ES1075993U

ES1075993U - Unidad de balancín de una máquina de atar con fleje

Info

Publication number: ES1075993U
Application number: ES201130856U
Authority: ES
Inventors: Ming-Shih Yang
Original assignee: Pantech International Inc
Current assignee: Pantech International Inc
Priority date: 2011-08-08
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2012-01-24
Anticipated expiration: 2021-08-08
Also published as: ES1075993U9; ES1075993Y

Abstract

1. Unidad de balancín de una máquina de atar con fleje que comprende un balancín que comprende:un extremo pivotante;un extremo oscilante; yun asiento conformado sobre el balancín, dispuesto adyacente al extremo oscilante y que comprendeuna parte frontal correspondiente al extremo pivotante 11 del balancín;una parte posterior correspondiente al extremo oscilante del balancín;dos lados opuestos;un hueco de montaje conformado en una superficie superior del asiento;una parte inferior definida en el hueco de montaje; yuna protrusión de soporte conformada sobre la parte inferior del asiento y que se extiende hacia los lados del asiento;un panel de posicionamiento montado en el hueco de montaje del asiento y sobre la protrusión de soporte;dos paneles dentados montados sobre el panel de posicionamiento 30, dispuestos paralelos a la parte frontal y a la parte posterior del asiento y que se deslizan selectivamente hacia la parte frontal y la parte posterior del asiento, comprendiendo cada panel dentado:dos lados que se corresponden respectivamente con los lados del asiento;una superficie superior dentada; ydos protrusiones deslizantes que sobresalen respectivamente de los lados del panel dentado; ydos soportes montados bien sujetos en el hueco de montaje del asiento y dispuestos respectivamente adyacentes a los lados del asiento, y comprendiendo cada soporte un lado interior correspondiente a los paneles dentados; yun hueco de deslizamiento conformado en el lado interior del soporte y montado alrededor de las protrusiones deslizantes correspondientes del panel dentado.2. Unidad de balancín según la reivindicación 1, en el que el asiento del balancín comprende adicionalmente un hueco interior conformado en la parte inferior del asiento y que se extiende hacia los lados del asiento;La unidad de balancín comprende además un soporte montado en el hueco interior del balancín;La protrusión de soporte se conforma sobre una parte superior del soporte y sobresale introduciéndose en el hueco de montaje del asiento.3. Unidad de balancín según la reivindicación 1, en la que cada panel dentado comprende además un hueco de la parte inferior conformado en una parte inferior del panel dentado y a través de una parte frontal y una parte posterior del panel dentado y montado alrededor del panel de posicionamiento.4. Unidad de balancín según la reivindicación 2, en la que cada panel dentado comprende además un hueco de la parte inferior conformado en una parte inferior del panel dentado y a través de una parte frontal y una parte posterior del panel dentado y montado alrededor del panel de posicionamiento.5. Unidad de balancín según las reivindicaciones 2 ó 4, en la que el soporte es una varilla redonda.6. Unidad de balancín según las reivindicaciones 2 ó 4, en la que el soporte se corresponde con el hueco interior del asiento y se incrusta en el interior del mismo; yLa protrusión de soporte es convexa.7. Unidad de balancín según las reivindicaciones 2 ó 4, en la que el soporte se corresponde con el hueco interior del asiento y se incrusta en el interior del mismo; yLa protrusión de soporte presenta una sección transversal rectangular.8. Unidad de balancín según las reivindicaciones 2 ó 4, en la que el soporte se corresponde con el hueco interior del asiento y se incrusta en el interior del mismo; yLa protrusión de soporte presenta una sección transversal triangular.9. Unidad de balancín según la reivindicación 1, en la que el asiento del balancín comprende además un hueco interior conformado en la parte inferior del asiento y que se extiende hacia los lados del asiento; y la unidad de balancín comprende además una pluralidad de soportes esféricos montados en el interior del hueco interior del balancín y dispuestos a lo largo del mismo.

Description

Nanocomposiciones sacarídicas para la preparación de vacunas

Campo técnico

La presente invención se refiere al desarrollo de formulaciones basadas en el diseño de vehículos nanométricos, capaces de inducir o potenciar una repuesta inmunológica frente a un antígeno asociado. Más en concreto, se refiere a nanosistemas de aplicación en el campo de las enfermedades infecciosas. Adicionalmente, la invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que los comprenden, así como a procedimientos para su preparación.

Antecedentes

Las vacunas se componen tradicionalmente de microorganismos atenuados o muertos que son capaces de generar protección inmunológica frente a la enfermedad que causan una vez inoculados al organismo. El éxito de este tipo de vacunas reside en que el organismo reconoce dicho patógeno y comienza una respuesta inmunitaria frente al mismo, así como la generación de memoria inmunológica, lo que permite desencadenar una respuesta inmediata cuando el microorganismo patógeno entra en el organismo. Sin embargo, la utilización de este tipo de vacunas puede ir acompañada de cierta problemática relacionada principalmente con (i) la posible reactivación del agente infeccioso como consecuencia de mutaciones en el genoma, (ii) la presencia de agentes tóxicos que pueden acompañar al patógeno como son los lipopolisacáridos (LPS), o (iii) la pérdida de potencia debido a deficiencias en el transporte y almacenamiento en las condiciones de refrigeración requeridas (Plotkin SA. Vaccines: past, present and future. Nat Med 2005;11(4 (suppl)):S5-11).

Para solventar algunos de estos problemas, en los últimos años se han obtenido antígenos subunidad formados por las partes mejor conservadas de los patógenos, o plásmidos ADN codificadores de estos antígenos, para que el organismo pueda reconocerlos como invasores una vez administrados, y que presentan un mejor perfil de seguridad al evitar la inoculación del microorganismo entero. Sin embargo, este aumento en la seguridad de la vacuna suele conllevar una disminución en la inmunogenicidad de la misma, lo que da lugar a una menor potencia de la respuesta inmune generada. Por esta razón, tanto los antígenos subunidad como las vacunas ADN requieren (i) una dosificación múltiple con dosis de recuerdo para asegurar la protección inmunológica, así como (ii) el apoyo de algún tipo de agente adyuvante, de forma que ayude a la inducción y potenciación de la respuesta inmunitaria frente al antígeno/material genético administrado, y por tanto, frente al propio patógeno.

Actualmente, sólo las sales insolubles de aluminio (álum) están aprobadas por las agencias regulatorias de todo el mundo, y las únicas por la FDA (US Food and Drug Administration), para su uso en humanos con este fin. Sin embargo, se han identificado múltiples inconvenientes relacionados con este adyuvante, tales como:

-: aparición de síntomas locales tras la inyección como hinchazón, eritemas o nódulos cutáneos (Lindbald EB. Aluminium adjuvants - in retrospect and prospect. Vaccine 2004;22:3658-3668),

-: pérdida de potencia por congelación accidental (Zapata MI, Peck GE, Hem SL, White JL, Feldkamp JR. Mechanism of freeze-thaw instability of aluminum hydroxycarbonate and magnesium hydroxide gels. J Pharm Sci 1984;73:3-9),

-: inducción de una respuesta inmune únicamente de tipo humoral, lo que lo hace menos adecuado para aquellos microorganismos que requieran una respuesta celular para ser eliminados del organismo (Brewer JM. (How) do alumiun adjuvants work? Immunol Lett 2006;102:10-15),

-: aparición de reacciones alérgicas (Brewer JM. (How) do alumiun adjuvants work? Immunol Lett 2006;102:10-15),

-: necesidad de administrarlo por vía parenteral y en varias dosis para generar protección.

Por lo tanto, se hace necesario el desarrollo de nuevos sistemas adyuvantes que sean menos tóxicos, más tolerables por el paciente, que permitan la potenciación y modulación de las respuestas inmunes frente a una amplia variedad de microorganismos patógenos, así como una reducción en el número de dosis necesaria para alcanzar protección frente a enfermedades infecciosas.

Nuevos sistemas basados en lípidos y tensioactivos (emulsiones) han sido introducidos recientemente en el mercado europeo formando parte de vacunas frente a la gripe pandémica: MF59TM, AS03TM y la AF03 TM, desarrollados respectivamente por las empresas farmacéuticas Novartis, GlaxoSmithKline (GSK) y Sanofi Pasteur (EMEA – pandemic influenza vaccines: http://tinyurl.com/5vw5yyn ):

•: MF59TM (Novartis): Aflunov® (H5N1), Focetricia® (H1N1), Foclivia® (H5N1)

•: AS03TM (GSK): Prepandrix® (H5N1)

•: AF03 TM (Sanofi Pasteur): Humenza® (H1N1)

Dichas formulaciones adyuvantes basadas en emulsiones se han aprobado acompañando a virus inactivados provenientes de diversas cepas de influenza relacionadas con el brote pandémico. Su aplicación junto con antígenos subunidad no se encuentra aprobada por las agencias regulatorias, aunque no obstante, esta aplicación se encuentra recogida en numerosos documentos (por ejemplo: US2009191226 (A2), US2009304742 (A1), WO 2010125461 (A1), US 2005136073 (A1), WO2007006939 (A3), WO 0168129 (A2)). Las emulsiones adyuvantes descritas en dichos documentos presentan como composición común, la parte oleosa compuesta por escualeno y una mezcla de tensioactivos no iónicos que le confieren estabilidad al sistema. A mayores pueden ir acompañadas de agentes antioxidantes como el a-tocoferol (por ejemplo: WO2006100110 (A1), WO 2009127676, WO 2009127677, US 2010183667 (A1)) u otras moléculas inmunomoduladoras como el CpG (por ejemplo: EP 1572124 (A4)), muramil dipéptidos (por ejemplo: US2003147898 (A1), EP0315153 (A2)), monofosforil lípido A (por ejemplo: WO9956776 (A2), EP1951298 (A1)) ó también éste último combinado con QS21 (por ejemplo: US 2007196394 (A1), WO9517210 (A1)). Pero no tienen ninguna cubierta polimérica ni de ninguna otra naturaleza.

También se han descrito otros sistemas nanocapsulares, en concreto cabe mencionar una composición de nanocápsulas polisacarídicas (EP1834635 A1). Sin embargo, este sistema emplea en el núcleo oleoso aceites compuestos por ácidos grasos y sus derivados (ésteres ó amidas) y además requiere la presencia de un compuesto polioxialquilenado para estabilizar el sistema.

Breve descripción de la invención

La presente invención proporciona un sistema al cual es posible asociar antígenos en su superficie de forma eficaz. Este sistema presenta ventajas especialmente relevantes en el campo de las vacunas. Por un lado por ser menos tóxico que las vacunas que se comercializan actualmente, debido a que los materiales que lo componen son materiales seguros desde un punto de vista regulatorio y biocompatibles. Por otro lado porque su empleo permite alcanzar protección frente a enfermedades infecciosas empleando un número de dosis de antígeno más reducido que en el caso de las vacunas que se comercializan.

Así, en un primer aspecto, la invención se dirige a un sistema para la administración de antígenos que comprende nanocápsulas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que comprenden:

a): al menos un polisacárido catiónico;

b): al menos un componente oleoso de características inmunoestimulantes;

c): al menos un tensioactivo aniónico; y

d): al menos un antígeno;

caracterizadas por presentar una estructura tipo reservorio, donde el núcleo está compuesto por componentes

lipídicos y está recubierto por al menos un polisacárido catiónico. En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema como se ha definido anteriormente que se encuentra en forma liofilizada.

En otro aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende un sistema como se ha definido anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un sistema como se ha definido anteriormente. En otro aspecto, la invención hace referencia a una composición farmacéutica que comprende un sistema como se

ha definido anteriormente para su uso en la prevención de enfermedades infecciosas. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un procedimiento para la preparación de un sistema como se ha

definido anteriormente que comprende: a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico; b) preparar una solución orgánica de al menos un componente oleoso de características

inmunoestimulantes y al menos un tensioactivo aniónico; c) mezclar bajo agitación las soluciones formadas en a) y b) con la formación espontánea de las nanocápsulas polisacarídicas; d) incubar el antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas. Alternativamente, el procedimiento para la preparación de un sistema como se ha definido anteriormente comprende: a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico;

b): preparar una solución orgánica de al menos un componente oleoso de características

inmunoestimulantes y al menos un tensioactivo aniónico;

c): mezclar la solución b) bajo agitación con una solución acuosa;

d): incubar la mezcla obtenida en c) con la solución a);

e): incubar al menos un antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas.

La invención hace referencia asimismo al uso de un sistema como se ha definido anteriormente en la preparación de una vacuna. En una realización particular, dicha vacuna es para aplicación en prevención de enfermedades infecciosas. Preferiblemente las enfermedades infecciosas a las que va dirigida la prevención son aquellas causadas por agentes víricos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) donde se puede observar la morfología de las nanocápsulas polisacarídicas sin antígeno asociado. Las nanocápsulas presentan una forma regular esférica y tamaño de partícula nanométrico homogéneo.

Figura 2: Imágenes de fluorescencia in vivo tras la administración intramuscular de nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno, elaboradas a partir de poli-D-glucosamina marcada con Alexa Fluor 750 succiminidil éster. Las nanocápsulas polisacáridicas son capaces de formar un depot en el lugar de inyección que permanece durante al menos 5 horas tras la inyección.

Figura 3: Imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) donde se puede observar la morfología de las nanocápsulas polisacarídicas con el rHBsAg asociado a su superficie. Dichas nanocápsulas presentan una forma regular esférica y tamaño de partícula nanométrico homogéneo.

Figura 4: Las nanocápsulas polisacarídicas con o sin antígeno asociado han sido liofilizadas con diferentes concentraciones de trehalosa como agente crioprotector. En esta gráfica se puede apreciar que tras la resuspensión del polvo liofilizado es posible recuperar el tamaño de partícula de la suspensión inicial.

Figura 5: Las nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno son capaces de generar una respuesta inmunitaria protectora frente a hepatitis B tras la administración de dos (0 y 4 semanas) ó tres dosis (0,4 y 8 semanas) de 10 μg de rHBsAg asociado, por vía nasal. Se puede observar en esta figura la importancia de una tercera dosis por vía mucosa para generar niveles mayores de inmunoglobulinas específicas.

Figura 6: El efecto adyuvante de las nanocápsulas polisacarídicas se ha probado tras la administración de dos dosis de 10 μg de rHBsAg asociado por vía intramuscular (0 y 4 semanas). La concentración de anticuerpos frente al antígeno alcanzada por las distintas formulaciones de nanocápsulas se prolonga durante el tiempo de estudio (6 meses) y en ambos casos se consiguen niveles significativamente mayores con ambos sistemas (nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno (_) o núcleo de escualeno e imiquimod (.)) que la formulación de referencia de la vacuna (rHBsAg-alum) (-X-) a la misma dosis. La diferente composición del núcleo da lugar una diferencia en la cinética de inducción de la respuesta inmune de ambos nanosistemas. *Nanocápsulas polisacarídicas vs. rHBsAg-alum p<0.05.

Figura 7: La administración en una dosis única de 10 μg de rHBsAg asociado a las nanocápsulas polisacarídicas (con núcleo de escualeno (_) o núcleo de escualeno e imiquimod (.)) ha generado niveles seroprotectores de IgG (>100mIU/mL) que se prolongan durante un largo período de tiempo (6 meses), no siendo éstos estadísticamente diferentes a los generados por rHBsAg-alum (-X-) administrado en dos dosis de 10 μg (0 y 4 semanas). En este caso, la composición del núcleo oleoso de las nanocápsulas (escualeno o escualeno e imiquimod) no influye en la magnitud o en la cinética de la respuesta inmune. *Nanocápsulas polisacarídicas vs. rHBsAg-alum p<0.05).

Descripción detallada de la invención

En la presente invención, por el término “nanocápsulas polisacarídicas” se hace referencia a estructuras estables y de características homogéneas, reproducibles y modulables perfectamente diferenciables de sistemas autoensamblados, que se forman como consecuencia de un proceso controlado de interacción electrostática entre un tensioactivo aniónico, que se encuentra englobando al componente oleoso, con el polisacárido catiónico. La interacción que resulta entre los diferentes componentes de las nanocápsulas genera entidades físicas características, que son independientes y observables, cuyo tamaño medio es inferior a 1 Im, es decir, un tamaño promedio de entre 1 y 999 nm.

Por el término “tamaño medio” se entiende el diámetro promedio de la población de nanocápsulas, que comprende la estructura compuesta por el núcleo hidrofóbico y la cubierta polimérica, que se mueve junta en un medio acuoso. El tamaño medio de estos sistemas puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por un experto en la técnica.

Las nanocápsulas polisacarídicas del sistema de la invención tienen un tamaño de partícula medio inferior a 1 Im, es decir, tienen un tamaño medio de entre 1 y 999 nm, preferiblemente de entre 50 y 800 nm. En una realización particular el tamaño medio está comprendido entre 150 nm y 350 nm. El tamaño medio de las nanocápsulas está influido principalmente por su composición y las condiciones de formación.

Por otra parte, las nanocápsulas pueden presentar una carga eléctrica (medida mediante el potencial �), cuya magnitud puede tomar valores positivos o negativos dependiendo de la proporción de los diferentes componentes en el sistema. En una realización particular de la invención, las nanocápsulas presentan carga positiva que puede variar entre +1 mV y +75 mV. En una realización particular, la carga está comprendida entre +25 mV y +67 mV.

El potencial � de los sistemas de la invención puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por un experto en la técnica, y que se describen, por ejemplo, en la parte experimental de la presente memoria descriptiva.

Polisacárido catiónico

La cubierta polisacarídica que rodea al núcleo oleoso proporciona ventajas a la presente invención. Por un lado, dicha cubierta ofrece la posibilidad de asociar el antígeno al sistema mediante interacciones electrostáticas, y así además es posible conocer exactamente la proporción de antígeno que se administra unido al vehículo. Por otro lado, la cubierta polisacarídica también tiene un papel importante en la inducción y potenciación de la respuesta inmune ya que se le han descrito propiedades inmunoadyuvantes (Zaharoff DA, Rogers CJ, Hance KW, Scholm J, Greiner JW. Chitosan solution enhances both humoral and cell-mediated immune responses to subcutaneous vaccination. Vaccine 2007;25:2085-94). Además, las características superficiales dadas por la cubierta polisacarídica, junto con el tamaño nanométrico del sistema, ofrece ventajas para la inmunización a través de vías mucosas, por ejemplo la vía nasal, mejorando la absorción del antígeno a través de la barrera mucosa (Prego C, Torres D, Alonso MJ. Chitosan nanocapsules: a new carrier for nasal peptide delivery. J Drug Deliv Sci Tec 2006;16(5):331-37).

Por el término “polisacárido catiónico” se entiende cualquier molécula compuesta por subunidades glicídicas, preferiblemente de origen natural, con una carga neta positiva, incluyendo en dicha definición aquellos polisacáridos catiónicos sobre los que se han efectuado modificaciones tales como fragmentación enzimática o química o derivatización o marcaje. En una realización particular, el polisacárido catiónico se selecciona de entre el grupo consistente en policationes de dextrano y poliglucosaminas.

En una realización particular, el polisacárido catiónico es la poli-D-glucosamina, sus sales, fragmentos, derivados o derivados marcados.

En la presente invención, se entiende por el término “poli-D-glucosamina” un homopolímero formado por subunidades de D-glucosamina unidas mediante enlaces glicosídicos � -(1-4). En términos generales, se obtiene a partir de la quitina que está compuesta por subunidades de N-acetil-D-glucosamina y es uno de los componentes principales de las paredes celulares de los hongos y del exoesqueleto de los artrópodos (arácnidos, crustáceos, insectos). La poli-D-glucosamina que se encuentra disponible comercialmente se obtiene mediante hidrólisis alcalina de la quitina, lo que da lugar a la eliminación de los grupos acetilo de dicha molécula (desacetilación) dejando libres los grupos amino primarios. De esta forma, la desacetilación completa de la quitina da lugar a la obtención del homopolímero poli-D-glucosamina, representado en la figura inferior.

Los grupos amino primarios de los monómeros de D-glucosamina son capaces de protonarse en medio ácido, lo que le confiere a este polisacárido su carácter catiónico y en consecuencia sus características especiales de hidrosolubilidad y bioadhesión. Por otro lado, se trata de un material de indudable interés en el campo farmacéutico y cosmético, por ser biocompatible y biodegradable, cuyos productos de degradación no son tóxicos (Fini A, Orienti I. The role of chitosan in drug delivery. Am J Drug Deliv 2003;1:43).

En el contexto de la presente invención, se puede emplear derivados de poli-D-glucosamina que presenten diferentes grados de acetilación (porcentaje de subunidades de D-glucosamina acetiladas), como son los quitosanos. Estos derivados se pueden conseguir mediante la modulación de la reacción de desacetilación de la quitina, de forma que se pueden dejar libres en mayor o menor medida los grupos amino primarios. Otro procedimiento descrito en la literatura se refiere a reacciones de reacetilación de la molécula de poli-D-glucosamina (Lamarque G, Viton C, Domard A. Comparative study of the second and third heterogenous deacetylation of alphaand beta-chitins in a multistep process. Biomacromolecules 2004;5(5):1899).

Por otro lado, en el contexto de la presente invención, se puede emplear poli-D-glucosamina con un amplio intervalo de pesos moleculares, sin que este parámetro influya significativamente en la formación de las nanocápsulas.

El término poli-D-glucosamina tal y como se utiliza en la presente descripción incluye este polisacárido como base o como sal ácida, ésta última formada normalmente por ácidos inorgánicos u orgánicos como el ácido clorhídrico, ácido láctico, ácido cítrico ó ácido ascórbico. En una realización preferida de la invención, la sal ácida utilizada es el clorhidrato.

Componente oleoso de características inmunoestimulantes

El empleo de aceites con características inmunoestimulantes es crítico en los sistemas de la presente invención ya que se liberan de forma simultánea a los antígenos asociados y se consigue un efecto sinérgico sobre las células diana, en este caso células del sistema inmunitario.

Por el término “componente oleoso de características inmunoestimulantes” se entiende cualquier aceite, es decir, líquido graso de diversos orígenes que no se disuelve en el agua y que tiene menor densidad que ésta, caracterizado por presentar propiedades estimulantes sobre las células del sistema inmunitario. Dicho componente oleoso de características inmunoestimulantes se selecciona de entre el grupo consistente en vitaminas liposolubles, aceites minerales derivados de parafina e isoterpenos. En una realización particular, la vitamina liposoluble es ácido retinoico (vitamina A) ó alfa-tocoferol (vitamina E). En una realización particular, el isoterpeno se selecciona entre escualeno y escualano. En una realización particular de la invención, el aceite es escualeno.

El escualeno es un hidrocarburo poliinsaturado de la familia de los isoterpenos o isoprenoides, cuya estructura se puede observar en la siguiente figura:

Se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza ya que todos los organismos complejos producen escualeno, incluido los humanos. Se trata del precursor inicial en la ruta de síntesis de colesterol. Para su uso comercial se extrae principalmente del aceite de hígado del tiburón, aunque también puede tener origen vegetal por ejemplo obtenido a partir de aceite de oliva y hojas de olivo, aceite de germen de trigo o aceite arroz.

En una realización particular, el sistema de la invención comprende nanocápsulas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que comprenden poli-D-glucosamina, al menos un tensioactivo aniónico, un isoterpeno y al menos un antígeno. En una realización particular, la poli-D-glucosamina está marcada.

Tensioactivo aniónico

Se entiende como “tensioactivo aniónico” cualquier molécula compuesta de una parte hidrófoba y un resto hidrófilo, que presenta carga neta negativa por ionización de dicho grupo molecular hidrófilo. Estas moléculas presentan, por tanto, propiedades anfifílicas, lo que hace que en una mezcla agua/aceite, éstas migren hacia la superficie entre el agua y la fase oleosa. Así, la cabeza hidrofílica se mantiene en la fase acuosa y la cola hidrófoba interacciona con el aceite alterando las propiedades superficiales de la interfaz agua/aceite y permitiendo la formación de una emulsión, así como su estabilización.

En una realización particular, el tensioactivo aniónico es un compuesto fosfolipídico. Los fosfolípidos son un tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo fosfato. El fosfato se une mediante un enlace fosfodiéster a otro grupo de átomos como colina, serina o etanolamina y que habitualmente poseen una carga eléctrica. En una realización particular el compuesto fosfolipídico es lecitina. La lecitina se conoce como una mezcla de distintos fosfolípidos en diversas proporciones. El fosfolípido mayoritario en la lecitina es la fosfatidilcolina, aunque también contiene otros fosfolípidos como la fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol y lisofosfatidilcolina, representados en la figura inferior. La proporción de los diferentes fosfolípidos en la composición de la lecitina depende principalmente de la fuente de obtención, así como del proceso de purificación y separación de los compuestos. Así, la lecitina puede tener un origen animal si se extrae por ejemplo de la yema del huevo, aunque lo más habitual es que el origen sea vegetal, siendo la principal fuente las judías de la planta de soja. Otras fuentes de obtención de lecitinas vegetales son también otras semillas oleosas

como las de colza, girasol y maíz. Además, existen también fosfolípidos obtenidos mediante síntesis química. En una realización particular de la invención, el origen de la lecitina utilizada es la planta de la soja.

Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina Fosfatidilinositol Lisofosfatidilcolina

En una realización particular, el sistema de la invención comprende nanocápsulas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que comprenden poli-D-glucosamina, lecitina, un isoterpeno y al menos un antígeno. En una realización particular, la poli-D-glucosamina está marcada.

Antígeno

Los sistemas de la invención permiten la liberación del antígeno simultáneamente a los componentes inmunoestimulantes o inmunomoduladores que conforman el núcleo oleoso, con la finalidad de ejercer un efecto sinérgico sobre las células diana, en este caso células del sistema inmunitario.

Por el término “antígeno”, se entiende cualquier macromolécula de naturaleza proteica, polisacarídica, lipídica o formada por combinaciones de éstas, que forma parte de componentes estructurales de microorganismos patógenos y que son capaces de generar una respuesta inmune adaptada una vez administrados, para dar lugar a una protección inmunológica frente a dicho patógeno.

En una realización particular, el antígeno es un antígeno de origen viral. En otra realización particular, el antígeno de origen viral se selecciona de entre el grupo consistente en las subunidades características del virus de la hepatitis A, B, C ó E, virus del papiloma humano, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (por ejemplo, proteínas gp120, gp41, gp36, p24), virus de la influenza (por ejemplo, proteínas HA, NP, NA, ó M), citomegalovirus, virus del herpes simple, SARS coronavirus, rotavirus, virus sincicial respiratorio, virus de parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubeola, virus de Epstein-Barr, virus del dengue y virus de la varicela Zoster. En una realización particular, el antígeno seleccionado es una subunidad del virus de la hepatitis B. En una realización más particular es el antígeno recombinante de superficie de la hepatitis B (rHBsAg).

La proporción de antígeno asociado a las nanocápsulas puede ser de hasta el 95% con respecto al peso total del polisacárido catiónico. Aunque, la proporción de antígeno se podrá adecuar a las necesidades del caso particular y teniendo en cuenta la dosis que se precise administrar. En una realización particular, la proporción del antígeno se encuentra entre el 1 y el 50% en peso con respecto al polisacárido. En una realización particular, la proporción del antígeno se encuentra entre el 1 y el 25% en peso con respecto al polisacárido.

Molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras

El sistema de la presente invención, compuesto por un núcleo hidrofóbico y una cubierta hidrofílica, permite la incorporación de ingredientes adicionales que contribuyen a potenciar o modular la respuesta inmune. De este modo, además del efecto propio del componente oleoso con propiedades inmunoestimulantes que conforma el núcleo de las nanocápsulas, es posible incorporar un agente inmunoestimulante o inmunomodulador en el núcleo, de forma que se consigue una liberación simultánea con el antígeno asociado a la superficie del mismo vehículo en las células del sistema inmune, sobre las cuales se va ejercer la acción terapéutica. Con esta estrategia se genera un efecto sinérgico de los componentes con propiedades inmunoestimulantes o inmunomoduladores que forman las

nanocápsulas una vez capturadas por las células inmunocompetentes, y se potencia y/o modula la respuesta inmune específica frente al antígeno asociado.

Así, en una realización particular, los sistemas de la invención descritos previamente comprenden adicionalmente una molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes o inmunomoduladores.

Por “molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras” se entiende cualquier molécula, con actividad terapéutica reconocida, capaz de ejercer una acción estimuladora, moduladora o ambas sobre las células del sistema inmunitario y por tanto capaz de inducir, potenciar o modular una respuesta inmune específica frente al antígeno que acompañan.

En una realización particular, dicha molécula bioactiva es de carácter hidrofóbico. Esta molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras puede ser de alto o bajo peso molecular y presenta como característica específica una estructura química que le confiera carácter hidrofóbico, para poder ser incluido en el núcleo oleoso de las nanocápsulas y así favorecer su liberación simultáneamente con el antígeno seleccionado. En una realización particular, la molécula bioactiva se selecciona de entre el grupo consistente en un compuesto lipopolisacárido (LPS), monofosforil lípido A, imidazoquinolinas, saponinas, muramil-dipeptidos (MDP) y lipopéptidos. En una realización particular, las imidazoquinolinas son resiquimod, gardiquimod o imiquimod. En una realización particular, la saponina es quilaja A o QS21. En una realización particular, el lipopéptido es Pam3Cys.

En una realización particular, la molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras es el imiquimod, cuya fórmula se representa en la figura inferior.

El imiquimod pertenece al grupo de las imidazoquinolinas y actúa como agente estimulante y modulador de las células del sistema inmune innato por acción agonista directa sobre el receptor intracelular TLR 7 (Toll-like receptor 7), el cual se encuentra asociado a la membrana de endosomas presentes en el citoplasma de las células del sistema inmunitario. Por tanto, la activación de dicho receptor por el imiquimod permite amplificar y modular la respuesta inmune específica frente al antígeno que acompaña (Stanley MA. Imiquimod and the imidazoquinolones: mechanism of action and therapeutic potential. Clin Exp Dermatol 2002;27:571).

En una realización particular, el sistema de la invención comprende nanocápsulas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que comprenden poli-D-glucosamina, lecitina, un isoterpeno, imiquimod y al menos un antígeno. En una realización particular, la poli-D-glucosamina está marcada. En otra realización particular, el antígeno es un antígeno subunidad característico del virus de la hepatitis B.

En otra realización particular, el sistema de nanocápsulas de la presente invención comprende, adicionalmente al menos un polímero catiónico no sacarídico.

En otra realización particular, el sistema de nanocápsulas de la presente invención comprende, adicionalmente, al menos un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de dichas nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo. En una realización particular, dicho compuesto se selecciona de entre el grupo consistente en un marcador, un agente de seguimiento y un agente de tinción. Son ejemplos de estos compuestos la rodamina B, rodamina 6G, DiD o DiR, que puede incorporarse al sistema disuelto en el núcleo oleoso, o unirse covalentemente al polisacárido catiónico y por tanto a la superficie de la nanocápsula, como por ejemplo la trimetilrodamina ó el Alexa Fluor® succiminidil ésteres.

Todos los compuestos que pueden ser asociados al sistema de nanocápsulas polisacarídicas de la invención mencionados anteriormente, se pueden adicionar a la fase orgánica o a la fase acuosa previamente a la formación de las mismas, o bien pueden ser adicionados a las nanocápsulas una vez formadas.

Las composiciones farmacéuticas según la invención, incluyen cualquier composición líquida (es decir, suspensión o dispersión de las nanocápsulas de la invención) para aplicación por vía oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal, pulmonar, ótica, vaginal, intrauterina, rectal, entérica o parenteral, o cualquier composición en forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su administración por vía tópica, ocular, nasal, vaginal o rectal.

En una realización particular, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral ó vía mucosa. En una realización particular la composición farmacéutica se administra por vía nasal.

El procedimiento para preparar los nanosistemas de la invención tiene la ventaja de emplear técnicas sencillas, fácilmente escalables y que permiten la manufacturación en condiciones estériles.

Así en otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un sistema de nanocápsulas polisacarídicas como se ha definido previamente, que comprende:

a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico;

b) preparar una solución orgánica de al menos un componente oleoso de características inmunoestimulantes y al menos un tensioactivo aniónico;

c) mezclar bajo agitación magnética las soluciones formadas en a) y b) con la formación espontánea de las nanocápsulas;

d) incubar el antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas.

Alternativamente, una variante del procedimiento para la preparación de un sistema de nanocápsulas polisacarídicas como se ha definido anteriormente, comprende:

a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico;

c) mezclar la disolución b) bajo agitación con una solución acuosa;

d) incubar la mezcla obtenida en c) con la solución a);

e) incubar al menos un antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas.

En una realización particular el polisacárido catiónico se ha marcado previamente con un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo. En otra realización particular, el polisacárido catiónico marcado es una poliglucosamina marcada.

La incorporación del polisacárido catiónico se lleva a cabo mediante la disolución acuosa del mismo a una concentración entre 0,1 y 2 mg/mL, más preferiblemente entre 0,1 y 1 mg/mL, y aún más preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mg/mL.

De acuerdo con otra realización particular, el tensioactivo aniónico se disuelve en un solvente orgánico a una concentración de entre 2 y 8 mg/mL, preferiblemente entre 4 y 6 mg/mL.

En otra realización particular, en la misma fase orgánica donde se encuentra el tensioactivo aniónico se disuelve el componente oleoso con propiedades inmunoestimulantes a una concentración entre 2 y 25 mg/mL, preferiblemente entre 10 y 25 mg/mL.

En una realización particular, el tensioactivo aniónico puede estar formando parte en una mezcla con tensioactivos neutros. El uso opcional de tensioactivos neutros se puede utilizar con fines estabilizadores del sistema o para mejorar la solubilidad de moléculas hidrofóbicas que se pudiesen incluir en el núcleo oleoso de las nanocápsulas.

La formación de las nanocápsulas polisacarídicas objeto de la presente invención es consecuencia de un proceso controlado de emulsificación de los componentes oleosos y el tensioactivo aniónico que se produce por difusión del disolvente orgánico de la fase orgánica a la fase acuosa. Este proceso da lugar a la formación de gotículas del componente oleoso de tamaño nanométrico, estabilizadas por el tensioactivo aniónico, o mezcla de tensioactivos (nanoemulsión primaria). Al mismo tiempo, se produce una interacción electrostática entre el tensioactivo aniónico dispuesto en la superficie de las gotículas de la nanoemulsión primaria con el polisacárido catiónico disuelto en la fase acuosa, y que pasa a recubrir la superficie de la misma. Fruto de dicho proceso controlado, denominado desplazamiento del disolvente, se obtienen las nanocápsulas polisacarídicas de tamaño y carga superficial predeterminados, homogéneos, ajustables y reproducibles, con independencia de que se asocie o no antígeno alguno.

El antígeno se asocia a las nanocápsulas mediante interacción electrostática con el polisacárido catiónico que forma la cubierta polimérica de las nanocápsulas. Se adiciona en una etapa posterior a la formación de las nanocápsulas mediante incubación conjunta de una solución del antígeno con la suspensión acuosa de las nanocápsulas. En una realización particular, la relación en masa entre el polisacárido catiónico y el antígeno es entre 1:0.01 y 1:0.35, preferiblemente entre 1:0.025 y 1:0.25.

En el caso de la incorporación de moléculas hidrofóbicas al núcleo oleoso de las nanocápsulas, como pueden ser la molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras, o el compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo, éstos se disuelven en la solución orgánica previamente a la formación de las nanocápsulas. Así, en una realización particular, el procedimiento descrito previamente comprende adicionalmente la adición de una molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras y/o un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo, en la solución orgánica b).

La proporción de estas moléculas en el sistema dependerá de la solubilidad de cada molécula en la solución orgánica, así como de la dosis a administrar en el caso de las moléculas bioactivas con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras, ó de la intensidad de fluorescencia que se pretenda conseguir en el caso de los marcadores fluorescentes. En una realización particular la proporción en peso de la molécula bioactiva o del compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas con respecto al polisacárido catiónico se encuentra entre el 0,5 y el 50%.

El procedimiento de elaboración de las nanocápsulas mencionadas puede incluir una etapa adicional de liofilización, con el fin de preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los volúmenes de producto que van a manipularse. En una realización particular, el procedimiento descrito previamente comprende adicionalmente una etapa después de la etapa c) ó d) en la que las nanocápsulas se someten a un proceso de liofilización.

Para la liofilización de las nanocápsulas puede ser únicamente necesaria la adición de pequeñas cantidades de azúcares tales como glucosa, sacarosa o trehalosa a una concentración que oscila desde un 1 hasta un 20% u otras moléculas que actúen como crioprotectores y/o lioprotectores. Las nanocápsulas de la invención tienen la ventaja adicional de que el tamaño de partícula antes y después de la liofilización no se modifica de manera significativa una vez regeneradas. El proceso puede adicionalmente comprender una etapa de regeneración de las nanocápsulas liofilizadas. El proceso de regeneración del producto liofilizado consiste en la adición de una solución acuosa para dar lugar de nuevo a la suspensión original de nanocápsulas. Por tanto, las nanocápsulas tienen la ventaja de que pueden liofilizarse y resuspenderse sin ninguna alteración en las características de las mismas.

Debido al elevado potencial de los sistemas coloidales de la presente invención en el campo biomédico, dichos sistemas resultan adecuados para su uso en la formulación de vacunas que prevengan de enfermedades infecciosas en seres humanos y animales con el fin de modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción de inducción y potenciación inmunológica directa que dé lugar a la generación de protección inmune específica frente a microorganismos patógenos causantes de la enfermedad, así como la modulación de dicha respuesta para generar una respuesta adecuada frente a cada patógeno.

En una realización particular, los sistemas de la invención resultan ser adecuados para generar una respuesta inmune específica in vivo frente al antígeno asociado, así como la capacidad para estimular de forma directa células humanas/animales del sistema inmunitario in vitro o ex vivo. En consecuencia, el sistema de nanocápsulas polisacarídicas de la invención resulta útil en la preparación de un medicamento destinado a la prevención de enfermedades infecciosas mediante la vacunación.

A continuación, para una mayor comprensión de las características y ventajas de la presente invención, se hará referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa completen la descripción anterior, sin suponer en modo alguno que ésta se vea limitada a los mismos.

Ejemplos

Como procedimiento común a los ejemplos detallados a continuación, se han caracterizado las nanocápsulas polisacarídicas desde el punto de vista del tamaño, el potencial (o carga superficial), la morfología y la eficacia de asociación.

Durante la exposición de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes técnicas:

El tamaño de partícula ha sido determinado mediante la técnica de espectroscopía de correlación fotónica (PCS) y haciendo uso, para ello, de un ZetaSizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) obteniendo el tamaño medio de la población y el índice de polidispersión de la misma. Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en agua Milli-Q.

El potencial de las nanocápsulas ha sido determinado mediante la técnica de anemometría por dispersión de láser (LDA) haciendo uso para ello, de un ZetaSizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK). Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en una solución 10 milimolar de KCl.

Para los estudios in vivo de la eficacia de los sistemas de nanocápsulas polisacarídicas para inducir una respuesta inmune específica frente a rHBsAg se han utilizado ratones BALB/c. Grupos de 10 ratones se han inmunizado por vía intramuscular e intranasal con 10Ig de rHBsAg asociado a las nanoestructuras, siguiendo diferentes pautas de inmunización. A continuación, se ha realizado una monitorización de los niveles de IgG totales específicos frente a rHBsAg con intervalos de muestreo de 1 mes y una duración total de 6 meses. En todos los estudios se utiliza como

control positivo el rHBsAg adsorbido a hidróxido de aluminio (álum, Sigma-Aldrich, España), que es el adyuvante presente en la vacuna comercial, el cual se administra intramuscularmente en dos dosis de 10Ig separadas 4 semanas. Los animales se han mantenido en condiciones de temperatura constante (220C) con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad y dieta estándar.

La cuantificación de anti-rHBsAg IgG sérico se realiza mediante ELISA. En este caso se utilizan placas Maxisorb (Nunc, Dinamarca) que se recubren con el rHBsAg. Una vez añadidas las diluciones seriadas del suero, se añade el anticuerpo secundario frente a IgG de ratón y conjugado con peroxidasa (Southern Biotech, USA). El revelado se realiza con ABTS (Sigma-Aldrich, España) y los títulos de anticuerpos se transforman a mIU/mL gracias a una recta de calibrado que se hace de forma paralela con anticuerpos de conejo frente a HBsAg (Biokit, España) a concentraciones conocidas y posteriormente reconocidos por anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (Southern Biotech, USA).

Los siguientes materiales tal y como se utilizan en los siguientes ejemplos, fueron adquiridos a diferentes casas comerciales: Poly-D-glucosamina de diversos pesos moleculares y grados de acetilación (Biosyntech, Canadá y Pronova, Dinamarca), escualeno (Merck, Alemania), lecitina Epikuron 145V (Cargill, España), imiquimod (InVivoGen, USA), rodamina-6G (Sigma-Aldrich, España), tetrametilrodamina y Alexa Fluor 750 succiminidil ésteres (InvitroGen, USA), rHBsAg (Shantha Biotech, India).

Ejemplo 1: Preparación de nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno y diferentes cubiertas poliméricas.

Se prepararon nanocápsulas polisacarídicas con un núcleo de escualeno según el procedimiento de desplazamiento del disolvente. De este modo se han formado las nanocápsulas polisacarídicas utilizando dos tipos de poli-Dglucosamina (polisacárido catiónico) de diferente peso molecular (Pm) y grado de acetilación (GA), descritos la tabla

1.

Tabla 1: Características de los polisacáridos catiónicos (poli-D-glucosamina) utilizados para la obtención de nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno.

Polisacárido (abreviatura): Pm (kDa) GA (%) Forma Fabricante

Poli-D-glucosamina (GL): 276 4 Base Biosyntech Canada

Quitosano (CS): 125 14 Sal clorhidrato Pronova

Para ello se preparó una solución acuosa donde el polisácarido se encuentra disuelto a una concentración de 0.025 ó 0.05%, para GL ó CS respectivamente. En el caso del primero, se utiliza una solución acuosa al 0.05% de ácido acético para su disolución. El segundo, al encontrarse en forma de sal clorhidrato, se disuelve en agua Milli-Q.

Por otro lado, se prepara una fase orgánica donde, la lecitina se disuelve en propanol a una concentración de 120 mg/mL ó 80 mg/mL en función de la cubierta polimérica (para GL ó CS respectivamente). En esta solución orgánica se co-disuelve el escualeno a una proporción del 25% con respecto al volumen de propanol. Finalmente la fase orgánica se completa con acetona de forma que el volumen de la mezcla propanol:escualeno representa el 6.25% en el total de la misma. La fase orgánica se añade sobre la fase acuosa bajo agitación magnética formándose espontáneamente las nanocápulas polisacarídicas. Se mantiene la agitación durante 5-10 minutos y seguidamente se procede a la evaporación de los solventes orgánicos a vacío hasta conseguir una concentración final del polisacárido que forma parte de las nanocápsulas de 1mg/mL.

Las relaciones entre el polisacárido y el tensioactivo aniónico (lecitina) se muestran en la tabla 2. Asimismo, dicha tabla muestra el diámetro medio, índice de polidispersión (PdI) y carga eléctrica superficial (potencial �) de los sistemas obtenidos. La morfología de las nanocápsulas vista en microscopio electrónico se muestra en la figura 1 donde se puede apreciar que presentan una forma esférica y poblaciones homonogéneas.

Tabla 2. Características físico-químicas de nanocápsulas polisacarídicas (NC) elaboradas a partir de dos tipos de poli-D-glucosamina (GL ó CS).

Polisacárido:lecitina (p:p): Tamaño (nm) PdI Potencial � (m))

GLNC: 1:12 172 ± 3 0.16 ± 0.03 +66 ± 1

CSNC: 1:4 199±2 0.15 ± 0.02 +40 ± 2

Ejemplo 2: Encapsulación de imiquimod en el núcleo de escualeno de las nanocápsulas polisacarídicas.

Se prepararon nanocápsulas polisacarídicas en cuyo núcleo de escualeno se ha encapsulado una molécula bioactiva con propiedades farmacológicas probadas inmunoestimulantes e inmunomoduladoras (imiquimod). El imiquimod se adiciona a la preparación de nanocápsulas polisacarídicas a diversas proporciones con respecto al peso total de los componentes del sistema (indicado en tabla 3). Así, se prepararon nanocápsulas a partir de ambos polisacáridos con diferente grado de desacetilación y peso molecular (tabla 1).

Para ello se preparó una solución acuosa donde el polisacárido se encuentra disuelto a una concentración de 0.025 ó 0.05%, para GL ó CS respectivamente. En el caso del primero, se utiliza una solución acuosa al 0.05% de ácido acético para su disolución. El segundo, al encontrarse en forma de sal clorhidrato, se disuelve en agua Milli-Q.

Para lograr la encapsulación del imiquimod, de carácter altamente hidrofóbico, se disuelve previamente en el aceite (escualeno) a una concentración de 20 mg/mL. Por otro lado, la lecitina se disuelve en propanol a una concentración de 120 mg/mL ó 80 mg/mL en función de la cubierta de cada formulación (para GL ó CS respectivamente). En esta solución orgánica se co-disuelve la solución oleosa de escualeno e imiquimod a una proporción del 25% con respecto al volumen de propanol. Finalmente la fase orgánica se completa con acetona de forma que el volumen de la mezcla propanol:escualeno representa el 6.25% en el total de la misma. La fase orgánica se añade sobre la fase acuosa bajo agitación magnética formándose espontáneamente las nanocápulas polisacarídicas. Se mantiene la agitación durante 5-10 minutos y seguidamente se procede a la evaporación de los solventes orgánicos a vacío hasta conseguir una concentración final del polisacárido que forma parte de las nanocápsulas de 1mg/mL.

La eficacia de encapsulación del imiquimod se ha determinado de forma indirecta mediante la cuantificación de la molécula libre mediante HPLC (Agilent, USA) tras el aislamiento de las nanocápsulas por ultracentrifugación (42800xg, 1 hora, 15ºC; Beckman-Coulter, UK).

En la tabla 3 se muestran además el diámetro medio, índice de polidispersión (PdI) y carga eléctrica superficial (potencial �) de los sistemas obtenidos con diferentes cubiertas polisacarídicas, así como el porcentaje de imiquimod encapsulado en cada sistema.

Tabla 3: Características físico-químicas de nanocápsulas polisacarídicas elaboradas a partir de dos tipos de poli-Dglucosamina encapsulando imiquimod.

Tamaño

Carga teórica (%): PdI Potencial (m)) E.E.* (%)

(nm)

IMQ GLNC: 1.43 198 ± 5 0.07 ± 0.01 +63 ± 1 40

IMQ CSNC: 1.85 196 ± 8 0.15 ± 0.02 +42 ± 4 70

*E.E.: eficacia de encapsulación

Ejemplo 3: Encapsulación de Rodamina-6G en el núcleo de escualeno de las nanocápsulas polisacarídicas.

Se prepararon nanocápsulas polisacarídicas fluorescentes con cubierta de poli-D-glucosamina (GL – tabla 1) y núcleo oleoso de escualeno. Para este fin se ha encapsulado un marcador fluorescente de carácter hidrofóbico, la rodamina-6G, en el núcleo oleoso de las mismas.

Para ello se preparó una solución acuosa donde el polisacárido se encuentra disuelto a una concentración de 0.025% en una solución acuosa al 0.05% de ácido acético para su disolución.

Para lograr la encapsulación de la rodamina-6G, de carácter altamente hidrofóbico, se disuelve previamente en el aceite (escualeno) a una concentración de 0.25 mg/mL. Por otro lado, la lecitina se disuelve en propanol a una concentración de 120 mg/mL. En esta solución orgánica se co-disuelve la solución oleosa de escualeno y rodamina6G a una proporción del 25% con respecto al volumen de propanol. Finalmente la fase orgánica se completa con acetona de forma que el volumen de la mezcla propanol:escualeno representa el 6.25% en el total de la misma. La fase orgánica se añade sobre la fase acuosa bajo agitación magnética formándose espontáneamente las nanocápulas polisacarídicas. Se mantiene la agitación durante 5-10 minutos y seguidamente se procede a la evaporación de los solventes orgánicos a vacío hasta conseguir una concentración final del polisacárido que forma parte de las nanocápsulas de 1mg/mL.

La eficacia de encapsulación de la rodamina se ha determinado de forma indirecta mediante la cuantificación de la etiqueta fluorescente libre mediante fluoroespectroscopía (Aexc=480; Aem=555; Perkin-Elmer, USA) tras el aislamiento de las nanocápsulas por ultracentrifugación (42800xg, 1 hora, 15ºC; Beckman-Coulter, UK).

El diámetro medio de las nanocápsulas obtenidas fue de 190 ± 2 nm (índice de polidispersión de 0.14) y su carga eléctrica superficial (potencial �) de +60 ± 2 mV con un porcentaje de asociación de la rodamina-6G de 82.5 ± 1.7%.

Ejemplo 4: Preparación de nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno formadas a partir de un polisacárido catiónico marcado con una sonda fluorescente.

Se prepararon nanocápsulas polisacarídicas fluorescentes con cubierta de poli-D-glucosamina (GL – tabla 1), previamente marcada con una sonda fluorescente, y nucleo oleoso de escualeno. Para ello se han utilizado la tetrametilrodamina (TAMRA) (A exc=540; A em= 580) y el Alexa Fluor 750 (A exc=749; A em= 775) succiminidil ésteres.

Para el marcaje del polisacárido con cualquiera de estos dos marcadores fluorescentes, éste se disuelve en una solución acuosa de ácido acético 0.01% a 2 mg/mL. Sobre esta solución se añaden, bajo agitación magnética, 30Il de una solución de TAMRA ó Alexa Fluor 750 succiminidil éster en DMSO (10 mg/mL) y se deja reaccionar durante 15 minutos. La solución resultante se dializa en agua (Slide-A-Lyzer Dyalisis Cassettes, Thermo Scientific, USA) durante 24 horas. El grado de marcaje de la poli-D-glucosamina con TAMRA y Alexa Fluor 750 succiminidil éster se ha realizado mediante espectrometría UV (A=280) (Beckman-Coulter, UK), según especificaciones del fabricante.

Finalmente, la poli-D-glucosamina marcada con TAMRA ó Alexa Fluor 750 se utiliza para la elaboración de las nanocápsulas polisacarídicas, para lo cual se diluye con agua Milli-Q a una concentración de 0.025%. Por otro lado, se prepara una fase orgánica donde la lecitina se disuelve en propanol a una concentración de 120 mg/mL. En esta solución orgánica se co-disuelve el escualeno a una proporción del 25% con respecto al volumen de propanol. Finalmente la fase orgánica se completa con acetona de forma que el volumen de la mezcla propanol:escualeno representa el 6.25% en el total de la misma. La fase orgánica se añade sobre la fase acuosa bajo agitación magnética formándose espontáneamente las nanocápulas polisacarídicas. Se mantiene la agitación durante 5-10 minutos y seguidamente se procede a la evaporación de los solventes orgánicos a vacío hasta conseguir una concentración final del polisacárido que forma parte de las nanocápsulas de 1mg/mL.

En la tabla 4 se muestran además el diámetro medio, índice de polidispersión (PdI) y carga eléctrica superficial (potencial �) de los sistemas obtenidos con ambos marcadores fluorescentes.

Tabla 4: Características físico-químicas de nanocápsulas polisacarídicas fluorescentes elaboradas a partir de poli-Dglucosamina previamente marcada con tetrametilrodamina (TAMRA) ó Alexa Fluor 750 succiminidil ésteres.

Tamaño (nm): PdI Potencial (m))

TAMRA-GLNC: 215 ± 2 0.21 ± 0.01 + 56 ± 1

Alexa Fluor 750-GLNC: 222 ± 1 0.17 ± 0.01 + 57 ± 1

Ejemplo 5: Las nanocápsulas polisacarídicas forman un depot en el lugar de inyección.

Se ha estudiado el tiempo de residencia en el lugar de inyección de las nanocápsulas de poli-D-glucosamina marcada con Alexa Fluor 750. Para ello, se ha utilizado la técnica de adquisición de imágenes de fluorescencia in vivo, (IVIS Xenogen, USA) realizando un seguimiento a tiempo real de las nanocápsulas fluorescentes una vez administradas a ratones BALB/c por vía intramuscular.

Como podemos apreciar en la figura 2, las nanocápsulas permanecen en el lugar de inyección durante al menos 5 horas tras la inyección de una dosis de 60Ig de poli-D-glucosamina marcada formando parte de la cubierta de las nanocápsulas polisacarídicas.

Ejemplo 6: Asociación del antígeno recombinante de superficie de la hepatitis B (rHBsAg) a la superficie polimérica de las nanocápsulas polisacarídicas.

Se han preparado nanocápsulas polisacarídicas capaces de asociar en su superficie el antígeno recombinante de superficie de la hepatitis B (rHBsAg). Para este fin, se han preparado las nanocápsulas polisacarídicas según los procedimientos descritos anteriormente (ejemplos 1 y 2) con diferentes composiciones en su núcleo oleoso (escualeno ó escualeno con imiquimod) ó cubierta polisacarídica (CS ó GL – tabla 1). El rHBsAg se añade posteriormente a la formación de las nanocápsulas mediante incubación a temperatura ambiente de la solución de antígeno (0.5 mg/mL) con la suspensión de la nanocápsulas previamente aisladas y resuspendidas en agua hasta una concentración del polisacárido constituyente de 1 mg/mL. De esta forma se consigue asociar el antígeno a una relación 1:0.25 de polisacárido:rHBsAg (p:p).

La eficacia de asociación del rHBsAg se determinó mediante cuantificación por ELISA tipo sandwich. Para ello, se utilizó un kit para la detección de dicho antígeno (HBsAg Version 3, Murex, UK). Para la correspondiente cuantificación, se prepara una recta de calibrado con concentraciones conocidas del antígeno utilizando como blanco las nanocápsulas blancas o el sobrenadante obtenido tras la centrifugación de las mismas en función del tipo de muestra que se analice. Se ha analizado tanto de forma indirecta cuantificando el antígeno libre tras el aislamiento de las nanocápsulas por ultracentrifugación (42800xg, 1 hora, 15ºC; Beckman Coulter, UK), así como el total liberado tras el tratamiento enzimático de las nanocápsulas con quitosanasa (US Biologicals, USA).

En la tabla 5 se muestran además el diámetro medio, índice de polidispersión (PdI) y carga eléctrica superficial (potencial �) de los sistemas obtenidos con las diferentes combinaciones de composici

ón del núcleo y la cubierta después de la incubación de los sistemas con el rHBsAg. La morfología de las nanocápsulas con rHBsAg vista en microscopio electrónico se muestra en la figura 3 donde se pueden apreciar que presentan una forma esférica y poblaciones homonogéneas.

Tabla 5: Características físico-químicas de nanocápsulas polisacarídicas que presentan diferente composición en su núcleo (solo escualeno; escualeno e imiquimod (IMQ)), con rHBsAg asociado a las diferentes cubiertas polisacarídicas (CS ó GL) con una relación polisacárido:rHBsAg 1:0.25 (p:p).

Composición: Tamaño (nm) PdI Potencial � (mV) E.A.* (%)

CSNC:rHBsAg: 211 ± 7 0,12 ± 0,03 +42 ± 11 77 ± 3

IMQ CSNC:rHBsAg: 191 ± 4 0,10 ± 0,02 +43 ± 5 75 ± 5

GLNC:rHBsAg: 230 ± 13 0,23 ± 0,02 +60 ± 3 72 ± 8

IMQ GLNC:rHBsAg: 299 ± 11 0,26 ± 0,04 +60 ± 4 78 ± 6

*E.A.: eficacia de asociación

Ejemplo 7: Elaboración de un producto liofilizado a partir de las nanocápsulas polisacarídicas blancas y con el antígeno recombinante de superficie de la hepatitis B (rHBsAg) asociado.

Con el objetivo de desarrollar una forma farmacéutica más estable, las nanocápsulas fueron liofilizadas. Para ello, se prepararon las nanocápsulas polisacarídicas con poli-D-glucosamina (GL – tabla 1) como cubierta y núcleo de escualeno, como se ha descrito previamente, así como la posterior asociación de rHBsAg a la superficie de las nanocápsulas preformadas.

Las suspensiones de nanopartículas polisacarídicas con o sin antígeno asociado fueron liofilizadas en presencia de diferentes concentraciones de trehalosa en función de la presencia de rHBsAg en la superficie de las nanoestructuras. De este modo, la liofilización se produce con una concentración final de trehalosa del 5 ó 20%, para nanocápsulas blancas ó para las que llevan asociado rHBsAg, respectivamente. Para ello, las suspensiones (1 mL) de nanocápsulas fueron sometidas a un proceso de congelación a -20oC y subsiguiente liofilización (Virtis Genesis freeze dryer, 25ES, Virtis, NY, USA). Tras la liofilización, los sistemas de nanocápsulas fueron regenerados sin dificultad mediante adición de 1 mL de agua Milli-Q, recuperando la suspensión acuosa de nanocápsulas y, a continuación, se determinó el tamaño medio de las nanopartículas. En la Figura 4 se muestra la conservación del tamaño de partícula tras la resuspensión en agua Milli-Q del polvo liofilizado elaborado a partir de las nanocápsulas con y sin antígeno asociado.

Ejemplo 8: Las nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno a las cuales se ha asociado rHBsAg en su superficie, son capaces de generar respuestas inmunológicas protectoras a largo plazo frente a hepatitis B cuando se administran por vía nasal.

Las nanocápsulas polisacarídicas a base de poli-D-glucosamina (GL – tabla 1) y núcleo de escualeno, a cuya superficie se ha asociado rHBsAg y previamente descritas en los ejemplos 1 y 6, han sido sometidas a evaluación biológica. Para ello se administraron a ratones BALB/c por vía nasal, 10 Ig de rHBsAg asociado a las nanocápsulas, en 2 ó 3 dosis separadas 4 semanas entre cada una. Para determinar la respuesta inmune generada tras la inmunización nasal se ha cuantificado la concentración de anticuerpos específicos (IgG) en sangre a los diferentes tiempos de muestreo tal y como se ha descrito previamente. La duración de la monitorización de los niveles plasmáticos de IgG se ha realizado durante 6 meses.

Como se puede apreciar en figura 5 tras la inmunización nasal con las nanocápsulas polisacarídicas se consiguen niveles seroprotectores de IgG frente a hepatitis B (>10 mIU/mL) (Shouval D. Hepatitis B vaccines. J Hepatol 2003;39: S70-76) prolongados en el tiempo. Sin embargo la concentración de anticuerpos específicos es mayor (>100 mIU/mL) cuando el esquema de inmunización es de 3 dosis de 10 Ig de rHBsAg asociado a las nanocápsulas.

Ejemplo 9: La modificación de la composición del núcleo oleoso de las nanocápsulas polisacarídicas permite la modulación en la cinética de la respuesta inmune específica generada tras la administración intramuscular de los sistemas a los cuales se ha asociado rHBsAg en su superficie.

Se ha evaluado la capacidad adyuvante de las nanocápsulas polisacarídicas a base de poli-D-glucosamina (GL – tabla 1) con núcleos oleosos de diferentes composiciones (escualeno ó escualeno+imiquimod), a cuya superficie se ha asociado rHBsAg, previamente descritas en el ejemplo 6.

Para ello se administraron 10 Ig de rHBsAg asociado a las nanocápsulas a ratones BALB/c en 2 dosis separadas 4 semanas. Como control positivo se utilizó la vacuna comercial (rHBsAg-álum), administrada siguiendo el mismo esquema de inmunización que para las nanocápsulas. Para determinar la respuesta inmune generada tras la inmunización se ha cuantificado la concentración de anticuerpos específicos (IgG) en sangre a los diferentes tiempos de muestreo tal y como se ha descrito previamente. La duración de la monitorización de los niveles plasmáticos de IgG se ha realizado durante 6 meses.

Como se puede apreciar en figura 6 tras la segunda inmunización por vía intramuscular las nanocápsulas presentan un evidente efecto adyuvante, generando niveles plasmáticos de IgG mayores que los conseguidos con el adyuvante comercial (álum) a la misma dosis, independientemente de la composición de las nanocápsulas. Por otro lado, se observa que las nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno dan lugar a una respuesta inmune intensa a tiempos más largos (GLNC). La inclusión del imiquimod (IMQ-GLNC) en el núcleo oleoso da lugar a la inducción de una respuesta específica más temprana que mantiene niveles elevados de anticuerpos en el tiempo.

Ejemplo 10: Las nanocápsulas polisacarídicas son capaces de generar niveles seroprotectores frente a la hepatitis B que se prolongan durante largos períodos de tiempo cuando se administran en una dosis única por vía intramuscular.

Se ha evaluado la capacidad para generar respuestas inmunes prolongadas tras una única administración intramuscular de las nanocápsulas polisacarídicas a base de poli-D-glucosamina (GL – tabla 1) con núcleos oleosos de diferentes composiciones (escualeno ó escualeno+imiquimod), a cuya superficie se ha asociado rHBsAg, previamente descritas en el ejemplo 6.

Para ello se administraron a ratones BALB/c, 10 Ig de rHBsAg asociado a las nanoc

ápsulas en una dosis única. Como control positivo se utilizó la vacuna comercial (rHBsAg-alum) administrada en dos dosis de 10 Ig separadas 4 semanas. Para determinar la respuesta inmune generada tras la inmunización se ha cuantificado la concentración de anticuerpos específicos (IgG) en sangre a los diferentes tiempos de muestreo tal y como se ha descrito previamente. La duración de la monitorización de los niveles plasmáticos de IgG se ha realizado durante 6 meses.

Como se puede apreciar en figura 7, las nanocápsulas polisacarídicas son capaces de generar niveles seroprotectores (>10 mIU/mL) de anticuerpos específicos frente a hepatitis B. Además, la respuesta inmune específica generada tras una dosis única con las nanocápsulas polisacarídicas se mantiene en niveles altos de IgG durante un largo período de tiempo (6 meses) independientemente de la composición del núcleo oleoso, no siendo estos niveles significativamente diferentes a aquellos generados por la vacuna comercial administrada en dos dosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un sistema para la administración de antígenos que comprende nanocápsulas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que comprenden: a) al menos un polisacárido catiónico; b) al menos un componente oleoso de características inmunoestimulantes; c) al menos un tensioactivo aniónico; y

d) al menos un antígeno; caracterizadas por presentar una estructura tipo reservorio, donde el núcleo está compuesto por componentes lipídicos y está recubierto por al menos un polisacárido catiónico.
2.

Sistema según la reivindicación 1, donde el polisacárido catiónico se selecciona de entre el grupo consistente en policationes de dextrano, poliglucosaminas o polisacáridos cationizados.
3.

Sistema según la reivindicación 2, donde el polisacárido catiónico es la poli-D-glucosamina, sus sales, fragmentos, derivados o derivados marcados.
4.

Sistema según la reivindicación 1, donde el componente oleoso de características inmunoestimulantes se selecciona de entre el grupo consistente en vitaminas liposolubles, aceites minerales derivados de parafina e isoterpenos.
5.

Sistema según la reivindicación 4, donde el componente oleoso es un isoterpeno.
6.

Sistema según la reivindicación 1, donde el tensioactivo aniónico es un fosfolípido.
7.

Sistema según reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente otros tensioactivos de tipo neutro.
8.

Sistema según la reivindicación 1, donde el antígeno es un antígeno de origen viral.
9.

Sistema según reivindicación 8, donde el antígeno de origen viral se selecciona de entre el grupo consistente en antígenos subunidad característicos de virus de la hepatitis A, B, C ó E, virus del papiloma humano, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1, virus de la influenza, citomegalovirus, virus del herpes simple, SARS coronavirus, rotavirus, virus sincicial respiratorio, virus de parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubeola, virus de Epstein-Barr, virus del dengue, virus de la varicela Zoster.
10.

Sistema según reivindicación 9, donde el antígeno es un antígeno subunidad característico del virus de la hepatitis B.
11.

Sistema según las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende una molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes o inmunomoduladoras.
12.

Sistema según reivindicación 11, donde la molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes o inmunomoduladoras es de carácter hidrofóbico.
13.

Sistema según las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende al menos un polímero catiónico no sacarídico.
14.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende al menos un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo.
15.

Sistema según la reivindicación 14, donde el compuesto se selecciona de entre el grupo consistente en un marcador, un agente de seguimiento y un agente de tinción.
16.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las nanocápsulas se encuentran en forma liofilizada.
17.

Vacuna que comprende un sistema como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16.
18.

Composición farmacéutica que comprende un sistema como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
19.

Composición farmacéutica, según la reivindicación 18, para su uso en la prevención de enfermedades infecciosas.
20.

Un procedimiento para la preparación de un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende: a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico; b) preparar una solución orgánica de al menos un componente oleoso de características inmunoestimulantes y al menos un tensioactivo aniónico;

c) mezclar bajo agitación las soluciones formadas en a) y b) con formación espontánea de las nanocápsulas; d) incubar al menos un antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas.
21.

Un procedimiento para la preparación de un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que comprende: a) preparar una solución acuosa de al menos un polisacárido catiónico; b) preparar una solución orgánica de al menos un componente oleoso de características inmunoestimulantes y al menos un tensioactivo aniónico; c) mezclar la solución b) bajo agitación con una solución acuosa;

d) incubar la mezcla obtenida en c) con la solución a); e) incubar al menos un antígeno sobre la superficie de las nanocápsulas preformadas.
22.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, que comprende además la adición de una molécula bioactiva con propiedades inmunoestimulantes ó inmunomoduladoras y/o un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo, en la solución orgánica b).
23.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, en donde el polisacárido catiónico se ha marcado previamente con un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanocápsulas tras su aplicación a un ser vivo.
24.

Procedimiento según la reivindicación 20, que comprende una etapa adicional después de la etapa c) ó d) en la que las nanocápsulas se someten a un proceso de liofilización.
25.

Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende una etapa adicional después de la etapa d) ó e) en el que las nanocápsulas se someten a un proceso de liofilización.
26.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25, que comprende una etapa adicional en la que se regeneran las nanopartículas liofilizadas.
27.

Uso de un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la preparación de una vacuna.
28.

Uso, según la reivindicación 27, para la preparación de una vacuna para la prevención de enfermedades infecciosas.
29.

Uso, según la reivindicación 28, para la prevención de enfermedades infecciosas causadas por agentes víricos.
30.

Uso, según reivindicación 29, para la prevención de enfermedades infecciosas víricas seleccionadas de entre el grupo consistente en hepatitis A, B, C y E, cáncer cervical causado por el virus del papiloma humano, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), gripe estacional, gripe pandémica, mononucleosis infecciosas por citomegalovirus ó por virus de Epstein-Barr, infección por herpes simple, gastroenteritis por rotavirus, síndrome respiratorio agudo severo (SARS), parainfluenza, neumonía por virus sincicial respiratorio, encefalitis japonesa, dengue, rubeola, paperas, sarampión y varicela Zoster.

18

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Tamaño (nm) Tamaño (nm)

300 250 200 150 100 50 0

250 200 150 100 50 0

19 Figura 4 (A)

Nanocápsulas polisacarídicas sin antígeno

Antes 2,5 5

% Trehalosa

Figura 4 (B)

Nanocápsulas polisacarídicas con antígeno

Antes 20

% Trehalosa

Anti-HBsAg IgG (mIU/mL)

Figura 5

Inmunización nasal frente a rHBsAg con nanocápsulas polisacarídicas con núcleo de escualeno

Anti-rHBsAg IgG (mIU/mL)

400 300 200 100 0

Figura 6

*

*

*

*

0 5 10152025

Tiempo tras primera inmunización (semanas)

21

Figura 7

Anti-HBsAg IgG (mIU/mL)

*

*

5 10 15 20 25 30

Tiempo tras primera inmunización (semanas)