ES2199218T3 - Estreptavidina de nucleo recombinante. - Google Patents
Estreptavidina de nucleo recombinante.Info
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Abstract
EL INVENTO SE TRATA DE UN METODO PARA LA PRODUCCION DE ESTREPTAVIDINA EN FORMA NUCLEAR RECOMBINANTE. EXIGE QUE LAS CELULAS HUESPED SE TRANSFORMEN MEDIANTE CODIGO ADN PARA ESTREPTAVIDINA EN FORMA NUCLEAR, QUE UNA VEZ TRANSFORMADAS SEAN CULTIVADAS BAJO CONDICIONES APROPIADAS Y QUE REPRESENTEN EL CODIGO ADN PARA LA ESTREPTOVIDINA EN FORMA NUCLEAR, Y QUE LA ESTREPTOVIDINA EN FORMA NUCLEAR SEA AISLADA DE LAS CELULAS HUESPED O DE MEDIO DE CULTIVO. PARA EL ADN DE LA ESTREPTOVIDINA EN FORMA NUCLEAR SE USA UN CODIGO DE ADN QUE TIENE (A) LA SECUENCIA NUCLEOTIDA MOSTRADA EN SEQ ID N CORRESPONDA A LA SECUENCIA (A) PARA LA DEGENERACION DE CODIGO GENETICO.
Description
Estreptavidina de núcleo recombinante.
La estreptavidina es por naturaleza (en estado
natural) una proteína tetrámera, teniendo cada subunidad una
longitud de 159 aminoácidos y un peso molecular de 16.450 Da
(Dalton). La obtención de estreptavidina se efectúa a partir del
material filtrado de cultivo de Streptomyces avidinii
(Chaiet, L. y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother. 3
(1963), 28-32). La estreptavidina se caracteriza,
así como también la proteína homóloga avidina aislada a partir de
la clara de huevo o albúmina de gallinas, por una fijación no
covalente extraordinariamente fuerte a la vitamina H
(d-biotina) soluble en agua. Se fija una molécula
de biotina por cada subunidad de estreptavidina, es decir se fijan
4 moléculas de biotina al tetrámero. La constante de disociación de
esta fijación es de 10^{-15}mol/l. Al contrario que la avidina,
la estreptavidina que procede de Streptomyces avidinii no
está glicosilada, no contiene aminoácidos con un contenido de
azufre y posee un punto isoeléctrico más bajo, situado
aproximadamente a un valor de pH de 6,5. El sistema de avidina y
biotina, y en particular el sistema de estreptavidina y biotina,
encuentra ya una amplia utilización en el diagnóstico y en la
biología molecular (Wilchek, M. y Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184
(1990), 5-13 y 14-45). Un ejemplo de
la utilización del sistema de biotina y estreptavidina consiste en
que se fija biotina o estreptavidina a moléculas diana, p. ej.
analitos, o a una superficie, p. ej. una superficie de un
recipiente con reactivos, a medios cromatográficos o a
biopolímeros, realizándose que la fijación de la molécula diana hace
posible p. ej. su detección.
Usualmente, se aísla estreptavidina como una
proteína segregada a partir del material filtrado del cultivo de
Streptomyces avidinii. Estas formulaciones preparadas de
estreptavidina son, no obstante, heterogéneas en lo que respecta a
la secuencia de aminoácidos en los extremos terminales de N y/o C,
lo que se ha de atribuir a una proteolisis durante la fermentación
(largos períodos de tiempo de fermentación) o/y durante la
purificación (Argarana, C.E. y colaboradores, Nucl. Acids Res. 14
(1986) 1.871-1.882; Bayer, E.A. y colaboradores,
Methods Enzymol. 184 (1990), 80-89; Pähler, A. y
colaboradores, J. Biol. Chem. 262 (1987)
13.933-13.937; Hendrickson, W.A. y colaboradores,
Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989) 2.190-2.194;
Bayer, E.A. y colaboradores, Biochem. J. 259 (1989)
369-376). Junto a esto, la estreptavidina natural
completa tiende a la agregación (= conglomeración) (Pähler, A. y
colaboradores, J. Biol. Chem. 262 (1987)
13.933-13.937; Bayer, E.A. y colaboradores, Biochem.
J. 259 (1989) 369-376; Bayer, E.A. y colaboradores,
J. Biochem. Biophys. Methods 13 (1986) 103-112).
Por consiguiente, plantea problemas el aislamiento reproducible de
proteínas de estreptavidina naturales o biológicamente activas,
acortadas proteolíticamente, procedentes de S. avidinii.
La agregación que ya tiene lugar durante el
aislamiento de una estreptavidina natural (nativa) para dar
oligómeros y su escasa solubilidad (Pähler, A. y colaboradores, J.
Biol. Chem. 262 (1987), 13.933-13.937) conducen
también a problemas en el caso de la utilización de estreptavidina
en el sistema de estreptavidina y biotina, puesto que una
proporción de la estreptavidina, que no se puede determinar con
exactitud, es retirada de la mezcla de reacción, de tal manera que
son posibles falseamientos de los resultados del ensayo.
Otra desventaja más de la estreptavidina natural
consiste en que ella, durante la fermentación y el tratamiento es
procesada proteolíticamente de manera limitada en sus extremos
terminales de N y C. Así, por regla general, se obtiene una mezcla
de diferentes productos de degradación, constituyendo el producto
final de este procesamiento proteolítico una proteína de núcleo
("core") con aproximadamente 125 a 127 aminoácidos (Pähler, A.
y colaboradores, J. Biol. Chem. 262 (1987)
13.933-13.937; Bayer, E.A. y colaboradores, Biochem.
J. 259 (1989) 369-376). El procesamiento
proteolítico mejora el comportamiento de fijación de la
estreptavidina para formar conjugados con biotina (Bayer, E.A. y
colaboradores, Biochem. J. 259 (1989) 369-376). La
mezcla de productos de degradación, que se obtiene usualmente, no
muestra, sin embargo, ningún comportamiento de fijación
reproducible con exactitud, por lo que son posibles falseamientos
de los resultados de medición.
La preparación por vía recombinante de
estreptavidina ha sido descrita en el documento de patente europea
EP-B-0.198.015. La expresión
heteróloga y la secreción de una estreptavidina natural en E.
coli mediante la secuencia de señal natural de la
estreptavidina conducían a variantes de estreptavidina que se
segregan dentro del periplasma. Estas variantes de estreptavidina,
designadas como ECO-avidinas, son no obstante
heterogéneas en el extremo terminal de C. Además, la secuencia de
señal de S. avidinii no era disociada totalmente en E.
coli, por lo que el extremo terminal de N de la molécula
contiene 13 aminoácidos adicionales en comparación con la
estreptavidina natural.
Sano y Cantor (Biochemical and Biophysical
Research Communications, tomo 176, Nº 2, 1991) describen una
proteína preparada por vía recombinante, que lleva los aminoácidos
16-133 de la estreptavidina natural, pero que en el
extremo terminal de C lleva 8 aminoácidos de vector adicionales.
En un trabajo de Sano, T. y Cantor, C. R. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 142-146) se
describen la expresión heteróloga de una estreptavidina recombinante
en E. coli, el aislamiento en forma de "corpúsculos de
inclusión" (del inglés "Inclusion Bodies" = IB's) y la
renaturalización. En este caso, se trata de una proteína de fusión
de estreptavidina acortada en el extremo terminal de N, que
contiene los aminoácidos 15 hasta 159 de la molécula natural de
estreptavidina. Sin embargo, se puso de manifiesto que una parte (de
30 a 50%) de la proteína de fusión con estreptavidina purificada y
naturalizada se agrega para formar oligómeros.
Fue misión del presente invento la de poner a
disposición una proteína mutante de estreptavidina homogénea
(estreptavidina de núcleo (core)), en la que se eliminen por lo
menos parcialmente las desventajas del estado de la técnica. Otra
meta del presente invento fue el desarrollo de un procedimiento de
preparación seguro, sencillo, reproducible y económico para una
estreptavidina de núcleo homogénea, que sea adecuada para las
diferentes aplicaciones preparativas y analíticas, y que en
particular sea adecuada para ensayos de diagnóstico.
El problema planteado por la misión de acuerdo
con el invento se resuelve mediante un procedimiento para la
obtención de una estreptavidina de núcleo recombinante, en el que
se transforman células hospedantes con un ADN que codifica una
estreptavidina de núcleo, se lleva a cabo una cultivación de las
células hospedantes transformadas en condiciones adecuadas, se
produce una expresión del ADN que codifica la estreptavidina de
núcleo y se obtiene la estreptavidina de núcleo recombinante a
partir de las células hospedantes o del medio de cultivo, el cual
está caracterizado porque se utiliza un ADN que codifica una
estreptavidina de núcleo, que tiene
(a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ
ID NO. 1 ó
(b) una secuencia de nucleótidos que corresponde
a la secuencia de nucleótidos (a) dentro del marco de la
degeneración del código genético.
Mediante el procedimiento de acuerdo con el
invento se consigue obtener una estreptavidina de núcleo que es
homogénea y que, por lo tanto, es adecuada en grado especial para
aplicaciones de diagnóstico. La estreptavidina de núcleo de acuerdo
con el invento puede contener igualmente un radical de metionina en
el extremo terminal de N.
La preparación del ADN que codifica una
estreptavidina de núcleo, la transformación de células hospedantes
adecuadas y su cultivación, así como la expresión y la obtención
del producto recombinante, se pueden llevar a cabo según métodos
habituales para un experto en la materia, tal como se describen
típicamente en "Molecular Cloning" [Clonación Molecular], T.
Maniatis, I.F. Fritsch y J. Sambrook, Cold Spring Harbor
Laboratory. La preparación del ADN que codifica una estreptavidina
de núcleo se puede efectuar partiendo del gen estructural de
estreptavidina (obtenible p. ej. de British Biotechnology Limited),
acortando el extremo 3' por un fragmento de ADN, que codifica la
secuencia de aminoácidos situada en el extremo terminal de C
IleAspAlaAlaLysLysAlaGlyValAsnAsnGlyAsnProLeuAspAlaValGlnGln
y acortando el extremo 5' por un fragmento de
ADN, que codifica la secuencia de aminoácidos situada en el extremo
terminal de N
AspProSerLysAspSerLysAlaGluValSerAla.
Para la expresión directa (iniciación de la
traducción) de la estreptavidina de núcleo se tiene que adosar al
extremo 5' del gen de estreptavidina de núcleo todavía la secuencia
ATG que codifica el aminoácido Met. El codón de iniciación para
metionina es disociado parcialmente de nuevo por una
metionilaminopeptidasa celular, en dependencia del organismo
hospedante utilizado después de la traducción (Dalboge, H. y
colaboradores, FEBS L. 266 (1990) 1-3). Al contrario
que el procesamiento de la estreptavidina natural, en el caso de la
secreción y la purificación a partir de materiales filtrados de
cultivo de S. avidinii, este procesamiento se limita al
radical de metionina situado en el extremo terminal de N y,
mediante la elección de las condiciones al realizar la cultivación
del microorganismo y la expresión, está establecido fijamente en su
magnitud, de tal manera que, correspondiendo a la misión de acuerdo
con el invento, se obtiene un producto de composición constante,
que se puede preparar de una manera reproducible.
La elección del vector de expresión se orienta a
la célula hospedante escogida. Vectores adecuados para las
diferentes células hospedantes son conocidos para el experto en la
materia y no necesitan ser ilustrados más detalladamente aquí.
Como célula hospedante se utiliza
convenientemente un microorganismo, p. ej., un organismo procariota
o una levadura. De manera especialmente preferida se utiliza E.
coli en combinación con un plásmido de expresión adecuado para
E. coli. La célula hospedante se transforma de manera en sí
conocida con un plásmido recombinante, que contiene una o varias
copias del ADN que codifica una estreptavidina de núcleo, utilizado
de acuerdo con el invento. En este caso se emplea de manera
preferida un plásmido de expresión recombinante, que tiene un
origen de replicación en múltiples copias, es decir, que en una
célula transformada se presenta con por lo menos 20,
preferiblemente con por lo menos 100 copias por célula. Como origen
de replicación en múltiples copias se adecua, por ejemplo, el
origen de replicación del plásmido pUC19.
Para la preparación de la estreptavidina de
núcleo de acuerdo con el invento, el ADN que codifica la
estreptavidina de núcleo en la célula hospedante transformada se
pone bajo el control de un promotor bien regulable. En este caso,
en la célula hospedante transformada está presente preferiblemente
un plásmido adicional, que produce la sobreexpresión de una
proteína represora, que desactiva al promotor regulable durante la
fase de cultivación de las células. En esta forma de realización
del procedimiento del invento, entonces la expresión del ADN que
codifica una estreptavidina de núcleo mediante adición de un
inductor que activa al promotor regulable.
Las condiciones de expresión se ajustan de manera
en sí conocida preferiblemente de tal manera que se obtenga la
estreptavidina de núcleo recombinante en forma de los denominados
"corpúsculos de inclusión", puesto que éstos se pueden separar
fácilmente de los constituyentes celulares solubles. Los
"corpúsculos de inclusión" así obtenidos se pueden entonces
solubilizar asimismo de manera en sí conocida y naturalizar para
dar una estreptavidina de núcleo biológicamente activa y soluble,
por ejemplo según el procedimiento descrito en el documento de
solicitud de patente europea EP-A 253 823.
La estreptavidina de núcleo naturalizada es
sometida luego convenientemente a una purificación fina,
preferiblemente mediante cromatografía. Para la cromatografía se
adecuan, por ejemplo, materiales para cromatografía por afinidad,
intercambiadores de iones o materiales para la cromatografía
hidrófoba.
Otro objeto más del invento es un ADN
recombinante, que codifica una estreptavidina de núcleo y que
tiene
(a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ.
ID NO. 1 o
(b) una secuencia de nucleótidos correspondiente
a la secuencia de nucleótidos (a) dentro del marco de la
degeneración del código genético.
Otro objeto más del invento es un vector
recombinante, que contiene por lo menos una copia del ADN
recombinante precedentemente definido. El vector de base es
convenientemente un plásmido, pero se pueden emplear también
vectores víricos. El vector del invento posee preferiblemente un
origen de replicación en múltiples copias. Además de esto, en el
vector de acuerdo con el invento el ADN que codifica la
estreptavidina de núcleo se encuentra preferiblemente bajo el
control de un promotor regulable.
Otro objeto más del invento es una célula
hospedante, que es transformada con el ADN recombinante
anteriormente definido o bien con el vector que contiene a este
último.
Finalmente, es un objeto del invento también la
estreptavidina de núcleo recombinante, que está caracterizada por
la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 2 con o sin el
radical de metionina situado en el extremo terminal de N.
Los plásmidos y microorganismos citados en la
presente solicitud fueron depositados en la Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1B,
D-3300 Braunschweig, con arreglo a las
estipulaciones del Tratado de Budapest bajo los siguientes números
de depósito:
| E. coli K12 RM 82 | DSM 5445, el 02.10.1991 |
| pSAM-core/pUBS 500 | DSM 6720, el 20.09.1991 |
En la lista de secuencias
la SEQ ID NO. 1 muestra la secuencia de ADN de la
estreptavidina de núcleo,
la SEQ ID NO. 2 muestra la secuencia proteínica
de la estreptavidina de núcleo con un radical de metionina en el
extremo terminal de N.
La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del
plásmido de expresión de estreptavidina de núcleo
pSAM-Core.
La Figura 2 muestra los espectros de dicroísmo
circular (CD de Circular Dichroismus) de la estreptavidina de
núcleo de acuerdo con el invento (2a) o bien de la estreptavidina
de núcleo convencional procedente de S. avidinii (2b) en
cada caso sin biotina (curva 1) o con biotina (curva 2).
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar
adicionalmente el invento.
En la siguiente estructura artificial
(construcción) de plásmido el extremo 3' del gen estructural de
estreptavidina natural se acortó por un fragmento de ADN, que
codifica la secuencia de aminoácidos en el extremo terminal de C
IleAspAlaAlaLysLysAlaGlyValAsnAsnGlyAsnProLeuAspAlaValGlnGln.
Para ello el plásmido pUC18-BBG9
(vector pUC18) con el gen de estreptavidina insertado, British
Biotechnology Limited (documento de patente internacional WO
89/03422) se digirió con las endonucleasas de restricción NheI y
HindIII, se aisló el fragmento de NheI/HindIII con una longitud de
aproximadamente 2,7 kpb (kilo-pares de bases) y se
ligó con el fragmento de ADN sintético
***: codón de interrupción
(estructura artificial:
pUC18-BBG9-C). La secuencia de ADN
deseada fue confirmada por secuenciación del ADN.
El plásmido pD-NX es un derivado
del plásmido pQE-6 (pDS56/RBSII,Nco1) de la entidad
Diagen (Düsseldorf), a partir del que se había eliminado el gen de
la cloramfenicol-acetil transferasa (CAT) exento de
promotor.
Para ello, el plásmido pDS56/RBSII,Nco1 se
digirió con las endonucleasas de restricción NheI y XbaI, se aisló
el fragmento del vector de NheI/XbaI con una longitud de
aproximadamente 2,6 kpb, y se unieron por ligación los extremos
compatibles de los sitios de corte con NheI y XbaI (estructura
artificial: pD-NX).
En la siguiente estructura artificial de plásmido
el extremo 5' del gen estructural de estreptavidina natural se
acortó por un fragmento de ADN, que codifica la secuencia de
aminoácidos en el extremo terminal de N
AspProSerLysAspSerLysAlaGlnValSerAla.
Para ello, el plásmido
pUC18-BBG9-C, preparado tal como se
ha descrito anteriormente, se digirió con la endonucleasa de
restricción PstI, el extremo 3' sobresaliente del sitio de corte
con PstI se digirió con la polimerasa de ADN de T4, el ADN se
disoció posteriormente con HindIII, se aisló el fragmento de
estreptavidina PstI(romo)/HindIII de con una longitud de
aproximadamente 390 pb (pares de bases) y se ligó en el fragmento
de vector NcoI(romo)/HindIIII pD-NX de
aproximadamente 2,6 kpb de longitud, después de haber rellenado el
extremo 5' sobresaliente del sitio de corte con NcoI con la
polimerasa de Klenow (estructura artificial:
pSA-core).
Para aumentar el número de copias del plásmido
(efecto de dosis génica) en E. coli, el origen de
replicación de pMB1 del plásmido pSA-core se
intercambió por el origen de replicación del plásmido en múltiples
copias pUC19 (Chambers, S.P. y colaboradores, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 29 (1988) 572-578).
Para ello el fragmento de Af1III/Bg1I con una
longitud de aproximadamente 1 kpb procedente del
pSA-core se intercambió por el fragmento análogo
procedente de pUC19 (Yanish-Perron, C. y
colaboradores, Gene 33 (1985) 103-119) (estructura
artificial: pSAM-core). La Figura 1 muestra el mapa
plasmídico de pSAM core. El plásmido pSAM-core ha
sido depositado en forma de una mezcla de plásmidos con pUBS500
bajo la designación DSM 6720.
Para la expresión de la estreptavidina de núcleo,
la cepa de E. coli K12 RM82 (DSM 5445) (un revertante con
metionina de ED 8654, Murray, N.E. y colaboradores, Mol. Gen.
Genet. 150 (1977) 53-61) se transformó con el
plásmido de expresión de la estreptavidina de núcleo
pSAM-core (con resistencia frente a ampicilina) y
con el plásmido represor de lacl^{q} pUBS500 (resistencia frente
a kanamicina, para su preparación y descripción véase: el documento
EP-A 0.373.365).
Las células
RM82/pUbS500/pSAM-core se cultivaron en el medio DYT
(1% (p/v = peso/volumen) de un extracto de levadura, 1% (p/v) de
Bacto Tryptone, Difco, y 0,5% de NaCl) con 50 mg/l de ampicilina y
50 mg/l de kanamicina hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nm
de 0,6-0,9, y a continuación se indujeron con IPTG
(concentración final 1-5 mmol/l). Después de una
fase de inducción de 4-8 horas, se cosecharon las
células mediante centrifugación, se lavaron con el tampón
Tris-HCl 25 mmol/l, valor de pH 7,5, y se
almacenaron a -20ºC hasta realizar el tratamiento ulterior.
El sedimento de células obtenido a partir de 1 ml
de medio de cultivo separado por centrifugación (células
RM82/pUBS500/pSAM-core) se resuspendió en 0,25 ml
del tampón de fosfato 10 mmol/l, valor de pH 6,8, y en EDTA 1
mmol/l, y las células se disgregaron mediante tratamiento con
ultrasonidos. Después de haber centrifugado, se mezcló el material
sobrenadante con 1/5 de volumen del tampón de muestras 5xSDS
(tampón de muestras 1xSDS: Tris-HCl 50 mmol/l, valor
de pH 6,8, 1% de SDS, 1% de mercaptoetanol, 10% de glicerol, 0,001%
de azul de bromofenol). La fracción de desperdicio celular
insoluble se resuspendió en 0,3 ml de tampón de muestras 1XSDS con
urea 6-8 M, las muestras se incubaron a 95ºC
durante 5 minutos y se centrifugaron. Después de esto las proteínas
se separaron mediante electroforesis en gel de
SDS-poli(acrilamida) (PAGE) (Laemmli, U.K.,
Nature 227 (1970) 680-685) y se tiñeron con el
colorante Coomassie Brilliant Blue R.
Además, las proteínas separadas por
electroforesis se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, se
fijaron (Towbin, H. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 76
(1979) 4.350) y las proteínas reactivas inmunológicamente con
estreptavidina se detectaron con un antisuero específico
anti-estreptavidina de oveja.
La proteína de estreptavidina de núcleo
sintetizada en E. coli era homogénea y se encontró
exclusivamente en la fracción del desperdicio celular insoluble
(IB's). Mediante SDS-PAGE y análisis por
transferencia de borrón Western no se pudieron detectar fragmentos
de estreptavidina de núcleo acortados. El nivel de expresión de
estreptavidina de núcleo fue de 30-50% referido a la
proteína total de E. coli. La secuencia proteínica de la
estreptavidina de núcleo se representa en SEQ ID NO. 2.
40 g (peso en húmedo) de células de E.
coli RM82/pUBS500/pSAM-core se suspendieron a
0ºC en 200 ml de Tris-HCl 0,1 mol/l, valor de pH
7,0, se mezclaron con 60 mg de lisozima y se incubaron durante 20
minutos a 0ºC. Después de haber añadido 2 mmol/l de MgCl_{2} y 1
mg/100 ml de ADNasa (Boehringer Mannheim GmbH, Nº de catálogo
104159) las células se disgregaron (lisaron) totalmente por medios
mecánicos mediante dispersión a alta presión, después de esto el
ADN se digirió a 25ºC durante 30 minutos. A continuación, la
solución de disgregación se mezcló con 100 ml de EDTA 60 mmol/l, 6%
de Triton X100 y NaCl 1,5 mol/l, valor de pH 7,0, y se incubó
durante otros 30 minutos a 0ºC. Después de esto, se sedimentaron
los constituyentes insolubles (desperdicio celular e IB's) mediante
centrifugación con una centrifugadora Sorvall.
El sedimento se resuspendió en 200 ml de
Tris-HCl 0,1 mol/l, EDTA 20 mmol/l, valor de pH
6,5, y se incubó durante 30 minutos a 25ºC; el preparado de IB se
aisló entonces mediante centrifugación.
10 g de sedimento de IB's (peso en húmedo) se
suspendieron en 40 ml de Tris-HCl 0,1 mol/l,
guanidina-HCl 6 mol/l, EDTA 10 mmol/l, valor de pH
7,0, mediante agitación durante 1,5 horas a 4ºC. Los constituyentes
insolubles se separaron mediante centrifugación y el material
sobrenadante transparente se dializó frente a
Tris-HCl 0,1 mol/l, guanidina-HCl 6
mol/l, EDTA 10 mmol/l, valor de pH 7,0 (3 x 3 l, 24 horas,
4ºC).
La renaturalización se llevó a cabo a 25ºC
mediante una adición en 20 veces cada vez de 2 ml de un material
solubilizado de estreptavidina de núcleo (40 mg/ml) en 1,6 l de
fosfato de sodio 0,1 mol/l, EDTA 5 mmol/l, valor de pH 7,0, a unos
intervalos de 20 minutos.
Después de haber terminado la reacción de
naturalización, se separaron los constituyentes insolubles mediante
centrifugación y el material sobrenadante transparente que contenía
estreptavidina de núcleo se trató ulteriormente.
La tanda de renaturalización se puede concentrar
en caso de que sea necesario mediante filtración a través de
membranas, y/o, para eliminar guanidina -HCl, se puede dializar
frente a un tampón deseado.
\newpage
La estreptavidina de núcleo procedente de las
tandas de renaturalización puede ser purificada ulteriormente en
caso de que sea necesario por métodos cromatográficos, que son
conocidos para el experto en la materia.
La tanda de renaturalización se concentró en una
celda de agitación mediante ultrafiltración hasta un volumen de 120
ml, se centrifugó para separar los residuos no disueltos y después
de esto se dializó frente a Tris-HCl 20 mmol/l,
valor de pH 8,5, (2 x 10 l, 24 horas, 4ºC). Una columna de
Q-Sepharose ff equilibrada con el mismo tampón (3 x
28 cm, V = 200 ml) se cargó con la tanda de renaturalización
concentrada y dializada (1 volumen de columna/hora = 1 VC/h) y se
lavó con el tampón de equilibración hasta tanto que la absorción del
material eludo a 280 nm alcanzase el valor en vacío del tampón. La
elución del material fijado se efectuó mediante un gradiente de
NaCl de 0 hasta 150 mmol/l en el tampón de equilibración (10 VC, 1
VC/h).
| Volumen | Actividad^{1)} | C_{prot} | SA^{2)} | |
| ml | unidades/ml | mg/ml | unidades/mg | |
| material dializado | 180 | 34,8 | 2 | 17,4 |
| material eluido de Q | 200 | 24,8 | 1,3 | 19,4 |
| 1) Actividad en el ensayo de titulación (compárese el Ejemplo 6.2) | ||||
| 2) Actividad específica: actividad en el ensayo de titulación dividida por el contenido de proteínas de | ||||
| la muestra |
Fracciones adecuadas procedentes de la elución se
reunieron (V = 200 ml), se concentraron en la celda de agitación,
se dializaron frente a agua bidestilada (2 x 15 l, 70 horas, 4ºC),
se congelaron y se liofilizaron.
La homogeneidad y la pureza de la estreptavidina
de núcleo purificada y naturalizada se investigó mediante
SDS-PAGE (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970)
680-685).
La estreptavidina de núcleo purificada y
naturalizada era homogénea (presentaba una sola banda) en la
SDS-PAGE (peso molecular: aproximadamente 13.500 Da)
con una pureza de > 98% con un procesamiento de aproximadamente
70-90% de la metionina en el extremo terminal de
N.
La actividad de la estreptavidina de núcleo se
determinó mediante titulación con biotina vigilando la modificación
de la absorción a 233 nm provocada por la formación del complejo. 1
unidad es definida como la fijación de 1 \mug de biotina por la
muestra.
La determinación de la proteína se efectuó
mediante medición de la extinción a 280 nm. El coeficiente de
extinción de una solución al 1% es \varepsilon = 34 a 280 nm
(Green, M., Methods Enzymol. 184 (1990) 51-67).
La actividad específica medida (19,4 unidades/mg
de proteína) corresponde a una estequiometría de la fijación de
biotina : estreptavidina de núcleo \geq 1 (referida al
monómero).
La modificación de la estructura provocada por la
fijación de biotina se vigiló mediante espectroscopia de CD. Para
ello se registraron espectros antes y después de la adición de
biotina, y éstos se compararon con espectros obtenidos de igual
manera de una estreptavidina de núcleo preparada de manera
convencional a partir de S. avidinii.
\newpage
Los espectros se registraron bajo las siguientes
condiciones en un espectrómetro de CD Jasco J-600:
Una estreptavidina de núcleo recombinante o bien una estreptavidina
de núcleo de S. avidinii (material liofilizado) se disolvió
hasta una concentración de aproximadamente 2 \mumol/l en agua
bidestilada, se introdujo en una cubeta con un camino de la luz de
5 mm y se midió con un régimen de exploración de 20 nm/minuto en el
intervalo de 200 a 250 nm, con una amortiguación ("constante de
tiempo") de 8 segundos, frente a agua bidestilada en la cubeta
de referencia. A continuación, se añadió biotina a la cubeta de
medición hasta una concentración de aproximadamente 6 \mumol/l, y
después de esto se registró de nuevo el espectro en las mismas
condiciones.
Los espectros de una estreptavidina de núcleo
purificada procedente de E. coli (Fig. 2a) y los espectros
de una estreptavidina de núcleo preparada convencionalmente a
partir de S. avidinii (Fig. 2b) son idénticos.
SEQ ID NO. 1
TIPO DE LA SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 387 pares de bases
SEQ ID NO. 2
TIPO DE LA SECUENCIA: proteína
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 128 aminoácidos
Claims (21)
1. Procedimiento para la obtención de una
estreptavidina de núcleo recombinante, en el que se transforman
células hospedantes con un ADN que codifica una estreptavidina de
núcleo, se lleva a cabo una cultivación de las células hospedantes
transformadas en condiciones adecuadas, se produce una expresión
del ADN que codifica la estreptavidina de núcleo y se obtiene la
estreptavidina de núcleo recombinante a partir de las células
hospedantes o del medio de cultivo, caracterizado porque se
utiliza un ADN que codifica una estreptavidina de núcleo, que
tiene
(a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ
ID NO. 1 o
(b) una secuencia de nucleótidos correspondiente
a la secuencia de nucleótidos (a) dentro del marco de la
degeneración del código genético.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utiliza una célula hospedante
microbiana.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, caracterizado porque se utiliza una célula hospedante
procariótica.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utiliza E. coli como
célula hospedante.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utiliza una célula hospedante
eucariótica.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
5, caracterizado porque se utiliza una levadura como célula
hospedante.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la célula
hospedante se transforma con un plásmido recombinante, que contiene
por lo menos una copia del ADN que codifica la estreptavidina de
núcleo.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque se utiliza un plásmido recombinante
con un origen de replicación en múltiples copias.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN
que codifica la estreptavidina de núcleo se encuentra en la célula
hospedante transformada bajo el control de un promotor
regulable.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque la expresión del ADN
que codifica la estreptavidina de núcleo se produce mediante
adición de un inductor para el promotor regulable.
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
estreptavidina de núcleo recombinante se obtiene a partir de las
células hospedantes en forma de corpúsculos de inclusión y, a
continuación, se llevan a cabo una solubilización y una
naturalización de los corpúsculos de inclusión para dar una
estreptavidina de núcleo soluble, biológicamente activa.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque la estreptavidina
de núcleo naturalizada se purifica por cromatografía.
13. ADN recombinante, caracterizado
porque codifica una estreptavidina de núcleo y tiene
(a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ
ID NO. 1 o
(b) una secuencia de nucleótidos correspondiente
a la secuencia de nucleótidos (a) dentro del marco de la
degeneración del código genético.
14. Vector recombinante, caracterizado
porque contiene por lo menos una copia de un ADN de acuerdo con la
reivindicación 13.
15. Vector de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizado porque es un plásmido.
16. Vector de acuerdo con la reivindicación 15,
caracterizado porque posee un origen de replicación en
múltiples copias.
17. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 14 hasta 16, caracterizado porque el ADN
que codifica la estreptavidina de núcleo se encuentra bajo el
control de un promotor regulable.
18. Plásmido pSAM-core DSM
6720.
19. Célula hospedante, caracterizada porque es
transformada con un ADN de acuerdo con la reivindicación 13 o con un
vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 18.
20. Estreptavidina de núcleo recombinante,
caracterizada porque tiene
(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ
ID NO. 2 y/o
(b) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ
ID NO. 2 sin el radical Met en el extremo terminal de N.
21. Utilización de una estreptavidina de núcleo
recombinante de acuerdo con la reivindicación 20 para
procedimientos de análisis in vitro diagnósticos y para la
cromatografía por afinidad.
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