EP4683652A1 - Preparation de levure saccharomyces boulardii inactivée - Google Patents

Preparation de levure saccharomyces boulardii inactivée

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EP4683652A1
EP4683652A1 EP24719090.3A EP24719090A EP4683652A1 EP 4683652 A1 EP4683652 A1 EP 4683652A1 EP 24719090 A EP24719090 A EP 24719090A EP 4683652 A1 EP4683652 A1 EP 4683652A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
saccharomyces boulardii
yeast
preparation
kgy
gamma radiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24719090.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Emmanuelle Le Guern
Xavier Roux
Philippe TIXADOR
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocodex SAS
Original Assignee
Biocodex SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Biocodex SAS filed Critical Biocodex SAS
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61K2800/81—Preparation or application process involves irradiation

Definitions

  • the present invention relates to a preparation of Saccharomyces boulardii yeast subjected to beta or gamma radiation and its use as a medicament.
  • the present invention also relates to a method for inactivating a Saccharomyces boulardii yeast preparation and to a pharmaceutical composition or medical device comprising an inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation.
  • Vulvovaginal infections are common conditions in women. In fact, almost all women are affected by a vulvovaginal infection at some point in their lives, and some even recurrently. Vulvovaginal infections are mainly manifested by painful or bothersome physical symptoms that can affect quality of life. The most common symptoms are leukorrhea associated with various vulvovaginal manifestations such as itching, burning and irritation.
  • Bacterial vulvovaginal infections are the most common vulvovaginitis. They are linked to an imbalance in the vaginal microbiota characterized by the development of anaerobic bacteria, such as Gardnerella vaginalis, Prevotella spp. and Mobiluncus spp. Vulvovaginal yeast infections, or candidiasis, are considered the second most common cause of vulvovaginitis. They are linked to the proliferation of a fungus of the genus Candida in the vagina.
  • vulvovaginal infections varies depending on the pathogen causing the infection.
  • Bacterial infections are typically treated with antibiotics, such as metronidazole and clindamycin (Wilson (2004) Sex Transm Infect, 80: 8-11).
  • antibiotics can cause side effects and may contribute to antibiotic resistance. Indeed, cure rates range from 60% to 90% after 5 days of antibiotic treatment.
  • approximately 30% of treated women experience a recurrence within 3 months and 66% within 6 months of treatment.
  • Yeast infections are usually treated with topical or oral antifungal medications that belong to the azole family of drugs. However, some antifungal medications can cause unwanted side effects such as irritation, abdominal pain, or nausea.
  • Probiotics have also been administered to women with vulvovaginitis to maintain or restore the balance of the microbiota.
  • Most vaginal probiotics developed to date contain lactobacilli given the dominant presence of these microorganisms in the microbiotas of women in good gynecological health.
  • lactobacilli the dominant presence of these microorganisms in the microbiotas of women in good gynecological health.
  • these probiotics have shown positive effects on the prevention and treatment of bacterial vulvovaginitis, they are less effective on candidiasis (Hanson et al. (2016) J Midwifery Womens Health, 61: 339-355).
  • the present invention arises from the unexpected discovery by the inventors that the administration of Saccharomyces boulardii yeast inactivated by gamma or beta radiation makes it possible to treat bacterial vulvovaginal infections with Gardnerella vaginalis and to treat vulvovaginal infections with Candida albicans yeast.
  • the present invention relates to a preparation of Saccharomyces boulardii yeast subjected to beta or gamma radiation.
  • the present invention also relates to a method of inactivating the Saccharomyces boulardii yeast preparation comprising a step of subjecting the Saccharomyces boulardii yeast preparation to beta or gamma radiation.
  • the present invention also relates to a yeast preparation.
  • Saccharomyces boulardii obtainable by the process as defined above.
  • the present invention also relates to the preparation of Saccharomyces boulardii yeast as defined above, for use as a medicament.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition or medical device or a cosmetic product comprising a Saccharomyces boulardii yeast preparation as defined above.
  • the present invention also relates to a Saccharomyces boulardii yeast preparation as defined above, a pharmaceutical composition as defined above or a medical device as defined above, for use in the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for use in restoring vaginal flora, and/or for preventing recurrences of vulvovaginitis, and/or preventing or treating symptoms of vulvovaginitis, in an individual.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating vulvovaginitis and/or restoring the vaginal flora, and/or preventing recurrences of vulvovaginitis, and/or preventing or treating the symptoms of vulvovaginitis, in an individual, comprising administering to said individual a Saccharomyces boulardii yeast preparation as defined above, a pharmaceutical composition as defined above, or a medical device as defined above.
  • the present invention also relates to the use of a Saccharomyces boulardii yeast preparation as defined above, of a pharmaceutical composition as defined above, for obtaining a medicament or a medical device intended for the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for restoring the vaginal flora, and/or for preventing recurrences of vulvovaginitis, and/or for preventing or treating the symptoms of vulvovaginitis, in an individual.
  • the present invention also relates to the cosmetic use of a Saccharomyces boulardii yeast preparation as defined above or of a cosmetic product as defined above for the intimate hygiene or personal care of an individual.
  • the present invention also relates to a method of personal hygiene or personal hygiene of an individual, in which the individual is administered a preparation of Saccharomyces boulardii yeast as defined above or a cosmetic product as defined above, in particular in a cosmetically effective quantity.
  • the term “comprising” means “including”, “containing” or “encompassing”, that is to say that when an object “comprises” one or more elements, elements other than those mentioned may also be included in the object.
  • the expression “consisting of” means “made up of”, that is to say that when an object "consists of” one or more elements, the object cannot include elements other than those mentioned.
  • a “yeast” according to the invention is a fungus, preferably unicellular.
  • the yeast according to the invention is preferably of the genus Saccharomyces, more preferably of the species Saccharomyces cerevisiae and even more preferably of the species Saccharomyces cerevisae var. boulardii.
  • Saccharomyces cerevisiae var. boulardii is synonymous with Saccharomyces boulardii and is well known to those skilled in the art and is notably described in Hennequin et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39:551-559.
  • Saccharomyces boulardii according to the invention is obtained from drugs of the Ultra-Levure® brand or from deposits in the American Type Culture Collection (ATCC, USA) under the reference 74012 or in the National Collection of Culture and Microorganisms (CNCM, France) under the reference 1-745. Also preferably, Saccharomyces boulardii is Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 or Saccharomyces cerevisiae var. boulardii HANSEN CBS 5926.
  • the yeast according to the invention is freeze-dried, such as Saccharomyces boulardii of the Ultra-Levure® brand.
  • freeze-drying is a method of preservation in which yeast is frozen and then subjected to sublimation of the frozen water contained therein to yield a lyophilizate in the form of dry yeast powder preferably containing less than 2% water and more preferably less than 1% water.
  • the lyophilized yeast cells are obtained from of yeast cell concentrates. Any type of yeast freeze-drying method known to those skilled in the art may be used.
  • the yeast according to the invention is preferably freeze-dried by means of the following freeze-drying method: culturing the yeast in a liquid nutrient medium until the cells reach a stationary phase; concentrating the cultured yeast cells and freezing the concentrate; freeze-drying the concentrate.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation means any preparation that can be obtained from Saccharomyces boulardii yeast.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation is obtained from yeast cells themselves or contains yeast cell secretions, yeast cell culture, yeast cell extract, yeast cell conditioned medium or yeast cell culture supernatant.
  • yeast cells or “yeast cell culture” include viable or dead yeast cells, intact or in the form of debris.
  • at least a portion of the yeast cells according to the invention or included in the yeast cell culture according to the invention are viable, in particular viable and culturable, before being subjected to beta or gamma radiation.
  • at least a portion of the yeast cells according to the invention or included in the yeast cell culture according to the invention more preferably essentially all of the yeast cells according to the invention or included in the yeast cell culture according to the invention are dead or inactivated after being irradiated with beta or gamma radiation.
  • Yeast cell viability is defined as the ability of a yeast cell to multiply. Yeast cell viability can be determined by methylene blue staining and microscopic observation. The number of viable cells and culturable cells in a sample can be estimated by determining the number of Colony Forming Units (CFU) contained in the sample.
  • CFU Colony Forming Unit
  • the number of CFU of yeast cells in a liquid sample containing yeast can be determined by plating a determined volume of the sample onto a solid medium, e.g. for example a gelled medium, allowing the growth of yeasts, and by incubating the solid medium for a period of time, for example 48 h, and at a temperature, for example 30°C, allowing the growth of yeast colonies.
  • a solid medium e.g. for example a gelled medium
  • the number of colonies relative to the volume spread on the solid medium makes it possible to determine the number of CFU contained in the sample.
  • a detailed protocol for determining the CFU according to the invention is described in particular in Toothaker and Elmer (1984) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 26:552-556 in the paragraph “Assay for S.
  • yeast sample is in the form of a solid, for example a lyophilized powder
  • the yeast cells or a culture of yeast cells according to the invention comprise from 10 8 CFU/g to 10 12 CFU/g, more preferably, from 2.10 9 CFU/g to 2.10" CFU/g before subjection to beta or gamma radiation.
  • yeast cell culture Many methods for preparing yeast cells, yeast cell culture, yeast cell extract, yeast cell conditioned medium and yeast cell culture supernatant are well known in the art and are described in particular in "Yeast Protocols” (1996) Methods in Cell and Molecular Biology, Ed. Ivor H. Evans, Humana Press.
  • the yeast cell culture according to the invention can be obtained by any standard method well known to those skilled in the art for the culture of yeast cells.
  • the yeast cell culture according to the invention can be obtained by inoculating a complete liquid culture medium such as a yeast extract, a peptone and a dextrose (YEPD or YPD) and incubating the medium at 30°C - 37°C with shaking and under aerobic conditions for at least 24 hours, 36 hours or 48 hours and preferably less than 96 hours.
  • a complete liquid culture medium such as a yeast extract, a peptone and a dextrose (YEPD or YPD)
  • the yeast cells according to the invention can be obtained from a yeast cell culture medium according to the invention by sedimentation or centrifugation of the yeast cells.
  • the yeast cell extracts according to the invention can be obtained by any method of fragmentation of yeast cells known in the state of the art applied to the culture of yeast cells or to yeast cells according to the invention, such as autolysis, hydrolysis or autoclaving.
  • the yeast cell extract according to the invention is selected from the group consisting of a membrane extract, a cytoplasmic extract or a nuclear extract.
  • the yeast cell-conditioned medium of the invention relates to any medium, such as a liquid cell culture medium, which has been contacted with yeast cells.
  • the medium has been contacted with yeast cells for a sufficient period of time for the yeast cells to have secreted into the medium.
  • the medium has been contacted by yeast cells for 1 to 9 days, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 days.
  • the conditioned medium of the invention preferably contains molecules secreted by the yeast cells such as proteins.
  • the conditioned medium of the invention does not contain cellular debris.
  • the yeast cell culture supernatant may be obtained by any method well known to those skilled in the art.
  • the yeast cell culture supernatant according to the invention may in particular be obtained by centrifugation of the yeast cell culture according to the invention and removal of the supernatant portion of the centrifuged culture.
  • the yeast cell culture supernatant according to the invention may also be obtained by filtering the yeast cell culture according to the invention through a filter retaining the yeast cells and recovering the filtrate.
  • the yeast cell culture, yeast cell extract, yeast cell conditioned medium and yeast cell culture supernatant according to the invention may have been subjected to at least one treatment or transformation step such as centrifugation, filtration, purification, chromatography, concentration, decantation, drying, lyophilization or distillation, in particular filtration, more particularly sterilizing filtration for example with 0.2 ⁇ m filters.
  • at least one treatment or transformation step such as centrifugation, filtration, purification, chromatography, concentration, decantation, drying, lyophilization or distillation, in particular filtration, more particularly sterilizing filtration for example with 0.2 ⁇ m filters.
  • the yeast preparation to be used according to the invention comprises:
  • Saccharomyces boulardii is the only microorganism or probiotic included in the preparation, composition, in particular pharmaceutical, the medicament, the medical device or the cosmetic product according to the invention.
  • no other microorganism or probiotic such as bacteria of the genus Lactobacillus, in particular L. rhamnosus, L. fermentum, L. crispatus, L jensinii or L gasseri, of the genus Enterococcus, in particular Enterococcus faecium, or yeasts of the genus Saccharomyces, in particular S. cerevisiae, is present in the preparation, the composition, the medicament, the medical device or the cosmetic product.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention is subjected to beta or gamma radiation.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention is subjected to beta radiation.
  • the Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention is subjected to gamma radiation.
  • the irradiation of the Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention by beta or gamma radiation has the effect of inactivating the Saccharomyces boulardii yeast, that is to say that the Saccharomyces boulardii yeast is incapable of growth or reproduction; we also speak of the absence of residual vitality of the Saccharomyces boulardii yeast.
  • irradiation of the Saccharomyces boulardii yeast preparation with beta or gamma radiation results in an absence of residual vitality of the Saccharomyces boulardii yeast.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention comprises essentially 0 Colony Forming Units (CFU) per gram of Saccharomyces boulardii yeast preparation.
  • CFU Colony Forming Units
  • essentially 0 Colony Forming Units is meant that the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation does not contain living cells, or that the concentration of living cells is well below the detection limits.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention comprises less than 10 3 CFU, less than 10 2 CFU, less than 10 CFU, less than 10 CFU, less than 1 CFU per gram of Saccharomyces boulardii yeast preparation.
  • the preparation of Saccharomyces boulardii yeast subjected to beta or gamma radiation is in powder form, in particular dried or freeze-dried.
  • kGy is a measure of absorbed radiation dose. It stands for “kilogray”, where 1 kGy is equal to 1000 grays (Gy).
  • the gray (Gy) is the International System of Units (SI) standard unit of absorbed radiation dose, equivalent to the absorption of one joule of energy per kilogram of matter.
  • SI International System of Units
  • the kGy expresses the absorbed dose of radiation, such as beta or gamma radiation, that the Saccharomyces boulardii yeast preparation has received.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation is subjected to beta or gamma radiation of at least 10 kGy, at least 15 kGy, at least 20 kGY, at least 25 kGY.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation is subjected to beta or gamma radiation of at most 150 kGY, at most 100 kGy, more preferably at most 80 kGy.
  • the Saccharomyces boulardii yeast preparation is subjected to beta or gamma radiation of between 10 and 150 kGy, 10 and 100 kGy, 10 and 90 kGy, 10 and 80 kGy, 10 and 70 kGy, 10 and 60 kGy, 10 and 50 kGy, 10 and 45 kGy, 10 and 40 kGy, 10 and 35 kGy, 10 and 30 kGy, 10 and 25 kGy, 10 and 20 kGy, or 10 and 15 kGy.
  • beta or gamma radiation of between 10 and 150 kGy, 10 and 100 kGy, 10 and 90 kGy, 10 and 80 kGy, 10 and 70 kGy, 10 and 60 kGy, 10 and 50 kGy, 10 and 45 kGy, 10 and 40 kGy, 10 and 35 kGy, 10 and 30 kGy, 10 and 25 kGy, 10 and 20 kGy
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation is subjected to beta or gamma radiation of between 20 and 100 kGy, 20 and 80 kGy, 25 and 80 kGy, 25 kGy and 50 kGy. Even more preferably, the yeast preparation Saccharomyces boulardii is subjected to beta or gamma radiation of approximately 25 kGy.
  • Gamma radiation treatment can be performed using any technique well known to those skilled in the art. It is typically performed using a cobalt-60 irradiator.
  • a cobalt-60 irradiator uses a source of cobalt-60, a radioactive isotope, as a gamma ray source.
  • the source is typically in the form of pellets or rods that are placed in the irradiator.
  • the irradiator is designed to contain and shield the radioactive source, while allowing the gamma rays to penetrate the products to be irradiated.
  • the inactivation process typically involves loading the products to be inactivated into the irradiator, activating the radioactive source, and exposing the products to gamma rays for a period of time ranging from a few seconds to several minutes.
  • the exposure time is determined by the type of product, its density and the desired level of inactivation. This time can be easily adapted by those skilled in the art.
  • the irradiator allows the gamma rays to penetrate through the products, reaching all surfaces, crevices and hidden areas, thus ensuring the inactivation of all microorganisms.
  • Beta radiation treatment can be performed using any technique well known to those skilled in the art. It is typically performed using a device called an electron beam (EB) sterilizer.
  • EBB sterilizers utilize a high-energy electron beam.
  • An EBB sterilizer typically consists of an electron accelerator that produces the high-energy electron beam, a series of magnets that focus and direct the beam, and a treatment chamber where the products are exposed to the beam.
  • the accelerator is typically powered by a high-voltage electrical supply.
  • the inactivation process typically involves loading the products to be inactivated into the treatment chamber, activating the electron accelerator, and exposing the products to the high-energy electron beam for a period of time, ranging from a few seconds to several minutes.
  • the exposure time is determined by the type of product, its density, and the level of inactivation desired. This time can be easily adapted by the person skilled in the art.
  • the method of inactivating the Saccharomyces boulardii yeast preparation comprises a step of subjecting the Saccharomyces boulardii yeast preparation to beta or gamma radiation.
  • Saccharomyces boulardii yeast preparation is in the form of a dry powder or freeze-dried before subjection to beta or gamma radiation.
  • the method for inactivating the Saccharomyces boulardii yeast preparation comprises the following steps: providing a Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, in particular in powder form, in particular dried or freeze-dried; subjecting the Saccharomyces boulardii yeast preparation to beta or gamma radiation.
  • the method may also include a step of verifying the inactivation of the Saccharomyces boulardii yeast preparation following the irradiation step. To do this, it is possible to measure the residual vitality of the yeast preparation, for example by determining the number of Colony Forming Units (CFU) contained in the preparation.
  • CFU Colony Forming Units
  • the method may also comprise a step of storing the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation, in particular in the form of dried or freeze-dried powder.
  • the irradiation dose is selected based on the desired efficacy for inactivating the yeast and can be determined by those skilled in the art.
  • the Saccharomyces boulardii yeast preparation is subjected to beta or gamma radiation of at least 10 kGy.
  • Saccharomyces boulardii yeast inactivated by beta or gamma radiation can be mixed with a wax.
  • the term "wax” refers to a composition based on one or more esters of an alcohol, in particular glycerol, and fatty acids, which is solid at room temperature (18-23°C).
  • the wax according to the invention is based on "hard fat", within the meaning of the European Pharmacopoeia (Ph. Eue), namely a mixture of triglycerides, diglycerides and monoglycerides, which can in particular be obtained either by the esterification of glycerol by fatty acids of natural origin, or by transesterification of natural fats.
  • the fatty acids according to the invention are saturated or unsaturated, preferably saturated. Furthermore, the fatty acids according to the invention preferably comprise at least 8 carbon atoms (C8) or at least 12 carbon atoms (C12). Also preferably, the fatty acids according to the invention comprise at most 18 carbon atoms (C18).
  • the wax according to the invention comprises, or is based on, triglycerides, in particular saturated triglycerides.
  • the wax according to the invention comprises, or is based on, saturated C8-C18 or C12-C18 triglycerides, such as for example C10-C18 triglycerides.
  • the wax according to the invention may comprise additives, such as at least one lubricant or at least one emulsifier, in particular selected from the group consisting of glycerol monoricinoleate, a polyethylene glycol monocetyl ether, in particular Ceteth-20, a polyethylene glycol monostearic ether, in particular Steareth-20, and lecithin.
  • additives such as at least one lubricant or at least one emulsifier, in particular selected from the group consisting of glycerol monoricinoleate, a polyethylene glycol monocetyl ether, in particular Ceteth-20, a polyethylene glycol monostearic ether, in particular Steareth-20, and lecithin.
  • the wax according to the invention has a melting point greater than 32°C. Also preferably, the wax according to the invention has a melting point less than 37°C. More preferably, the wax according to the invention has a melting point greater than 32°C and less than 37°C.
  • the melting point is preferably measured under normal pressure.
  • normal pressure is a pressure of 1 bar.
  • the wax according to the invention is selected from the group consisting of SUPPOCIRE® NA PASTILLES (Gattefossé), OVUCIRE® 3460 PASTILLES (Gattefossé) and SUPPOCIRE® AML PASTILLES (Gattefossé).
  • the wax according to the invention may comprise a mixture of polyethylene glycol (PEG) and “hard fat”, a mixture of “hard fat”, glyceryl ricinoleate and ethoxylated fatty alcohol such as polyethylene glycol hexadecyl ether, a mixture of triglycerides, diglycerides and monoglycerides, the triglyceride fraction preferably being predominant.
  • PEG polyethylene glycol
  • hard fat a mixture of “hard fat”
  • glyceryl ricinoleate and ethoxylated fatty alcohol such as polyethylene glycol hexadecyl ether
  • triglycerides diglycerides and monoglycerides
  • the triglyceride fraction preferably being predominant.
  • the wax according to the invention has a relative humidity of 20% to 35% before mixing.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention is mixed with the wax according to the invention in powder form, in particular freeze-dried.
  • the mixture consists of 15 to 35% (m/m) of inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention.
  • the mixture of inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention and a wax according to the invention has a melting point greater than 32°C.
  • the mixture according to the invention has a melting point less than 37°C. More preferably, the mixture according to the invention has a melting point greater than 32°C and less than 37°C.
  • the melting point is preferably measured under normal pressure.
  • normal pressure is a pressure of 1 bar.
  • the mixture according to the invention has a liquefaction time of less than 60 min, preferably less than 50 min, less than 40 min, more preferably about 30 min in water at 37°C.
  • the mixture according to the invention has a breaking strength greater than 5.4 kg at a temperature of 23°C.
  • the mixture according to the invention comprises, or consists of, 15 to 35% (m/m) of Saccharomyces boulardii yeast preparation in powder form, in particular freeze-dried, inactivated and 65 to 85% (m/m) of wax according to the invention. More preferably, the mixture according to the invention comprises, or consists of, 30% (m/m) of Saccharomyces boulardii yeast preparation in powder form, in particular freeze-dried, inactivated and 70% (m/m) of wax according to the invention.
  • the composition, in particular pharmaceutical, according to the invention, the medical device according to the invention, the medicament according to the invention or the cosmetic product according to the invention comprises, or consists of, the mixture in a unit mass of 1 g to 5 g, in particular of approximately or exactly 2 g.
  • the composition, in particular pharmaceutical, according to the invention, the medical device according to the invention, the medicament according to the invention or the cosmetic product according to the invention comprises a unit mass of 0.15 g to 1.75 g, in particular 0.3 to 0.7 g, of Saccharomyces boulardii yeast preparation in powder form, in particular freeze-dried, inactivated. More preferably, the composition, in particular pharmaceutical, according to the invention, the medical device according to the invention, the medicament according to the invention or the cosmetic product according to the invention, comprises a unit mass of 0.6 g, of Saccharomyces boulardii yeast preparation in powder form, in particular freeze-dried, inactivated.
  • composition in particular pharmaceutical, according to the invention may comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles.
  • composition according to the invention may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may comprise one or more cosmetically acceptable excipients or vehicles in addition to the mixture.
  • the cosmetic product according to the invention may comprise one or more excipients or vehicles cosmetically acceptable in addition to the preparation or composition according to the invention.
  • medical device means any instrument, apparatus, equipment, software, material or other article, used alone or in combination, intended for use in humans to diagnose, prevent, control, treat or alleviate a disease and whose primary intended action in or on the human body is not achieved by pharmacological, immunological or metabolic means, but whose function can be assisted by such means.
  • the medical device according to the invention is a class IIa medical device.
  • the preparation of Saccharomyces boulardii yeast inactivated by a beta or gamma ray, the composition, in particular pharmaceutical, the medical device according to the invention or the cosmetic product according to the invention is administered orally, in particular in the form of a capsule or tablet, or vaginally, in particular in the form of an ovule or intravaginal capsule.
  • the preparation of Saccharomyces boulardii yeast inactivated according to the invention, the composition according to the invention, the medicament according to the invention, the medical device according to the invention or the cosmetic product according to the invention is administered vaginally, in particular in the form of an ovule.
  • the preparation of inactivated Saccharomyces boulardii yeast, the composition, in particular pharmaceutical, the medicament, the medical device according to the invention or the cosmetic product according to the invention is intended to be used as an ovule.
  • the term “ovule” is considered equivalent to “vaginal ovule” or “gynecological ovule”.
  • the ovule is a medicament, composition or medical device of hard or soft consistency and ovoid shape intended to be inserted into the vagina.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, the composition according to the invention, the medicament according to the invention, the medical device or the cosmetic product according to the invention is administered to the individual according to the invention in the form of an ovule once a day.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation is administered in an amount ranging from 100 to 1000 mg/day, more preferably from 200 to 800 mg/day, such as for example 300 mg/day, 400 mg/day, 500 mg/day, 600mg/day, 700 mg/day, preferably over periods ranging from 7 to 14 days. More preferably, The inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation is administered in an amount of approximately 600 mg/day.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, the composition according to the invention, the medical device according to the invention is administered in a prophylactically or therapeutically effective amount to prevent or treat vulvovaginitis and/or to restore the vaginal flora, and/or to prevent recurrences of vulvovaginitis, and/or to treat the symptoms of vulvovaginitis.
  • Vulvovaginitis is well known to those skilled in the art; it is an inflammation of the vulva and vagina.
  • the causes of vulvovaginitis are diverse and include: infections, such as:
  • Yeast infections or fungal infections also called candidiasis. These infections, well known to those skilled in the art, are caused by a type of fungus called Candida, more specifically Candida albicans.
  • Bacterial vaginosis This infection, well known to those skilled in the art, results from a disruption of the normal balance of bacteria in the vagina.
  • bacterial vaginosis is caused by an overgrowth of certain types of bacteria, particularly Gardnerella vaginalis, Gardnerella mobiluncus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma horn inis, Peptostreptococcus species, and Urea plasma urealyticum, in the vagina.
  • STIs sexually transmitted infections
  • herpes such as herpes, chlamydia and gonorrhea.
  • Symptoms of vulvovaginitis may include itching, local irritation, burning, redness in the vulva and vagina, discharge Discolored, excessive and/or foul-smelling vaginal discharge, pain during urination and intercourse may also occur.
  • prevention or treatment of vulvovaginitis means the relief of at least one symptom of vulvovaginitis, the control of the progression of vulvovaginitis, and/or the cure of vulvovaginitis.
  • “restoration of vaginal flora” refers to the restoration of a normal or healthy vaginal flora, or microbiota, in particular in terms of diversity and quantity of microorganisms, in particular after treatment with a local or systemic anti-infective.
  • the pH of a normal or healthy vaginal flora is approximately 4.5.
  • the local or systemic anti-infective is selected from antibiotics, in particular from the nitroimidazole family, such as metronidazole; antifungal drugs, in particular from the imidazole family, such as econazole, clotrimazole, miconazole or fluconazole; antiseptics; antiparasitics, in particular from the nitroimidazole family, such as metronidazole.
  • antibiotics in particular from the nitroimidazole family, such as metronidazole
  • antifungal drugs in particular from the imidazole family, such as econazole, clotrimazole, miconazole or fluconazole
  • antiseptics in particular from the nitroimidazole family, such as metronidazole.
  • recurrent vulvovaginitis refers to the recurrence of at least one symptom of vulvovaginitis after an initial episode of this infection has been treated.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, the composition, in particular pharmaceutical, according to the invention, the medicament according to the invention, the medical device according to the invention is administered in combination with at least one additional compound useful for the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for the restoration of the vaginal flora, and/or for the prevention of recurrences of vulvovaginitis.
  • the additional compound useful for the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for the restoration of vaginal flora, and/or for the prevention of recurrences of vulvovaginitis may be chosen from any compound well known to those skilled in the art.
  • the additional compound useful for the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for the restoration of vaginal flora, and/or for the prevention of recurrences of vulvovaginitis is selected from the group consisting of: antibiotics, including those of the nitroimidazole family, such as metronidazole, or of the lincosamide family, such as clindamycin; antifungal medicines, including those of the imidazole family, such as econazole, clotrimazole, miconazole or fluconazole; antiseptics; antiparasitics, including those of the nitroimidazole family, such as metronidazole; topical creams or ointments, including those containing corticosteroids and topical estrogens.
  • antibiotics including those of the nitroimidazole family, such as metronidazole, or of the lincosamide family, such as clindamycin
  • antifungal medicines including those of
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, the composition according to the invention, the medicament according to the invention, the medical device according to the invention can be associated with a change in lifestyle such as for example having good hygiene, avoiding the use of aggressive chemicals, avoiding soaps and detergents, etc.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention, the composition, in particular pharmaceutical, according to the invention, the medicament according to the invention, the medical device according to the invention is not administered in combination with at least one additional compound useful for the prevention or treatment of vulvovaginitis and/or for the restoration of the vaginal flora, and/or for the prevention of recurrences of vulvovaginitis in particular an additional compound as defined above.
  • “combined” or “in combination” means that the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation according to the invention is administered together with an additional compound, either together, i.e. at the same site of administration, or separately, or at different times, provided that the period during which the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation exerts its effects on the individual and the period during which the additional compound exerts its pharmacological effects on the individual, at least partially overlap.
  • the individual according to the invention is a mammal, more preferably a human, particularly of the female sex.
  • the individual according to the invention has at least one symptom of vulvovaginitis and/or suffers from vulvovaginitis, and/or has a risk of recurrence of vulvovaginitis.
  • the individual according to the invention has vulvovaginitis, in particular a yeast infection or candidiasis, bacterial vaginosis, in particular caused by Gardnerella vaginalis and/or Gardnerella mobiluncus.
  • vulvovaginitis in particular a yeast infection or candidiasis, bacterial vaginosis, in particular caused by Gardnerella vaginalis and/or Gardnerella mobiluncus.
  • Figure 1 shows the number of Gardnerella vaginalis cells, expressed as a percentage relative to the control, cultured on solid medium without Saccharomyces boulardii (Sb, control), and treated with 5 mg/ml of Saccharomyces boulardii yeast not subjected to gamma radiation or with 5 mg/ml of Saccharomyces boulardii yeast inactivated by 25 kGy gamma radiation.
  • Figure 2 shows the amount of Gardnerella vaginalis in CFU/ml in liquid culture medium as a function of time elapsed without treatment with Saccharomyces boulardii (Sb, control), treated with Saccharomyces boulardii not subjected to gamma radiation, treated with Saccharomyces boulardii inactivated by 25 kG gamma radiation, and treated with Saccharomyces boulardii inactivated by 50 kG gamma radiation.
  • Figure 3 shows the percentage of Candida albicans (Ca) cell attachment to VK2 vaginal epithelial cells as a function of the amount of unirradiated and irradiated lyophilized Saccharomyces boulardii (SBL) used to treat VK2 cells.
  • Light gray bars correspond to 0 kGy irradiation
  • black bars correspond to 3 kGy irradiation
  • white bars correspond to 10 kGy irradiation
  • white bars with black horizontal stripes correspond to 25 kGy irradiation
  • white bars with black dots correspond to 50 kGy irradiation
  • white bars with black vertical stripes correspond to 80 kGy irradiation.
  • Figure 4 shows the percentage of Candida albicans (Ca) cell attachment to VK2 vaginal epithelial cells as a function of the amount of unirradiated and irradiated lyophilized Saccharomyces boulardii (SBL) used to
  • Figure 4 shows the vaginolysin/GAPDH signal ratio of untreated G. vaginalis-infected VK2 cell cultures treated with lyophilized Saccharomyces (SBL) (10 mg/ml) and lyophilized Saccharomyces boulardii irradiated with 25 kGy gamma radiation (10 mg/ml) as a function of time.
  • SBL lyophilized Saccharomyces
  • Figure 5 shows the percentage of trypan blue permeability of G. vaginalis-infected and untreated VK2 cells, G. vaginalis-infected VK2 cells treated with lyophilized Saccharomyces boulardii (SBL), G. vaginalis-infected VK2 cells treated with lyophilized Saccharomyces boulardii irradiated with 25 kGy gamma radiation, uninfected VK2 cells, uninfected VK2 cells treated with lyophilized Saccharomyces boulardii, and uninfected VK2 cells treated with lyophilized Saccharomyces boulardii irradiated with 25 kGy gamma radiation.
  • SBL lyophilized Saccharomyces boulardii
  • the inventors evaluated the effect of inactivated Saccharomyces boulardii on Gardnerella vaginalis.
  • the effect of 5 mg/ml of lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 yeast preparation inactivated by 25 kGy gamma radiation was tested on the growth of Gardnerella vaginalis cultured on agar medium.
  • the effect of the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparation was compared with the effect of 5 mg/ml lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 not subjected to gamma radiation.
  • the effect of two inactivated lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 yeast preparations was tested on the growth of Gardnerella vaginalis in liquid medium.
  • the effect of the two inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparations was compared with the effect of 5 mg/ml Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 not subjected to gamma radiation.
  • the inactivated Saccharomyces boulardii yeast preparations used are as follows:
  • the inventors evaluated the effect of inactivated Saccharomyces boulardii in the treatment and prevention of vaginal candidiasis, particularly on the attachment of Candida albicans to vaginal epithelial cells after adaptation of the protocol described by Yang et al. (2016) Biomed Environ Sci, 31: 816-828.
  • VK2 vaginal epithelial cells were cultured in six-well plates and used to assess the adhesion ability of C. albicans cells (standard strain SC5314).
  • VK2 vaginal epithelial cells were infected with C. albicans at 2 x 10 2 yeast cells per well in Keratinocyte Medium. VK2 vaginal epithelial cells were treated with:
  • Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilized non-irradiated in quantities of 1 mg/ml, 3.16 mg/ml, and 31.62 mg/ml;
  • Lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 irradiated with gamma radiation of 3 KGy at quantities of 1 mg/ml, 3.16 mg/ml, and 31.62 mg/ml;
  • Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 freeze-dried irradiated with gamma radiation of 10 KGy at the amounts of 1 mg/ml, 3.16 mg/ml, and
  • Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 freeze-dried irradiated with 25 KGy gamma radiation at quantities of 1 mg/ml, 3.16 mg/ml, and
  • Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 freeze-dried irradiated with gamma radiation of 50 KGy at the amounts of 1 mg/ml, 3.16 mg/ml, and
  • Adhesion efficiency is expressed as the ratio of the number of adherent cells treated with Saccharomyces boulardii to that of cells cultured in DMEM alone.
  • the inventors evaluated the effect of inactivated Saccharomyces boulardii on vaginolysin which is responsible for the lysis of vaginal epithelial cells and is therefore a carbon source for Gardnerella vaginalis.
  • 3 groups were formed: a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and not treated; a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and treated with 10 mg/ml of lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745; a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and treated with 10 mg/ml of lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 irradiated with 25 kGy gamma radiation. After incubation and homogenization the wells are washed with PBS.
  • VK2 cells are lysed and the amount of vaginolysin in the cell lysate is analyzed.
  • the inventors evaluated the effect of inactivated Saccharomyces boulardii treatment on the membrane permeability of VK2 cells infected with G. vaginalis.
  • VK2 cell monolayers were cultured in six-well plates in the presence of medium comprising 10% fetal calf serum and infected with G. vaginalis at a rate of 2 * 106 cells per well.
  • 3 groups were formed: a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and not treated; a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and treated with 10 mg/ml of lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745; a group of VK2 vaginal epithelial cells infected with G. vaginalis and treated with 10 mg/ml of lyophilized Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 irradiated with 25 kGy gamma radiation. After incubation, trypan blue is added to the wells. When the integrity of the cell plasma membrane is impaired, trypan blue will penetrate the cells and label them blue.
  • Treatment with lyophilized Saccharomyces boulardii in an amount of 10 mg/ml reduces by approximately 70% the increase in membrane permeability induced by infection of cells by G. vaginalis.

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Abstract

La présente invention concerne une préparation de levure Saccharomyces boulardii soumise à un rayonnement bêta ou gamma.

Description

PREPARATION DE LEVURE SACCHAROMYCES BOULARDII INACTIVEE
Domaine de l’invention
La présente invention concerne une préparation de levure Saccharomyces boulardii soumise à un rayonnement bêta ou gamma ainsi que son utilisation à titre de médicament. La présente invention concerne également un procédé d’inactivation d’une préparation de levure Saccharomyces boulardii ainsi qu’une composition pharmaceutique ou un dispositif médical comprenant une préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée.
Arrière-plan techniaue
Les infections vulvovaginales, ou vulvovaginites, sont des affections courantes chez les femmes. En effet, la quasi-totalité des femmes sont concernées par une infection vulvo-vaginale à un moment de leur vie, voire de façon récurrente pour certaines. Les infections vulvovaginales se manifestent essentiellement par des symptômes physiques douloureux ou gênants qui peuvent affecter la qualité de vie. Les symptômes les plus courants sont des leucorrhées associées à divers manifestations vulvovaginales telles que des démangeaisons, des brûlures et des irritations.
Ces infections peuvent être causées par divers agents pathogènes tels que les bactéries, les champignons et les virus. Les infections vulvovaginales bactériennes constituent les vulvo-vaginites les plus fréquentes. Elles sont liées à un déséquilibre du microbiote vaginal caractérisé par le développement de bactéries anaérobies, telles que Gardnerella vaginalis, Prevotella spp. et Mobiluncus spp. Les infections vulvovaginales à levures, ou candidoses, sont considérées comme la seconde cause la plus fréquente de vulvovaginites. Elles sont liées à la prolifération d’un champignon du genre Candida dans le vagin.
La prise en charge médicale des infections vulvovaginales varie en fonction de l'agent pathogène responsable de l'infection. Les infections bactériennes sont généralement traitées avec des antibiotiques, tel que le métronidazole et la clindamycine (Wilson (2004) Sex Transm Infect, 80: 8-1 1 ). Cependant, les antibiotiques peuvent causer des effets secondaires et peuvent contribuer à la résistance aux antibiotiques. En effet, les taux de guérison varient entre 60 et 90 % après 5 jours de traitement par antibiotique. Toutefois, environ 30% des femmes traitées présentent une récidive dans les 3 mois suivants et 66% dans les 6 mois suivant le traitement. Les infections à levures sont généralement traitées avec des médicaments antifongiques topiques ou oraux appartenant à la famille des dérivés azolés. Cependant, certains médicaments antifongiques peuvent causer des effets secondaires indésirables tels que des irritations, des douleurs abdominales ou des nausées.
Des probiotiques ont également été administrés à des femmes souffrant de vulvovaginites afin de maintenir ou restaurer l’équilibre du microbiote. La plupart des probiotiques vaginaux développés à ce jour contiennent des lactobacilles compte tenu de la présence dominante de ces micro-organismes dans les microbiotes de femmes en bonne santé gynécologique. Cependant, bien que ces probiotiques aient montré des effets positifs sur la prévention et le traitement des vulvovaginites bactériennes, ils s’avèrent moins efficaces sur les candidoses (Hanson ét al. (2016) J Midwifery Womens Health, 61 : 339-355).
Ainsi, au vu des taux de résistance en augmentation et des taux élevés de rechutes, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques complémentaires ou alternatives à celles existantes pour la prise en charge des infections vulvovaginales.
Résumé de l’invention
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue par les inventeurs que l’administration de levure Saccharomyces boulardii inactivée par un rayonnement gamma ou bêta permet de traiter les infections vulvovaginales bactérienne à Gardnerella vaginalis et de traiter les infections vulvovaginales à levure Candida albicans.
Ainsi, la présente invention concerne une préparation de levure Saccharomyces boulardii soumise à un rayonnement bêta ou gamma.
La présente invention concerne également un procédé d’inactivation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii comprenant une étape de soumission de la préparation de levure Saccharomyces boulardii à un rayonnement bêta ou gamma.
La présente invention concerne également une préparation de levure
Saccharomyces boulardii inactivée susceptible d’être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également la préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus, pour une utilisation à titre de médicament.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou dispositif médical ou un produit cosmétique comprenant une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus, une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ou un dispositif médical tel que défini ci- dessus, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et/ou pour une utilisation dans la restauration de la flore vaginale, et/ou pour prévenir les récidives de vulvovaginite, et/ou prévenir ou traiter les symptômes de la vulvovaginite, chez un individu.
La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement de la vulvovaginite et/ou de restauration de la flore vaginale, et/ou de prévention des récidives de vulvovaginite, et/ou de prévention ou traitement des symptômes de la vulvovaginite, chez un individu, comprenant l’administration audit individu d’une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci- dessus, d’une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, ou d’un dispositif médical tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus, d’une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour l’obtention d’un médicament ou d’un dispositif médical destiné à la prévention ou au traitement de la vulvovaginite et/ou à la restauration de la flore vaginale, et/ou à la prévention des récidives de vulvovaginite, et/ou à la prévention ou au traitement des symptômes de la vulvovaginite, chez un individu.
La présente invention concerne également l’utilisation cosmétique d’une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus ou d’un produit cosmétique tel que défini ci-dessus pour l’hygiène intime ou la toilette intime d’un individu.
La présente invention concerne également une méthode d’hygiène intime ou de toilette intime d’un individu, dans laquelle on administre à l’individu une préparation de levure Saccharomyces boulardii telle que définie ci-dessus ou un produit cosmétique tel que défini ci-dessus, notamment en une quantité cosmétiquement efficace.
Description détaillée de l’invention
A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c'est-à-dire que lorsqu'un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d'autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l'objet. A contrario, l'expression « consistant en » signifie « constitué de », c'est-à-dire que lorsqu'un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l'objet ne peut pas comprendre d'autres éléments que ceux mentionnés.
Saccharomyces boulardii
Une « levure » selon l'invention est un champignon, de préférence unicellulaire. La levure selon l'invention est de préférence du genre Saccharomyces, plus préférablement de l'espèce Saccharomyces cerevisiae et encore plus préférablement de l'espèce Saccharomyces cerevisae var boulardii. Comme on l’entend ici, Saccharomyces cerevisiae var. boulardii est synonyme de Saccharomyces boulardii et est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite dans Hennequin ét al. (2001 ) J. Clin. Microbiol. 39:551-559.
De manière particulièrement préférée, Saccharomyces boulardii selon l'invention est obtenue à partir de médicaments de la marque Ultra-Levure® ou de dépôts dans ÏAmerican Type Culture Collection (ATCC, USA) sous la référence 74012 ou dans la Collection Nationale de Culture et de Microorganismes (CNCM, France) sous la référence 1-745. De préférence aussi, Saccharomyces boulardii est Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 ou Saccharomyces cerevisiae var. boulardii HANSEN CBS 5926.
De préférence, la levure selon l'invention est lyophilisée, telle que Saccharomyces boulardii de la marque Ultra-Levure®.
Comme on l’entend ici, la « lyophilisation » est une méthode de conservation dans laquelle la levure est congelée et est ensuite soumise à la sublimation de l'eau congelée qu'elle contient pour donner un lyophilisât sous forme de poudre de levure sèche contenant de préférence moins de 2% d'eau et plus préférentiellement moins de 1 % d'eau. De préférence, les cellules de levure lyophilisées sont obtenues à partir de concentrés de cellules de levure. Tout type de méthode de lyophilisation de levure connu de l'homme du métier peut être utilisé. Cependant, la levure selon l'invention est de préférence lyophilisée au moyen de la méthode de lyophilisation suivante : cultiver la levure dans un milieu nutritif liquide jusqu'à ce que les cellules atteignent une phase stationnaire ; concentrer les cellules de levure cultivées et congeler le concentré ; lyophiliser le concentré.
Comme on l’entend ici, l’expression « préparation de levure de Saccharomyces boulardii », désigne toute préparation qui peut être obtenue à partir de levure de Saccharomyces boulardii.
De préférence, la préparation de levure de Saccharomyces boulardii est obtenue à partir de cellules de levure en elles-mêmes ou contient des sécrétions de cellules de levure, une culture de cellules de levure, un extrait de cellules de levure, un milieu conditionné de cellules de levure ou un surnageant de culture de cellules de levure.
Comme on l’entend ici, les « cellules de levure » ou la « culture de cellules de levure » comprennent les cellules de levure viables ou mortes, intactes ou sous forme de débris. De préférence, au moins une partie des cellules de levure selon l'invention ou comprises dans la culture de cellules de levure selon l'invention sont viables, en particulier viables et cultivables, avant d’être soumises à un rayonnement bêta ou gamma. De préférence, au moins une partie des cellules de levure selon l'invention ou comprises dans la culture de cellules de levure selon l'invention, plus préférablement essentiellement toutes les cellules de levure selon l'invention ou comprises dans la culture de cellules de levure selon l'invention sont mortes ou inactivée après avoir été irradiées par un rayonnement bêta ou gamma.
La viabilité d'une cellule de levure est définie comme la capacité d'une cellule de levure à se multiplier. La viabilité des cellules de levure peut notamment être déterminée par coloration au bleu de méthylène et observation microscopique. Le nombre de cellules viables et de cellules cultivables dans un échantillon peut être estimé en déterminant le nombre d'Unités Formant Colonies (UFC) contenues dans l'échantillon.
A titre d'exemple, le nombre d'UFC de cellules de levure dans un échantillon liquide contenant des levures, tel qu'une culture cellulaire de levure, peut être déterminé en étalant un volume déterminé de l'échantillon sur un milieu solide, par exemple un milieu gélifié, permettant la croissance des levures, et en incubant le milieu solide pendant une période de temps, par exemple 48 h, et à une température, par exemple 30°C, permettant la croissance des colonies de levure. Le nombre de colonies par rapport au volume étalé sur le milieu solide permet de déterminer le nombre d'UFC contenues dans l'échantillon. Un protocole détaillé de détermination des UFC selon l'invention est notamment décrit dans Toothaker et Elmer (1984) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 26:552-556 dans le paragraphe « Assay for S. boulardii ». Par ailleurs, lorsque l'échantillon de levure se présente sous la forme d'un solide, par exemple une poudre lyophilisée, il est préférable de déterminer le nombre d'UFC contenues dans l'échantillon après remise en suspension d'une masse déterminée de l'échantillon dans une solution aqueuse, notamment de l'eau distillée ou une solution de NaCI à 0,9% à pH 7.
De préférence, les cellules de levure ou une culture de cellules de levure selon l'invention comprennent de 108 UFC/g à 1012 UFC/g, plus préférablement, de 2.109 UFC/g à 2.10" UFC/g avant soumission à un rayonnement béta ou gamma.
De nombreuses méthodes de préparation de cellules de levure, d'une culture de cellules de levure, d'un extrait de cellules de levure, d'un milieu conditionné de cellules de levure et d'un surnageant de culture de cellules de levure sont bien connues dans l’état de la technique et sont notamment décrites dans « Yeast Protocols )) (1996) Methods in Cell and Molecular Biology, Ed. Ivor H. Evans, Humana Press.
La culture de cellules de levure selon l'invention peut être obtenue par toute méthode standard bien connue de l'homme du métier pour la culture de cellules de levure. A titre d'exemple, la culture de cellules de levure selon l'invention peut être obtenue en inoculant un milieu de culture liquide complet tel qu'un extrait de levure, un peptone et un dextrose (YEPD ou YPD) et en incubant le milieu à 30°C - 37°C sous agitation et dans des conditions aérobies pendant au moins 24 heures, 36 heures ou 48 heures et de préférence moins de 96 heures.
Les cellules de levure selon l'invention peuvent être obtenues à partir d'un milieu de culture de cellules de levure selon l'invention par sédimentation ou centrifugation des cellules de levure.
Les extraits de cellules de levure selon l'invention peuvent être obtenus par toute méthode de fragmentation des cellules de levure connue dans l’état de la technique appliquée à la culture de cellules de levure ou aux cellules de levure selon l'invention, telle que l'autolyse, l'hydrolyse ou l'autoclavage. En particulier, l'extrait de cellules de levure selon l'invention est choisi dans le groupe constitué par un extrait de membrane, un extrait cytoplasmique ou un extrait nucléaire.
De préférence, le milieu conditionné par des cellules de levure selon l'invention concerne tout milieu, tel qu'un milieu liquide de culture cellulaire, qui a été mis en contact avec des cellules de levure. De préférence, le milieu a été mis en contact avec des cellules de levure pendant une durée suffisante pour que les cellules de levure aient sécrété dans le milieu. A titre d'exemple, le milieu a été contacté par des cellules de levure pendant 1 à 9 jours, de préférence 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 jours. Le milieu conditionné selon l'invention contient de préférence des molécules sécrétées par les cellules de levure telles que des protéines. De préférence, le milieu conditionné selon l'invention ne contient pas de débris cellulaires.
Le surnageant de culture de cellules de levure peut être obtenu par toute méthode bien connue de l'homme du métier. Le surnageant de culture de cellules de levure selon l'invention peut notamment être obtenu par centrifugation de la culture de cellules de levure selon l'invention et prélèvement de la partie surnageante de la culture centrifugée. Le surnageant de culture de cellules de levure selon l'invention peut également être obtenu en filtrant la culture de cellules de levure selon l'invention à travers un filtre retenant les cellules de levure et en récupérant le filtrat.
La culture de cellules de levure, l'extrait de cellules de levure, le milieu conditionné de cellules de levure et le surnageant de culture de cellules de levure selon l'invention peuvent avoir été soumis à au moins une étape de traitement ou de transformation telle que la centrifugation, la filtration, la purification, la chromatographie, la concentration, la décantation, le séchage, la lyophilisation ou la distillation, notamment la filtration, plus particulièrement la filtration stérilisante par exemple avec des filtres de 0,2 m.
De préférence, la préparation de levure à utiliser selon l'invention comprend :
- le prélèvement de cellules de levure,
- la culture des cellules de levure,
- éventuellement le traitement des cellules de levure,
- l'obtention d’une préparation de levure, et
- l’irradiation de la préparation de levure par un rayonnement béta ou gamma.
De préférence, Saccharomyces boulardii est le seul microorganisme ou probiotique compris dans la préparation, la composition, notamment pharmaceutique, le médicament, le dispositif médical ou le produit cosmétique selon l’invention. En d’autres termes, aucun autre microorganisme ou probiotique, tel que des bactéries du genre Lactobacillus, notamment L. rhamnosus, L. fermentum, L. crispatus, L jensinii ou L gasseri, du genre Enterococcus, notamment Enterococcus faecium, ou des levures du genre Saccharomyces, notamment S. cerevisiae, n’est présent dans la préparation, la composition, le médicament, le dispositif médical ou le produit cosmétique.
Inactivation de Saccharomyces boulardii
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii selon l’invention est soumise à un rayonnement bêta ou gamma.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation de levure Saccharomyces boulardii selon l’invention est soumise à un rayonnement bêta.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation de levure Saccharomyces boulardii selon l’invention est soumise à un rayonnement gamma.
De préférence, l’irradiation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii selon l’invention par un rayonnement bêta ou gamma a pour effet d’inactiver la levure Saccharomyces boulardii c’est-à-dire que la levure Saccharomyces boulardii est incapable de croissance ou de reproduction, on parle également d’absence de vitalité résiduelle de la levure Saccharomyces boulardii.
Ainsi, de préférence l’irradiation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii par un rayonnement bêta ou gamma résulte en une absence de vitalité résiduelle de la levure Saccharomyces boulardii.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention comprend essentiellement 0 Unités Formant Colonies (UFC) par gramme de préparation de levure Saccharomyces boulardii. On entend par « essentiellement 0 Unité Formant Colonies » le fait que la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée ne contient pas de cellules vivantes, ou que la concentration de cellules vivantes est très en dessous des limites de détection.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention comprend moins de 103 UFC, moins de 102 UFC, moins de 10 UFC, moins de 1 UFC par gramme de préparation de levure Saccharomyces boulardii. De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii soumise à un rayonnement bêta ou gamma est sous forme de poudre, notamment séchée ou lyophilisée.
Comme on l’entend ici, « kGy » est une mesure de la dose de rayonnement absorbée. Cela signifie « kilogray », où 1 kGy est égal à 1000 grays (Gy). Le gray (Gy) est l'unité standard du Système international d'unités (SI) de la dose de rayonnement absorbée, équivalente à l'absorption d'un joule d'énergie par kilogramme de matière. Dans le contexte la présente invention, le kGy exprime la dose absorbée de rayonnements, tels que les rayonnements béta ou gamma, que la préparation de levure Saccharomyces boulardii a reçue.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma d’au moins 10 kGy, d’au moins 15 kGy, d’au moins 20 kGY, d’au moins 25 kGY.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma d’au plus 150 kGY, d’au plus 100 kGy, plus préférablement d’au plus 80 kGy.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma compris entre 10 et 150 kGy, 10 et 100 kGy, 10 et 90 kGy, 10 et 80 kGy, 10 et 70 kGy, 10 et 60 kGy, 10 et 50 kGy, 10 et 45 kGy, 10 et 40 kGy, 10 et 35 kGy, 10 et 30 kGy, 10 et 25 kGy, 10 et 20 kGy, ou 10 et 15 kGy. Plus préférablement, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumises à un rayonnement bêta ou gamma compris entre 20 et 100 kGy, 20 et 80 kGy, 25 et 80 kGy, 25 kGy et 50 kGy. De manière encore plus préférée, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma d’environ 25 kGy.
Le traitement par rayonnement gamma peut se faire selon n’importe quelle technique bien connue de l’homme du métier. Il est généralement effectué à l'aide d'un irradiateur au cobalt 60. Un irradiateur au cobalt 60 utilise une source de cobalt 60, un isotope radioactif, comme source de rayons gamma. La source se présente généralement sous la forme de pastilles ou de tiges qui sont placées dans l’irradiateur. L’irradiateur est conçu pour contenir et protéger la source radioactive, tout en permettant aux rayons gamma de pénétrer dans les produits à irradier.
Le processus d’inactivation consiste généralement à charger les produits à inactiver dans l’irradiateur, à activer la source radioactive et à exposer les produits aux rayons gamma pendant un certain temps pouvant aller de quelques secondes à plusieurs minutes. Le temps d'exposition est déterminé par le type de produit, sa densité et le niveau d’inactivation souhaité. Ce temps peut être facilement adapté par l’homme du métier. Avantageusement, l’irradiateur permet aux rayons gamma de pénétrer à travers les produits, atteignant toutes les surfaces, les crevasses et les zones cachées, garantissant ainsi l'inactivation de tous les micro-organismes.
Le traitement par rayonnement bêta peut se faire selon n’importe quelle technique bien connue de l’homme du métier. Il est généralement effectué à l'aide d'un appareil appelé stérilisateur à faisceau d'électrons (FE). Les stérilisateurs à faisceau d'électrons (FE) utilisent un faisceau d'électrons à haute énergie. Un stérilisateur à faisceau d'électrons se compose généralement d'un accélérateur d'électrons qui produit le faisceau d'électrons à haute énergie, d'une série d'aimants qui concentrent et dirigent le faisceau, et d'une chambre de traitement où les produits sont exposés au faisceau. L'accélérateur est généralement alimenté par une alimentation électrique à haute tension. Le processus d’inactivation consiste généralement à charger les produits à inactiver dans la chambre de traitement, à activer l'accélérateur d'électrons et à exposer les produits au faisceau d'électrons à haute énergie pendant un certain temps, pouvant aller de quelques secondes à plusieurs minutes. Le temps d'exposition est déterminé par le type de produit, sa densité et le niveau d’inactivation souhaité. Ce temps peut être facilement adapté par l’homme du métier.
De préférence, le procédé d’inactivation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii comprend une étape de soumission de la préparation de levure Saccharomyces boulardii à un rayonnement bêta ou gamma.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est sous forme de poudre sèche ou lyophilisée avant soumission à un rayonnement bêta ou gamma.
A titre d’exemple, le procédé d’inactivation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii comprend les étapes suivantes : fournir une préparation de levure Saccharomyces boulardii selon l’invention, en particulier sous forme de poudre, notamment séchée ou lyophilisée ; soumettre la préparation de levure Saccharomyces boulardii à un rayonnement bêta ou gamma. Le procédé peut également comprendre une étape de vérification de l’inactivation de la préparation de levure Saccharomyces boulardii suite à l’étape d’irradiation. Pour ce faire, il est possible de mesurer la vitalité résiduelle de la préparation de levure, en déterminant par exemple le nombre d'Unités Formant Colonies (UFC) contenues dans la préparation.
Le procédé peut également comprendre une étape de stockage de la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée, notamment sous forme de poudre séchée ou lyophilisée.
De préférence, la dose d'irradiation est choisie en fonction de l'efficacité désirée pour inactiver la levure et peut être déterminée par l’homme du métier. De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma d’au moins 10 kGy.
Cire
La préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée par un rayonnement bêta ou gamma peut être mélangée à une cire.
Comme on l'entend ici, le terme « cire » désigne une composition à base d'un ou plusieurs esters d'un alcool, notamment le glycérol, et d'acides gras, qui est solide à température ambiante (18-23°C). De préférence, la cire selon l'invention est à base de « hard fat », au sens de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eue), à savoir un mélange de triglycérides, de diglycérides et de monoglycérides, qui peuvent notamment être obtenus soit par l'estérification du glycérol par des acides gras d'origine naturelle, soit par transestérification de graisses naturelles.
Les acides gras selon l’invention sont saturés ou insaturés, de préférence saturés. Par ailleurs, les acides gras selon l'invention comprennent de préférence au moins 8 atomes de carbone (C8) ou au moins 12 atomes de carbone (C12). De préférence également, les acides gras selon l'invention comprennent au plus 18 atomes de carbone (Cl 8).
De préférence, la cire selon l'invention comprend des, ou est à base de, triglycérides, notamment saturés. En particulier, la cire selon l'invention comprend des, ou est à base de, triglycérides en C8-C18 ou en C12-C18 saturés, tel que par exemple des triglycérides en C10-C18.
Par ailleurs, la cire selon l'invention peut comprendre des additifs, tels qu'au moins un lubrifiant ou au moins un émulsifiant, notamment sélectionnés dans le groupe constitué du monoricinoléate de glycérol, d'un éther monocétylique de polyéthylène glycol, en particulier le Ceteth-20, d'un éther monostéarique de polyéthylène glycol, en particulier le Steareth-20, et de la lécithine.
De préférence, la cire selon l'invention a un point de fusion supérieur à 32°C. De préférence également, la cire selon l'invention a un point de fusion inférieur à 37°C. Plus préférablement, la cire selon l'invention a un point de fusion supérieur à 32°C et inférieur à 37°C.
Comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, le point de fusion est de préférence mesuré sous une pression normale. Comme on l'entend ici, une pression normale est une pression de 1 bar.
De préférence, la cire selon l'invention est sélectionnée dans le groupe constitué de SUPPOCIRE® NA PASTILLES (Gattefossé), OVUCIRE® 3460 PASTILLES (Gattefossé) et SUPPOCIRE® AML PASTILLES (Gattefossé).
A titre d’exemple, la cire selon l’invention peut comprendre un mélange de polyéthylène glycol (PEG) et de « hard fat », un mélange de « hard fat », ricinoléate de glycéryle et d’alcool gras éthoxylés tel que le polyethylene glycol hexadecyl ether, un mélange de triglycérides, de diglycérides et de monoglycérides, la fraction triglycéride étant de préférence prédominante.
De préférence, la cire selon l'invention a une humidité relative de 20% à 35% avant mélange.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention est mélangée à la cire selon l’invention sous forme de poudre, notamment lyophilisée.
De préférence, le mélange est constitué de 15 à 35% (m/m) de préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention.
De préférence, le mélange de préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention et d’une cire selon l’invention a un point de fusion supérieur à 32°C. De préférence également, le mélange selon l'invention a un point de fusion inférieur à 37°C. Plus préférablement, le mélange selon l'invention a un point de fusion supérieur à 32°C et inférieur à 37°C.
Comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, le point de fusion est de préférence mesuré sous une pression normale. Comme on l'entend ici, une pression normale est une pression de 1 bar. De préférence, le mélange selon l'invention a un temps de liquéfaction inférieur à 60 min, de préférence inférieur à 50 min, inférieur à 40 min, plus préférablement d’environ 30 min dans une eau à 37°C.
De préférence, le mélange selon l'invention a une résistance à la rupture supérieure à 5,4 kg à une température de 23°C.
De préférence, le mélange selon l'invention comprend, ou est constitué de 15 à 35% (m/m) de préparation de levure Saccharomyces boulardii sous forme de poudre, notamment lyophilisée, inactivée et de 65 à 85% (m/m) de cire selon l'invention. Plus préférablement le mélange selon l'invention comprend, ou est constitué de, 30% (m/m) de préparation de levure Saccharomyces boulardii sous forme de poudre, notamment lyophilisée, inactivée et de 70% (m/m) de cire selon l'invention.
De préférence, la composition, notamment pharmaceutique, selon l'invention, le dispositif médical selon l'invention, le médicament selon l'invention ou le produit cosmétique selon l'invention comprend, ou consiste en, le mélange en une masse unitaire de l g à 5 g, notamment d'environ ou exactement 2 g.
De préférence également, la composition, notamment pharmaceutique, selon l'invention, le dispositif médical selon l'invention, le médicament selon l'invention ou le produit cosmétique selon l'invention, comprend une masse unitaire de 0, 15 g à 1 ,75 g, notamment de 0,3 à 0,7 g, de préparation de levure Saccharomyces boulardii sous forme de poudre, notamment lyophilisée, inactivée. Plus préférablement, la composition, notamment pharmaceutique, selon l'invention, le dispositif médical selon l'invention, le médicament selon l'invention ou le produit cosmétique selon l'invention, comprend une masse unitaire de 0,6 g, de préparation de levure Saccharomyces boulardii sous forme de poudre, notamment lyophilisée, inactivée.
Administration
La composition, notamment pharmaceutique, selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
La composition selon l’invention peut être une composition cosmétique. Dans ce cas, la composition cosmétique peut comprendre un ou plusieurs excipients ou véhicules cosmétiquement acceptables en plus du mélange. De même, le produit cosmétique selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs excipients ou véhicules cosmétiquement acceptables en plus de la préparation ou composition selon l’invention.
On entend par « dispositif médical » tout instrument, appareil, équipement, logiciel, matière ou autre article, utilisé seul ou en association, destiné à être utilisé chez l’homme pour diagnostiquer, prévenir, contrôler, traiter ou atténuer une maladie et dont l’action principale voulue dans ou sur le corps humain n’est pas obtenue par des moyens pharmacologiques, immunologiques ou métaboliques, mais dont la fonction peut être assistée par de tels moyens. De préférence, le dispositif médical selon l’invention est un dispositif médical de classe lia.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée par un rayon bêta ou gamma, la composition, notamment pharmaceutique, le dispositif médical selon l’invention ou le produit cosmétique selon l'invention est administré par voie orale, notamment sous forme de gélule ou de comprimé, par voie vaginale, notamment sous forme d’ovule ou de gélule intravaginale. Plus préférablement, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention, la composition selon l’invention, le médicament selon l’invention, le dispositif médical selon l’invention ou le produit cosmétique selon l'invention est administré par voie vaginale, notamment sous la forme d’un ovule.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée, la composition, notamment pharmaceutique, le médicament, le dispositif médical selon l’invention ou le produit cosmétique selon l'invention est destiné à être utilisé à titre d’ovule.
Comme on l’entend ici, le terme « ovule » est considéré équivalent à « ovule vaginal » ou « ovule gynécologique ». De préférence, l’ovule est un médicament, une composition ou un dispositif médical de consistance dure ou molle et de forme ovoïde destiné à être inséré dans le vagin.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention, la composition selon l’invention, le médicament selon l’invention, le dispositif médical ou le produit cosmétique selon l'invention est administré à l’individu selon l’invention sous forme d’ovule 1 fois par jour.
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée est administrée en une quantité allant de 100 à 1000 mg/jour, plus préférablement de 200 à 800 mg/jour, tel que par exemple 300 mg/jour, 400 mg/jour, 500 mg/jour, 600mg/jour, 700 mg/jour, de préférence sur des périodes allant de 7 à 14 jours. Plus préférablement, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée est administrée en une quantité d’environ 600 mg/jour.
Applications
De préférence, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l'invention, la composition selon l’invention, le dispositif médical selon l’invention, est administré en une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace pour prévenir ou traiter la vulvovaginite et/ou pour restaurer la flore vaginale, et/ou pour prévenir les récidives de vulvovaginite, et/ou pour traiter les symptômes de vulvovaginite.
La vulvovaginite est bien connue de l’homme du métier, il s’agit d’une inflammation de la vulve et du vagin. Les causes de la vulvovaginite sont diverses et incluent notamment : les infections, telles que :
• Les infections à levures ou infections fongiques, également appelées candidoses. Ces infections biens connues de l’homme du métier sont causées par un type de champignon appelé Candida, plus particulièrement Candida albicans.
• La vaginose bactérienne. Cette infection bien connue de l’homme du métier résulte d’une perturbation de l'équilibre normal des bactéries dans le vagin. Habituellement, la vaginose bactérienne est causée par une prolifération de certains types de bactéries, en particulier Gardnerella vaginalis, Gardnerella mobiluncus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma horn inis, Peptostreptococcus species, et Urea plasma urealyticum, dans le vagin.
• Les infections parasitaires, notamment à Trichomonas.
• Les infections sexuellement transmissibles (1ST) comme l'herpès, la chlamydia et la gonorrhée.
Les allergies ou irritations, par exemple à certains savons, détergents ou crèmes. Les changements hormonaux, comme ceux qui se produisent par exemple pendant la ménopause.
Les problèmes de peau, comme l'eczéma ou le psoriasis.
Les symptômes de la vulvovaginite peuvent inclure des démangeaisons, des irritations locales, des brûlures, des rougeurs dans la vulve et le vagin, des pertes vaginales colorées, excessives et/ou malodorantes, des douleurs lors de la miction et des rapports sexuels peuvent également survenir.
Comme on l’entend ici, la « prévention ou de traitement de la vulvovaginite » désigne le soulagement d’au moins un symptôme de vulvovaginite, le contrôle de la progression de la vulvovaginite et/ou la guérison de la vulvovaginite.
Comme on l’entend ici, la « restauration de la flore vaginale » désigne le rétablissement d’une flore, ou microbiote, vaginale normale ou saine, notamment en termes de diversité et de quantité de micro-organismes, notamment après un traitement par un anti-infectieux local ou systémique. De préférence, le pH d’une flore vaginal normale ou saine est d’environ 4,5. De préférence, l’anti-infectieux local ou systémique est sélectionné parmi des antibiotiques, notamment de la famille des nitroimidazoles, tel que le métronidazole ; des médicament antifongique, notamment de la famille des imidazolés, tels que l’éconazole, le clotrimazole, le miconazole ou le fluconazole ; des antiseptiques ; des antiparasitaires, notamment de la famille des nitroimidazoles, tel que le métronidazole.
Comme on l’entend ici, les « récidives de vulvovaginite » désignent la réapparition d’au moins un symptôme de la vulvovaginite après qu'un épisode initial de cette infection ait été traité.
Composé additionnel
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention, la composition, notamment pharmaceutique, selon l’invention, le médicament selon l’invention, le dispositif médical selon l’invention est administré en combinaison avec au moins un composé additionnel utile pour la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et /ou pour la restauration de la flore vaginale, et/ou pour la prévention des récidives de vulvovaginite.
Le composé additionnel utile pour la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et/ou pour la restauration de la flore vaginale, et ou pour la prévention des récidives de vulvovaginite peut être choisi parmi n’importe quel composé bien connu de l’homme du métier.
De préférence, le composé additionnel utile pour la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et/ou pour la restauration de la flore vaginale, et/ou pour la prévention des récidives de vulvovaginite est sélectionné dans le groupe constitué : des antibiotiques, notamment de la famille des nitroimidazoles, tel que le métronidazole, ou de la famille des lincosamides tel que la clindamycine ; des médicaments antifongiques, notamment de la famille des imidazolés, tels que l’éconazole, le clotrimazole, le miconazole ou le fluconazole ; des antiseptiques ; des antiparasitaires, notamment de la famille des nitroimidazoles, tel que le métronidazole ; des crèmes ou onguents topiques, notamment celles et ceux contenant des corticostéroïdes et les œstrogènes topiques.
De plus, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention, la composition selon l’invention, le médicament selon l’invention, le dispositif médical selon l’invention peut être associé à un changement de mode de vie tel que par exemple avoir une bonne hygiène, éviter l'utilisation de produits chimiques agressifs, éviter les savons et détergents, etc.
Dans un mode de réalisation de l’invention, la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention, la composition, notamment pharmaceutique, selon l’invention, le médicament selon l’invention, le dispositif médical selon l’invention n’est pas administré en combinaison avec au moins un composé additionnel utile pour la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et /ou pour la restauration de la flore vaginale, et/ou pour la prévention des récidives de vulvovaginite en particulier un composé additionnel tel que défini ci-dessus.
Comme on l’entend ici, « combiné » ou « en combinaison » signifie que la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée selon l’invention est administrée en même temps qu’un composé additionnel, soit ensemble, c'est-à-dire au même site d'administration, soit séparément, soit à des moments différents, à condition que la période pendant laquelle la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée exerce ses effets sur l'individu et la période pendant laquelle le composé additionnel exerce ses effets pharmacologiques sur l'individu, se recoupent au moins partiellement.
Individu
De préférence, l’individu selon l’invention est mammifère, plus préférablement un humain notamment de sexe féminin. De préférence, l’individu selon l’invention présente ou moins un symptôme de vulvovoginite et/ou est atteint de vulvovaginite, et/ou présente un risque de récidive de vulvovaginite.
De préférence, l’individu selon l’invention a une vulvovaginite, en particulier une infection à levure ou candidose, une vaginose bactérienne, notamment causée par Gardnerella vaginalis et/ou Gardnerella mobiluncus.
Description des figures
Figure 1
La Figure 1 représente le nombre de cellules Gardnerella vaginalis, exprimé en pourcentage par rapport au contrôle, cultivées sur milieu solide sans Saccharomyces boulardii (Sb, contrôle), et traitées avec 5 mg/ml de levure Saccharomyces boulardii non soumis à un rayonnement gamma ou avec 5 mg/ml de levure Saccharomyces boulardii inactivée par un rayonnement gamma de 25 kGy.
Figure 2
La Figure 2 représente la quantité de Gardnerella vaginalis en CFU/ml dans le milieu de culture liquide en fonction du temps écoulé sans traitement avec Saccharomyces boulardii (Sb, contrôle), traitée avec Saccharomyces boulardii non soumis à un rayonnement gamma, traitée avec Saccharomyces boulardii inactivée par un rayonnement gamma de 25 kG et traitée avec Saccharomyces boulardii inactivée par un rayonnement gamma de 50 kG.
Figure 3
La figure 3 représente le pourcentage d’attachement de cellules Candida albicans (C.a) aux cellules épithéliales vaginale VK2 en fonction de la quantité de Saccharomyces boulardii lyophilisée (SBL) non irradiée et irradiée utilisée pour traiter les cellules VK2. Les barres gris clair correspondent à une irradiation de 0 kGy, les barres noires correspondent à une irradiation de 3 kGy, les barres blanches correspondent à une irradiation de 10 kGy, les barres blanches avec des rayures horizontales noires correspondent à une irradiation de 25 kGy, les barres blanches avec des points noirs correspondent à une irradiation de 50 kGy et les barres blanches avec des rayures noires verticales correspondent à une irradiation de 80 kGy. Figure 4
La figure 4 représente le ratio signal vaginolysine/GAPDH des cultures de cellules VK2 infectées par G. vaginalis et non traitées, traitées avec Saccharomyces lyophilisée (SBL) ( 10 mg/ml) et Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy (10 mg/ml) en fonction du temps.
Figure 5
La figure 5 représente le pourcentage de perméabilité au bleu trypan des cellules VK2 infectées par G. vaginalis et non traitées, des cellules VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par Saccharomyces boulardii lyophilisée (SBL), des cellules VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy, des cellules VK2 non infectées, des cellules VK2 non infectées traitées par Saccharomyces boulardii lyophilisée, et des cellules VK2 non infectées traitées par Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy.
EXEMPLES
EXEMPLE 1
Les inventeurs ont évalué l’effet de Saccharomyces boulardii inactivée sur Gardnerella vaginalis.
1. Sur support solide
L’effet de 5 mg/ml de préparation de levure Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 sous forme lyophilisée inactivée par un rayonnement gamma de 25 kGy a été testé sur la croissance Gardnerella vaginalis cultivée sur milieu gélosé. L’effet de la préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée a été comparé à l’effet de 5mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisé non soumis à un rayonnement gamma.
Les résultats montrent que la préparation de levure Saccharomyces boulardii irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy inhibe la croissance de Gardnerella vaginalis de manière similaire à Saccharomyces boulardii non soumis à un rayonnement gamma (voir la Figure 1 ).
2. En milieu liquide
L’effet de deux préparations de levures Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisées inactivées a été testé sur la croissance Gardnerella vaginalis en milieu liquide. L’effet des deux préparations de levures Saccharomyces boulardii inactivées a été comparé à l’effet de 5mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 non soumis à un rayonnement gamma.
Les préparations de levure Saccharomyces boulardii inactivées utilisées sont les suivantes :
5 mg/ml de préparation de levure Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée inactivée par un rayonnement gamma de 25 kGy ;
5 mg/ml de préparation de levure Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée inactivée par un rayonnement gamma de 50 kGy. Les résultats montrent que la croissance de Gardnerella vaginalis est inhibée par les préparations de levures Saccharomyces boulardii irradiées par un rayonnement gamma (voir la Figure 2). Les résultats montrent en outre que l’inhibition de la croissance de Gardnerella vaginalis obtenue par les préparations de levures Saccharomyces boulardii inactivées est au moins égale à celle obtenue avec un traitement à Saccharomyces boulardii non inactivée.
EXEMPLE 2
Les inventeurs ont évalué l’effet de Saccharomyces boulardii inactivée dans le traitement et la prévention des candidoses vaginales, en particulier sur l’attachement de Candida albicans aux cellules épithéliales vaginales après adaptation du protocole décrit par Yang et al. (2018) Biomed Environ Sci, 31 : 816-828.
Des cellules épithéliales vaginales VK2 ont été cultivées dans des plaques à six puits et utilisées pour évaluer la capacité d'adhésion des cellules de C. albicans (souche standard SC5314).
Les cellules épithéliales vaginales VK2 ont été infectées par C. albicans à raison de 2 x 102 cellules de levures par puits dans du Milieu kératinocyte. Les cellules épithéliales vaginales VK2 ont été traitées avec :
Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée non irradiée aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et 31 ,62 mg/ml ;
Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma de 3 KGy aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et 31 ,62 mg/ml ;
Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma de 10 KGy aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et
31 ,62 mg/ml ;
Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma de 25 KGy aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et
31 ,62 mg/ml ;
Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma de 50 KGy aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et
31 ,62 mg/ml ; Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma de 80 KGy aux quantités de 1 mg/ml, 3,16 mg/ml, et 31 ,62 mg/ml.
Le nombre de cellules adhérentes a été vérifié par comptage des colonies après 1 heure d’incubation. Après 1 h d'incubation, les cellules de levure dissociées ont été éliminées en rinçant les puits avec du PBS. Les puits ont ensuite été recouverts de gélose, et le nombre de cellules adhérentes a été quantifié par comptage des colonies. L'efficacité de l'adhésion est exprimée comme le rapport entre le nombre de cellules adhérentes traitées avec Saccharomyces boulardii par rapport à celui des cellules cultivées dans du DMEM uniquement.
Les résultats montrent que le traitement avec Saccharomyces boulardii réduit l’adhésion de C. albicans aux cellules vaginales. L’effet inhibiteur de l’adhésion des cellules de C. albincans aux cellules vaginales est dose-dépendant.
EXEMPLE 3
Les inventeurs ont évalué l’effet de Saccharomyces boulardii inactivée sur la vaginolysine qui est responsable de la lyse des cellules épithéliales vaginale est donc une source de carbone pour Gardnerella vaginalis.
Des monocouches de cellules VK2 cultivées dans des plaques à six puits en présence d’un milieu comprenant 10% de sérum de veau fœtal sont infectées par G. vaginalis à raison de 2 * 104 cellules par puits.
3 groupes sont formés : un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et non traitées ; un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par 10 mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée ; un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par 10 mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy. Après incubation et homogénéisation le puits sont lavés avec du PBS.
Les cellules VK2 sont lysées et la quantité de vaginolysine dans le lysat cellulaire est analysé.
Les résultats montrent qu’à 24h et 48h après l’infection par G. vaginalis, une grande quantité de vaginolysine est détectée dans les lysats des cellules VK2 en absence de traitement (groupe non traité) (voir la Figure 4).
Les résultats montrent qu’un traitement avec Saccharomyces boulardii lyophilisée à 1 Omg/ml permet de réduire la quantité de vaginolysine associée aux lysats de cellules VK2.
En outre, un traitement avec Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée montre une efficacité accrue d’inhibition de l’activité de la vaginolysine. Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée agit de manière plus efficace sur la vaginolysine induite par G. vaginalis que Saccharomyces boulardii lyophilisée non irradiée.
EXEMPLE 4
Les inventeurs ont évalué l’effet d’un traitement de Saccharomyces boulardii inactivée sur la perméabilité membranaire des cellules VK2 infectées par G. vaginalis.
Des monocouches de cellules VK2 sont cultivées dans des plaques à six puits en présence d’un milieu comprenant 10% de sérum de veau fœtal et sont infectées par G. vaginalis à raison de 2 * 106 cellules par puits.
3 groupes sont formés : un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et non traitées ; un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par 10 mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée ; un groupe de cellules épithéliales vaginales VK2 infectées par G. vaginalis et traitées par 10 mg/ml de Saccharomyces boulardii CNCM 1-745 lyophilisée irradiée par un rayonnement gamma de 25 kGy. Après incubation, du bleu trypan est ajouté dans les puits. Quand l’intégrité de la membrane plasmique des cellules est altérée le bleu trypan va pénétrer dans les cellules et les marquer en bleu.
Après incubation, les puits sont lavés avec du PBS. Le bleu trypan est élué et la perméabilité membranaire est quantifiée.
Les résultats montrent que l’infection des cellules VK2 par G. vaginalis entraîne une augmentation massive de la perméabilité membranaire (voir Figure 5, groupe non traité).
Un traitement avec Saccharomyces boulardii, sans infection préalable par G. vaginalis n’a pas d’effet sur la perméabilité membranaire des cellules VK2.
Un traitement avec Saccharomyces boulardii lyophilisée en une quantité de 10mg/ml permet de réduire d’environ 70% l’augmentation de la perméabilité membranaire induite par l’infection des cellules par G. vaginalis.
En outre, un traitement avec Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée avec un rayonnement gamma en une quantité de 10 mg/ml aboli complément l’augmentation de la perméabilité membranaire induite par l’infection par G. vaginalis. Ainsi, Saccharomyces boulardii lyophilisée irradiée abolit complètement la cytotoxicité liée à l’infection.

Claims

Revendications
1. Préparation de levure Saccharomyces boulardii soumise à un rayonnement bêta ou gamma.
2. Préparation selon la revendication 1 , dans laquelle la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement beta ou gamma d’au moins 10 kGy.
3. Préparation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la préparation de levure Saccharomyces boulardii est sous forme de poudre, notamment séchée ou lyophilisée.
4. Préparation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant essentiellement 0 Unités Formant Colonies (UFC) par gramme de préparation de levure Saccharomyces boulardii.
5. Procédé d’inactivation d’une préparation de levure Saccharomyces boulardii comprenant une étape de soumission de la préparation de levure Saccharomyces boulardii à un rayonnement bêta ou gamma.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la préparation de levure Saccharomyces boulardii est soumise à un rayonnement bêta ou gamma d’au moins 10 kGy.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la préparation de levure Saccharomyces boulardii est sous forme de poudre, notamment séchée ou lyophilisée.
8. Préparation de levure Saccharomyces boulardii inactivée susceptible d’être obtenue par le procédé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 5 à
7.
9. Préparation telle que définie dans l' une quelconque des revendications 1 à 4 et 8, pour une utilisation à titre de médicament.
10. Composition pharmaceutique ou dispositif médical comprenant une préparation telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 8.
11. Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 10, comprenant en outre une cire.
12. Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 10 ou 1 1 , pour une utilisation à titre d'ovule.
13. Préparation telle que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 8, composition pharmaceutique ou dispositif médical tel que défini dans l’une quelconque des revendications 10 à 12, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement de la vulvovaginite et/ou pour une utilisation dans la restauration de la flore vaginale, et/ou pour la prévention des récidives de vulvovaginite, et/ou la prévention ou le traitement des symptômes de vulvovaginite, chez un individu.
14. Produit cosmétique comprenant une préparation telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 8.
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