ES2199849T3 - Procedimiento de separacion por cromatografia en columna. - Google Patents

Procedimiento de separacion por cromatografia en columna.

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ES2199849T3 ES00956199T ES00956199T ES2199849T3 ES 2199849 T3 ES2199849 T3 ES 2199849T3 ES 00956199 T ES00956199 T ES 00956199T ES 00956199 T ES00956199 T ES 00956199T ES 2199849 T3 ES2199849 T3 ES 2199849T3
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Abstract

Procedimiento para la separación por cromatografía en columna de mezclas de sustancias, empleándose como eluyente un fluido o una mezcla de fluidos en estado líquido, no subcrítico y no crítico (T<Tcr y p<pcr), que son 5 gaseosos a 25ºC y 1 bar.

Description

Procedimiento de separación por cromatografía en columna.
El presente invento se refiere a un procedimiento de separación por cromatografía en columna mediando utilización de un fluido líquido y de bajo peso molecular como eluyente para aislar y/o purificar y/u obtener de manera preparativa sustancias (naturales) a partir de mezclas de sustancias, preferiblemente mezclas de sustancias naturales.
Los procedimientos de separación por cromatografía en columna desempeñan de manera acrecentada un cometido importante en el tratamiento de materias primas, en la purificación de productos, y en la síntesis química tanto a escala de laboratorio como también en el caso de producciones a gran escala técnica. Igualmente en la analítica química, éstos son imprescindibles para el aislamiento, la identificación y la determinación cuantitativa y/o cualitativa de componentes individuales en mezclas de sustancias. Otros sectores de aplicación importantes para tales separaciones son el reciclado, en el que se separan sustancias tóxicas y nocivas, pero también sustancias valiosas, desde materiales viejos inutilizados, tales como aguas residuales y gases de escape.
No obstante, por motivos de costos, sólo unos pocos procedimientos de separación por cromatografía en columna se han llevado hasta el aprovechamiento comercial. En particular, en el marco de la obtención preparativa de materias primas, en particular a partir de mezclas de sustancias naturales -así como de su analítica- pasan a emplearse procedimientos de separación por cromatografía en columna, tales como los de HPLC (del inglés "High Performance Liquid Chromatography"), es decir de cromatografía de líquido de alto rendimiento o a alta presión, así como de SFC (del inglés, "Supercritical Fluid Chromatography"), es decir de cromatografía de fluido supercrítico.
La HPLC aprovecha el reconocimiento de que el rendimiento de separación de una columna aumenta al disminuir el tamaño de granos de la fase estacionaria. En el caso de la HPLC, se trabaja con un material de separación por cromatografía considerablemente más fino (3-10 \mum) que en la cromatografía en gel (35-75 \mum) o que en la cromatografía en columna "clásica" (120-200 \mum). La finura de los materiales de separación requiere, no obstante, la aplicación de altas presiones (hasta de 40 Mpa), lo que está vinculado con un considerable esfuerzo técnico. Las columnas tienen usualmente una longitud de 5-100 cm (en la mayoría de los casos, no obstante, de 25 cm) con un diámetro interno de 1-25 \mum. Rellenada con gel de sílice o con un material similarmente poroso (de 10 \mum o menos), una columna con una longitud de 25 cm puede tener 5.000 platos (etapas teóricas de separación) - se pueden conseguir incluso unos números de platos de hasta 65.000/m, según sea la fase estacionaria. Las separaciones típicas mediante HPLC se llevan a cabo a la temperatura ambiente, preferiblemente a 20 hasta 40ºC (entidad Merck, Chrombook, 1996, Darmstadt, entidad Phenomenex, cátalogo de cromatografía, 99/00, Torrance, CA, EE.UU.). Las bombas necesarias pueden hacerse funcionar en la HPLC analítica hasta una presión de 400 bar. En la HPLC preparativa, se hacen funcionar las bombas hasta una presión de 70 bar (rendimiento de las bombas: 300 l/h) a 100 bar (rendimiento de las bombas: 60 l/h de eluyente (líquido)) (compárese, p.ej. la entidad Merck, Chrombook, página 233, 1996, Darmstadt). El factor limitador en la HPLC es, en particular a altos caudales, la presión de las bombas. Las longitudes de las columnas utilizadas son, por tanto, cortas en la mayoría de los casos; se realiza que, cuanto más pequeño sea el diámetro de partículas del material cromatográfico utilizado, tanto más cortas han de ser las columnas. En principio, se puede efectuar una compensación mediante unas más altas presiones máximas de trabajo, pero esto incrementa enormemente los costos de funcionamiento y puede conducir a que el procedimiento de HPLC sea antieconómico en el marco de una utilización preparativa.
La SFC se ha impuesto como procedimiento de separación por cromatografía en columna con gases (CO_{2}, N_{2}O, SF_{6}, etc.) en estado supercrítico como fase móvil. En el caso de la SFC, los líquidos y gases se calientan bajo presión, siendo transferidos éstos al estado supercrítico por encima de la respectiva temperatura crítica (T_{cr}) y de la respectiva presión crítica (P_{cr}). En este estado, los líquidos supercríticos se caracterizan, frente a los líquidos verdaderos, no sólo por su densidad más pequeña, su viscosidad más baja y sus coeficientes de difusión mucho más altos, sino también, sobre todo, por su sobresaliente capacidad de disolución. Por lo tanto, los líquidos supercríticos a base de CO_{2}, etileno, propano, amoníaco, dióxido de dinitrógeno, agua, tolueno, heterociclos con nitrógeno, encuentran utilización, entre otros usos, en la extracción, la denominada en inglés Supercritical Fluid Extraction (SFE ó SCFE = extracción con fluidos supercríticos; también llamada "Destraktion" = "destracción") - de sustancias naturales. Se conocen, p.ej. la extracción de cafeína a partir de café mediante CO_{2} supercrítico, de sustancias amargas de lúpulo, de sustancias odoríferas, de hidrocarburos a partir de petróleo o carbón, para la reactivación de catalizadores heterogéneos (compárese la obra de Wenclawiak (coordinador de edición), Analysis with Supercritical Fluids: Extraction and Chromatography (Análisis con fluidos supercríticos: extracción y cromatografía, Berlín: editorial Springer 1992).
Por regla general, en la SFC se trabaja a unas temperaturas situadas por encima de 35ºC y a una presión en la parte de salida de la columna de más que 120 bar.
Se han descrito numerosas separaciones a temperaturas situadas por debajo de la temperatura crítica de la fase móvil utilizada; compárese K. Anton, C. Berger (coordinadores de edición); Packed Columns [Columnas rellenas], Marcel Dekker Inc., Nueva York, Basilea, Hong-Kong, 1998).
La separación de mezclas de sustancias, en particular mezclas de sustancias naturales, mediante una SFC, se ha descrito en una serie de publicaciones, tales como en el documento de solicitud de patente japonesa JP-A-10/316,991; y las citas Chirality (1992); 4(4), 252-62; J. chromatogr. (1989), 464(1), 125-37; Nihon Yukagakkaishi (1997), 46(11), 1.335-1.345; Semin. Food Anal. (1996), 1(2), 101-116; J. High Resolut. Chromatogr. (1996), 19(10), 569-570; Jasco Rep. (1991), 33(1), 6-11; Anal. Chem. (1990), 62(12), 394R-402R; y J. Chromatogr. Sci. (1990), 28(1), 9-14.
Vérillon y Coleman describen en la página 64 (cita de Anton, véase más arriba) los intervalos de temperaturas y de presiones para el trabajo con fluidos -tales como CO_{2}-, situados entre 3 y 200ºC y 90-400 bar. Las separaciones se efectúan en el margen supercrítico y subcrítico, pero no en el margen líquido, es decir, en un margen de presiones situado por debajo de la presión crítica y de la temperatura crítica.
Jusforques describe en la página 409, en el capítulo 14 (cita de Anton, véase más arriba) el margen de trabajo requerido con unas temperaturas comprendidas entre 0 y 150ºC y unas presiones comprendidas entre 100 y 350 bar (equipo de SFC: Super C12 en el marco de la SFC preparativa).
La entidad Prochrom indica igualmente un intervalo de presiones de trabajo comprendidas entre 100 y 350 bar, a unas temperaturas comprendidas entre 10 y 80ºC (entidad Prochrom, folleto para semipreparative Supercritical Fluid Chromatograph, tipo: SuperC 20, 1998, Chamigneulle, Francia).
El documento de patente europea EP 0.099.765 B1 divulga que la presión de entrada de la mezcla en la columna tiene que ser mayor que la presión crítica del eluyente, y, ciertamente, tiene que estar entre 1,05 y 3. Presiones menores que la presión crítica son descritas explícitamente como condiciones de separación.
El documento de solicitud de patente europea EP-A-0.127.926 divulga un procedimiento de cromatografía, en el que se utilizan gases licuados como eluyentes. Los gases se mantienen por debajo de la temperatura crítica, pero son licuados por compresión, empléandose presiones supercríticas.
M. Perrut describe en el documento de patente noruega NO 163139, como condiciones de separación, sólo los márgenes supercrítico y subcrítico y, ciertamente, unas presiones de 70-250 bar y unas temperaturas comprendidas entre 25 y 80ºC.
En el estado de la técnica no se han realizado separaciones por cromatografía para fases móviles, con un margen de trabajo situado por debajo de la temperatura y la presión críticas.
Schultz et al. (Schultz, W.G.; Randall, J.M.: Food Technol. 24, 1.282 (1970)) describe solamente una extracción inespecífica a 22ºC y 63 bar de concentrados aromáticos de frutas y jugos de frutas homogeneizadas/os. No se efectúa ninguna separación por cromatografía.
El presente invento está basado, por consiguiente, en la misión de poner a disposición un procedimiento de cromatografía en columna dentro del marco de una cromatografía de líquido, para el aislamiento y/o la purificación y/o la obtención preparativa a gran escala técnica de sustancias (naturales) a partir de mezclas de sustancias (naturales), que conduzca a productos puros por causa de un alto rendimiento de separación.
Por consiguiente, el presente invento se refiere a un procedimiento para la separación por cromatografía en columna de mezclas de sustancias, en el que se emplea como eluyente un fluido o una mezcla de fluidos en estado líquido, no subcrítico y no crítico (T < T_{cr} y P < P_{cr}), que son gaseosos a 25ºC y 1 bar (denominado seguidamente procedimiento de acuerdo con el invento).
En el caso de los eluyentes que pasan a emplearse de acuerdo con el invento, se trata de compuestos de bajo peso molecular, que son gaseosos en condiciones normales (25ºC; 1 bar) y que pasan a emplearse en unas condiciones de temperatura y presión tales que se presentan en el estado líquido, pero no en el estado crítico o no en el estado subcrítico (por lo tanto, no por encima de la temperatura crítica y no por debajo de la presión crítica).
Los eluyentes preferidos para el procedimiento de acuerdo con el invento son compuestos fácilmente volátiles con una pequeña interacción.
Eluyentes especialmente preferidos son óxido de dinitrógeno (N_{2}O) líquido; hidrocarburos fluorados o fluorados y clorados ("freones") líquidos, tales como p.ej. clorotrifluorometano (CClF_{3}), trifluorometano (CHF_{3}), tetrafluorometano (CF_{4}), 1,1,1,2-tetrafluoroetano (C_{2}F_{4}H_{2}), dióxido de carbono (CO_{2}) líquido, hexafluoruro de azufre (SF_{6}) líquido, propeno (C_{3}H_{6}) líquido, propano (C_{3}H_{8}) líquido, amoníaco (NH_{3}) líquido, dióxido de azufre (SO_{2}) líquido, xenón (Xe) líquido, etano (C_{2}H_{6}) líquido, que en condiciones normales se presentan en forma gaseosa.
Preferiblemente, se emplean los eluyentes que tienen una viscosidad dinámica de 10^{-4}-10^{-6} Pa\cdots, preferiblemente de 2*10^{-4}-2*10^{-6} Pa\cdots, y una densidad de 0,5-1,2 g/ml, preferiblemente de 0,5-1,2 g/ml.
La medición de la viscosidad dinámica se efectúa, para las finalidades de esta solicitud, con un viscosímetro capilar a 25ºC.
En el procedimiento de acuerdo con el invento, estas moléculas de bajo peso molecular se presentan en forma líquida como eluyente en la fase móvil.
Se emplean preferiblemente los eluyentes que son conocidos para un experto en la materia en el sector de las SFC.
Sin embargo se prefiere muy especialmente un dióxido de carbono líquido y, ciertamente, en el intervalo líquido de temperaturas de -57ºC a 31,3ºC, preferiblemente de 0 a 20ºC.
Además, se prefiere muy especialmente un dióxido de carbono líquido y, ciertamente, en el intervalo de presiones de 30 a 73,7 bar, y muy preferiblemente de 30 hasta 60 bar.
En el caso del dióxido de carbono, la presión crítica es de 73,7 bar y la temperatura crítica es de 31,3ºC. El punto triple de dióxido de carbono está situado en -57ºC y 5,2 bar.
Por supuesto que los citados eluyentes se pueden presentar también en una mezcla.
El margen de trabajo de los eluyentes de bajo peso molecular que se emplean es la fase líquida con los correspondientes valores de p, T.
Estos valores de p, T reinan igualmente en la columna escogida de separación por cromatografía, a lo largo de la que se conduce el eluyente como fase móvil.
El concepto de procedimiento de separación por cromatografía en columna en el sentido de este invento, significa que la separación de sustancias se efectúa por distribución, es decir por el proceso de disolución en las dos fases, que no son miscibles una con otra, y por adsorción a un material sólido (adsorbente) junto a una fase estacionaria en presencia de un eluyente como fase móvil. Por consiguiente, se puede hablar de una cromatografía de líquido-sólido (en inglés: Liquid Solid Chromatography, LSC). Para los conceptos aquí utilizados existen propuestas de la IUPAC acerca de la terminología, y se hace referencia expresa a éstas.
En una forma de realización especial, la fase móvil, que contiene un eluyente, se mezcla con ayuda de un agente de modificación usual en la cromatografía, tal como un alcohol que es líquido en las condiciones de funcionamiento, p.ej. etanol o metanol. Este agente de modificación se puede mezclar eventualmente con otros materiales aditivos y coadyuvantes, tales como ácidos o bases (p.ej. ácido acético o dietil-amina).
En el marco del procedimiento de acuerdo con el invento se establecen numerosas ventajas en comparación con los procedimientos conocidos, tales como los procedimientos de HPLC ó SFC.
Es especialmente ventajoso, con respecto a los procedimientos conocidos de HPLC ó SFC, el hecho de que en el procedimiento de acuerdo con el invento se tienen que aplicar presiones menores, por ejemplo, solamente unas presiones de hasta aproximadamente 70 bar. De esta manera, se pueden ahorrar costos, puesto que todas las piezas componentes requeridas, tales como bombas, captadores o registradores de presión, o bien conducciones tubulares, se pueden estructurar de manera correspondiente o se pueden dimensionar más pequeñas. Se pueden reducir los requisitos de seguridad necesarios para la seguridad en el trabajo y la seguridad de funcionamiento.
Se ha encontrado ahora, de manera sorprendente, que el procedimiento de acuerdo con el invento se puede efectuar en presencia de cualquier tipo de fases estacionarias sólidas, usuales en el comercio, tales como las que se utilizan en el marco de las HPLC y/o de las SFC.
No obstante, se prefieren columnas con fases modificadas o no modificadas a base de gel de sílice, óxido de aluminio o dióxido de titanio, así como fases estacionarias poliméricas soportadas, tales como p.ej. la fase de diol, la fase de amino-propilo, las fases RP8 y RP18, aplicadas sobre gel de sílice, óxido de aluminio o dióxido de titanio, siendo aplicadas estas fases en particular sobre soportes de gel de sílice.
El procedimiento de acuerdo con el invento se puede emplear para longitudes de las columnas situadas en amplios intervalos. Usualmente, las columnas tienen una longitud de por lo menos 10 cm, pero se prefieren unas longitudes de 0,25-2,0 m, y se prefieren especialmente las de 1,1-1,7 m.
Estas longitudes más altas de las columnas garantizan un alto rendimiento de separación y se pueden conseguir, puesto que el procedimiento de acuerdo con el invento no provoca ninguna gran disminución de la presión en la columna.
La disminución de la presión se puede ser estimar según la Fórmula 1 en la Tabla 1. Debido a que se escoge pequeña la viscosidad de los eluyentes líquidos que pasan a emplearse, la resultante disminución de la presión es también pequeña. Debido a la pequeña disminución de la presión por cm de columna, se puede escoger la columna con una longitud correspondientemente grande, a igualdad del diámetro de partículas de la fase estacionaria, o se pueden utilizar unos diámetros de partículas más pequeños, en comparación con la HPLC, con una longitud constante de la columna.
El procedimiento de acuerdo con el invento se puede hacer funcionar con disposiciones usuales, tal como las que se emplean también en los conocidos procedimientos de SFC.
Para ilustrar aún más el invento, seguidamente se describirá el funcionamiento de una disposición de SFC a escala industrial con el eluyente CO_{2}.
El CO_{2} que se ha de alimentar es enfriado mediante un intercambiador de calor desde un depósito de reserva de CO_{2} líquido. El CO_{2} transportado por la bomba se lleva con ayuda del intercambiador de calor a condiciones supercríticas (T>31ºC, p>74 bar), típicamente a 40-60ºC. Ese CO_{2} circula a través de la columna de separación y es descomprimido en una válvula de regulación de la presión. Esta válvula de regulación de la presión regula la presión de salida desde la columna, que reina en el extremo final de la columna de separación, y se mantiene por encima de la presión crítica (p>74 bar). De esta manera se garantizan unas condiciones de separación supercríticas en la columna de separación. El CO_{2} se enfría mediante la expansión adiabática en la válvula de regulación de la presión. A continuación, el CO_{2} se calienta con un intercambiador de calor y se lleva al estado gaseoso. En un separador, el producto se separa con respecto del CO_{2} gaseoso. El CO_{2} gaseoso llega a través del intercambiador de calor, que lo licúa de nuevo, al depósito de reserva. Se establece un circuito cerrado de CO_{2}. El producto se inyecta de una manera discontinua, desde el recipiente de reserva, con ayuda de la bomba, dentro de la columna de separación. Para esta disposición de SFC usual se necesitan en total por lo menos cuatro intercambiadores de calor, que consumen mucha energía.
En el marco del procedimiento de acuerdo con el invento se establecen, adicionalmente al modo de proceder descrito para el procedimiento de SFC, numerosas posibilidades para una disposición funcional, algunas de las cuales se describen a continuación.
La ventaja especial del procedimiento de acuerdo con el invento reside en que se evitan un enfriamiento y un calentamiento alternados del CO_{2'} que consumen mucha energía.
El CO_{2'} que se ha de alimentar, es enfriado desde un depósito de reserva de CO_{2} líquido mediante un intercambiador de calor. El CO_{2} transportado por la bomba se ajusta a la temperatura de separación con ayuda de un intercambiador de calor. Éste puede, no obstante, ser muy pequeño, puesto que el CO_{2} es calentado sólo típicamente desde 0-5ºC hasta 5-20ºC.
Si se escogen unas temperaturas bajas de separación, p.ej. de 5ºC, este intercambiador, además, puede ser puesto fuera de funcionamiento. El CO_{2} líquido circula a través de la columna de separación. Con ayuda de una válvula de conmutación, las fracciones individuales se desvían a las denominadas columnas de fraccionamiento, por ejemplo, a tres columnas de fraccionamiento. Son posibles columnas de fraccionamiento en un número arbitrario, pero, en el caso más sencillo, es posible una columna de fraccionamiento y una conducción tubular adicional, que une la válvula de conmutación con otra válvula de conmutación.
La presión de salida desde la columna es regulada con una válvula reguladora de la presión. En esta válvula tiene lugar la descompresión del CO_{2}. Después de haber inyectado la muestra (suposición: la muestra contiene 3 componentes A, B y C), la muestra se separa en la columna de separación.
Durante la elución del componente A la válvula de conmutación se conmuta de tal manera que el CO_{2} y el componente A sean desviados en dirección hacia la otra válvula de conmutación. El CO_{2} líquido es descomprimido. El CO_{2} pierde su capacidad de disolución. El componente A se retiene de esta manera en la columna de fraccionamiento. El CO_{2} se enfría aún más con ayuda de un intercambiador de calor (en caso de que sea necesario) y llega de nuevo al depósito de reserva.
Después de haber eluido el componente A desde la columna, la válvula de conmutación se conmuta hacia otra columna de fraccionamiento. El componente B eluyente es retenido en esta columna de fraccionamiento. El componente C es retenido en otra columna de fraccionamiento. Si no se eluye ninguna sustancia de la muestra, la corriente de CO_{2} se puede conducir facultativamente a través de una de las columnas de fraccionamiento o a través de una conducción tubular adicional, con una válvula reguladora de la presión, que une la válvula de conmutación con la otra válvula de conmutación.
El material cromatográfico de la columna de separación se escoge de tal manera que la resolución de los componentes de la muestra sea máxima. El material de las columnas de fraccionamiento se escoge de tal manera que la adsorción del respectivo componente de la muestra sea máxima en las condiciones allí reinantes durante la separación.
Este modo de proceder se puede repetir para varias inyecciones (hasta que se haya alcanzado la capacidad de una columna de fraccionamiento). La elución de los respectivos componentes se efectúa con ayuda de un disolvente fuerte apropiado, p.ej. etanol. Una bomba dispuesta por separado transporta los eluyentes a través de la válvula de conmutación hasta la salida situada detrás de la otra válvula de conmutación. Las fracciones valiosas se recogen, por lo tanto, en este caso, disueltas en un líquido.
La ventaja de esta disposición descrita reside en que no se necesitan ni un cuarto intercambiador de calor ni tampoco un separador.
En otras formas de realización del procedimiento de acuerdo con el invento, la válvula reguladora de la presión puede estar dispuesta directamente detrás de la columna de separación. El CO_{2} expandido con el respectivo componente de la muestra es conducido tan sólo después de la descompresión, mediante la válvula de conmutación, a la correspondiente columna de fraccionamiento. La ventaja con respecto a la disposición precedentemente descrita consiste en que se requiere solamente una válvula reguladora de la presión.
En otras formas de realización del procedimiento de acuerdo con el invento, las válvulas reguladoras de la presión pueden estar situadas detrás de las columnas de fraccionamiento. Adicionalmente, detrás de éstas se encuentran unos separadores adicionales.
En el caso de esta disposición, la presión se regula detrás de la columna de fraccionamiento. El material de las columnas de fraccionamiento se escoge de tal manera que los componentes A, B y C sean retenidos en la correspondiente columna de fraccionamiento en las condiciones reinantes. Después de haber inyectado y recogido múltiples veces los componentes de la muestra en las columnas de fraccionamiento, los componentes individuales se pueden separar mediante un aumento de la fuerza de elución del CO_{2} y/o mediante adición de un agente de modificación para la elución, y se pueden separar con respecto del CO_{2} a través de los respectivos separadores.
Alternativamente, la elución se puede efectuar también con un eluyente líquido. En este caso, se puede prescindir de los separadores. La disposición se puede modificar también de tal manera que, en lugar de tres separadores, se utilice solamente un separador detrás de la válvula de conmutación.
Mediante el procedimiento de acuerdo con el invento, una instalación de SFC usual se puede hacer funcionar de una manera mucho más ventajosa en lo que respecta a la energía. El CO_{2} no tiene que ser calentado en absoluto, o sólo un poco, en el intercambiador de calor situado detrás del depósito de reserva. Debido a la menor presión que hay delante de la unidad reguladora de la presión, el enfriamiento causado por la expansión adiabática es también menor y, por consiguiente, se tiene que aportar mucha menos energía al intercambiador de calor situado detrás de la columna de separación. En principio, el procedimiento de acuerdo con el invento se puede llevar a cabo en cualquier instalación de SFC.
El procedimiento de acuerdo con el invento es muy especialmente apropiado para la separación por cromatografía en columna de ácidos grasos superiores, insaturados, en particular insaturados varias veces, o de sus derivados, tales como ésteres o lípidos, preferiblemente a partir de aceites naturales, tales como un aceite vegetal, aceite de algas, un aceite de microorganismos o de hongos, así como un aceite de pescado y, por consiguiente, es apropiado para la obtención y la purificación de SDA (ácido estearidónico, 18:4, n-3), AA (ácido araquidónico, 20:4 n-6), ETA (ácido eicosatetraenoico, 20:4, n-3), EPA 25 (ácido eicosapentaenoico, 20:5, n-3), DPA (ácido docosapentaenoico, 22:5, n-3), DHA (ácido docosahexaenoico, 22:6, n-3). GLA (ácido gamma-linolénico 18:3, n-6), ALA (ácido alfa-linolénico18:3, n-3), DPA (ácido docosapentaenoico, 22:5, n-6).
Los siguientes Ejemplos sirven para la explicación del invento, sin limitarlo a estos
Ejemplos Ejemplo 1
Se utilizó una disposición de SFC usual, tal como se ha descrito anteriormente. Las columnas utilizadas tenían una longitud de hasta 170 cm. Las presiones de trabajo utilizadas normalmente estaban, por regla general, entre 120 y 350 bar. Estas columnas se pueden emplear en la SFC, puesto que las disminuciones de la presión son sólo pequeñas (normalmente de 20-50 bar)incluso a través de una columna tan larga. Debido a las pequeñas disminuciones de presión, se pueden emplear también caudales más altos, que en la SFC, al contrario que en la HPLC, sólo conducen a una pequeña pérdida de eficiencia. Como eluyente se utilizó dióxido de carbono. Los parámetros de trabajo se enumeran en la siguiente Tabla 1. Junto al empleo de acuerdo con el invento de dióxido de carbono líquido, se empleó también dióxido de carbono supercrítico.
(TABLA 1 pasa a página siguiente)
TABLA 1 Parámetros de trabajo
Cálculo de p columna: 10 l L (cm) d (cm) R (cm) dp (\mum) tipo
110 9 4,5 25
\varphi (g/ml) \etadin.(Pa s) \etadin.(cPoise) F (kg/h) F (ml/min) \Deltap (bar)
80 bar, 50ºC 0,219 2,05E-05 0,02053 300 22.831,05 21,6 SFC
100 bar, 50ºC 0,3899 2,95E-05 0,02945 300 12.823,80 17,4 SFC
200 bar, 50ºC 0,784 6,80E-05 0,06797 300 6.377,55 20,0 SFC
25ºC, 150 bar 0,8771 8,63E-05 0,0863 300 5.700,60 22,7 SbFC
0ºC, 150 bar 1 1,23E-04 0,1234 300 5.000,00 28,4 SbFC
0ºC, 300 bar 1,055 1,47E-04 0,1466 300 4.739,34 32,0 SbFC
0ºC, 40 bar 0,9333 1,01E-04 0,1009 300 5.357,33 24,9 LFC
10ºC, 50 bar 0,8705 8,00E-05 0,08 300 5.743,83 21,2 LFC
25ºC, 70 bar 0,744 6,04E-05 0,06043 300 6.720,43 18,7 LFC
MeOH, 20ºC 0,79 5,84E-04 0,584 300 6.329,11 170,4 HPLC
EtOH, 20ºC 0,789 1,20E-03 1,201 300 6.337,14 350,9 HPLC
Cálculo \ de \ acuerdo \ con: \ \Delta p \ = \frac{F\cdot \eta \cdot L\cdot \text{1.000}}{60\cdot \pi \cdot r^{2}\cdot dp^{2}}
con
\Deltap disminución de la presión en [bar]
F caudal volumétrico del eluyente en [ml/min]
L longitud de la columna en [cm]
\eta viscosidad en [cPoise]; 1.000 cPoise = 1 Pa s
R radio interno de la columna en [cm]
Dp diámetro de partículas en [\mucm]
Ejemplo 2
Se llevaron a cabo separaciones de un éster etílico de aceite de pescado en dos fases estacionarias diferentes. Se escogieron en cada caso tanto condiciones supercríticas como también una combinación de temperaturas y caudales tomada a partir del intervalo de acuerdo con el invento. En la siguiente Tabla 2 se comparan entre sí la pureza del EPA y/o del DHA de las fracciones recogidas.
Se separó un aceite de pescado en diversas condiciones: fase líquida (T=18ºC, p_{n} = 52 bar; F = 300 kg/h); fase supercritica (T=46ºC, p_{n} = 105 bar; F = 300 kg/h); fase estacionaria: amino-propilo; fase móvil: CO_{2}]
En la Tabla 2 se registra el contenido de EPA en % de la respectiva fracción. Como se puede reconocer fácilmente, la evolución es muy similar. Sin embargo, la separación se efectuó mucho más rápidamente en el intervalo líquido de acuerdo con el invento.
Era posible una reducción desde aproximadamente 75 hasta sólo 40 min. La pureza alcanzable de manera absoluta era solamente algo más pequeña (en lugar de 95% en condiciones de separación supercríticas, aproximadamente 90% en el intervalo líquido). Si para el cálculo del rendimiento se toman como fundamento las fracciones con una pureza de EPA de más que 80%, ésta correspondía en el margen supercrítico a 52,7% de la masa inyectada y en el margen líquido a 52,0% de ésta. Estas cifras ilustran que las separaciones conseguidas son muy similares.
No obstante, las instalaciones necesarias en el margen líquido son esencialmente más baratas, puesto que sólo tienen que ser apropiadas para presiones de hasta 70 bar y no tienen que estar estructuradas hasta para 300 bar.
TABLA 2
Contenido de EPA en % Contenido de EPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
12 1,4 21 2,03
12,5 0,18 23 0,99
13 0,12 25 0,29
13,5 0,25 28 0,54
14 0,19 30 3,01
14,5 0,23 32 13
15 0,53 33 14,23
15,5 3,61 34 14,35
16 13,94 35 18,63
16,5 27,28 36 25,5
17 44,65 37 36,16
17,5 64,79 38 54,23
18 73,59 39 76,62
18,5 79,96 40 91,08
19 84,14 41 93,96
19,5 86,69 42 94,78
20,5 89,07 43 95,18
21 89,64 44 95,44
21,5 89,45 45 95,31
22 88,05 46 95,25
22,5 87,0147 47 94,34
23 85,76 48 93,67
23,5 84,1 49 93,03
24 82,16 50 92,34
24,5 80,53 51 91,7
25 78,8 52 91,24
25,5 76,97 53 90,67
TABLA 2 (continuación)
Contenido de EPA en % Contenido de EPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
26 75,63 54 89,42
26,5 74,09 56 86,79
27 73,21 59 79,34
28,5 69,27 62 61,96
32 59,55 67 14,71
34 51,7 121 1,95
37 26,52
40 17,67
En la Tabla 3 se registran las purezas de las fracciones tanto en cuanto a EPA como también en cuanto a DHA, para las mismas separaciones. También aquí se puede reconocer que las separaciones son comparables, pero que la separación en el margen líquido se puede llevar a cabo con esta fase en la mitad de tiempo.
Se separó un aceite de pescado diversas condiciones: fase líquida (T=18ºC, p_{n} = 52 bar; F = 300 kg/h); fase supercritica (T=46ºC, p_{n} = 105 bar; F = 300 kg/h); fase estacionaria: amino-propilo; fase móvil: CO_{2}
TABLA 3
Contenido de EPA/DPA en % Contenido de EPA/DPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de Duración de la Contenido de
separación EPA/DPA de separación EPA/DPA de
(min) la fracción (%) (min) la fracción (%)
12 1,4/2,99 21 2,03/85,53
12,5 0,18/0,31 23 0,99/9,92
13 0,12/0,18 25 0,29/0,65
13,5 0,25/0,32 28 0,54/0,27
14 0,19/0,26 30 3,01/0,37
14,5 0,23/0,27 32 13/0,28
15 0,53/0,12 33 14,23/0,2
15,5 3,61/0,16 34 14,35/0,01
16 13,94/0,01 35 18,63/0,01
16,5 27,28/0,11 36 25,5/0,15
17 44,65/0,01 37 36,16/0,01
TABLA 3 (continuación)
Contenido de EPA/DPA en % Contenido de EPA/DPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de Duración de la Contenido de
separación EPA/DPA de separación EPA/DPA de
(min) la fracción (%) (min) la fracción (%)
17,5 64,79/0,01 38 54,23/0,01
18 73,59/0,01 39 76,62/0,22
18,5 79,96/0,01 40 91,08/0,01
19 84,14/0,01 41 93,96/0,01
19,5 86,69/0,01 42 94,78/0,01
20,5 89,07/0,32 43 95,18/0,13
21 89,64/0,75 44 95,44/0,01
21,5 89,45/1,41 45 95,31/0,27
22 88,05/2,58 46 95,25/0,35
22,5 87,01/3,72 47 94,34/0,44
23 85,76/5,15 48 93,67/0,58
23,5 84,1/6,66 49 93,03/0,72
24 82,16/8,14 50 92,34/0,93
24,5 80,53/10 51 91,7/1,2
25 78,8/11,66 52 91,24/1,48
25,5 76,97/13,17 53 90,67/1,88
26 75,63/14,81 54 89,42/2,43
26,5 74,09/16,12 56 86,79/3,65
27 73,21/17,31 59 79,34/8,53
28,5 69,27/21,06 62 61,96/21,54
32 59,55/28,9 67 14,71/62,52
34 51,7/35,27 121 1,95/81,27
37 26,52/54,38
40 17,67/62,17
En las Tablas 4 y 5 se muestra una separación del mismo material de partida en otra fase estacionaria distinta. También aquí se puede observar que las separaciones en diferentes condiciones son muy semejantes. En esta fase estacionaria, las sustancias se eluyen, sin embargo, más tarde en el caso de condiciones líquidas. La pureza de EPA máxima alcanzable es en esta fase estacionaria de aproximadamente 80%. Si se define, como comparación para el rendimiento de masas, una pureza de EPA de más que 70%, entonces el rendimiento en condiciones líquidas es, con 36,2%, esencialmente más alto que en las condiciones supercríticas, con sólo 30,3%. La separación de fracciones de colas, que es muy pronunciada tanto para el EPA como también para el DHA, se ha de atribuir presuntamente a grupos de silanol que todavía son muy activos. Esta fase es menos apropiada para la separación. No obstante, se pudo mostrar que las separaciones en diferentes márgenes de estado son comparables.
Se separó un aceite de pescado en diversas condiciones: fase líquida (T=18ºC, p_{n} = 52 bar; F = 300 kg/h); fase supercritica (T=46ºC, p_{n} = 160 bar; F = 300 kg/h); fase estacionaria: gel de sílice; fase móvil: CO_{2}.
TABLA 4
Contenido de EPA en % Contenido de EPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
20 13,02 12 9,11
21 20,05 13 4,15
23 34,82 14 10,06
24 47,25 15 21,46
25 62,5 15,5 29,13
26 71,44 16 40,14
26,5 74,5 16,5 54,65
27 76,22 17 63,67
27,5 76,22 17,5 68,77
28 78,59 18 73,71
29 79,85 19 78,4
30 80,05 19,5 80,8
31 79,39 20 81,48
32 76,37 21 80,31
33 74 22 76,77
34 70,8 23 72,49
35 68,48 24 69,63
36 66,17 25 66,77
37 64,6 26 64,32
38 64 27 66,69
39 62,62 28 60,73
40 61,82 29 59,48
41 60,99 30 58,03
42 60,62 32 54,65
44 59,23 34 51,4
TABLA 4 (continuación)
Contenido de EPA en % Contenido de EPA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
46 57,65 36 46,5
48 56,66 38 42,34
50 55,32 40 37,86
52 53,51 45 27,81
55 48,97
60 44,15
TABLA 5
Contenido de EPA/DHA en % Contenido de EPA /DHA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
20 13,02/1,69 12 9,11/26,52
21 20,05/0,92 13 4,15/3,59
23 34,82/0,48 14 10,06/1,12
24 47,25/0,65 15 21,46/0,45
25 62,50/0,92 15,5 29,13/0,41
26 71,44/1,38 16 40,14/0,39
26,5 74,5/1,63 16,5 54,65/0,52
27 76,22/1,93 17 63,67/0,73
27,5 76,22/2,19 17,5 68,77/0,97
28 78,59/2,54 18 73,71/1,43
29 79,85/3,42 19 78,4/2,23
30 80,05/4,59 19,5 80,8/2,68
31 79,39/6,21 20 81,48/3,21
32 76,37//8,36 21 80,31/5,23
33 74/11,88 22 76,77/8,96
34 70,8/15,08 23 72,49/13,52
35 68,48/17,73 24 69,63/16,38
TABLA 5 (continuación)
Contenido de EPA/DHA en % Contenido de EPA /DHA en %
al separar con dióxido al separar con dióxido
de carbono líquido de carbono supercrítico
Duración de la Contenido de EPA Duración de la Contenido de EPA
separación (min) de la fracción (%) separación (min) de la fracción (%)
36 66,17/19,53 25 66,77/19,32
37 64,6/21,21 26 64,32/22,11
38 64/22,2 27 66,69/20,21
39 62,62/23,39 28 60,73/25,81
40 61,82/24,35 29 59,48/27,33
41 60,99/24,8 30 58,03/28,62
42 60,62/25,12 32 54,65/31,5
44 59,23/26,89 34 51,4/34,19
46 57,65/28,31 36 46,5/38,47
48 56,66/29,39 38 42,34/42,23
50 55,32/30,58 40 37,86/45,76
52 53,51/31,95 45 27,81/53,76
55 48,97/34,7
60 44,15/38,6
Abreviaturas utilizadas en el texto
HPLC cromatografía de líquido a alta presión
SFC cromatografía con gas supercrítico
SbFC cromatografía con gas fluido (T<T_{cr}; p>p_{cr})
LFC cromatografía con gas líquido (T<T_{cr}; p<p_{cr})
EPA éster etílico de ácido eicosapentaenoico (20:5)
DHA ácido docosahexaenoico (22:6)

Claims (13)

1. Procedimiento para la separación por cromatografía en columna de mezclas de sustancias, empleándose como eluyente un fluido o una mezcla de fluidos en estado líquido, no subcrítico y no crítico (T<T_{cr} y p<p_{cr}), que son gaseosos a 25ºC y 1 bar.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente se selecciona entre el conjunto que consta de óxido de dinitrógeno líquido, un hidrocarburo fluorado líquido o un hidrocarburo fluorado y clorado líquido, dióxido de carbono líquido, hexafluoruro de azufre líquido, propeno líquido, propano líquido, amoníaco líquido, dióxido de azufre líquido, xenón líquido, etano líquido, o una mezcla de éstos.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente tiene una viscosidad dinámica de 10^{-4}-10^{-5} Pa s, preferiblemente de 2*10^{-4} -2*10^{-5} Pa s, una densidad de 0,5-1,2 g/ml, preferiblemente de 0,5-1,2 g/ml.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente es dióxido de carbono líquido, preferiblemente en un intervalo de temperaturas de 0 a 20ºC.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente es dióxido de carbono líquido en un intervalo de presiones de 30 a 73,7 bar.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente contiene por lo menos un agente de modificación.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza una longitud de la columna de por lo menos 10 cm.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se utiliza una longitud de la columna de 0,25 a 2,0 m.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se utiliza un longitud de la columna de 1,1 a 1,7 m.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque como fase estacionaria se utilizan fases modificadas o no modificadas, seleccionadas entre el conjunto que consta de gel de sílice, óxido de aluminio, dióxido de titanio, así como fases estacionarias poliméricas, soportadas.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la fase estacionaria modificada se selecciona entre el conjunto que consta de una fase de diol, una fase de amino-propilo, una fase de RP8 y de RP18 aplicadas sobre gel de sílice, óxido de aluminio o dióxido de titanio,.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque como mezclas de sustancias se utilizan aceites naturales que contienen ácidos grasos insaturados.
13. Utilización de fluidos o de una mezcla de fluidos en estado líquido, no subcrítico o no crítico (T<T_{cr} y p<p_{cr}), que son gaseosos a 25ºC y 1 bar, para el aislamiento y/o la purificación y/o la obtención preparativa de mezclas de sustancias mediante cromatografía en columna.
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