterias resistentes a fármacos
convencionales, tales como las identificadas en el artículo del 28
de marzo de 1994 de la revista Newsweek e indicadas más adelante en
la tabla 1, la necesidad de un nuevo agente para combatir
enfermedades infecciosas se está volviendo crítica.
| Bacterias resistentes a fármaco | ||
| Bacterias | Enfermedades producidas | Antibióticos que ya no funcionan |
| Enterococcus | Toxicidad sanguínea, | Aminoglucósidos, |
| infecciones quirúrgicas | cefalosporinas, | |
| eritromicina, | ||
| penicilina, | ||
| tetraciclina, | ||
| vancomicina | ||
| Hemophilus influenza | Meningitis, | Cloranfenicol, |
| infecciones de oído, | penicilinas, | |
| neumonía, sinusitis | tetraciclina, | |
| trimetorprima/ | ||
| sulfametoxazol | ||
| Mycobacterium tuberculosis | Tuberculosis | Aminoglucósidos, |
| etambutol, | ||
| isoniazida, | ||
| pirazinamida, | ||
| rifampina | ||
| Neisseria gonorrhea | Gonorrea | Penicilinas, |
| espectinomicina, | ||
| tetraciclina | ||
| Plasmodium falciparum | Malaria | Cloroquina |
| Shigella dysenteriae | Diarrea severa | Ampicilina, |
| cloranfenicol, | ||
| tetraciclina, | ||
| trimetoprima/ | ||
| sulfametoxazol | ||
| Staphylococcus aureus | Toxicidad sanguínea, | Todos excepto vancomicina |
| neumonía, | ||
| infecciones quirúrgicas | ||
| Streptococcus pneumoniae | Meningitis, | Aminoglucósidos, |
| neumonía | cefalosporinas, | |
| cloranfenicol, | ||
| critromicina, | ||
| penicilinas, | ||
| tetraciclina, | ||
| trimetorprima/ | ||
| sulfametoxazol |
Es un objeto de la invención proporcionar un
nuevo agente bactericida y viricida.
Es otro objeto de esta invención proporcionar una
metodología para usar la tecnología de radicales libres mencionada
anteriormente como agentes bactericidas o viricidas. Es otro objeto
de la presente invención proporcionar un método para dirigir la
producción localizada de superóxido y especies descendientes del
mismo para la destrucción o modificación selectiva de células,
tejidos, membranas o fluidos extracelulares para combatir una
diversidad de problemas localizados, desde infecciones al cáncer, a
la coagulación después de una operación quirúrgica y a la
fribrosis.
La presente invención comprende la unión química
covalente orgánica de compuestos de selenio orgánicos seleccionados
entre el grupo compuesto por RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR' a
diversas moléculas de soporte, donde cada uno de R y R' se
selecciona entre el grupo compuesto por restos alifáticos que
contienen uno o más de los siguientes grupos reactivos: aldehído,
carboxílico, amino, alcohólico, fosfato, sulfato, halógeno o
fenólico, y combinaciones de los mismos, tales como
-(CH_{2})_{n}HN_{2}, -(CH_{2})_{n}COOH,
-(CH_{2})_{n}-\diameter, donde n es un
número entero igual o mayor que 1. R y R' pueden ser iguales o
diferentes. Las moléculas de soporte tienen un constituyente
reactivo complementario capaz de formar un enlace covalente con los
grupos reactivos del compuesto de selenio para producir un
conjugado de selenio-soporte, siendo dicho soporte
un soporte dirigido a un sitio diana capaz de unirse
específicamente a un sitio diana y teniendo el sitio diana
compuestos de tiol asociados con el mismo, de tal forma que, en el
uso, el conjugado de selenio y soporte dirige selectivamente el
compuesto de selenio orgánico del conjugado a un sitio diana
selectivo para permitir que el compuesto de selenio reaccione con
dichos tioles endógenos en dicho sitio diana para generar superóxido
para una destrucción localizada.
El compuesto de selenio puede unirse
covalentemente al soporte oxidando el soporte con un agente
oxidante para generar grupos reactivos complementarios a los grupos
reactivos del compuesto de selenio, retirando el exceso de agente
oxidante y formando el conjugado de selenio-soporte
por incubación del compuesto de selenio con el soporte oxidado
durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los
grupos reactivos del compuesto de selenio se unan covalentemente a
los grupos reactivos complementarios del soporte.
Las moléculas de soporte pueden seleccionarse
entre anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales,
polipéptidos, péptidos, carbohidratos, lípidos, vitaminas, fármacos
y otros soportes o dispositivos orgánicos tales como lectina,
plásmidos, liposomas, ácidos nucleicos y dispositivos implantables
para el tratamiento de enfermedades producidas por patógenos, tales
como virus, protozoos, bacterias, rickettsia, levaduras,
micoplasmas, hongos u otros patógenos, y enfermedades de cualquier
etiología conocida o desconocida, tales como cánceres y glaucoma. La
presente invención se refiere al tratamiento y cura de un amplio
espectro de cánceres, infecciones bacterianas, virales y otras
infecciones bióticas.
Un descubrimiento interesante de la invención es
que el tejido, célula o fluido corporal proporciona la potencia
reductora para la generación de superóxido (O_{2}^{.-}). Sin
embargo, si se necesita una potencia reductora adicional in
vivo, puede suministrarse por glutatión exógeno o cisteína de
acuerdo con técnicas conocidas.
La invención también proporciona el uso de un
conjugado de selenio-soporte para la fabricación de
un adyuvante médico para el tratamiento de tumores cancerosos e
infecciones patogénicas, donde dicho conjugado de
selenio-soporte comprende (i) un compuesto de
selenio orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por RSeH,
RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R y R' son iguales y
diferentes y cada uno es un resto alifático que contiene al menos un
grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por grupos
reactivos de aldehído, amino, alcohólicos, carboxílicos, fosfato,
sulfato, halógeno o fenólicos y combinaciones de los mismos, unidos
covalentemente a (ii) un soporte que tiene un constituyente capaz
de formar un enlace covalente con los grupos reactivos del
compuesto de selenio para producir el conjugado de
selenio-soporte. El soporte es capaz de suministrar
de forma localizada y de unirse de forma específica a tumores
cancerosos y patógenos que comprenden un sitio diana, que tienen
compuestos de tiol endógenos, para dirigir selectivamente el
compuesto de selenio orgánico al sitio diana para la generación
localizada de superóxido para la destrucción localiza en el sitio
diana. La invención también incluye el uso de un dispositivo
recubierto con selenio para la fabricación de un adyuvante médico
para prevenir el crecimiento celular indeseado asociado con el uso
de implantes, y el uso de un soporte de selenio para la fabricación
de un adyuvante médico para la prevención de la cicatrización
indeseada en procedimientos quirúrgicos. El compuesto de selenio
orgánico mencionado anteriormente se une covalentemente a la
superficie de un dispositivo implantable o una matriz estacionaria,
obteniéndose un dispositivo o soporte recubierto con selenio, según
sea el caso, para la generación localizada de superóxido en el
implante o en el sitio quirúrgico para inhibir la formación de
tejido cicatrizado u otro crecimiento celular indeseable.
La invención también comprende la unión de estos
mismos aductos de selenio para inmunoensayos y otros trabajos
analíticos cuantitativos como se describe por la Patente de Estados
Unidos Nº 4.341.757, presentada el 23 de julio de 1982, que se
incorpora en este documento como referencia. La presente invención
proporciona, por ejemplo, un método para detectar la presencia de
un compuesto de interés biológico, que comprende la etapas de
incubar conjuntamente una mezcla de una muestra que se sospecha que
contiene un compuesto de interés biológico y un conjugado de
selenio-soporte como se ha descrito anteriormente,
donde el soporte puede unirse de forma específica al compuesto de
interés biológico, para unir el conjugado de
selenio-soporte a un determinante del compuesto de
interés biológico. Después, se retira todo el conjugado de
selenio-soporte no unido. Posteriormente, el método
incluye las etapas de añadir un compuesto de tiol a la mezcla para
que reaccione con el selenio para generar superóxido, y después
añadir un agente indicador a la mezcla. El agente indicador puede
reaccionar con superóxido. Finalmente, se detecta la reacción entre
el agente indicador y el superóxido. El agente indicador puede ser,
por ejemplo, lucigenina, azul de metileno o citocromo C. Los
compuestos de interés biológico pueden ser proteínas, vitaminas,
hormonas, enzimas, anticuerpos, polisacáridos, antígenos celulares
y de tejidos, los patógenos descritos en este documento, fármacos u
otras células sanguíneas o fluidos intra o extracelulares. Los
anticuerpos específicos para cualquiera de estos compuestos pueden
obtenerse por técnicas bien conocidas. Tales anticuerpos pueden
usarse como soporte para la unión al compuesto de selenio de la
invención.
La unión de compuestos de selenio de las
configuraciones descritas anteriormente a soportes, medios de
diagnóstico o dispositivos cuando se presentan a tioles endógenos
tales como glutatión, que se produce en células vivas aerobias, o
tioles exógenos tales como glutatión o cisteína, produce superóxido
(O_{2}^{.-}), peróxido de hidrógeno, el radical hidroxilo
(^{.}OH) y otras especies de oxígeno reactivas citotóxicas, de
forma que colectivamente forman una farmacología de radicales
libres localizada y una farmacopea basada en el anión de selenio
catalítico, Rse^{-}. Como los superóxidos son tan mortales para
las células, el cuerpo tiene mecanismos naturales para destruir los
superóxidos, por ejemplo, con dismutasa. De esta manera, el radical
superóxido, O_{2}^{-}, tiene una vida media relativamente corta
y se degradará. El H_{2}O_{2} y el ^{.}OH se producen de forma
secundaria y tienen una vida ligeramente mayor. Como se usa en
este documento, por brevedad, el superóxido incluirá O_{2}^{.-}
y sus especies de oxígeno descendientes. Debido a la corta vida, el
O_{2}^{.-} debe generarse en o cerca del sitio donde se desea
la destrucción. La unión covalente de compuestos de selenio que
producen el anión RSe- proporciona una nueva química analítica
basada en la generación y detección de superóxido (O_{2}^{.-})
usando quimioluminiscencia o la reducción de diversos colorantes,
tales como azul de metileno o citocromo C. El azul de metileno y el
citocromo C en la forma oxidada pueden reducirse por selenio unido
a una molécula receptora por medio de la generación de superóxido.
La cantidad de azul de metileno o citocromo C reducido puede
medirse espectrofotométricamente y cuantificarse, reflejando de
esta manera la concentración de la molécula a la que se une el
selenio.
Preferiblemente, esta invención proporciona un
aducto molecular pequeño, RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR o
RSeSeR', usando el grupo detector para la química analítica quimioluminiscencia o colorantes químicos por medio de la producción de superóxido (O_{2}^{.-}); y el generador de superóxido (O_{2}^{.-}), que sólo es tóxico en un área muy localizada producida por el conjugado Rse^{-} y que se determina por la unión de una molécula de soporte o se localiza por una matriz insoluble estable. La presente invención soluciona substancialmente el problema generalizado de la toxicidad sistémica del selenio en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer metastásico y demuestra una nueva farmacología de radicales libres aplicada. Esta invención representa un avance importante en la aplicación de la toxicidad de selenio en el tratamiento de enfermedades y en la extensión o sensibilidad analítica y en la facilidad de detección para inmunoensayos isotópicos estables. La farmacología del radical libre superóxido de dirección, basada en la adición de selenio a moléculas diana de la presente invención, es prometedora para una nueva farmacopea bacteriana. Esto mismo ocurre para infecciones virales, en las que la conjugación de la configuración apropiada de selenio a un agente de dirección viral, tal como un anticuerpo o péptido de unión, hará que un virus virulento se vuelva no virulento.
RSeSeR', usando el grupo detector para la química analítica quimioluminiscencia o colorantes químicos por medio de la producción de superóxido (O_{2}^{.-}); y el generador de superóxido (O_{2}^{.-}), que sólo es tóxico en un área muy localizada producida por el conjugado Rse^{-} y que se determina por la unión de una molécula de soporte o se localiza por una matriz insoluble estable. La presente invención soluciona substancialmente el problema generalizado de la toxicidad sistémica del selenio en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer metastásico y demuestra una nueva farmacología de radicales libres aplicada. Esta invención representa un avance importante en la aplicación de la toxicidad de selenio en el tratamiento de enfermedades y en la extensión o sensibilidad analítica y en la facilidad de detección para inmunoensayos isotópicos estables. La farmacología del radical libre superóxido de dirección, basada en la adición de selenio a moléculas diana de la presente invención, es prometedora para una nueva farmacopea bacteriana. Esto mismo ocurre para infecciones virales, en las que la conjugación de la configuración apropiada de selenio a un agente de dirección viral, tal como un anticuerpo o péptido de unión, hará que un virus virulento se vuelva no virulento.
La presente invención proporciona además un
implante que comprende un conjugado de
selenio-soporte como se ha descrito anteriormente.
La presente invención también proporciona un agente farmacéutico
para el tratamiento de tumores cancerosos e infecciones patogénicas
que comprende un conjugado de selenio-soporte como
se ha descrito anteriormente en este documento.
La invención puede entenderse mejor haciendo
referencia a las figuras en las que:
La fig. 1 es un gráfico que demuestra el
porcentaje de hemólisis de eritrocitos humanos producida por
conjugados Ab-Se, Ab nativo y combinaciones de los
dos;
la fig. 2 es un gráfico que muestra la
citotoxicidad de un conjugado covalente de
anticuerpo-selenio;
la fig. 3 es un gráfico de barras que muestra el
crecimiento celular, medido por la incorporación de timidina
tritiada, sobre plástico tratado con plasma de CO_{2} con y sin el
acoplamiento covalente posterior con selenocistamina;
la fig. 4 es un gráfico de barras que muestra el
crecimiento de células en plástico tratado con plasma de CO_{2}
con o sin el acoplamiento covalente posterior de selenocistamina
durante tiempos de tratamiento variables; y
la fig. 5 es un gráfico de barras que muestra el
crecimiento celular en presencia y ausencia de esponjas de celulosa
tratadas con selenio unidas covalentemente, medido por la
incorporación de timidina tritiada.
\newpage
Esta invención se refiere a la unión covalente de
aductos de selenio de la configuración RSeH, RSeR, RSeR',
RSeSeR o RSeSeR' a moléculas de soporte, medios de diagnóstico y dispositivos. El conjugado de Se-soporte producido de esta manera se administra por inyección o ingestión y se lleva por medios fisiológicos normales a un sitio diana o molécula diana, o se implanta quirúrgicamente en un sitio diana, tras lo cual se genera superóxido (O_{2}^{.-}) cuando el conjugado Se-soporte reacciona con tioles endógenos presentes en la superficie del tejido local diana, bacterias, virus, protozoos u otros compuestos diana. La toxicidad del selenio producida por el conjugado Rse^{-} está muy localizada porque se determina por la unión específica de la molécula de soporte o se localiza por la matriz insoluble estable de un implante. Cada uno de R y R' se selecciona entre el grupo compuesto por restos alifáticos que contienen uno o más grupos reactivos de aldehído, carboxílicos, amino, alcohólicos, fosfato, sulfato, halógeno o fenólicos, y combinaciones de los mismos, tales como -(CH_{2})_{n}HN_{2}, -(CH_{2})_{n}COOH, -(CH_{2})_{n}-\diameter, donde n es un número entero mayor que 1, y preferiblemente está comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, y más preferiblemente es de aproximadamente 3 a 5. R y R' pueden ser iguales o diferentes. Los grupos R, por sí mismos, no tienen un papel real en el método de la invención distinto de proporcionar grupos reactivos para unirse al soporte y proteger al selenio hasta que alcance los sitios diana. Por consiguiente, la longitud de la cadena alifática no es importante. El peso molecular preferido del compuesto es de aproximadamente 1000 o menor, pero serán adecuados pesos moleculares superiores. Los ejemplos representativos de los compuestos de selenio incluyen, pero sin limitación, NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeCH_{3} (RSeR'), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeCH_{2}CH_{2}NH_{2} (RSeR), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH_{2} (RSeSeR), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH-celulosa (RSeSeR') y selenocistamina. Se prefieren las configuraciones RSeH, RSeSeR y RSeSeR'. Estos compuestos de selenio se unen covalentemente o de otra manera a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal y, cuando entran en contacto con un tiol, pueden generar superóxido (O_{2}^{.-}), H_{2}O_{2}, radicales hidroxilo (^{.}OH) o cualquier otra especie de oxígeno reactiva. Los tioles pueden ser tioles exógenos añadidos, por ejemplo, a un inmunoensayo competitivo, o tioles endógenos encontrados en membranas, en el citoplasma celular o en fluidos extracelulares. Si los tioles nativos son insuficientes, pueden usarse glutatión, derivados de glutatión, cisteína u otro tiol, suministrados exógenamente, expresamente para la generación de superóxido. El conjugado de selenio-soporte se usa para tratar, de una manera farmacológica, el cáncer, tanto primario como metastásico, infecciones y enfermedades producidas por cualquier virus de cualquier origen, vegetal, animal o humano, cualquier bacteria de cualquier origen, vegetal, animal o humano, cualquier protozoo de cualquier origen, vegetal, animal o humano y otros patógenos. El conjugado de anticuerpo-selenio, por ejemplo, se unirá específicamente al virus, bacteria, protozoo o célula cancerígena y catalizará la producción de superóxido, H_{2}O_{2} y otras especies de oxígeno reactivas. Los virus tienen proteínas superficiales a las que pueden unirse los conjugados de selenio y anticuerpo. El selenio reacciona con tioles en esas proteínas superficiales para generar el superóxido en la superficie del virus. La ausencia de un mecanismo de absorción en el virus no es importante, porque el daño se realiza en la superficie viral.
RSeSeR o RSeSeR' a moléculas de soporte, medios de diagnóstico y dispositivos. El conjugado de Se-soporte producido de esta manera se administra por inyección o ingestión y se lleva por medios fisiológicos normales a un sitio diana o molécula diana, o se implanta quirúrgicamente en un sitio diana, tras lo cual se genera superóxido (O_{2}^{.-}) cuando el conjugado Se-soporte reacciona con tioles endógenos presentes en la superficie del tejido local diana, bacterias, virus, protozoos u otros compuestos diana. La toxicidad del selenio producida por el conjugado Rse^{-} está muy localizada porque se determina por la unión específica de la molécula de soporte o se localiza por la matriz insoluble estable de un implante. Cada uno de R y R' se selecciona entre el grupo compuesto por restos alifáticos que contienen uno o más grupos reactivos de aldehído, carboxílicos, amino, alcohólicos, fosfato, sulfato, halógeno o fenólicos, y combinaciones de los mismos, tales como -(CH_{2})_{n}HN_{2}, -(CH_{2})_{n}COOH, -(CH_{2})_{n}-\diameter, donde n es un número entero mayor que 1, y preferiblemente está comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, y más preferiblemente es de aproximadamente 3 a 5. R y R' pueden ser iguales o diferentes. Los grupos R, por sí mismos, no tienen un papel real en el método de la invención distinto de proporcionar grupos reactivos para unirse al soporte y proteger al selenio hasta que alcance los sitios diana. Por consiguiente, la longitud de la cadena alifática no es importante. El peso molecular preferido del compuesto es de aproximadamente 1000 o menor, pero serán adecuados pesos moleculares superiores. Los ejemplos representativos de los compuestos de selenio incluyen, pero sin limitación, NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeCH_{3} (RSeR'), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeCH_{2}CH_{2}NH_{2} (RSeR), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH_{2} (RSeSeR), NH_{2}CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH-celulosa (RSeSeR') y selenocistamina. Se prefieren las configuraciones RSeH, RSeSeR y RSeSeR'. Estos compuestos de selenio se unen covalentemente o de otra manera a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal y, cuando entran en contacto con un tiol, pueden generar superóxido (O_{2}^{.-}), H_{2}O_{2}, radicales hidroxilo (^{.}OH) o cualquier otra especie de oxígeno reactiva. Los tioles pueden ser tioles exógenos añadidos, por ejemplo, a un inmunoensayo competitivo, o tioles endógenos encontrados en membranas, en el citoplasma celular o en fluidos extracelulares. Si los tioles nativos son insuficientes, pueden usarse glutatión, derivados de glutatión, cisteína u otro tiol, suministrados exógenamente, expresamente para la generación de superóxido. El conjugado de selenio-soporte se usa para tratar, de una manera farmacológica, el cáncer, tanto primario como metastásico, infecciones y enfermedades producidas por cualquier virus de cualquier origen, vegetal, animal o humano, cualquier bacteria de cualquier origen, vegetal, animal o humano, cualquier protozoo de cualquier origen, vegetal, animal o humano y otros patógenos. El conjugado de anticuerpo-selenio, por ejemplo, se unirá específicamente al virus, bacteria, protozoo o célula cancerígena y catalizará la producción de superóxido, H_{2}O_{2} y otras especies de oxígeno reactivas. Los virus tienen proteínas superficiales a las que pueden unirse los conjugados de selenio y anticuerpo. El selenio reacciona con tioles en esas proteínas superficiales para generar el superóxido en la superficie del virus. La ausencia de un mecanismo de absorción en el virus no es importante, porque el daño se realiza en la superficie viral.
Cuando el compuesto de Se orgánico se une a una
molécula de anticuerpo de localización dirigida, se cree que se une
típicamente al fragmento F(Ab^{-})_{2} del
anticuerpo. También pueden ser el sitio de unión otros fragmentos
del anticuerpo, naturales o sintéticos, tales como carbohidratos o
aminoácidos modificados.
La molécula de localización dirigida que lleva el
selenio puede ser cualquier proteína, polipéptido, péptido,
carbohidrato, lípido, fármaco, vitamina, hormona, lectina,
plásmido, liposoma, ácidos nucleicos u otras moléculas orgánicas de
localización dirigida para las que existe un receptor. Tales
substancias de localización dirigidas son conocidas para los
especialistas en la técnica. Sea cual sea la localización del
problema, como soporte se elige un constituyente que se dirija al
sitio. El selenio se introduce en un anticuerpo o en otras moléculas
de localización dirigida por modificación química de restos
existentes tales como el aminoácido serina, para generar las
configuraciones covalentes RSeH, RSeSeR, RSeSeR' o Rse^{-}.
El selenio puede unirse covalentemente a
cualquier proteína, anticuerpo, hapteno o matriz a usar en
cualquier inmunoensayo o ensayo de unión competitiva, con lo que el
superóxido (O_{2}^{.-}) o sus especies de oxígeno reactivas
descendientes se usan como sistema de detección usando
quimioluminiscencia, colorantes químicos o moléculas que reaccionan
con O_{2}^{.-} o H_{2}O_{2} como indicador de las
concentraciones de aducto de selenio desconocidas.
Los compuestos de selenio pueden unirse a
cualquier matriz sólida o estacionaria, tal como una capa de
celulosa, una capa de proteína, otra capa de carbohidrato, una
matriz de plástico o de otro polímero o una matriz fibrosa
biocompatible para generar superóxido (O_{2}^{.-}) y su especie
de oxígeno reactiva descendiente cuando se implanta la matriz. El
dispositivo no debe ser metálico, pero puede ser un compuesto
organometálico o un metal recubierto con un compuesto orgánico al
que puede unirse el compuesto de selenio. El selenio unido a la
matriz insoluble inhibe el crecimiento celular en el área
localizada de la matriz debido a la generación localizada de
superóxido.
Los medios de diagnóstico, como se usan en este
documento, se refieren a moléculas a las que se ha unido selenio,
que después se unen específicamente a otra molécula para uso en
ensayos de diagnóstico para la generación y medición de radicales
superóxido. Los ejemplos de ensayos de diagnóstico con los que son
particularmente adecuados los conjugados de
Se-soporte de la presente invención incluyen ensayos
de unión competitiva, ensayos de unión directa, inmunoensayos y
ensayos histológicos tales como reducción de nitroazul tetrazolio a
partir de la formación de formazán.
Los dispositivos, como se usan en este documento,
se refieren a superficies de soporte estacionarias de materiales
tales como celulosa, plásticos, colágeno y polímeros capaces de
unirse al selenio. Los ejemplos de tales dispositivos incluyen
válvulas cardíacas protésicas, implantes de lentes intraoculares,
implantes de pene, catéteres, shunts vasculares y otros implantes
protésicos con una función especializada. Por ejemplo, la
superficie de implantes de lentes intraoculares se une al compuesto
de selenio de forma que, tras la implantación, el selenio cataliza
localmente la producción de superóxidos en la superficie del
implante. El superóxido reacciona con la superficie celular para
minimizar la formación de cicatrices. Un implante vascular, por
ejemplo, puede recubrirse con el compuesto de selenio de forma que,
tras la implantación, se inhiba la coagulación de la sangre en el
sitio del implante. La superficie de estos implantes proporciona una
matriz para unir el compuesto de selenio y suministrar el selenio
en un sitio específico. El efecto es localizado. Además, cualquier
cantidad de selenio que pueda escapar es demasiado pequeña como para
ser tóxica, y se metaboliza fácilmente. El superóxido tiene una
vida media muy corta. Se degradará relativamente pronto, de forma
que sólo producirá daños considerables en el sitio localizado de su
generación.
El elemento no metálico selenio existe en varios
estados de oxidación catalíticos y no catalíticos, in vitro
e in vivo. Si están presentes en suficientes concentraciones
de compuestos de tiol, los compuestos de selenio tales como
selenuros, Rse^{-}, oxidan los tioles, produciendo superóxido
(O_{2}^{.-}) y otras especies de oxígeno biológicamente
reactivas. El superóxido y los otros productos reactivos
producidos, peróxido de hidrógeno, radicales tiol y otros radicales
libres orgánicos, son tóxicos para las membranas biológicas, las
moléculas y las células. Cuando está presente en suficiente
concentración en forma del anión de selenoselenuro, Rse^{-}, el
selenio puede detener y destruir células normales, células
cancerosas, células bacterianas, células de levadura y virus. Cuando
los compuestos de selenio orgánicos se unen covalentemente a
cualquier molécula de dirección tal como un anticuerpo mono- o
policlonal, péptido o polipéptido, hormona, vitamina, fármaco o
dispositivo, tales conjugados constituyen una nueva clase de
agentes farmacéuticos y dispositivos que producen radicales libres.
El selenio es muy diferente de otros elementos que producen
radicales libres, por ejemplo, hierro, cobre o cobalto, ya que el
selenio puede formar fácilmente aductos pequeños reemplazando al
azufre y se combina covalentemente con compuestos de carbono e
hidrógeno. Tales aductos marcados con selenio de la química
apropiada seguirán siendo no tóxicos hasta que se activen por un
tiol y la farmacología de radicales libres puede localizarse
molecularmente por la molécula de soporte. Esta química de radicales
libres también es útil para ensayos de unión competitiva de
proteínas. La química de radicales libres generada por los
compuestos de selenio puede detectarse por quimioluminiscencia o
reducción de colorantes por un espectrofotómetro proporcionando un
medio para la cuantificación de un compuesto, que se une al
anticuerpo, hapteno o fármaco al que se une el selenio y con el que
posteriormente reacciona con tioles.
Se realizó una serie de ensayos para unir
covalentemente los compuestos de selenio a una diversidad de
soportes. Además, se realizaron ensayos para ensayar la capacidad
de los conjugados de selenio-soporte para producir
superóxidos y destruir a las células o inhibir el crecimiento
celular. El intervalo de temperaturas para la unión de compuestos de
selenio a soportes depende del soporte usado pero, en general,
estará comprendido entre 4ºC y aproximadamente 37ºC y,
preferiblemente, entre aproximadamente la temperatura ambiente y
37ºC.
Un anticuerpo de eritrocitos humanos (disponible
en Dako Corporation) que contenía 5 mg de proteína/ml se incubó con
un exceso molar de 1500 veces de Na_{2}IO, en tampón fosfato
potásico a pH 6,0 durante 1-2 horas a
aproximadamente la temperatura ambiente. A esta solución se le
añadieron 100 \mug de glicerol para retirar el exceso de peryodato
y, después de la diálisis, un exceso molar de 200 veces de
selenocistamina\cdotHCl (disponible en Sigma Chemical Co.) que
contenía una relación molar de 1:2,2 de trietilamina. Este método
en su procedimiento generalizado es el descrito por Hurwitz, E.,
Levey, R., Mason, R., Wilcheck, M., Aron, R. y Sela, M., "The
covalent binding of daunomycin and adrionmycin to antibodies with
retention of both drug and antibody", Cancer Research,
vol. 35, páginas 1175-1181 (1975) y Hurwitz, E.,
"Specific and nonspecific macromolecular-drug
conjugates for the improvement of cancer chemotherapy",
Biopolymers, vol. 22, páginas 557-567 (1983),
por O'Shannessy, D.J. y Quarles, R.H., "Labeling of the
oligosaccharide moieties of immunoglobulins", J. Immunologic
Methods, vol. 99, páginas 153-161 (1987) y por
Rodwell et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.571.958, expedida el
9 de junio de 1987.
En esta reacción, la selenocistamina de la
configuración (RSeSeR) forma una base de desplazamiento covalente
estable y un enlace covalente entre la selenoamina y el resto
aldehído del carbohidrato oxidado con peryodato tras la reducción
con cianoborohidrato. El conjugado de
anticuerpo-selenio (Ab-Se) después
se separó de los componentes que no habían reaccionado en una
columna de Shephadex G-25 que se eluyó y se detectó
por un control UV a 280 nm.
Después de una diálisis extensiva, el
Ab-Se produjo continuamente superóxido
(O_{2}^{.-}) a un pH de 7,2 o a un pH de 9,0 como se controló
por quimioluminiscencia de lucigenina (disponible en Sigma Chemical
Co.), una técnica bien conocida, en presencia de glutatión usando un
Los Alamos Diagnostics Luminometer. La quimioluminiscencia, que es
específica para el O_{2}^{.-}, puede inactivarse completamente
en esta reacción por la superóxido dismutasa nativa.
\newpage
Se incubaron alícuotas del Ab-Se
a diversas concentraciones, es decir, de una manera respondedora a
la dosis, a 37ºC, durante 14 horas, con una suspensión al 1% de
eritrocitos humanos lavados en una solución equilibrada
fisiológicamente para mantener la viabilidad celular. En este
momento, se mide la hemólisis de los eritrocitos a 415 nm mediante
absorción de la hemoglobina liberada como se describe por Hu, M.L.
y Spallholz, J.E., "In vitro hemolysis of rat erythrocytes
by selenium compounds", Biochemical Pharmacology, vol. 32,
páginas 957-961 (1983).
En una segunda medición de la citotoxicidad del
conjugado Ab-Se, se realizaron las siguientes
condiciones para evaluar visualmente la lesión citotóxica en la
membrana de los eritrocitos. Se incubó una suspensión al 1% de
eritrocitos humanos a 37ºC durante 3 horas con altos niveles del
conjugado Ab-soporte de Se preparado como en el
ejemplo 1. Después, las células se examinaron para determinar las
lesiones en la membrana usando un microscopio Olympus BH con los
siguientes objetivos; 4 aumentos, 10 aumentos; 40 aumentos y 100
aumentos.
El experimento constaba de muestras de:
- 1)
- eritrocitos de control sin anticuerpos;
- 2)
- eritrocitos con Ab-Se;
- 3)
- eritrocitos con Ab nativo;
- 4)
- eritrocitos pre-incubados con Ab nativo durante veinte minutos seguido de la adición de Ab-Se a 37ºC; y
- 5)
- eritrocitos incubados durante 3 horas a 37ºC con selenocistamina a la misma concentración de selenio que el Ab-Se, es decir, 0,5 \mug de Se por conjugado de Ab-Se.
A continuación se proporcionan descripciones del
aspecto de los eritrocitos después de 3 horas de incubación,
observado con un microscopio óptico.
1) Todas las células de control parecían tener un
tamaño y forma normales; tenían el aspecto de disco bicóncavo
típico de los eritrocitos con una membrana uniforme en todo su
contorno;
2) los eritrocitos con Ab-Se
revelaron una lisis extensa por el aspecto de las células, con un
hinchamiento extenso de hasta 4-6 veces el tamaño de
la célula de control; las células también revelaron un solo o
múltiples agujeros prominentes en la membrana con citoplasma
extruido; las células que permanecieron intactas revelaron
irregularidades extensivas a lo largo de toda la membrana, teniendo
los bordes un aspecto parecido a espigas, como indicio de la
peroxidación de lípidos en las membranas por acción de la actividad
de los radicales libres.
3) todos los eritrocitos con el Ab nativo
parecían tener el tamaño normal, con membranas celulares
perfectamente lisas, y no hubo indicios de lesión visual de la
membrana; las células tendían a agruparse conjuntamente en grandes
series de masas celulares. Este efecto se debe a que se agrega el
Ab nativo, que forma enlaces entre las células, es decir,
célula-Ab-célula-Ab-
célula-Ab, etc.. No hubo lisis de células.
4) los eritrocitos preincubados con Ab nativo
durante veinte minutos antes de la adición de Ab-Se
tuvieron un aspecto idéntico a los del punto 3 anterior, sin
revelar lesiones en las membranas celulares.
5) los eritrocitos incubados con
selenocistamina\cdotHCl en concentraciones de Se iguales a
Ab-Se no mostraron lisis de células, aunque
parecían ser un porcentaje pequeño de células, aproximadamente un
5%, con irregularidades que revelaban indicios de una pequeña
toxicidad para las membranas.
Este ejemplo demuestra que el Ab solo no produce
lesiones en las células y que el compuesto de selenio solo, sin
conjugación con el soporte, produce pocos o ningún daño a las
células. Sin embargo, cuando se une al vehículo, como en el
Ab-Se, la combinación produce un daño extensivo a
la célula. En el ejemplo en el que las células se preincubaron con
Ab-Se, éste debe unirse específicamente al sitio
diana para reaccionar con tioles y generar superóxido. La etapa de
preincubación permite que el Ab nativo bloquee los sitios de unión.
Los bajos niveles de Ab nativo inhibirán la unión de
Ab-Se. Los niveles superiores de Ab nativo detendrán
completamente la unión de Ab-Se.
La figura 1 demuestra que, para la misma serie de
ensayos comparativos que en los del ejemplo 2, los altos niveles de
Ab-Se produjeron casi un 100% de hemólisis en 14
horas, produciéndose el 85% en las cuatro primeras horas; mientras
que en el ejemplo de Ab/Ab-Se que tenía una
relación de 1:1 entre Ab nativo y Ab-Se, una
cantidad igual de anticuerpo nativo no marcado bloqueó el sitio de
unión del Ab-Se ocasionando una reducción del 70% en
la hemólisis. Cuando la relación entre Ab nativo y
Ab-Se aumentó a 2,5:1, el porcentaje de hemólisis se
redujo espectacularmente. Las células de control en PBS y en
presencia de anticuerpo nativo solo mostraron únicamente una
hemólisis espontánea de aproximadamente un 8% y un 6%,
respectivamente.
Se ha modificado una inmunoglobulina específica
para un antígeno de cáncer expresado ampliamente,
TAG-72, obtenida originalmente a partir de células
de cáncer colorrectal, pero encontrada en una amplia diversidad de
cánceres distintos, mediante la unión covalente de selenocistamina,
y ha demostrado que produce superóxido en presencia de tiol in
vitro y que se une y es citotóxica para las células cancerosas
in vitro. En general, se oxidan 5 mg/ml de anticuerpo B72.3
específico para el antígeno TAG-72, producido por
medios bien conocidos en un ratón, con 0,42 mg de NaIO_{4}
durante una 1 hora a 0ºC. Después se añaden 100 \mul de glicerol.
El anticuerpo B72.3 oxidado se hace reaccionar con un exceso de 200
veces de selenocistamina a 4ºC durante 48 horas. Después, el
complejo de anticuerpo-Se se reduce por un exceso de
100 veces de cianoborohidruro y después se cromatografía en una
columna de Sephadex G-25 mediante técnicas
conocidas. El anticuerpo controlado a 280 nm se recoge, se dializa
y se concentra en una columna de Proteína G. Se demuestra que el
inmunoconjugado de anticuerpo-Se produce superóxido
(O_{2}^{.-}) in vitro usando quimioluminiscencia de
lucigenina amplificada. La quimioluminiscencia puede inhibirse por
la adición de superóxido dismutasa.
Cuando este anticuerpo de cáncer se añade a
células cancerosas cultivadas en cultivos de tejidos en placas de
24 pocillos, se demuestra que el inmunocomplejo de
anticuerpo-Se es citotóxico para las células
cancerosas cultivadas en cultivos realizados de una manera
dependiente de la dosis durante 2 días, como se muestra en la
figura 2, cuando se mide mediante la incorporación celular de
timidina tritiada.
Otro ejemplo de esta tecnología es la síntesis de
selenofolato a partir de la vitamina ácido fólico y
seleno-cistamina\cdotHCl, de la configuración
Folato-SeSeR. En un matraz de fondo redondo con
tapones y una barra de agitación, se añaden 26 mg de
selenocistamina\cdotHCl, 44 mg de ácido fólico y 26 \mul de
trietilamina en cloroformo seco (20 ml). A esta suspensión se le
añadieron 23 mg de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla se agitó
magnéticamente durante 48 horas, después de lo cual se añadieron 4
ml de agua. La mezcla de reacción se transfirió a un matraz de fondo
redondo de 250 ml y se secó usando un evaporador rotatorio Buchii
1. El contenido de color amarillo-anaranjado seco
se lavó con agua destilada, que se desechó, y después se redisolvió
en metanol caliente. Los contenidos de tres alícuotas se
cromatografiaron en una columna de 28,0 x 2,4 cm de Sephadex
LH-20 en metanol. El producto, selenofolato, se
recogió entre los volúmenes de elución de 71 y 104 ml. A diferencia
del ácido fólico, el selenofolato no es fluorescente bajo una luz
negra (UV). El producto (cristales de color
amarillo-blanco muy pálido) se cristalizó en metanol
caliente. El Rf del selenofolato en metanol en TLC de gel de sílice
de 60 \ring{A} es de 0,65; el Rf del ácido fólico y de la
selenocistamina es de 0,00. Los datos espectrales en metanol al 100%
para el producto, selenofolato, y los reactivos se proporcionan en
la tabla 2.
| Datos espectrales de selenofolato y reactivos | |||
| Color | Absorción | Absorción | |
| máxima | mínima | ||
| Ácido fólico | Amarillo | 286 nm | 251 nm |
| brillante | 348 nm | ||
| Selenocistamina\cdotHCl | Amarillo | 302 nm | 265 nm |
| brillante | |||
| Selenofolato | Amarillo muy | 276 nm | 259 nm |
| pálido |
El producto, selenofolato, de la configuración
Folato-N-CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH_{2},
produce superóxido (O_{2}^{.-}) en presencia de glutatión,
medido por quimioluminiscencia de lucigenina. Este compuesto
vitamínico modificado es citotóxico para las células tras su
absorción de una manera dependiente de la dosis. Los derivados de
folato son fármacos quimioterapéuticos usados comúnmente, como se
describe en Stokstad, E.L.R. y Jukes, T.H. "Sulfonamides and folic
acid antagonists: A historical review", J. Nutrition,
vol. 117, páginas 1335-1341 (1987); Kramer, K.G.,
Bell, R. y Pieteraz, G.A., "Aminopterin-Monoclonal
antibody conjugates: Antitumor activity and toxicity", Drug
Delivery, vol. 1, páginas 29-33 (1993).
En un tubo de ensayo de 50 ml tapado a rosca, se
añaden 10 piezas de una capa de celulosa de aproximadamente 6 mg de
cada una y 34 mg de Na_{2}IO_{4} ajustado a pH 6,0 en 20 ml. La
oxidación de peryodato se realiza a temperatura ambiente durante 4
horas, después de lo cual las capas de celulosa se drenan y se
lavan 5 veces con un tampón de pH 6,0. A las capas de celulosa en 25
ml de tampón PBS de pH 6,0 se les añaden 21 mg de
selenocistamina\cdotHCl y 30 \mul de trietilamina contenida en
5 ml de tampón. Comenzando a tiempo 0 (control), 0,5, 1, 2, 3, 4 y 8
horas después, se retiró una capa de celulosa del tampón, se lavó
con agua destilada y se secó al aire. Se recogieron tres capas a
las 8 horas, se lavaron y se secaron al aire. Como se muestra en la
tabla 3, la capacidad de la capa de celulosa,
celulosa-NH-CH_{2}CH_{2}SeSeCH_{2}CH_{2}NH_{2},
para generar superóxido (O_{2}^{.-}), medida por
quimioluminiscencia de lucigenina a pH de 7,2 en presencia de
glutatión, generalmente es proporcional al tiempo de incubación de
la capa de celulosa oxidada con la selenocistamina.
| Quimioluminiscencia de capas de celulosa | |
| marcadas con selenocistamina | |
| Tiempo de reacción (horas) | Promedio de unidades de CL mg de |
| celulosa/Min. | |
| 0 | 0 |
| 0,5 | 251 |
| 1,0 | 320 |
| 2,0 | 459 |
| 3,0 | 443 |
| 4,0 | 427 |
| 8,0 | 510 |
Los resultados adicionales demuestran que el
selenio continúa actuando, sin una variación significativa a lo
largo del tiempo.
La fig. 5 demuestra la capacidad de los
compuestos de selenio, cuando se unen a una esponja de celulosa, de
inhibir significativamente el crecimiento de la línea de
fibroblastos de ratón NIH-3T3, que se desarrolla en
condiciones sin nutrientes. Las células NIH-3T3 se
cultivaron en placas de suero de ternero, una mezcla convencional
para estimular el crecimiento. En estas placas se pusieron esponjas
preparadas como en el ejemplo 6. El experimento se realizó dos
veces. Cada vez, el crecimiento celular se redujo
significativamente en comparación con las células de control no
expuestas al conjugado de selenio-vehículo.
La capa de celulosa-selenio con
mayor cantidad de marcador se ha implantado experimentalmente en el
ojo de un conejo New Zeland sometido a una cirugía de filtración
primaria que imita el glaucoma refractario humano. El fallo de la
trabeculectomía debido al glaucoma refractario se debe a la
fibrosis y a la cicatrización de la vesícula (una bolsa creada
cuando el tejido se une de nuevo después de realizar una abertura
en la cámara anterior del ojo) a nivel episcleral. En conejos, la
implantación de una pieza de la capa de celulosa marcada con selenio
de aprox. 1 x 0,5 nm debajo de la vesícula en comparación con una
cirugía de control (una operación simulada en la que en el ojo
izquierdo se implanta una capa de celulosa no marcada con selenio
frente a la implantación de la capa de celulosa recubierta con
selenio en el ojo derecho experimental) ha demostrado los
siguientes efectos experimentales; 1) la presión intravascular del
ojo experimental se redujo significativamente después de la cirugía
y tardó más tiempo en volver a la situación normal que en el ojo de
control, y 2) el ojo experimental con la capa de
Se-celulosa, tras el examen patológico, no mostró
fibrosis ni cerca ni dentro de la capa, a diferencia de lo que
ocurrió en el ojo de control, en el que se observó una capa de
celulosa (sin selenio) que tenía fibrosis. Estos resultados
demuestran que la capa marcada con celulosa-selenio
previene la cicatrización debida a la fibrosis en conejos. La
cicatrización debida a la fibrosis es la causa principal del fallo
quirúrgico en el glaucoma refractario humano. La capa de
celulosa-selenio previno la formación localizada de
tejido cicatrizado en los conejos ensayados sin que se observaran
daños patológicos en los tejidos normales.
Se trata plástico con un flujo de iones de plasma
de CO_{2} en una máquina de plasma de gas producida por Advanced
Plasma Systems, Inc. (St. Petersburg, FL). Esto hace que el
CO_{2} reaccione con la capa superficial de átomos para producir
grupos carboxilo en la superficie del plástico. Estos grupos
carboxilo después pueden formar enlaces cruzados covalentes por
técnicas bien conocidas, tales como las usadas para el acoplamiento
de grupos amino a un grupo carboxilo en la síntesis de péptidos,
con compuestos que contienen selenio tales como selenocistamina, por
medio del uso de clorhidrato de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.
Esta técnica funcionará para cualquier material plástico,
incluyendo el teflón. Se ha descubierto que el plástico que contiene
el compuesto de selenio unido covalentemente inhibe el crecimiento
de células que crecen en cultivos de tejidos. Estos resultados
pueden verse en las figuras 3 y 4, donde se demuestra que el
plástico no tratado mantiene el crecimiento de las células mientras
que el plástico con el selenio unido inhibe el crecimiento
celular.
Se sabe que el virus VIH, que produce el SIDA, se
une y destruye la función de las células T adyuvantes, afectando
negativamente de esta manera al sistema inmune. Se sintetizó el
péptido que representa el segmento de la proteína CD4 en la
superficie de las células T adyuvantes a las que se une el virus
VIH (SIDA), TYICEVEDQKEE. Éste se modificó para unirse mejor al
virus del SIDA, obteniéndose la forma bencilada:
TYIC_{bzl}E_{bzl}VEDQKEE. El ácido selenopropiónico después se
activó por reacción con una carbodiimida, tal como
EDC[1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida].
Este intermedio de O-acilisourea activo después se
hizo reaccionar con el péptido anterior para formar un aducto que
dirigiera el selenio al virus del SIDA.
Se realizaron ensayos para demostrar que el
conjugado de péptido-Se se unirá específicamente a
la superficie externa del virus VIH, catalizará la producción de
superóxido tras el contacto con tioles en las proteínas
superficiales del virus y destruirá el virus. Como se ha indicado
previamente, el mecanismo de esta invención elimina los problemas
encontrados debido a la ausencia de un mecanismo de absorción en
virus. Se espera que este procedimiento también evite los problemas
asociados con la capacidad de los virus VIH de mutar y, por lo
tanto, de eludir los intentos previos de destruir el virus o de
tratar el SIDA.
El selenio está particularmente adaptado y tiene
una gran compatibilidad con diversos agentes bioquímicos para el
marcaje de anticuerpos y folato, como se ha demostrado
anteriormente en los ejemplos 1 y 5, respectivamente. Se sabe que
los radicales libres son citotóxicos. La aplicación de esta química
recién descrita para los conjugados de selenio, es decir, la
generación de superóxido O_{2}^{.-} en presencia de tioles,
permite límites de detección de 10^{-10} a 10^{-12} gramos por
milímetro por quimioluminiscencia o por reducción de un colorante,
tal como azul de metileno. Como se ha indicado anteriormente, el
azul de metileno y el citocromo C en la forma oxidada pueden
reducirse por el selenio unido a una molécula receptora, por medio
de la generación de superóxido. La cantidad de azul de metileno o
citocromo C reducido puede medirse espectrofotométricamente y
cuantificarse, reflejando de esta manera la concentración de la
molécula a la que se une el selenio.
La presente invención supone una mejora con
respecto a la invención indicada en la Patente de Estados Unidos Nº
4.341.757 ya que 1) no requiere degradación química del conjugado
que contiene selenio para el análisis, y 2) la quimioluminiscencia o
el método de detección por colorante extiende la sensibilidad
analítica a 10^{-10}-10^{-12} gramos por
milímetro, ya que el tiempo amplifica la baja concentración de
selenio para la detección debido a su naturaleza catalítica. La
Patente de Estados Unidos Nº 4.341.757 describe clases de
compuestos de selenio que tienen una alta reactividad con
proteínas, polipéptidos y antígenos, y describe el procedimiento
para ensayos de unión competitiva de proteínas usando un
inmunoensayo no isotópico "frío". La presente invención amplía
los límites de detección y simplifica la química para inmunoensayos
isotópicos de selenio estables.
Aunque existen varias teorías por las que el
selenio es carcinostático y citotóxico para todas las células in
vitro y es tóxico sistémicamente para los animales in
vivo, sólo recientemente, Spallholz, J.E., "On the nature of
selenium toxicity and carcinostatic activity" Free Radical
Biology and Medicine, vol. 17, páginas 45-65
(1994) proporcionó una comprensión experimental y teórica de la
toxicidad del selenio como un generador catalítico preoxidativo de
superóxido (O_{2}^{.-}) y otros descendientes de oxígeno
reactivos. Ninguna publicación previa a Yan y Spallholz,
"Generation of Reactive Oxygen Species From the Reaction of
Selenium Compounds With Thiols and Mammary Tumor Cells",
Biochemical Pharmacology, vol. 45, páginas
429-437 (1993) ha descrito está química de
radicales libres de los compuestos de selenio sencillos en presencia
de células cancerígenas.
La comprensión y aplicación de esta química de
selenio de radicales libres catalítica por conjugados covalentes de
sólo ciertas configuraciones de compuestos de selenio, RSeH,
RSeSeR, y RSeSeR', que se dirigen a las membranas por conjugación
con moléculas tales como anticuerpos monoclonales y policlonales,
péptidos y otras moléculas tales como folato, y con dispositivos
tales como una capa de celulosa o un implante plástico, proporciona
la posibilidad de conseguir una toxicidad del selenio dirigida que
se produce sólo en un medio macromolecular sin toxicidad sistémica
del selenio. Los especialistas en la técnica familiarizados con las
moléculas de dirección (como se describe en Sela, M. y Hurwitz, E.,
"Conjugates of antibodies with cytotoxic drugs",
Immunoconjugates, Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy
of Cancer, páginas 189-216 (C-W
Vogel, ed.) (Oxford University Press (1987); Dillman et al.,
"Comparisons of Drug and toxin immunoconjugates", Antibody,
Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, vol. 1, páginas
65-77 (1988); y, Koppel, G.A., "Recent advances
with monoclonal antibody drug targeting for the treatment of human
cancer", Bioconjugate Chemistry, vol. 1, páginas
13-23 (1990)), tales como conjugados moleculares de
anticuerpos, péptidos, vitaminas, liposomas u otros agentes de
dirección, apreciarán la importancia farmacológica de esta
tecnología de radicales libres de selenio de dirección.
Esta invención, emplea la comprensión completa de
la química de radicales libres de compuestos de selenio
específicos. Aunque estos compuestos son tóxicos sistémicamente,
esta invención utiliza esta toxicidad de una manera controlada por
medio de la unión del compuesto de selenio a una molécula de
dirección tal como un anticuerpo, una proteína de unión o un
péptido, o una matriz tal como celulosa o plástico. Esto facilita
la destrucción o inhibición selectiva del crecimiento celular sin
toxicidad sistémica. Por ejemplo, hemos descubierto que el
inmunoconjugado de selenio-anticuerpo sólo es
tóxico cuando se une a la célula. Esto se demostró por el hecho de
que cuando su sitio de unión se ocupa por el anticuerpo nativo, no
se obtenía toxicidad de selenio. También descubrimos que este
conjugado de selenio-anticuerpo puede producir su
toxicidad desde el exterior de la célula. Por el contrario, el
selenio unido de forma no covalente debe entrar en las células para
producir toxicidad y puede hacer esto en cualquier célula, ya sea
cancerígena o normal. Esta percepción del mecanismo de toxicidad
del selenio (un conjugado de selenio unido al exterior de una célula
es tóxico y un conjugado de selenio que no puede unirse a una
célula no es tóxico) es nuevo y nos permite diseñar conjugados de
selenio que también son tóxicos para virus.
Claims (29)
1. Un método para fabricar un conjugado de
selenio-soporte que comprende:
unir covalentemente (i) un compuesto orgánico de
selenio seleccionado entre el grupo compuesto por RSeH, RSeR,
RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R y R' son iguales o diferentes y
cada uno comprende un resto alifático que contiene al menos un grupo
reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por grupos reactivos
de aldehído, amino, alcohólicos, carboxílicos, fosfato, sulfato,
halógeno o fenólicos y combinaciones de los mismos, a (ii) un
soporte que tiene un constituyente capaz de formar un enlace
covalente con dichos grupos reactivos de dicho compuesto de selenio
para producir un conjugado de selenio-soporte,
siendo dicho soporte un soporte dirigido a un sitio diana capaz de
unirse específicamente a un sitio diana, y teniendo el sitio diana
compuestos de tiol asociados con el mismo de tal forma que, en el
uso, el conjugado de selenio-soporte dirija
selectivamente el compuesto de selenio orgánico del conjugado a un
sitio diana selectivo para permitir que el compuesto de selenio
reaccione con dichos tioles endógenos de dicho sitio diana para
generar superóxido para una destrucción localizada.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicho
soporte comprende proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos,
vitaminas, fármacos, lectina, plásmidos, liposomas, ácidos
nucleicos y dispositivos implantables.
3. El método mencionado en la reivindicación 1,
donde dicho soporte es un anticuerpo específico para una bacteria,
virus, protozoo o antígeno celular.
4. El método de la reivindicación 1, donde la
etapa de unir covalentemente el compuesto de selenio al soporte,
comprende además:
oxidar dicho soporte con un agente oxidante para
generar grupos reactivos complementarios a los grupos reactivos de
dicho compuesto de selenio;
retirar el exceso de agente oxidante; y
formar dicho conjugado de
selenio-soporte por la incubación de dicho
compuesto de selenio con el soporte oxidado durante un periodo de
tiempo suficiente para permitir que los grupos reactivos de dicho
compuesto de selenio se unan covalentemente a los grupos reactivos
complementarios de dicho soporte.
5. El método de la reivindicación 1, donde dicho
sitio diana es un antígeno celular.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicho
sitio diana comprende un patógeno.
7. El método de la reivindicación 6, donde dicho
patógeno comprende virus, bacterias, protozoos, rickettsia,
levaduras, micoplasmas u hongos.
8. El método mencionado en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la administración de
compuestos de tiol exógenos en las proximidades de dicho sitio
diana.
9. El método de la reivindicación 1, donde dicho
soporte es un dispositivo implantable hecho de un material
insoluble para la implantación en el sitio diana.
10. El método mencionado en la reivindicación 1,
donde dicho soporte es un fragmento F(Ab-)2 de un anticuerpo
específico para el sitio diana.
11. Uso de un conjugado de
selenio-soporte para la fabricación de un adyuvante
médico para el tratamiento de tumores cancerosos e infecciones
patogénicas, donde dicho conjugado de
selenio-soporte comprende (i) un compuesto orgánico
de selenio seleccionado entre el grupo compuesto por RSeH, RSeR,
RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R y R' son iguales o diferentes y
cada uno es un resto alifático que contiene al menos un grupo
reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por grupos reactivos
de aldehído, amino, alcohólicos, carboxílicos, fosfato, sulfato,
halógeno o fenólicos y combinaciones de los mismos, unido
covalentemente a (ii) un soporte que tiene un constituyente capaz
de formar un enlace covalente con dichos grupos reactivos de dicho
compuesto de selenio para producir dicho conjugado de
selenio-soporte, siendo dicho soporte capaz de
suministrar de forma localizada y de unirse específicamente a un
sitio diana que comprende tumores cancerosos y patógenos que tienen
compuestos de tiol endógenos para dirigir selectivamente el
compuesto de selenio orgánico al sitio diana para la generación
localizada de superóxido.
12. El uso mencionado en la reivindicación 11,
donde dichos patógenos comprenden virus, bacterias protozoos,
rickettsia, levaduras, micoplasmas y hongos.
13. El uso mencionado en la reivindicación 11,
donde dicho soporte comprende anticuerpos monoclonales, anticuerpos
policlonales, polipéptidos, péptidos, carbohidratos, lípidos,
vitaminas, fármacos, lectina, plásmidos, liposomas, ácidos nucleicos
y dispositivos implantables.
14. El uso mencionado en la reivindicación 11,
que comprende además la administración de compuestos de tiol
exógenos en las proximidades de dicho sitio diana.
15. Un método de uso de un dispositivo
recubierto con selenio para la fabricación de un adyuvante médico
para prevenir el crecimiento celular indeseado asociado con el uso
de implantes, donde dicho dispositivo recubierto de selenio
comprende (i) un compuesto orgánico de selenio seleccionado entre
el grupo compuesto por RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R
y R' son iguales o diferentes y cada uno es un resto alifático que
contiene al menos un grupo reactivo seleccionado entre el grupo
compuesto por grupos reactivos de aldehído, amino, alcohólicos,
carboxílicos, fosfato, sulfato, halógeno o fenólicos y combinaciones
de los mismos, unido covalentemente a (ii) un implante no metálico
insoluble que tiene un constituyente superficial capaz de formar un
enlace covalente con dichos grupos reactivos de dicho compuesto de
selenio para producir dicho dispositivo recubierto con selenio,
para la generación localizada de superóxido para la destrucción
localizada en un sitio diana deseado que tiene compuestos de tiol
endógenos tras la implantación del dispositivo recubierto con
selenio en dicho sitio diana.
16. El uso mencionado en la reivindicación 15,
donde dicho dispositivo es un implante intraocular.
17. El uso mencionado en la reivindicación 15,
donde dicho dispositivo es un shunt vascular.
18. El uso mencionado en la reivindicación 15,
donde dicho dispositivo es un implante de pene.
19. El uso mencionado en la reivindicación 15,
que comprende además la administración de compuestos de tiol
exógenos en las proximidades de dicho sitio diana.
20. Uso de un soporte de selenio para la
fabricación de un adyuvante médico para la prevención de la
cicatrización indeseada en procedimientos quirúrgicos, donde dicho
soporte de selenio comprende (i) un compuesto orgánico de selenio
seleccionado entre el grupo compuesto por RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR
y RSeSeR', donde R y R' son iguales o diferentes y cada uno es un
resto alifático que contiene al menos un grupo reactivo seleccionado
entre el grupo compuesto por grupos reactivos de aldehído, amino,
alcohólicos, carboxílicos, fosfato, sulfato, halógeno o fenólicos y
combinaciones de los mismos, unido covalentemente a (ii) un soporte
que tiene un constituyente capaz de formar un enlace covalente con
dichos grupos reactivo de dicho compuesto de selenio para producir
dicho conjugado de selenio-soporte, para la
generación localizada de superóxido para la inhibición localizada
de la formación de tejido cicatrizado en un sitio quirúrgico que
tiene compuestos de tiol endógenos, tras la implantación del
conjugado de selenio-soporte en dicho sitio.
21. Un método para detectar la presencia de un
compuesto de interés biológico, que comprende las etapas de:
incubar conjuntamente una mezcla de una muestra
que se sospecha que contiene un compuesto de interés biológico y un
conjugado de selenio-soporte compuesto por:
(i) un compuesto orgánico de selenio seleccionado
entre el grupo compuesto por RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR',
donde R y R' son iguales o diferentes y cada uno es un resto
alifático que contiene al menos un grupo reactivo seleccionado entre
el grupo compuesto por grupos reactivos de aldehído, amino,
alcohólicos, carboxílicos, fosfato, sulfato, halógeno o fenólicos y
combinaciones de los mismos, unido covalentemente a
(ii) un sopote que tiene un constituyente
complementario capaz de formar un enlace covalente con dichos
grupos reactivos de dicho compuesto de selenio para producir dicho
conjugado de selenio-soporte, siendo capaz dicho
soporte de unirse específicamente a dicho compuesto de interés
biológico, para unir dicho conjugado de
selenio-soporte a un determinante presente en dicho
compuesto de interés biológico para formar un complejo;
retirar el conjugado de
selenio-soporte no unido;
añadir un compuesto de tiol a dicha mezcla para
reaccionar con dicho selenio para generar superóxido;
añadir un agente indicador a dicha mezcla, siendo
capaz dicho agente indicador de reaccionar con superóxido; y
detectar la reacción entre dicho agente indicador
y superóxido.
22. Un implante que comprende:
un conjugado de selenio-soporte
que comprende:
(i) un dispositivo hecho de un material insoluble
estructurado para la implantación en un sitio diana predeterminado,
y que tiene constituyentes reactivos en una superficie del
mismo;
(ii) un compuesto de selenio orgánico unido al
menos a una porción de dicha superficie de dicho dispositivo,
seleccionándose dicho compuesto de selenio entre el grupo compuesto
por RSeH, RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R y R' son iguales o
diferentes y cada uno es un resto alifático que contiene al menos
un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por grupos
reactivos de aldehído, amino, alcohólicos, carboxílicos, fosfato,
sulfato, halógeno o fenólicos y combinaciones de los mismos, para la
unión complementaria a al menos uno de dichos constituyentes
reactivos de dicho material, donde dicho sitio diana tiene
compuestos de tiol asociados con el mismo, de tal forma que, en el
uso, la implantación de dicho implante en dicho sitio diana inicia
la producción localizada de superóxido.
23. El implante mencionado en la reivindicación
23, donde dicho dispositivo es un implante intraocular.
24. El implante mencionado en la reivindicación
23, donde dicho dispositivo es un shunt vascular.
25. El implante mencionado en la reivindicación
23, donde dicho dispositivo es un implante de pene.
26. Un agente farmacéutico para el tratamiento de
tumores cancerosos e infecciones patogénicas, que comprende:
un conjugado de selenio-soporte
para la liberación localizada y unión a un sitio diana que
comprende tumores cancerosos o patógenos que tienen compuestos de
tiol endógenos, donde dicho conjugado de
selenio-soporte comprende (i) un compuesto de
selenio orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por RSeH,
RSeR, RSeR', RSeSeR y RSeSeR', donde R y R' son iguales o
diferentes y cada uno es un resto alifático que contiene al menos
un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por grupos
reactivos de aldehído, amino, alcohólicos, carboxílicos, fosfato,
sulfato, halógeno o fenólicos y combinaciones de los mismos, unido
covalentemente a (ii) un soporte dirigido a un sitio diana que tiene
un constituyente capaz de formar un enlace covalente con dichos
grupos reactivos de dicho compuesto de selenio para producir dicho
conjugado de selenio-soporte, siendo capaz dicho
soporte de unirse específicamente a dicho sitio diana para dirigir
selectivamente el compuesto de selenio a dicho sitio diana para la
generación localizada de superóxido para la destrucción en dicho
sitio diana.
27. El agente mencionado en la reivindicación 26,
donde dichos patógenos comprenden virus, bacterias, protozoos,
rickettsia, levaduras, microplasmas y hongos.
28. El agente mencionado en la reivindicación 26,
donde dicho soporte comprende anticuerpos monoclonales, anticuerpos
policlonales, polipéptidos, péptidos, carbohidratos, lípidos,
vitaminas, fármacos, lectina, plásmidos, liposomas, ácidos nucleicos
y dispositivos implantables.
29. El agente mencionado en la reivindicación 26,
donde dicho soporte es un fragmento F(Ab^{-})2 de
un anticuerpo específico para el sitio diana.
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