EP4185312A1 - Extrait de fleurs de bombax costatum riche en polysaccharides - Google Patents

Extrait de fleurs de bombax costatum riche en polysaccharides

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EP4185312A1
EP4185312A1 EP21755806.3A EP21755806A EP4185312A1 EP 4185312 A1 EP4185312 A1 EP 4185312A1 EP 21755806 A EP21755806 A EP 21755806A EP 4185312 A1 EP4185312 A1 EP 4185312A1
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EP
European Patent Office
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extract
skin
polysaccharides
disorders
advantageously
Prior art date
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Pending
Application number
EP21755806.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Sophie LECLERE- BIENFAIT
Stéphanie BREDIF
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Laboratoires Expanscience SA
Original Assignee
Laboratoires Expanscience SA
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Publication date
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to an extract of Bombax costatum flowers, said extract being rich in polysaccharides.
  • the invention also relates to a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition comprising such an extract.
  • the invention also relates to a method for extracting an extract of Bombax costatum flowers rich in polysaccharides, as well as the extract that can be obtained by said method.
  • the invention also relates to such a composition or such an extract for its use in the prevention or treatment of disorders or pathologies of the skin, mucous membranes or appendages, and in the prevention or treatment of vascular disorders.
  • the invention finally relates to a cosmetic care process for the skin, appendages or mucous membranes, with a view to improving their condition or their appearance, consisting in administering such a composition or such an extract.
  • the Bombax costatum belongs to the bombacaceae family (APG: Malvaceae).
  • the Bombax costatum is also called Bombax andrieui or Bombax houardii.
  • the Bombax costatum is more commonly called Kapok tree with red flowers, cheese tree, red kapok tree, false kapok tree, forest kapok tree, Voaka (in the Moré language), or Boumbou (in the Jula language).
  • Bombax is a pantropical genus comprising 8 species: 2 in Africa, 5 in Asia, and 1 in Oceania, present as far as the Solomon Islands. In the past, the delimitation of the genus Bombax was much wider. Bombax costatum is sometimes considered conspecific with Bombax buonopozense.
  • Bombax costatum is a fairly common food tree: the leaves are dried and eaten like those of the Baobab; the flowers, especially the calyxes, are also eaten.
  • Burkina Faso the bark is used to stain teeth red.
  • the flowers are commonly harvested for the fleshy calyx which is cooked and eaten as a vegetable.
  • the leaves are also eaten as a vegetable.
  • the immature fruits and sometimes the flowers are added as thickeners in sauces. Young immature fruits are also used in the preparation of a drink.
  • the seed oil is edible.
  • the flowers are highly valued as bees.
  • Maceration of the powdered root is eaten in sauce or applied as a bath against epilepsy. Bark preparations are applied to wounds to promote healing.
  • the bark is also used to prepare a medicine against trichomoniasis, amoebiasis and other forms of dysentery.
  • a bath in a stem bark extract is taken against insanity.
  • Powdered stem bark is used as a fumigant against headache.
  • a bark compress can be placed on the head.
  • the leaves are prescribed with other medicinal plants to treat leucorrhoea and diarrhoea.
  • An extract of crushed leaves is taken as a drink against problems during childbirth.
  • a bath in an extract of crushed leaves is taken repeatedly against convulsions.
  • a tea of dried leaves is taken or applied to the body against measles.
  • a decoction of leaves and stem or root bark is taken as a drink in cases of severe swelling.
  • a decoction of leaves and young twigs is drunk to treat jaundice.
  • a leaf decoction is also given to children to drink against rickets.
  • Different parts of the plant are used to promote lactation and as a tonic against fatigue. The skin is rubbed with leaves mixed with shea butter against leprosy.
  • a decoction of the bark and leaves and parts of other plants is taken against menstruation disorders.
  • the leaves are emollient and a warm bath in a leaf decoction may be prescribed for patients with fever, especially children.
  • the leaves are also used in hookworm treatments and the flowers in tapeworm treatments.
  • Polyosides or polysaccharides or glycans are arbitrarily defined as high molecular weight polymers resulting from the condensation of a large number of oses or sugars. They participate in different aspects in the life and even survival of plants. For example, they are responsible for the rigidity of the cell walls of higher plants (celluloses, hemi-cellulose, lignins, etc.), they are forms of energy storage (starch) and can protect tissues against dehydration because of their hydrophilic power ...
  • the skin microbiota is all the microorganisms (bacteria, viruses, fungi, etc.) residing on and in the skin.
  • the microbiota is present even in the dermis and adipose tissue and eccrine glands (Nakatsuji et al 2013).
  • the microbiota should not be confused with the microbiome which is the set of genes (genome of bacteria).
  • flora There are 2 major types of flora: - resident flora composed of commensal germs living at the expense of their host without causing damage; and
  • transient flora composed of saprophytic germs (harmless) and opportunistic pathogens.
  • the skin represents an environmental niche, a reservoir of nutrients for certain bacteria.
  • Bacteria can stimulate immune defenses; and the skin in response can develop a veritable anti-microbial shield that inhibits the growth of pathogens and stimulates the production of anti-microbial molecules, which contributes to maintaining a good state of skin health.
  • the same bacterium can be symbiotic or pathobiontic.
  • Symbionts lead to physiological inflammation, barrier protection, surveillance/tolerance (PAMs) by the skin and its innate immunity, absence of virulence, and sequestration of TLRs (Toll-like receptors).
  • Symbionts live in biofilms. It sometimes occurs for various intrinsic and/or environmental reasons, a loss of control of these symbionts which then become pathobionts.
  • the virulence factors of the microbiota increase, as well as inflammatory phenomena and the activation of the immune system. Commensal bacteria are sometimes eradicated.
  • atopic dermatitis Under so-called normal skin conditions, the host's immunity maintains the balance of the microbiota.
  • a deficiency in the immune system leads to dysbiosis and specific skin pathologies: atopic dermatitis, acne, psoriasis.
  • the Applicant has discovered that the extracts of Bombax costatum flowers, preferably of Bombax costatum calyxes, have cosmetic and dermatological properties never before described.
  • the subject of the invention is an extract rich in polysaccharides from flowers of Bombax costatum, preferably from calyxes of Bombax costatum.
  • the flower is the part of the plant comprising, from the outside to the inside, when complete:
  • the term "flower” includes at least the corolla and the calyx.
  • the flower can also be complete, that is to say include the calyx, the corolla, the androecium, and the gynoecium or pistil.
  • the extract according to the invention is preferably an extract of calyces of Bombax costatum.
  • extract rich in polysaccharides is meant an extract comprising mainly or essentially polysaccharides, that is to say that the majority compounds are polysaccharides.
  • the extract according to the invention thus advantageously comprises at least 15% by weight of polysaccharides, more advantageously at least 20% by weight, preferably at least 30% by weight, more advantageously at least 50% by weight, relative to the weight total dry extract.
  • the extract according to the invention thus advantageously comprises from 15% to 65% by weight of polysaccharides, more advantageously from 20% to 65% by weight, of preferably from 30% to 65% by weight, more advantageously from 50% to 65% by weight, relative to the total weight of the dry extract.
  • the percentages are expressed relative to the total weight of said dry extract (before any addition of a drying medium) and the assay is carried out according to the sulfuric phenol method (Dubois method) or according to the anthrone method - spectro assay - colorimetric of total sugars.
  • the polysaccharides present in the extract have an apparent molecular mass of between 1500 kDa and 6000 kDa, advantageously between 3000 kDa and 6000 kDa (determination by Gas Phase Chromatography).
  • the polysaccharides of the extract according to the invention comprise monosaccharides and derivatives chosen from the group consisting of galactose, rhamnose, galacturonic acid, glucuronic acid, and mixtures thereof.
  • galactose is meant D-galactose and L-galactose.
  • rhamnose is understood to mean D-rhamnose and L-rhamnose.
  • the polysaccharides of the extract according to the invention comprise a mixture of galactose, rhamnose, galacturonic acid, and glucuronic acid.
  • the polysaccharides of the extract according to the invention comprise (% by weight relative to the total weight of all the sugars (monosaccharides) present):
  • the extract according to the invention is advantageously substantially free of polyphenols.
  • the extract according to the present invention comprises less than 1% by weight of polyphenols, advantageously less than 0.5% by weight of polyphenols, relative to the total weight of the dry extract.
  • the extract rich in polysaccharides described above is advantageously obtained by solid/liquid extraction of the flowers, preferably of the calyces, of Bombax costatum, in water.
  • the polysaccharides can then be purified and/or re-solubilized in a suitable solvent in order to guarantee their physical and microbiological stability or dried by methods known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a method for preparing an extract rich in polysaccharides from flowers, preferably calyxes, of Bombax costatum, comprising at least one step of solid/liquid extraction in water and under optimal conditions. pH, time and temperature, known to those skilled in the art.
  • the method for preparing an extract rich in polysaccharides from flowers comprises the following successive steps: a) grinding the flowers, in particular the calyxes, of Bombax costatum; b) extraction of the flowers, in particular the calyxes, ground in water under optimal conditions of duration, pH and temperature; c) separation of the solid phase and the liquid phase by decantation, and/or centrifugation and/or precipitation and/or successive filtrations; and d) optionally, step of decolorizing the liquid phase using a suitable adjuvant; e) optionally, drying the extract obtained in step c) or d); and f) optionally, stabilization of the polysaccharides in a liquid medium in a solvent suitable for preserving the physico-chemical properties of the extract and for controlling microbial growth.
  • the process for preparing an extract rich in polysaccharides from flowers, preferably calyxes, of Bombax costatum comprises the following successive steps: a) grinding the flowers, in particular the calyxes, of Bombax costatum; b) extraction of the flowers, in particular the calyxes, crushed in water; c) separation of the solid phase and the liquid phase by decantation, and/or centrifugation and/or precipitation and/or successive filtrations; d) optionally, step of decolorization of the liquid phase using a suitable adjuvant; e) optionally, drying the extract obtained in step c) or d); and f) optionally, physical and microbiological stabilization of the extract obtained in step c), d) or e).
  • Step a) of grinding the plant can be carried out by methods known to those skilled in the art, in particular using a knife mill or a hammer mill.
  • Step b) of extraction is preferably carried out in the presence of water.
  • the percentage of crushed plant introduced into the water is advantageously between 2% and 10% w/w and preferably between 2% and 5% w/w, more advantageously 2% w/w.
  • This solid/liquid extraction is preferably carried out at a temperature comprised between 20°C and 100°C, in particular between 50°C and 90°C, more particularly between 70°C and 90°C, typically 90°C.
  • the extraction time is advantageously between 30 minutes and 4 hours, in particular between 1 hour and 3 hours, advantageously it is approximately 1 hour.
  • Step c) of separating the solid phase and the liquid phase is carried out by methods known to those skilled in the art, in particular by decantation, centrifugation and/or successive filtrations and/or purification by precipitation of the polysaccharides with using a suitable solvent and preferably ethanol or a saline solution.
  • the liquid phase obtained is advantageously purified and concentrated, for example by ultrafiltration and/or sterilizing filtration.
  • Step c) is carried out until a liquid phase is obtained which has perfect clarity and microbiological cleanliness of a degree less than or equal to 100 CFU/g in total germ.
  • step d) of bleaching the liquid phase is carried out, this is done by methods known to those skilled in the art, in particular by adding an adjuvant such as activated carbon or suitable and known bleaching earths. of the skilled person.
  • the extraction with water leads to an extract very poor in polyphenols or substantially devoid of polyphenols (polyphenols typically at trace state).
  • the extract according to the invention preferably obtained by solid/liquid extraction in water, typically has a content of less than 1% by weight, preferably less than 0.5% by weight, relative to the total weight of the dry extract.
  • the method according to the invention comprises at least one step of specific filtration and/or purification (step c)) and/or decolorization on activated carbon (step d)) which makes it possible to eliminate the remaining polyphenols if necessary.
  • the method comprises at least one purification step such as ultrafiltration which makes it possible to separate the “small” molecules such as the polyphenols from the “large” molecules (size greater than 1 million Daltons) such as the polysaccharides.
  • the treatment with activated carbon during step d) of discoloration also contributes to lowering the level of polyphenols of the extract to be advantageously present only in trace amounts at the end of the process according to the present invention.
  • the extract rich in polysaccharides according to the invention can be stabilized by a drying step e), by methods known to those skilled in the art.
  • Step e) of drying can, for example, be carried out in the presence of a support of the maltodextrin or acacia fiber type (Fibregum® company CNI).
  • the carrier content typically varies according to a ratio ranging from 0% to 80% carrier relative to the percentage of dry matter obtained in the liquid form of the extract.
  • the extract is preferably dried by freeze-drying or atomization in order to obtain a final powder.
  • Stage f) of physical and microbiological stabilization of the product obtained in stage c), d) or e) is advantageously carried out by partial elimination of the water and replacement with a solvent advantageously chosen from vegetable glycerin, glycols, and mixtures thereof, in particular from vegetable glycerin, glycols of vegetable origin and mixtures thereof, more particularly from a propanediol or propylene glycol, in particular 1,3-propanediol, and vegetable glycerin.
  • a solvent advantageously chosen from vegetable glycerin, glycols, and mixtures thereof, in particular from vegetable glycerin, glycols of vegetable origin and mixtures thereof, more particularly from a propanediol or propylene glycol, in particular 1,3-propanediol, and vegetable glycerin.
  • step f) is carried out in the liquid phase by reducing the amount of water by evaporation to less than 50% by weight and preferably less than 20% by weight, relative to the total mass of the extract and substitution with a bacteriostatic or bactericidal solvent chosen from vegetable glycerin, glycols, and mixtures thereof, in particular from vegetable glycerin, glycols of plant origin and mixtures thereof, more particularly from a propanediol or propylene glycol, in particular 1,3-propanediol, and vegetable glycerin.
  • the water/solvent ratio will then be advantageously between the ratios 50/50 and 0/100 (w/w) and preferably between 30/70 (w/w) and 10/90 (w/w) and advantageously
  • the extract rich in polysaccharides according to the invention can be obtained according to the following process: a′) Dissolving the ground flower at 2% (w/w) in water b′ ) Extraction with stirring for 1 h at 90° C.; c’) Purification by stages of successive filtrations; d’) Sterile filtration; and e′) Stabilization of the extract obtained by evaporation of water and addition of glycerin to obtain a water/glycerin ratio of between 50/50 and 0/100, advantageously between 30/70 and 10/90.
  • extract according to the invention designate the extract as such, as defined above, or the extract capable of being obtained by the process according to invention as described above.
  • the extract obtainable by the process according to the invention as described above has the same composition as the extract according to the invention as such, as defined above.
  • a subject of the invention is also a composition
  • a composition comprising an extract rich in polysaccharides of flowers, preferably calyxes, of Bombax costatum according to the invention and a water/solvent mixture in a water/solvent ratio (v/v) of between 50 /50 and 0/100, advantageously between 30/70 and 10/90, more advantageously 20/80, said solvent being chosen from glycols, vegetable glycerin and mixtures thereof, preferably from glycols of vegetable origin and glycerin vegetable, and preferably from 1,3-propanediol and vegetable glycerin.
  • the composition comprises from 0.001 to 30% by weight, advantageously 0.001% to 10% by weight, of an extract according to the invention (expressed by weight of dry extract relative to the total weight of the composition) and between 50 % and 99.999% by weight, advantageously between 70% and 99.999% by weight, of a water/solvent mixture, relative to the total weight of the composition, the water/solvent ratio being between 50/50 and 0/100, advantageously between 30/70 and 10/90, more advantageously 20/80, and the solvent being chosen from glycols, vegetable glycerin and mixtures thereof, preferably from glycols of vegetable origin and vegetable glycerin, and preferentially from 1,3-propanediol and vegetable glycerin.
  • the solvent is in an amount effective for a physical and microbiological stabilizing action of the composition according to the invention and in particular of the extract according to the invention.
  • a subject of the invention is also a composition comprising an extract rich in polysaccharides of flowers, preferably calyxes, of Bombax costatum according to the invention, as active principle, and where appropriate a suitable excipient.
  • the extract according to the invention is as defined in the paragraphs above concerning the extract as such and those concerning the extract capable of being obtained by the process according to the invention.
  • composition is advantageously cosmetic, pharmaceutical or dermatological.
  • Said composition is preferably formulated to be administered by external topical route.
  • the composition according to the invention comprises from 0.001 to 10%, typically from 0.01 to 5%, by weight of extract according to the invention, the weight of the extract being expressed as dry extract, relative to the weight composition total.
  • composition according to the invention may also comprise one or more other active principles.
  • composition according to the invention can be formulated in the form of various preparations suitable for topical administration and include in particular creams, emulsions, milks, ointments, lotions, oils, aqueous or hydro-alcoholic or glycolic solutions, powders, patches, sprays, shampoos, varnishes or any other product for external application.
  • the composition according to the invention may also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically acceptable excipient.
  • composition according to the present invention may also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant to those skilled in the art, in particular chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, filters chemicals or minerals, moisturizing agents, and thermal waters.
  • a person skilled in the art knows how to adapt the formulation of the composition according to the invention by using his general knowledge.
  • the optimal dosages and galenic forms of the compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmacological, dermatological or cosmetic treatment adapted to a patient or to an animal, such as for example the age or body weight of the patient or animal, the severity of his general condition, tolerance to treatment, side effects observed, type of skin.
  • a subject of the invention is also an extract according to the invention or a composition according to the invention for its use for preventing and/or treating disorders or pathologies of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and / or appendages (hair and nails) immature(s), normal(s) or mature/aged(s), in particular inflammatory reactions, oxidation reactions, disorders linked to radical attacks linked or not to pollution, disorders or pathologies linked to microbial attacks, barrier or homeostasis disorders, aging, in particular chronological and/or actinic aging, disorders or pathologies linked to mechanical and/or thermal attacks on the skin and/or mucous membranes and/or appendages; more advantageously inflammatory or irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucosa) immature(s), normal(s) or mature/
  • a subject of the invention is also an extract according to the invention or a composition according to the invention for its use for preventing and/or treating imbalances and/or disorders linked to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes ( gums, periodontium, genital mucosa) and/or appendages and/or their appendages, immature(s), normal(s) or mature/aged.
  • the extract according to the invention has a protective activity of the skin and / or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and / or appendages and / or their annexes, immature (s), normal (s) or mature(s)/aged(s), against mechanical, microbial, thermal and radical attacks.
  • the extract according to the invention acts for the defense of the microbiota and therefore makes it possible to fight against the microbiota imbalance.
  • the extract according to the invention makes it possible to stimulate the immune defenses of the skin and the cutaneous antioxidant system.
  • a subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for the manufacture of a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and/or treating disorders or pathologies of skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucosa) and/or appendages (hair and nails) immature(s), normal(s) or mature/aged(s), in particular inflammatory reactions , oxidation reactions, disorders linked to radical attacks whether or not linked to pollution, disorders or pathologies linked to microbial attacks, barrier or homeostasis disorders, ageing, in particular chronological aging and/or or actinic, disorders or pathologies linked to mechanical and/or thermal attacks on the skin and/or mucous membranes and/or appendages; more advantageously inflammatory or irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membrane
  • the invention also relates to the use of an extract according to the invention or a composition according to the invention for the manufacture of a pharmaceutical, cosmetic or dermatological composition for preventing and / or treating imbalances and / or disorders related to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and/or appendages and/or their appendages, immature(s), normal(s) or mature/aged(s) ).
  • the invention further relates to a method for preventing and / or treating disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and / or appendages (hair and nails) immature (s) , normal(s) or mature(s)/aged(s), in particular inflammatory reactions, oxidation reactions, disorders linked to radical attacks linked or not to pollution, disorders or pathologies linked to microbial attacks , barrier or homeostasis disorders, aging, in particular chronological and/or actinic aging, disorders or pathologies linked to mechanical and/or thermal attacks on the skin and/or mucous membranes and/or appendages; more advantageously inflammatory or irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages (hair and nails) and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) immature(s), normal (s) or mature(s
  • the invention also relates to a method for preventing and/or treating imbalances and/or disorders related to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and/or appendages and/or or their annexes, immature(s), normal(s) or mature(s)/aged(s), comprising the administration, in particular the topical administration, of an effective amount of an extract according to the invention or of a composition according to the invention, to a subject in need thereof.
  • composition or the extract according to the invention is intended for the prevention and/or treatment of inflammatory or irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or of the homeostasis of the skin, skin appendages (hair and nails) and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucosa) immature(s), normal(s) or mature(s)/aged(s) .
  • the inflammatory, irritative reactions, disorders or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin are: acne, rosacea or erythrocouperosis, vascular disorders, in particular redness and rosacea, dermatitis diaper, atopic dermatitis, eczema, contact dermatitis, irritative dermatitis, allergic dermatitis, seborrhoeic dermatitis (cradle cap), sensitive skin, reactive skin, dry skin (xerosis), skin dehydrated, skin with redness, skin erythema, aged or photo-aged skin, photosensitized skin, pigmented skin (melasma, post-inflammatory pigmentation...), skin with stretch marks, sunburn, irritation by chemical, physical (for example tension stress for pregnant women), bacteriological, fungal agents, skin aging, in particular photoaging and disorders linked to radical attacks linked to chemical pollution mic or atmospheric, and/or related to exposure to UV or IR.
  • the inflammatory, irritative reactions, disorders or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the mucous membranes are gingivitis (sensitive gums of newborns, hygiene problems, due to smoking or other), and irritation of the external or internal male or female genital spheres.
  • the inflammatory, irritative reactions, disorders or pathologies or disorders of the barrier or of the homeostasis of the appendages are brittle nails, fragile nails, weakened hair, brittle hair, dry hair.
  • the reactions, disorders or pathologies linked to the imbalance of the cutaneous microbiota are atopic dermatitis, eczema, the development of bad underarm odors, the weakening of the skin barrier, acne, psoriasis, and hidradenitis suppurativa.
  • the reactions, disorders or pathologies linked to the imbalance of the microbiota of the appendages are folliculitis, cradle cap, dandruff, itching of the scalp.
  • the reactions, disorders or pathologies linked to the imbalance of the microbiota of the mucous membranes are itching, irritation, candidiasis, and bacterial vaginosis.
  • a subject of the invention is also the cosmetic use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention, advantageously on healthy subjects, in the treatment and/or prevention of dehydrated skin; the skin with redness; aged or photo-aged skin; photosensitized skin; skin ageing, in particular photoaging; and disorders linked to radical attacks linked to chemical or atmospheric pollution, and/or linked to exposure to UV or IR.
  • a subject of the invention is also the cosmetic use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for caring for skin appendages, advantageously on healthy subjects, in particular for the treatment and/or prevention of brittle nails; brittle nails; weakened hair; brittle hair; and dry hair.
  • the invention also relates to a method for cosmetic care of the skin and/or appendages and/or mucous membranes, with a view to improving their condition and/or their appearance, advantageously on healthy subjects, consisting in administering a composition or a extract according to the present invention.
  • the invention relates to a method for the cosmetic care of the skin and/or appendages, with a view to preventing the alterations of the barrier and its dehydration, advantageously on healthy subjects, consisting in applying to the skin and/ or appendages a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and/or appendages, advantageously on healthy subjects, for preventing and/or treating alterations in the skin barrier; dehydrated skin; the skin with redness; aged skin or aged photo; photosensitized skin; skin ageing, in particular photoaging; disorders linked to mechanical or thermal aggression of the skin and disorders linked to free-radical attacks linked to chemical or atmospheric pollution, and/or linked to exposure to UV or IR rays, consisting in administering a composition or one of extracts according to the present invention.
  • FIGURES Figure 1 represents the growth curves of C. acnes and M.furfur (cf. Example 2-V-b.).
  • Figure 2 represents the effect of the active ingredient BCP on the bacterial growth of different strains in co-culture as a function of time (cf. Example 2-V-b.).
  • Figure 3 represents the analysis of the morphology of the RHEs after Hematoxylin/Eosin staining (cf. Example 2-VI-b.).
  • FIG. 4a and FIG. 4b represent the growth curves of the lactobacillus strains (cf. Example 2-VII-b.).
  • Figure 5 represents the analysis of the formation of biofilm by different strains of the cutaneous microbiota in the presence of the active ingredient BCP (see Example 2-IX).
  • Example 1 Preparation of a solution of polysaccharides from calyxes of Bombax costatum
  • Bombax costatum chalices are ground, then suspended with stirring in water at a proportion of 2% w/w chalices/water;
  • BCP extract The Bombax costatum polysaccharide extract according to Example 1 (called BCP extract) at 0.05% dry matter was added to the culture medium of normal human dermal fibroblasts (NHDLs) or of reconstituted melanized human epidermis.
  • the BCP extract increases the gene expression of 2 enzymes involved in the synthesis or remodeling of lipids within the stratum corneum:
  • the active ingredient BCP makes it possible to reinforce the barrier function of the epidermis and its hydration.
  • the active BCP increases the expression of syndecan-1 (SDC1).
  • SDC1 syndecan-1
  • Keratin 19 encoded by the KRT19 gene is an epithelial marker considered as a marker of epidermal stem cells.
  • the BCP extract By stimulating the expression of KRT19, the BCP extract has a protective effect on stem cells.
  • the BCP extract causes a decrease in the expression of the MITF gene.
  • the BCP extract exhibits melanogenesis inhibitory activity.
  • Table 2 below presents the most significant results of the BCP extract on the expression of genes in fibroblasts.
  • the BCP extract induces the expression of several enzymes involved in antioxidant defence: superoxide dismutases, in particular superoxide dismutase 1 (Cu/ZnSOD) encoded by the SOD1 gene and superoxide dismutase 2 (MnSOD) encoded by the SOD2.
  • superoxide dismutases in particular superoxide dismutase 1 (Cu/ZnSOD) encoded by the SOD1 gene and superoxide dismutase 2 (MnSOD) encoded by the SOD2.
  • the active BCP also induces the expression of one of the 2 isoforms of metallothionein 1 (MT1G).
  • the active BCP also induces the TXNRD1 gene encoding isoform 1 of thioredoxin reductase.
  • the joint induction of these genes coding for proteins possessing an antioxidant and/or detoxifying activity confers protection against UV rays and heavy metals resulting from urban pollution, for example.
  • the main function of fibroblasts present in the dermis is to produce, degrade, and therefore regulate the components of the extracellular matrix (ECM) with which they interact.
  • ECM extracellular matrix
  • the ECM is a complex structure formed by a network of collagen fibers, elastin fibers and structural glycoproteins.
  • ECM proteins regulated by the active ingredient BCP we find elastin (ELN) but also fibrillin-1 and -2 encoded respectively by the FBN1 and FBN2 genes.
  • the active BCP In addition to the induction of the ELN and FBN1 genes, the active BCP also induces FBN2, also constituting the micro fibrils.
  • the BCP active ingredient also acts on the collagen fibers since it increases the expression of the alpha 1 subunit of collagen 3 (COL3A1).
  • lamin B1 (LMNB1)
  • LMNB1 lamin B1
  • senescence related to age or associated with skin pathologies is accompanied by a loss of expression, at the protein and mRNA level, of lamin B1 (Dreesen, O. et al., 2013. The contrasting roles of lamin B1 in cellular aging and human disease Nucleus, 4(4), pp. 283-290).
  • LMNB1 LMNB1 within dermal fibroblasts testifies to an effect of the BCP active ingredient reducing senescence which may be associated with age or skin pathologies, and on the other hand s is beneficial for maintaining core structure and integrity.
  • the BCP extract induces a decrease in the expression of SESN2.
  • SESN2 in particular is involved in the UV response of skin cells. This goes in the direction of a greater activity of the mTORCl complex which goes hand in hand with a decrease in the autophagic activity of the cells and thus a regulatory effect of the mitophagic activity.
  • integrins are bound, via adhesion proteins, to intracellular actin filaments.
  • cytoplasmic adhesion proteins we find in particular talin-1 encoded by the TLN1 gene overexpressed by the active BCP. It constitutes the initial link between integrins and the actin cytoskeleton.
  • the binding of talin to integrins regulates their affinities for the ECM, whereas the binding of talin to actin constitutes the first link to the contractile machinery of cells.
  • Prostaglandin-endoperoxide synthases including cyclooxygenase-2 COX2 or PTGS2, catalyze the biosynthesis of prostaglandins (PG) from arachidonic acid in order to induce the inflammatory process via the secretion of cytokines and cutaneous vasodilation.
  • PG prostaglandins
  • the decrease in COX2 expression test ifies to the ability of the active BCP to reduce a possible inflammatory phenomenon that can be induced by different stimuli such as pathogens, UVs, ionizing radiation, etc.
  • ILla interleukin la
  • PGE2 prostaglandin-E2
  • ILip Interleukin 1b
  • TNFa Tumor Necrosis Factor a
  • IL6 Interleukin ⁇
  • IL8 Interleukin 8
  • Table 7 Dosage of TNF-alpha produced by KHNs under the effect of PMA stress $$$p ⁇ 0.001 vs. Control; *p ⁇ 0.05 ***p ⁇ 0.001 vs PMA One-way ANOVA followed by Tukey's test
  • Table 8 Dosage of PGE2 produced by KHNs under the effect of PMA stress $$$p ⁇ 0.001 vs Control; **p ⁇ 0.01 ***p ⁇ 0.001 vs PMA; ns Not Significant One-way ANOVA followed by Tukey's test
  • BCP extract Polysaccharides extract of Bombax costatum according to example 1
  • a photo was taken at the start of treatment and after 5 hours of incubation in order to measure the rate of progression of the HCNs within the lesion. The percentage of coverage was evaluated under the different conditions by image analysis.
  • BCP extract Polysaccharides extract of Bombax costatum according to example 1
  • AMPs anti-microbial peptides
  • TLR2 epidermal keratinocytes
  • the BCP extract significantly stimulated the gene and protein expression of defensins and TLR2; thus demonstrating anti-microbial activity and activation of immune defences.
  • RHE Human Reconstructed Epidermis
  • the counting of bacteria was carried out by counting the colonies after inoculation on specific agar of the ground RHE. The result is expressed in CFU/RHE (colony forming unit).
  • the BCP extract induced a marked inhibition of the adhesion of S. aureus to RHE. At 2%, the BCP extract also inhibited the adhesion of C. acnes. (See table 12)
  • the BCP extract significantly inhibited the adhesion of C. xerosis to the surface of explants (cf. table 13).
  • the BCP extract promotes a rebalancing of the skin microbiota by limiting the adhesion of pathogenic bacteria while preserving the adhesion of commensal bacteria.
  • BCP extract polysaccharide extract of Bombax costatum according to example 1
  • Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
  • Cutibacterium acnes ATCC 11827
  • Staphylococcus hominis ATCC 27844. - Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) and determination of the "activator" potential of bacterial growth:
  • the BCP extract was diluted in microplates at 0.25%; 0.5%; 1%; 2%; 4% and 8%, in the minimal culture medium specific to each strain.
  • the controls were prepared in a similar way to T sample: - A positive control for growth inhibition: Phenonip® 5% in the diluted medium,
  • the strains were added to the different conditions before incubation for 48 hours.
  • the BCP extract showed a nourishing effect against S. epidermidis, S. hominis and C. acnes strains and tended to inhibit the growth of S. aureus (bactericidal effect) (see figure 2).
  • Staphylococcus aureus The bacterium Staphylococcus aureus (S. aureus) is frequently detected in patients with atopic dermatitis.
  • the BCP extract according to Example 1 at 1% was applied as a 24-hour pre-treatment to the surface of reconstructed human epidermis (RHE).
  • RHEs were then treated topically by depositing the secretum (culture medium) of Staphylococcus aureus (ATCC 33592). After an additional 24 hours of incubation, a morphological analysis of the tissues was carried out after Hematoxylin/Eosin staining, as well as the analysis of the expression of barrier function markers by immunofluorescence. The level of expression of the proteins of interest was evaluated by semi-quantification using Image J software. b) Results
  • the secretum of S. aureus induced a moderate alteration in the morphology of the RHE: disorganization of the structure of the epidermis (basal layer), fewer grains of keratohyaline at the level of the granular layer.
  • the pre-treatment with the BCP extract preserved the morphology of the epidermis which are better organized, thicker and with a more marked production of keratohyaline grains.
  • barrier function markers As demonstrated by the results in Table 14, S. aureus secretum significantly reduced the level of expression of the barrier function markers studied: comeodesmosine, desmoglein-1 and filaggrin. This model is therefore representative of the negative impact of S. aureus on the barrier function, in particular in the pathophysiology of atopic dermatitis.
  • the BCP extract made it possible to counterbalance this decrease in expression.
  • Table 14 Expression of barrier markers in RHE $p ⁇ 0.05; $$ p ⁇ 0.01 vs Control; *p ⁇ 0.05;**p ⁇ 0.01 vs secretum - Unpaired t test
  • the BCP extract could therefore protect the skin from attack by S. aureus.
  • the prebiotic efficacy of the BCP extract according to example 1 was evaluated on 3 strains of Lactobacilli representative of the vaginal tract; in addition, the BCP extract was studied in a reconstructed model of vaginal epithelium colonized by strains of lactobacilli representative of the resident microflora.
  • L. gasseri ATCC 33323
  • LA-14 L. acidophilus
  • L. rhamnosus ATCC 53103
  • BCP extract Bombas costatum polysaccharide extract according to example 1
  • the bacterial growth was evaluated by spectrophotometric measurement of the OD at 600 nm (which gives an indication of the rate of bacterial replication), as well as the bacterial viability expressed in CFU/ml (to quantify the number viable residual bacteria).
  • the influence on bacterial metabolism was evaluated by measuring the production of lactic acid in the culture supernatants after 24 hours of incubation.
  • the BCP extract had a similar or even greater effect than the positive control (glucose) on the viability of lactobacilli, confirming its prebiotic effect.
  • BCP extract induced a prebiotic effect on L. acidophilus.
  • Lactic acid a product of the primary metabolism of lactobacilli, was quantified in L. Acidophilus culture media (see Table 16).
  • the BCP extract induced an increase in lactic acid production by L. acidophilus.
  • HVE colonized vaginal epithelium
  • Staphylococcus epidermidis ATCC 122278 and Corynebacterium striatum (ATCC 6940) strains were used.
  • Each bacterial strain was inoculated into a reconstituted sweat solution in the presence of the 0.1% BCP extract; 0.6% or 2% or 0.1% chlorhexidine digluconate (positive control). After 6h and 24h of incubation:
  • the bacterial viability was evaluated by bacterial count expressed in CFU/ml.
  • a sniff test was carried out in order to determine the olfactory signature qualitatively and semi-quantitatively (intensity of the odor): immediately after opening the vial, the odor was evaluated and scored by a trained operator: 1. Absent (comparable to positive control chlorhexidine 0.1%)
  • the BCP extract inhibited the odor produced by S. epidermidis and C. striatum compared to the negative control, without altering the viability of these bacteria (cf. table 19).
  • a biofilm is defined as the assembly of microbial cells associated with a living organism or a tissue and "coated” in a polysaccharide matrix.
  • Biofilm is one of the most important virulence factors in infectious diseases, it confers resistance to antibiotics, protection against defenses of the host, it increases the virulence of pathogenic bacteria by promoting their communication system (Quorum Sensing).
  • biofilms have been described in different pathologies or disorders: acne, rosacea, atopic dermatitis. Biofilms are also likely to disrupt healing mechanisms.
  • Biofilms Bacteria that associate in biofilm have an innate resistance to antibiotics, disinfectants and host defense systems; biofilms thus promote the persistence of pathogenic bacteria and their recalcitrance to treatment.
  • the involvement of the Staphylococcus aureus biofilm has been particularly described in the context of the pathophysiology of atopic dermatitis. Indeed, probably due to the alteration of the surface of the skin which allows it to adhere, 5. aureus is more easily found in the form of a biofilm in atopic skin; this state of biofilm promotes its resistance to treatment and increases its virulence, which results in the induction of chronic inflammation and pruritus, phenomena that contribute to the vicious circle of the pathogenesis of atopic dermatitis.
  • Staphylococcus epidermidis MFP04 healthy human skin strain (LMSM strain) characterized by metabolic analysis, AR 16S and genomic sequencing. It is a strain rather described as commensal.
  • Staphylococcus aureus MFP03 healthy human skin strain (FMSM strain) characterized by metabolic analysis, AR 16S and genomic sequencing. It is a commensal strain, an “opportunistic” pathogen, which can be responsible for certain skin infections and widely described as being involved in the pathophysiology of atopic dermatitis.
  • Corynebacterium xerosis CIP 100653T/ATCC373 strain from international databases. It is a commensal strain, involved in the production of axillary odors.
  • Cutibacterium propionibacterium acnes HL045PA1/HM-516 ribotype 4 (RT4): “acneic” strain characterized by Fitz-Gibbon et al. and obtained from an international database. It is a pathogenic strain, involved in the pathogenesis of acne.
  • Cutibacterium propionibacterium acnes HL110PA3/HM-554 ribotype 6 (RT6): “non-acneic” strain characterized by Fitz-Gibbon et al. and obtained from an international database. It is a commensal strain.
  • RT6 ribotype 6
  • LMSM strain healthy human skin strain characterized by metabolic analysis, 16S RNA and genomic sequencing. It is a commensal strain.
  • the active diluted l / 50 th was added to the medium at the beginning of culture. Bacterial growth was monitored in microplates over 24h, 48h or 72h depending on the strain. Absorbance was measured continuously using a microplate reader/incubator.
  • biofilm of bacterial species was studied in multi-well plates (96) using the crystal violet staining technique after culture in the presence of the active ingredient for 24, 48 or 72 hours depending on the strain.
  • the BCP extract of kapok polysaccharides according to the invention did not significantly modify the kinetics of bacterial growth under the conditions of the test.
  • the study of the production of biofilm by the various bacterial strains demonstrated the following effects of the extract of kapok polysaccharides (Cf figure 5): a significant inhibition of the formation of the biofilm of S. aureus; - an induction of the formation of the biofilm of S. epidermis; an absence of significant modulation of the formation of biofilms of M. luteus, C. xerosis or C. acnes RT6 (non-acne strain); inhibition of the formation of the biofilm of the acne strain C. acnes RT4 (acne strain).
  • the BCP extract of kapok polysaccharides inhibits the biofilm-forming capacity of pathogenic bacterial strains (S. aureus and C. acnes RT6 in particular), while preserving or even promoting the capacity of commensal bacteria to form a biofilm.

Abstract

L'invention se rapporte à un extrait de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, ainsi qu'à son procédé de préparation et l'extrait susceptible d'être obtenu par ledit procédé. L'invention a également pour objet une composition comprenant un tel extrait; la composition étant avantageusement cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique. L'invention concerne également une telle composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, ainsi que le déséquilibre ou les troubles associés au déséquilibre du microbiote cutané, des muqueuses, des phanères et annexes associées. L'invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.

Description

EXTRAIT DE FLEURS DE BOMBAX COSTATUM RICHE EN POLYSACCHARIDES
L’invention se rapporte à un extrait de fleurs de Bombax costatum, ledit extrait étant riche en polysaccharides. L’invention porte également sur une composition cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique comprenant un tel extrait. L’invention a également pour objet un procédé d’extraction d’un extrait de fleurs de Bombax costatum riche en polysaccharides, ainsi que l’extrait susceptible d’être obtenu par ledit procédé. L’invention concerne également une telle composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, et dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires. L’invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.
BOMBAX COSTATUM
Le Bombax costatum, appartient à la famille de bombacaceae (APG: Malvaceae). Le Bombax costatum est également appelé Bombax andrieui ou Bombax houardii. Le Bombax costatum est plus communément appelé Kapokier à fleurs rouges, fromager, kapokier rouge, faux kapokier, kapokier de forêt, Voaka (en langue Moré), ou Boumbou (en langue Jula).
Bombax est un genre pantropical comprenant 8 espèces : 2 en Afrique, 5 en Asie, et 1 en Océanie, présente jusque dans les îles Salomon. Autrefois, la délimitation du genre Bombax était bien plus large. Bombax costatum est parfois considéré comme conspécifique avec Bombax buonopozense.
Usages de Bombax costatum D’une manière générale, en Afrique, le Bombax costatum est un arbre à usage alimentaire assez fréquent : les feuilles sont séchées et mangées comme celles du Baobab ; les fleurs, et notamment les calices, sont également consommées. Au Burkina Faso, l’écorce est utilisée pour colorer les dents en rouge. On récolte couramment les fleurs pour le calice charnu qui est cuisiné et consommé comme légume. Les feuilles aussi se consomment comme légume. Les fruits immatures et parfois les fleurs sont ajoutées comme épaississants dans les sauces. Les jeunes fruits immatures sont également utilisés dans la préparation d’une boisson. L’huile des graines est consommable. Les fleurs sont très appréciées comme mellifères.
Plusieurs parties de l’arbre sont utilisées en médecine traditionnelle contre différentes maladies. La macération de la racine en poudre est consommée en sauce ou appliquée comme bain contre l’épilepsie. On applique des préparations d’écorce sur les blessures pour favoriser la guérison.
Au Sénégal et en Sierra Leone, des propriétés diurétiques sont attribuées à l’écorce de tige et de racine.
L’écorce est également utilisée pour préparer un médicament contre la trichomonase, l’amibiase et d’autres formes de dysenterie. Un bain dans un extrait d’écorce de tige se prend contre l’aliénation mentale. La poudre d’écorce de tige entre dans la composition d’un médicament appliqué en fumigation contre les maux de tête. Pour traiter les maux de tête ou les maux de dents, une compresse d’écorce peut être fixée sur la tête.
Les feuilles sont prescrites avec d’autres plantes médicinales pour traiter la leucorrhée et la diarrhée. Un extrait de feuilles broyées est absorbé comme boisson contre les problèmes pendant l’accouchement. Un bain dans un extrait de feuilles broyées se prend de manière répétée contre les convulsions. On absorbe une tisane de feuilles séchées ou on l’applique sur le corps contre la rougeole. La décoction de feuilles et d’écorce de tige ou de racine est absorbée comme boisson dans les cas d’œdèmes graves. On boit la décoction de feuilles et de jeunes rameaux pour traiter la jaunisse. La décoction de feuilles est également donnée à boire aux enfants contre le rachitisme. Différentes parties de la plante sont utilisées pour favoriser la lactation et comme tonique contre la fatigue. On frictionne la peau avec des feuilles mélangées à du beurre de karité contre la lèpre. Au Mali, la décoction de l’écorce et des feuilles et de parties d’autres plantes se prend contre les troubles de la menstruation. Les feuilles sont émollientes et un bain chaud dans une décoction de feuilles peut être prescrit aux patients fiévreux, en particulier les enfants. Les feuilles entrent également dans les traitements de l’ankylostome et les fleurs dans ceux contre le ténia.
Toutes ces données ont été tirées du rapport ethnobotanique rédigé par le Dr. Lassina SANOU, Colonel des Eaux et Forêts. Il travaille pour le Ministère de l’Environnement et du Développement Durable au Centre National des Semences Forestières (CNRS) du Burkina Faso, basé à Ouagadougou (décembre 2014).
LES POLYSACCHARIDES
Les polyosides ou polysaccharides ou glycannes sont arbitrairement définis comme des polymères de haut poids moléculaire résultant de la condensation d’un grand nombre d’oses ou sucres. Ils participent sous différents aspects à la vie voire survie des végétaux. A titre d’exemples, ils sont responsables de la rigidité des parois cellulaires des végétaux supérieurs (celluloses, hémi-cellulose, lignines ..), ce sont des formes de stockage de l’énergie (amidon) et peuvent protéger des tissus contre la déshydratation du fait de leur pouvoir hydrophile ... On distingue :
- Les polysaccharides homogènes (condensation d’un même ose) ; et
- Les polysaccharides hétérogènes (hexoses, pentoses, éther d’oses...), et les 2 catégories pouvant être linéaires ou ramifiées. LE MICROBIOTE et LE MICROBIOME
Le microbiote cutané est l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons...) résidant sur et dans la peau. Le microbiote est présent jusque dans le derme et tissu adipeux et glandes eccrines (Nakatsuji et al 2013). Le microbiote ne doit pas être confondu avec le microbiome qui est l’ensemble des gènes (génome des bactéries).
Il existe 2 grands types de flores : - la flore résidente composée de germes commensaux vivant aux dépens de leur hôte sans causer de dommages ; et
- la flore transitoire composée de germes saprophytes (inoffensifs) et pathogènes opportunistes.
Au niveau de la peau, il existe 1012 cellules bactériennes (106/cm2) pour 3.1010 cellules humaines (ratio 33:1 vs système gastro-intestinal : ratio 25:1) ; 500 germes différents ; 1 flore résidente ou transitoire ; et 4 Phyla prédominants.
Il existe de nombreuses interactions peau / microbiote :
- Des phénomènes de symbiose : la peau représente une niche environnementale, un réservoir en nutriments pour certaines bactéries.
Les bactéries peuvent stimuler les défenses immunitaires ; et la peau en réponse peut développer un véritable bouclier anti-microbien qui permet d’inhiber la croissance des pathogènes, et de stimuler la production de molécules anti-microbiennes, ce qui contribue au maintien d’un bon état de santé de la peau. Mais en fonction du contexte, une même bactérie peut être symbiotique ou pathobiontique. Les symbiotes amènent une inflammation physiologique, la protection de la barrière, une surveillance/tolérance (PAMs) par la peau et son immunité innée, une absence de virulence, et une séquestration des TLRs (récepteurs de type Toll). Les symbiotes vivent en biofïlms. Il survient parfois pour différentes raisons intrinsèques et/ou environnementales, une perte de contrôle de ces symbiotes qui deviennent alors des pathobiontes. Les facteurs de virulence du microbiote augmentent, ainsi que les phénomènes inflammatoires et l’activation du système immunitaire. Les bactéries commensales sont parfois éradiquées.
Dans des conditions, dites normales cutanées, l’immunité de l’hôte maintient l’équilibre du microbiote. Une déficience du système immunitaire amène à une dysbiose et à des pathologies cutanées particulières : dermatite atopique, acné, psoriasis. On voit augmenter la colonisation de la peau par P. acnés pendant l’acné, par Staphyloccocus aureus pendant la dermatite atopique, par la famille des Firmicutes lors du psoriaisis (et diminution des actinobactéries), par Malassezia furfur lors de la dermatite séborrhéique.
DESCRIPTION DE L’INVENTION
La Demanderesse a découvert que les extraits de fleurs de Bombax costatum, de préférence de calices de Bombax costatum, présentent des propriétés cosmétiques et dermatologiques jamais décrites jusqu’à présent. L’invention a pour objet un extrait riche en polysaccharides de fleurs de Bombax costatum, de préférence de calices de Bombax costatum.
En botanique, la fleur est la partie de la plante comprenant, de l'extérieur vers l'intérieur, lorsqu’elle est complète :
- le calice, formé par l’ensemble des sépales ; - la corolle, formée par l’ensemble des pétales ;
- l’androcée, c'est-à-dire l'ensemble des étamines (partie mâle), qui produit le pollen ; et
- le gynécée ou pistil, formé par l'ensemble des carpelles (partie femelle).
Dans la cadre de la présente invention, le terme « fleur » comprend au moins la corolle et le calice. La fleur peut également être complète, c’est-à-dire comprendre le calice, la corolle, l'androcée, et le gynécée ou pistil.
L’extrait selon l’invention est de préférence un extrait de calices de Bombax costatum.
Par « extrait riche en polysaccharides », on entend un extrait comprenant majoritairement ou essentiellement des polysaccharides, c’est-à-dire que les composés majoritaires sont des polysaccharides.
L’extrait selon l’invention comprend ainsi avantageusement au moins 15 % en poids de polysaccharides, plus avantageusement au moins 20 % en poids, de préférence au moins 30 % en poids, plus avantageusement au moins 50 % en poids, par rapport au poids total de l’extrait sec. L’extrait selon l’invention comprend ainsi avantageusement de 15 % à 65 % en poids de polysaccharides, plus avantageusement de 20% à 65 % en poids, de préférence de 30 % à 65 % en poids, plus avantageusement de 50 % à 65 % en poids, par rapport au poids total de l’extrait sec. Les pourcentages sont exprimés par rapport au poids total dudit extrait sec (avant ajout éventuel d’un support de séchage) et le dosage est réalisé selon la méthode au phénol sulfurique (méthode de Dubois) ou selon la méthode à l’anthrone - dosage spectro-colorimétrique des sucres totaux.
Selon la présente invention, les polysaccharides présents dans l’extrait ont une masse moléculaire apparente comprise entre 1500 kDa et 6000 kDa, avantageusement entre 3000 kDa et 6000 kDa (détermination par Chromatographie Phase Gazeuse).
Avantageusement, les polysaccharides de l’extrait selon l’invention comprennent les monosaccharides et dérivés choisis dans le groupe constitué du galactose, du rhamnose, de l’acide galacturonique, de l’acide glucuronique, et leurs mélanges. Dans le cadre de la présente invention, on entend par galactose le D-galactose et le L-galactose. De même, on entend par rhamnose, le D-rhamnose et le L-rhamnose.
Avantageusement, les polysaccharides de l’extrait selon l’invention comprennent un mélange de galactose, rhamnose, d’acide galacturonique, et d’acide glucuronique. Avantageusement, les polysaccharides de l’extrait selon l’invention comprennent (% en poids par rapport au poids total de tous les sucres (monosaccharides) présents) :
- De 10 % à 16 % de Galactose ;
- De 10 % à 17% de Rhamnose ;
- De 10 % à 17% d’acide galacturonique ; et
- De 3 % à 7 % d’acide glucuronique.
L’extrait selon l’invention est avantageusement substantiellement dépourvu de polyphénols. Typiquement, l’extrait selon la présente invention comprend moins de 1% en poids de polyphénols, avantageusement moins de 0,5% en poids de polyphénols, par rapport au poids total de l’extrait sec.
Dans le cadre de la présente invention, l’extrait riche en polysaccharides décrit ci-dessus est avantageusement obtenu par extraction solide/liquide des fleurs, de préférence des calices, de Bombax costatum, dans l’eau. Les polysaccharides pourront ensuite être purifiés et/ou re-solubilisés dans un solvant adéquat afin de garantir leur stabilité physique et microbiologique ou séchés par les procédés connus de l’Homme de l’art. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, comprenant au moins une étape d’extraction solide/liquide dans l’eau et dans les conditions optimales de pH, durée et de température, connues de l’homme de l’art. Avantageusement selon l’invention, le procédé de préparation d’un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices de Bombax costatum, comprend les étapes successives suivantes : a) broyage des fleurs, notamment des calices, de Bombax costatum ; b) extraction des fleurs, notamment des calices, broyées dans l’eau dans des conditions optimales de durée, pH et température ; c) séparation de la phase solide et de la phase liquide par décantation, et/ou centrifugation et/ou précipitation et/ou filtrations successives ; et d) éventuellement, étape de décoloration de la phase liquide grâce à un adjuvant adapté ; e) éventuellement, séchage de l’extrait obtenu à l’étape c) ou d) ; et f) éventuellement, stabilisation des polysaccharides en milieu liquide dans un solvant adapté à la préservation des propriétés physico-chimiques de l’extrait et au contrôle des développements microbiens.
Avantageusement selon l’invention, le procédé de préparation d’un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, comprend les étapes successives suivantes : a) broyage des fleurs, notamment des calices, de Bombax costatum ; b) extraction des fleurs, en particulier des calices, broyées dans l’eau ; c) séparation de la phase solide et de la phase liquide par décantation, et/ou centrifugation et/ou précipitation et/ou filtrations successives ; d) éventuellement, étape de décoloration de la phase liquide grâce à un adjuvant adapté ; e) éventuellement, séchage de l’extrait obtenu à l’étape c) ou d) ; et f) éventuellement, stabilisation physique et microbiologique de l’extrait obtenu à l’étape c), d) ou e).
L’étape a) de broyage de la plante peut être réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier, notamment à l’aide d’un broyeur à couteaux ou d’un broyeur à marteaux.
L’étape b) d’extraction est réalisée de préférence en présence d’eau. Le pourcentage de plante broyée introduite dans l’eau est avantageusement compris entre 2 % et 10% p/p et de préférence entre 2 % à 5% p/p, plus avantageusement 2% p/p. Cette extraction solide/liquide est réalisée de préférence à une température comprise entre 20°C et 100°C, en particulier entre 50°C et 90 °C, plus particulièrement entre 70°C et 90°C, typiquement 90°C. La durée d’extraction est avantageusement comprise entre 30 minutes et 4h, en particulier entre 1 h et 3 h, avantageusement elle est d’environ 1 heure.
L’étape c) de séparation de la phase solide et de la phase liquide est réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier, notamment par décantation, centrifugation et/ou filtrations successives et/ou purification par précipitation des polysaccharides à l’aide d’un solvant approprié et de préférence l’éthanol ou d’une solution saline. En particulier, durant l’étape c), la phase liquide obtenue est avantageusement purifiée et concentrée par exemple par ultrafiltration et/ou filtration stérilisante. L’étape c) est effectuée jusqu’à obtenir une phase liquide présentant une parfaite limpidité et une propreté microbiologique de degré inférieur ou égal à 100 UFC/g en germe totaux.
Lorsque l’étape d) de décoloration de la phase liquide est réalisée, celle-ci se fait par des méthodes connues de l’homme du métier, notamment par ajout d’un adjuvant tel que le charbon actif ou des terres décolorantes appropriées et connues de l’homme du métier.
Avantageusement selon l’invention, l’extraction à l’eau mène à un extrait très pauvre en polyphénols ou substantiellement dépourvu de polyphénols (polyphénols typiquement à l’état de traces). L’extrait selon l’invention, obtenu de préférence par extraction solide/liquide dans l’eau, a typiquement une teneur inférieure à 1% en poids, de préférence inférieure 0,5% en poids, par rapport au poids total de l’extrait sec. Avantageusement selon la présente invention, le procédé selon l’invention comprend au moins une étape de filtration spécifique et/ou de purification (étape c)) et/ou de décoloration sur charbon actif (étape d)) qui permet(tent) d’éliminer les polyphénols restants le cas échéant. En particulier, le procédé comprend au moins une étape de purification comme l’ultrafiltration qui permet de séparer les « petites » molécules telles que les polyphénols des « grosses » molécules (taille supérieure à 1 million de Daltons) telles que les polysaccharides. De plus, avantageusement, le traitement au charbon actif lors de l’étape d) de décoloration contribue également à faire baisser le taux de polyphénols de l’extrait pour être avantageusement présent uniquement à l’état de traces à l’issue du procédé selon la présente invention. Avantageusement, l’extrait riche en polysaccharides selon l’invention peut être stabilisé par une étape de séchage e), par des procédés connus de l’homme de l’art.
L’étape e) de séchage peut, par exemple, être réalisée en présence d’un support de type maltodextrines ou fibres d’acacia (Fibregum® société CNI). La teneur en support varie typiquement selon un ratio allant de 0% à 80% de support par rapport au pourcentage de matière sèche obtenu dans la forme liquide de l’extrait.
L’extrait est préférentiellement séché par lyophilisation ou atomisation afin d’obtenir une poudre finale.
L’étape f) de stabilisation physique et microbiologique du produit obtenu à l’étape c), d) ou e) est avantageusement effectuée par élimination partielle de l’eau et remplacement par un solvant avantageusement choisi parmi la glycérine végétale, les glycols, et leurs mélanges, en particulier parmi la glycérine végétale, les glycols d’origine végétale et leurs mélanges, plus particulièrement parmi un propanediol ou le propylène glycol, notamment le 1,3-propanediol, et la glycérine végétale. Avantageusement, l’étape f) est réalisée en phase liquide par réduction de la quantité d’eau par évaporation jusqu’à moins de 50% en poids et préférentiellement moins de 20% en poids, par rapport à la masse totale de l’extrait et substitution par un solvant bactériostatique ou bactéricide choisi parmi la glycérine végétale, les glycols, et leurs mélanges, en particulier parmi la glycérine végétale, les glycols d’origine végétale et leurs mélanges, plus particulièrement parmi un propanediol ou le propylène glycol, notamment le 1,3-propanediol, et la glycérine végétale. Le ratio eau/solvant sera alors avantageusement compris entre les ratios 50/50 et 0/100 (p/p) et préférentiellement entre 30/70 (p/p) et 10/90 (p/p) et avantageusement
20/80 (p/p). Préférentiellement, à titre d’exemple, l’extrait riche en polysaccharides selon l’invention peut être obtenu selon le procédé suivant : a’) Mise en solution de la fleur broyée à 2% (p/p) dans l’eau b’) Extraction sous agitation pendant lh à 90°C ; c’) Purification par étapes de filtrations successives ; d’) Filtration stérile ; et e’) Stabilisation de l’extrait obtenu par évaporation de l’eau et ajout de glycérine pour obtenir un ratio eau/glycérine compris entre 50/50 et 0/100, avantageusement entre 30/70 et 10/90. Dans la suite de la description, on parlera d’« extrait selon l’invention » pour désigner l’extrait en tant que tel, tel que défini ci-dessus, ou l’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessus. L’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessus présente la même composition que l’extrait selon l’invention en tant que tel, tel que défini ci-dessus.
L’invention a également pour objet une composition comprenant un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum selon l’invention et un mélange eau/solvant dans un ratio eau/solvant (v/v) compris entre 50/50 et 0/100, avantageusement entre 30/70 et 10/90, plus avantageusement 20/80, ledit solvant étant choisi parmi les glycols, la glycérine végétale et leurs mélanges, de préférence parmi les glycols d’origine végétale et la glycérine végétale, et préférentiellement parmi le 1,3- propanediol et la glycérine végétale. Avantageusement, la composition comprend de 0.001 à 30 % en poids, avantageusement 0.001 % à 10 % en poids, d’un extrait selon l’invention (exprimés en poids d’extrait sec par rapport au poids total de la composition) et entre 50 % et 99.999 % en poids, avantageusement entre 70 % et 99.999 % en poids, d’un mélange eau/solvant, par rapport au poids total de la composition, le ratio eau/solvant étant compris entre 50/50 et 0/100, avantageusement entre 30/70 et 10/90, plus avantageusement 20/80, et le solvant étant choisi parmi les glycols, la glycérine végétale et leurs mélanges, de préférence parmi les glycols d’origine végétale et la glycérine végétale, et préférentiellement parmi le 1,3- propanediol et la glycérine végétale. Selon cet aspect de l’invention, le solvant est en quantité efficace pour une action de stabilisation physique et microbiologique de la composition selon l’invention et notamment de l’extrait selon l’invention.
L’invention a également pour objet une composition comprenant un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum selon l’invention, en tant que principe actif, et le cas échéant un excipient approprié. L’extrait selon l’invention est tel que défini dans les paragraphes ci-dessus concernant l’extrait en tant que tel et ceux concernant l’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention.
La composition est avantageusement cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique. Ladite composition est de préférence formulée pour être administrée par voie topique externe. Avantageusement, la composition selon l’invention comprend de 0,001 à 10 %, typiquement de 0,01 à 5 %, en poids d’extrait selon l’invention, le poids de l’extrait étant exprimé en extrait sec, par rapport au poids total de la composition.
La composition selon l’invention peut comprendre en outre un ou plusieurs autres principes actifs.
La composition selon l’invention peut être formulée sous la forme de différentes préparations adaptées à une administration topique et incluent notamment les crèmes, les émulsions, les laits, les pommades, les lotions, les huiles, les solutions aqueuses ou hydro alcooliques ou glycoliques, les poudres, les patchs, les sprays, les shampooings, les vernis ou tout autre produit pour application externe. Selon sa nature (cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique), la composition selon l’invention peut en outre comprendre au moins un excipient cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement acceptable. Notamment, la composition selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement connu de l’homme du métier, en particulier choisi parmi les tensioactifs, les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, et les eaux thermales. L’homme du métier sait adapter la formulation de la composition selon l’invention en utilisant ses connaissances générales. Les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l’invention peuvent être déterminées selon les critères généralement pris en compte dans l’établissement d’un traitement pharmacologique, dermatologique ou cosmétique adapté à un patient ou à un animal, comme par exemple l’âge ou le poids corporel du patient ou de l’animal, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau.
L’invention a aussi pour objet un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), en particulier les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution, les troubles ou pathologies liées aux attaques microbiennes, les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, les troubles ou pathologies liées aux agressions mécaniques et/ou thermiques de la peau et/ou des muqueuse et/ou des phanères ; plus avantageusement les réactions ou pathologies inflammatoires, irritatives ou les troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau, des phanères et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s).
L’invention a aussi pour objet un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s). En effet, l’extrait selon l’invention présente une activité protectrice de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), à l’encontre des agressions mécaniques, microbiennes, thermiques et radicalaires. L’extrait selon l’invention agit pour la défense du microbiote et permet donc de lutter contre le déséquilibre microbiote. En outre, l’extrait selon l’invention permet de stimuler les défenses immunitaires de la peau et le système antioxydant cutanée.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour la fabrication d’une composition cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), en particulier les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution, les troubles ou pathologies liées aux attaques microbiennes, les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, les troubles ou pathologies liées aux agressions mécaniques et/ou thermiques de la peau et/ou des muqueuse et/ou des phanères ; plus avantageusement les réactions ou pathologies inflammatoires, irritatives ou les troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau, des phanères et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/ âgée(s) . L’invention a aussi pour objet l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour la fabrication d’une composition pharmaceutique, cosmétique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s).
L’invention a en outre pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), en particulier les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution, les troubles ou pathologies liées aux attaques microbiennes, les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, les troubles ou pathologies liées aux agressions mécaniques et/ou thermiques de la peau et/ou des muqueuse et/ou des phanères ; plus avantageusement les réactions ou pathologies inflammatoires, irritatives ou les troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau, des phanères (cheveux et ongles) et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), comprenant l’administration, notamment l’administration topique, d’une quantité efficace d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, à un sujet en ayant besoin.
L’invention a aussi pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), comprenant l’administration, notamment l’administration topique, d’une quantité efficace d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, à un sujet en ayant besoin. En particulier, la composition ou l’extrait selon l’invention est destiné(e) à la prévention et/ou au traitement des réactions ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau, des phanères (cheveux et ongles) et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/ âgée(s) .
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau sont : l’acné, la rosacée ou érythrocouperose, les troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses, la dermite du siège, la dermatite atopique, l’eczéma, la dermatite de contact, la dermatite irritative, la dermatite allergique, la dermite séborrhéique (croûte de lait), la peau sensible, la peau réactive, la peau sèche (xérose), la peau déshydratée, la peau avec rougeur, l’érythème cutané, la peau âgée ou photo âgée, la peau photosensibilisée, la peau pigmentée (mélasma, pigmentation post-inflammatoire...), la peau avec vergetures, les coups de soleil, les irritations par agents chimiques, physiques (par exemple contrainte de tension pour les femmes enceintes), bactériologiques, fongiques, le vieillissement cutanée, notamment du photo vieillissement et les désordres liés à des attaques radicalaires liées à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR.
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie des muqueuses sont les gingivites (gencives sensibles des nouveaux nés, problèmes d’hygiène, dus au tabagisme ou autres), et les irritations des sphères génitales mâles ou femelles externes ou internes.
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie des phanères sont les ongles cassants, les ongles fragiles, les cheveux fragilisés, les cheveux cassants, les cheveux secs.
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies liés au déséquilibre du microbiote cutané sont, la dermatite atopique, l’eczéma, le développement de mauvaises odeurs axillaires, la fragilisation de la barrière cutanée, l’acné, le psoriasis, et l’hidradénite suppuré. Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies liés au déséquilibre du microbiote des phanères sont les folliculites, croûtes de lait, pellicules, démangeaisons du cuir chevelu. Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies liés au déséquilibre du microbiote des muqueuses sont les démangeaisons, irritations, la candidose, et la vaginose bactérienne.
L’invention a également pour objet rutilisation cosmétique d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, avantageusement sur des sujets sains, dans le traitement et /ou la prévention de la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ou photo âgée ; la peau photosensibilisée ; du vieillissement cutané, notamment du photo vieillissement ; et des désordres liés à des attaques radicalaires liées à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR.
L’invention a également pour objet l’utilisation cosmétique d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour le soin des phanères, avantageusement sur des sujets sains, notamment pour le traitement et/ou la prévention des ongles cassants ; des ongles fragiles ; des cheveux fragilisés ; des cheveux cassants ; et des cheveux secs.
L’invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état et/ou leur aspect, avantageusement sur des sujets sains, consistant à administrer une composition ou un extrait selon la présente invention. En particulier, l’invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, en vue d’en prévenir les altérations de la barrière et sa déshydratation, avantageusement sur des sujets sains, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention. En particulier, l’invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, avantageusement sur des sujets sains, pour prévenir et/ou traiter les altérations de la barrière de la peau ; la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ou photo âgée ; la peau photosensibilisée ; le vieillissement cutané, notamment le photo vieillissement ; les désordres liés à aux agression mécanique ou thermique de la peau et les désordres liés à des attaques radicalaires liées à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR, consistant à administrer une composition ou un des extraits selon la présente invention.
Les exemples qui suivent permettent d’illustrer l’invention de manière non-limitative.
DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente les courbes de croissance de C. acnés et M.furfur (cf. Exemple 2- V-b.).
La Figure 2 représente l’effet de l’actif BCP sur la croissance bactérienne de différentes souches en co-culture en fonction du temps (cf. Exemple 2-V-b.).
La Figure 3 représente l’analyse de la morphologie des RHE après coloration Hématoxyline/Eosine (cf. Exemple 2-VI-b.).
La figure 4a et la figure 4b représentent les courbes de croissance des souches de lactobacilles (cf. Exemple 2-VII-b.).
La figure 5 représente l’analyse de la formation de biofilm par différentes souches du microbiote cutané en présence de l’actif BCP (Cf. Exemple 2-IX).
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d’une solution de polysaccharides de calices de Bombax costatum
- Les Calices de Bombax costatum sont broyés, puis mis en suspension sous agitation dans l’eau à la proportion de 2% p/p calices/eau ;
- Extraction une heure sous agitation à 90°C ;
- Centrifugation de la solution obtenue afin de séparer les résidus solides de la plante ;
- Décoloration par ajout de charbon actif et filtration ;
- Concentrât des polysaccharides par Ultrafiltration 15 kDa ; - Ajout de glycérine et évaporation de l’eau sous vide afin d’obtenir une concentration finale en glycérine de 80% p/p. Profil analytique de la solution de polysaccharides obtenue
- Solution visqueuse orangée
- Matière sèche (m/m) : 1 ,24%
- pH : 6,3 - Cendres 8,9%
- Sucres totaux (détermination par la méthode à l’anthrone) : 35%
- Viscosité de la solution (TA, mobilel, 2 rpm) : 2592 Cps
Profil analytique des polysaccharides obtenus (matière sèche) : - Masse moléculaire moyenne (détermination par Chromatographie Phase Gazeuse) :
3711 kDa
- Composition (détermination par Chromatographie Phase Gazeuse) :15% Galactose ; 17% rhamnose ; 17% acide galacturonique ; 5% acide glucuronique Exemple 2 : activités biologiques
Les activités biologiques potentielles de l’extrait ont été recherchées par un test de modulation d’expression de gènes sur fibroblastes dermiques et épidermes reconstruits mélanisés. Ainsi, l’expression de 96 gènes d’intérêts majeurs en physiologie cutanée et cosmétique a été étudiée par PCR-array sur des fibroblastes et des épidermes reconstruits mélanisés. a. Matériels et Méthodes :
L’extrait de polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) à 0,05% de matière sèche a été ajouté dans le milieu de culture de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDLs) ou d’épidermes humains mélanisés reconstitués.
Après 6 heures ou 24 heures d’incubation, l’expression des marqueurs sélectionnés a été évaluée par RT -PCR quantitative (carte micro fluidique TaqMan). La variation d’expression des marqueurs étudiés par rapport au témoin a été exprimée en quantité relative (QR, QR>1 : augmentation, QR<1 : diminution). b. Résultats : Les résultats les plus significatifs montrant l’effet de l’extrait BCP sur l’expression de gènes dans des épidermes reconstruits sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Variations de l’expression de gènes d’intérêt dans des épidermes humains reconstruits mélanisés
Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle = 1 p value déterminée suite à un test de Student
Ces résultats montrent que l’extrait BCP, en faisant varier l’expression génique de certains marqueurs, a un intérêt particulier dans les activités suivantes :
La synthèse et le remodelage des lipides dans la fonction barrière de l’épiderme
L’extrait BCP augmente l’expression génique de 2 enzymes impliquées dans la synthèse ou le remodelage des lipides au sein de la couche cornée : Le gène RAB1 IA pour une GTPase (Ras-related protein Rab-llA) et le gène SMPD1 pour la sphingomyelin phosphodiesterase.
En augmentant l’expression de ces deux gènes, l’actif BCP permet de renforcer la fonction barrière de l’épiderme et son hydratation. Les mécanismes de régulation de l’adhésion cellulaire, de la migration, prolifération et différenciation de kératinocytes :
L’actif BCP augmente l’expression du syndécan-1 (SDC1). La protection des cellules souches :
La kératine 19 encodée par le gène KRT19 est un marqueur épithélial considéré comme marqueur des cellules souches épidermiques.
En stimulant l’expression de KRT19, l’extrait BCP a un effet protecteur des cellules souches.
L’inhibition de la mélanogénèse :
L’extrait BCP entraîne une diminution de l’expression du gène MITF. Ainsi, en diminuant l’expression du gène MITF, l’extrait BCP présente une activité inhibitrice de la mélanogénèse.
Le tableau 2 ci-après présente les résultats les plus significatifs de l’extrait BCP sur l’expression de gènes dans des fîbroblastes.
Tableau 2 : Variations de l’expression de gènes d’intérêt dans des fîbroblastes dermiques humains normaux (NHDFs)
Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle =1 p value déterminée suite à un test de Student
Ces résultats montrent une activité de l’extrait BCP dans les axes suivants :
La protection contre le stress oxydant :
L’extrait BCP induit l’expression de plusieurs enzymes impliquées dans la défense anti- oxydante : les superoxydes dismutases, notamment la superoxyde dismutase 1 (Cu/ZnSOD) codée par le gène SOD1 et la superoxyde dismutase 2 (MnSOD) codée par le gène SOD2.
L’actif BCP induit également l’expression d’une des 2 isoformes de la métallothionéine 1 (MT1G). L’actif BCP induit également le gène TXNRD1 codant pour l’isoforme 1 de la thiorédoxine réductase. L’induction conjointe de ces gènes codant pour des protéines possédant une activité antioxydante et/ou détoxifïante confère une protection contre les UVs et les métaux lourds issus par exemple de la pollution urbaine. La matrice extracellulaire et l’élasticité de la peau pour un effet anti-âge :
La fonction principale des fîbroblastes présents dans le derme est de produire, de dégrader, et donc de réguler les composants de la matrice extracellulaire (MEC) avec laquelle ils interagissent. La MEC est une structure complexe formée d’un réseau de fibres de collagène, de fibres d’élastine et de glycoprotéines de structure. Parmi les protéines de la MEC régulées par l’actif BCP, on retrouve l’élastine (ELN) mais aussi les fïbrillines-1 et -2 encodées respectivement par les gènes FBN1 et FBN2. En plus de l’induction des gènes ELN et FBN1, l’actif BCP induit également FBN2, constituant également les micro fibrilles. En parallèle de son action sur les fibres élastiques, l’actif BCP agit également sur les fibres de collagène puisqu’il augmente l’expression de la sous-unité alpha 1 du collagène 3 (COL3A1).
L’action conjointe de BCP sur l’expression des constituants des fibres d’élastine et de collagène ainsi que sur MMPI et la paxilline va dans le sens d’un effet sur l’élasticité de la peau, particulièrement intéressante dans un contexte anti-âge.
Par ailleurs, il est démontré que le vieillissement cutané est associé à la diminution de la prolifération des fîbroblastes. On observe une diminution d’expression du facteur de prolifération Ki-67 lié à l’âge (Ma, C. et al., 2011. Expression of metallothionein-I and II in skin ageing and its association with skin prolifération. Br. J. Dermatol., 164(3), pp. 479-482 ). L’actif BCP augmente l’expression de MKI67 témoignant d’une augmentation de la prolifération des cellules, ce qui renforce son effet anti-âge. La lamine nucléaire :
Il a été montré que l’expression de la lamine B1 (LMNB1) au sein de la peau diminue avec l’âge. La lamine B1 est ainsi considérée comme un marqueur de la sénescence des cellules de la peau. En effet, il a été montré que la sénescence liée à l’âge ou associée à des pathologies de la peau s’accompagne d’une perte d’expression, au niveau protéique et ARNm, de la lamine B1 ( Dreesen , O. et al., 2013. The contrasting rôles oflamin B1 in cellular aging and human disease. Nucléus, 4(4), pp. 283-290 ).
Dès lors, une augmentation d’expression de LMNB1 au sein des fîbroblastes de derme témoigne d’un effet de l’actif BCP réduisant la sénescence pouvant être associée à l’âge ou à des pathologies de la peau, et d’autre part s’avère bénéfique pour le maintien de la structure et de l’intégrité du noyau.
L’autophagie :
L’extrait BCP, induit une diminution de l’expression de SESN2. SESN2 en particulier est impliqué dans la réponse aux UV des cellules de la peau. Ceci va dans le sens d’une activité plus importante du complexe mTORCl qui va de pair avec une diminution de l’activité autophagique des cellules et ainsi un effet régulateur de l’activité mitophagique.
La cicatrisation cutanée :
Au sein des sites d’adhésion focale, les intégrines sont liées, par l’intermédiaire de protéines d’adhésion, aux filaments d’actine intracellulaires. Parmi ces protéines cytoplasmiques d’adhésion, on retrouve notamment la taline-1 encodée par le gène TLN1 surexprimé par l’actif BCP. Elle constitue le lien initial entre les intégrines et le cytosquelette d’actine. La liaison de la taline aux intégrines régule leurs affinités pour la MEC alors que la liaison de la taline à l’actine constituerait le premier lien à la machinerie contractile des cellules. Ces 2 évènements sont particulièrement importants pour la migration cellulaire. En effet, celle-ci implique l’attachement et le détachement cycliques des intégrines à la MEC mais aussi la génération d’une force requise pour la translocation du contenu cellulaire (Atherton, P. et al., 2015. Vinculin Controls talin engagement with the actomyosin machinery. Nat. Commun, Volume 6, p. 10). L’augmentation d’expression du gène de la taline-1 combinée à celle de la paxilline témoigne d’une action sur la migration des cellules bénéfique notamment dans le processus de cicatrisation cutanée. La sous-expression de PTGS2 dans un contexte anti-inflammatoire :
Les prostaglandin-endoperoxide synthases dont fait partie la cyclooxygénase-2 COX2 ou PTGS2 catalysent la biosynthèse des prostaglandines (PG) à partir de l’acide arachidonique afin d’induire le processus inflammatoire via la sécrétion de cytokines et la vasodilatation cutanée.
La diminution d’expression de COX2 témoigne de la capacité de l’actif BCP à réduire un éventuel phénomène inflammatoire pouvant être induit par différents stimuli comme des agents pathogènes, les UVs, des radiations ionisantes, etc.
I. Activité Anti-inflammatoire
L’activité anti-inflammatoire de l’extrait de Polysaccharide de Bombax costatum selon l’exemple 1 a été mise en évidence vis-à-vis d’une inflammation induite par un stress au PMA. а) Matériels et méthodes
Des Kératinocytes Humains Normaux (KHN), ont été traités pendant 24 heures à 37°C par l’extrait de Polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) à 0,01% et/ou à 0,05% de matière sèche (MS) ou par la Dexaméthasone ou l’Indométacine à 10-7M (molécules de référence anti-inflammatoires). Les cellules ont ensuite été traitées par ajout de PMA à 10 pg/ml (Phorbol Myristate Acetate, agent induisant l’inflammation) pendant 16 heures à 37°C.
A l’issue du traitement, les quantités d’ILla (interleukine la), de PGE2 (Prostaglandine- E2), d’ILip (Interleukine 1b), de TNFa (Tumor Necrosis Factor a), d’IL6 (Interleukine б) et d’IL8 (Interleukine 8) sécrétées ont été mesurées par la technique ELISA dans les surnageants de culture.
La significativité des résultats a été évaluée par une analyse de variance à un facteur suivie d’un test de Tuckey. b) Résultats Comme le montrent les résultats des tableaux 3 à 8, l’extrait BCP a signifîcativement inhibé la production des médiateurs inflammatoires IL la, IL1 b, IL6, IL8, TNFa et PGE2 dans des kératinocytes sous conditions inflammatoires.
Ces résultats montrent l’activité anti-inflammatoire de l’extrait BCP. Tableau 3 : Dosage d’ILl-alpha produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $$p<0,01 vs Contrôle ; *p<0,05 **p<0,01 vs PMA ; ns Non Significatif ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey
Tableau 4 : Dosage d’ILl-beta produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $$p<0,01 vs Contrôle ; *p<0,05 vs PMA ; ns Non Significatif
ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey
Tableau 5 : Dosage d’IL6 produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $p<0,05 vs Contrôle ; *p<0,05 ***p<0,001 vs PMA ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey
Tableau 6 : Dosage d’IL8 produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $$$p<0,001 vs Contrôle ; *p<0,05 ***p<0,001 vs PMA ; ns Non Significatif ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey
Tableau 7 : Dosage de TNF-alpha produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $$$p<0,001 vs Contrôle ; *p<0,05 ***p<0,001 vs PMA ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey Tableau 8 : Dosage de PGE2 produit par des KHN sous l’effet d’un stress PMA $$$p<0,001 vs Contrôle ; **p<0,01 ***p<0,001 vs PMA ; ns Non Significatif ANOVA à un facteur suivi d’un test de Tukey
II. Activité sur la cicatrisation épidermique.
Le potentiel d’activité sur la cicatrisation épidermique de l’extrait de Polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) a été évalué par étude de la migration kératinocytaire, première étape du processus de réépithélisation cutanée. a) Matériels et méthodes
Scratch Assay : une lésion a été pratiquée sur un tapis de monocouche de kératinocytes humains normaux (KHN) à confluence avant traitement par l’extrait de BCP à 0,01% et 0,05% de matière sèche ou par l’EGF (Epidermal Growth Factor) à 100ng/ml.
Une photo a été réalisée en début de traitement et après 5 heures d’incubation afin de mesurer la vitesse de progression des KHN au sein de la lésion. Le pourcentage de recouvrement a été évalué dans les différentes conditions par analyse d’image.
La significativité des résultats a été évaluée par un test t de Student. b) Résultats
Comme démontré par les résultats du tableau 9, l’extrait BCP a significativement stimulé la migration kératinocytaire, confirmant ainsi son potentiel activateur de la cicatrisation cutanée. Tableau 9 : Migration de KHN
*p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 vs contrôle ; ttest
III. Activité sur les défenses innées anti-microbiennes L’effet de l’extrait de Polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) a été évalué sur l’expression de peptides anti-microbiens (PAMs) et du TLR2 dans des kératinocytes épidermiques. a) Matériels et méthodes Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été traités pendant 24h ou 48h par l’extrait BCP ou l’ILl b à 100ng/ml (référence positive).
A la fin du traitement, l’expression génique de hBD2, hBD3 et TLR2 a été analysée par RT -PCR quantitative en temps réel. Par ailleurs, les quantités de TLR2 et d’hBD2 intracellulaire ont été mesurées par ELISA. b) Résultats
Comme démontrés par les résultats des tableaux 10 et 11, l’extrait BCP a signifîcativement stimulé l’expression génique et protéique des défensines et de TLR2 ; démontrant ainsi une activité anti-microbienne et d’activation des défenses immunitaires.
Tableau 10 : Expression génique des PAMs et TLR2 dans des kératinocytes (QR : Quantité Relative)
*p<0,05 ; **p<0,01 ; *** p<0,001 ; ns Non Significatif vs Contrôle ANOVA à un facteur suivi d’un test de Dunnett
Tableau 11 : Production d’hBD2 et TLR2 dans des kératinocytes (Expression protéique intracellulaire) *p<0,05 ; **p<0,01 ; *** p<0,001 ; ns Non Significatif vs Contrôle
ANOVA à un facteur suivi d’un test de Dunnett
IV. Activité sur l’adhésion bactérienne L’effet de l’extrait BCP a été évalué sur l’adhésion de 4 souches bactériennes à la surface d’épidermes humains reconstruites (RHE) ou d’explants de peau a) Matériels et méthodes
- Etude de l’adhésion de S. aureus, S. epidermidis et C. acnés :
Des Epiderme Reconstruit Humains (RHE) ont été incubés pendant 15min en présence de l’extrait de polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) à 0,6% et 2%. Puis après deux rinçages par du PBS, les souches bactériennes Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) ou Cutibacterium acnés (ATCC 6919) ont été déposées à la surface des RHE pendant 4h. Après élimination des bactéries non adhérentes par 4 lavages successifs, les RHE ont été à nouveau incubés une nuit.
Le dénombrement des bactéries a été réalisé par comptage des colonies après ensemencement sur gélose spécifique des broyais de RHE. Le résultat est exprimé en UFC/RHE (Unité Formant Colonie).
- Etude de l’adhésion de C. xerosis : Des expiants de peau ont été incubés pendant 2h en présence de l’extrait BCP à 0,6% et 2 %. Une suspension de Corynebacterium xerosis (DSM 20743) a ensuite été déposée à la surface des expiants de peau pendant 2 heures. Après rinçage, ceux-ci ont été de nouveau incubés 24h. Les bactéries adhérentes à la surface des expiants de peau ont été récupérées par grattage puis ensemencées sur gélose afin de réaliser le dénombrement exprimé en UFC/cm2 b) Résultats
Aux deux concentrations testées, l’extrait BCP a induit une nette inhibition de l’adhésion de S. aureus sur des RHE. A 2%, l’extrait BCP a également inhibé l’adhésion de C. acnés. (Cf. tableau 12)
L’extrait de BCP a signifîcativement inhibé l’adhésion de C. xerosis à la surface d’explants (cf. tableau 13).
L’extrait de BCP permet de promouvoir un rééquilibrage du microbiote cutané en limitant l’adhésion de bactéries pathogènes tout en préservant l’adhésion de bactéries commensales.
Tableau 12 : Adhésion bactérienne sur RHE
Tableau 13 : Adhésion de C. xerosis sur expiants de peau **p<0,01 ; *** p<0,001 - ANOVA à un facteur suivi d’un test de Dunnett V. Activité sur la croissance bactérienne
L’activité anti-microbienne ou au contraire prébiotique de l’extrait de polysaccharides de Bombax costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) a été évaluée par l’étude de la croissance bactérienne de différentes souches cultivées séparément ou en co-culture. a) Matériels et méthodes
Les souches microbiennes suivantes, représentatives du microbiote cutané, ont été utilisées :
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) ;
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) ; Cutibacterium acnés (ATCC 11827) ;
Corynebacterium xerosis (ATCC 373) ;
Malassezia furfur (ATCC 14521) ;
Staphylococcus hominis (ATCC 27844). - Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et détermination du potentiel « activateur » de la croissance bactérienne :
L’extrait BCP a été dilué en microplaque à 0,25% ; 0,5% ; 1% ; 2% ; 4% et 8%, dans le milieu de culture minimal spécifique à chaque souche. Les contrôles ont été préparés de façon similaire à T échantillon : - Un contrôle positif d’inhibition de croissance : Phenonip® 5 % dans le milieu dilué,
- Un contrôle constitué de milieu de croissance dilué,
- Un contrôle constitué de milieu de croissance.
Les souches ont été ajoutées aux différentes conditions avant incubation de 48h.
En présence d’un trouble révélateur d’une croissance microbienne après 48 heures, le prélèvement d'un aliquot a été réalisé pour les trois plus fortes concentrations offrant encore une croissance des micro-organismes. Ces aliquots ont été déposées dans des plaques distinctes en dilutions décimales, de manière à déterminer la concentration des populations par dilutions limites.
Après 48h d’incubation, l'activation de la croissance bactérienne a été démontrée par détermination de la concentration de chaque micro-organisme (effectuée simultanément par lecture visuelle et mesure de l’absorbance à 620 nm (turbidité)) en fonction des dilutions décimales réalisées. Enfin, les résultats ont été exprimés par comparaison à la croissance bactérienne obtenues dans les témoins sans produit.
- Détermination de l’effet sur la croissance de bactéries en co-culture : Les souches S. aureus, S. epidermidis, S. hominis et C. acnés en co-culture ont été incubées pendant 48h en présence de l’extrait BCP à 0,25% ; 0,5% et 1% ou de Phénonip 0,5 %, contrôle positif d’inhibition de croissance.
Un aliquot a été prélevé et déposé sur géloses spécifiques aux souches sélectionnées. Après 48h d’incubation, le dénombrement a été effectué pour chaque souche. b) Résultats
- Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et détermination du potentiel « activateur » de la croissance bactérienne :
Sur C. acnés, une inhibition de la croissance bactérienne a été observée avec une CMI déterminée à 4%. La cinétique de croissance a montré un effet bactériostatique de l’extrait BCP vis-à-vis de C. acnés (cf. figure 1).
De même, la cinétique de croissance de M. furfur a montré un effet bactériostatique de l’extrait BCP vis-à-vis de cette levure (cf. figure 1).
- Détermination de l’effet sur la croissance de bactéries en co-culture :
L’extrait BCP a montré un effet nourricier vis-à-vis des souches S. epidermidis, S. hominis et C. acnés et a tendance à inhiber la croissance de S. aureus (effet bactéricide) (cf. figure 2).
Ces résultats montrent un effet protecteur de l’équilibre du microbiote cutané.
VI. Défense contre les dommages induits par S aureus
La bactérie Staphylococcus aureus (S. aureus) est fréquemment détectée sur des patients atteints de dermatite atopique.
La quantité de S. aureus présente chez ces patients est corrélée avec le degré de sévérité de la pathologie et joue un rôle important dans la physiopathologie. L’objectif de cette étude a été de reproduire le stress provoqué par cette bactérie sur l’épiderme, pour cela du secretum de S. aureus a été appliqué à la surface de RHE afin d’en étudier les conséquences sur des protéines de la différenciation épidermique. a) Matériels et méthodes
L’extrait BCP selon l’exemple 1 à 1% a été appliqué en pré-traitement de 24 heures à la surface d’épidermes humains reconstruits (RHE). Les RHE ont ensuite été traités topiquement par dépôt du secretum (milieu de culture) de Staphylococcus aureus (ATCC 33592). Après 24 heures supplémentaires d’incubation, une analyse morphologique des tissus a été réalisée après coloration Hématoxylline/Eosine, ainsi que l’analyse de l’expression de marqueurs de la fonction barrière par immunofluorescence. Le niveau d’expression des protéines d’intérêt a été évalué par semi-quantification à l’aide du logiciel Image J. b) Résultats
Analyse morphologique :
Comme le montre la figure 3, le secretum de S. aureus a induit une altération modérée de la morphologie des RHE : désorganisation de la structure de l’épiderme (couche basale), grains de kératohyaline moins nombreux au niveau de la couche granuleuse. Le pré-traitement par l’extrait BCP a préservé la morphologie des épidermes qui sont mieux organisés, plus épais et avec une production de grains de kératohyaline plus marquée.
Expression de marqueurs de la fonction barrière : Comme le démontrent les résultats du tableau 14, le secretum de S. aureus a signifîcativement diminué le niveau d’expression des marqueurs de la fonction barrière étudiés : Coméodesmosine, Desmogléine-1 et Filaggrine. Ce modèle est donc représentatif de l’impact négatif de S. aureus sur la fonction barrière, en particulier dans la physiopathologie de la dermatite atopique. L’extrait BCP a permis de contre-balancer cette diminution d’expression.
Tableau 14 : Expression des marqueurs de la barrière dans les RHE $ p<0,05 ; $$ p<0,01 vs Contrôle ; *p<0,05 ; **p<0,01 vs secretum - Unpaired t test
L’extrait BCP pourrait donc protéger la peau d’une agression par S. aureus.
VII. Activité protectrice de la microflore vaginale
L’efficacité prébiotique de l’extrait BCP selon l’exemple 1 a été évalué sur 3 souches de Lactobacilles représentatives du tractus vaginal ; par ailleurs, l’extrait BCP a été étudié dans un modèle reconstruit d’épithélium vaginal colonisé par des souches de lactobacilles représentatives de la microflore résidente. a) Matériels et méthodes
- Etude de l’effet prébiotique sur L. gasseri, L. acidophilus, L. rhamnosus :
Les souches L. gasseri (ATCC 33323), L. acidophilus (LA-14) et L. rhamnosus (ATCC 53103) ont été ensemencées dans un milieu appauvri en présence de l’extrait de polysaccharides de Bombas costatum selon l’exemple 1 (appelé extrait BCP) à 0,25% ; 0,5% ; 1% et 2% ou avec addition de 2% de glucose (contrôle positif).
Après 4h et 24h d’incubation, la croissance bactérienne a été évaluée par mesure spectrophotométrique de la DO à 600 nm (qui donne une indication du taux de réplication bactérienne), ainsi que la viabilité bactérienne exprimée en CFU/ml (pour quantifier le nombre de bactéries résiduelles viables).
L’influence sur le métabolisme bactérien a été évaluée par mesure de la production d’acide lactique dans les surnageants de culture après 24h d’incubation.
- Etude de l’effet protecteur sur épithélium vaginal reconstitué : L’extrait BCP à 1% a été appliqué à la surface d’un épithélium vaginal humain reconstitué (HVE), dans le même temps, les épithélia ont été colonisés par un mélange de L. crispatus (DSM 20356) et L. gasseri (DSM 20243), mimant la microflore résidente physiologique. Après 6h d’incubation, l’expression génique du peptide anti-microbien hBD2 a été évaluée par RT -PCR en temps réel. b) Résultats
- Etude de l’effet prébiotique sur L. gasseri, L. acidophilus, et L. rhamnosus Le taux de croissance bactérien évalué par mesure de la DO a permis de montrer un effet positif de l’extrait BCP sur la croissance de L. gasseri, de façon dose-dépendante dès 4h (effet prébiotique précoce) ; ainsi que sur L. acidophilus, avec plus particulièrement un effet prébiotique après 24h d’incubation (phase stationnaire) (Cf. Figure 4a et 4b).
De façon globale, l’extrait BCP a eu un effet similaire voire supérieur au contrôle positif (glucose) sur la viabilité des lactobacilles, confirmant son effet prébiotique.
L’évaluation de la viabilité bactérienne (cf. tableau 15) a montré que l’extrait BCP à 2% montrait l’effet prébiotique le plus important à 4h sur les 3 souches de lactobacilles, en particulier L. gasseri et, dans une moindre mesure, L. rhamnosus. Cette tendance se prolonge jusqu’à 24h pour L. rhamnosus tandis qu’une baisse importante de la viabilité a été observée à 24h pour L. gasseri, celle-ci s’explique par la starvation liée à la culture en milieu appauvri.
A 0,25% l’extrait de BCP a induit un effet prébiotique sur L. acidophilus.
Tableau 15 : Viabilité bactérienne des souches de lactobacilles *p<0,05 ; **p<0,01 - ANOVA test
L’acide lactique, produit du métabolisme primaire des lactobacilles, a été quantifié dans les milieux de culture L. Acidophilus (cf. tableau 16).
L’extrait BCP a induit une augmentation de la production d’acide lactique par L. acidophilus.
Tableau 16 : Quantification de l’acide lactique produit par L. acidophilus
*p<0,05 ; **p<0,01 - ANOVA test Globalement, ces résultats montrent un effet prébiotique de l’extrait BCP vis-à-vis de L. acidophilus. Cet effet est plus important à la concentration de 2%. Tableau 17 : Résumé de l’effet prébiotique sur les lactobacilles ++ effet supérieur au contrôle positif ; effet prébiotique élevé + effet équivalent au contrôle positif ; effet prébiotique - pas de modification par rapport au contrôle ; absence d’effet prébiotique - Etude de l’effet protecteur sur épithélium vaginal reconstitué (HVE) :
Sur le modèle d’épithélium vaginal (HVE) colonisé, l’extrait BCP a signifîcativement augmenté l’expression génique d’hBD2 (cf. tableau 18).
Ce résultat montre un effet booster des défenses épithéliales locales pour protéger la muqueuse des risques d’infection. Tableau 18 : Expression génique d’hBD2 dans des HVE colonisés par les Lactobacilles QR : Quantité Relative
VIII. Sniff test in vitro (activité déodorante) Un « sniff test » in vitro a été réalisé afin d’évaluer la capacité de l’extrait BCP selon l’exemple 1 à inhiber ou modifier la production d’odeurs par les principales espèces bactériennes responsables des odeurs axillaires : C. striatum, S. epidermidis. a) Matériels et méthodes
Les souches Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) et Corynebacterium striatum (ATCC 6940) ont été utilisées.
Chacune de ces souches possède une signature olfactive typique, résultat de la métabolisation de composants de la sueur : S. epidermidis : Acide valérianique et propionique ;
C. striatum : Sulphanyl alcohols.
Chaque souche bactérienne a été inoculée dans une solution de sueur reconstituée en présence de l’extrait BCP à 0,1% ; 0,6% ou 2% ou de chlorhexidine digluconate à 0,1% (contrôle positif). Après 6h et 24h d’incubation :
La viabilité bactérienne a été évaluée par comptage bactérien exprimé en CFU/ml.
Un sniff test a été réalisé afin de déterminer la signature olfactive qualitativement et semi- quantitativement (intensité de l’odeur) : immédiatement après ouverture du vial, l’odeur a été évaluée et scorée par un opérateur entraîné : 1. Absente (comparable au contrôle positif chlorhexidine 0,1%)
2. Modérée
3. Intense (signature olfactive bactérie-spécifique) b) Résultats
L’extrait BCP a inhibé l’odeur produite par S. epidermidis et C. striatum comparativement au contrôle négatif, sans altérer la viabilité de ces bactéries (cf. tableau 19).
Ces résultats démontrent une activité déodorante.
Tableau 19 : Viabilité et odeur des bactéries dans la sueur reconstituée **p<0,01 - ANOVA test vs Contrôle
IX. Étude du biofilm bactérien
Un biofïlm est défini comme l’assemblage de cellules microbiennes associées à un organisme vivant ou un tissu et « enrobées » dans une matrice polysaccharidique.
Le biofilm est l’un des facteurs de virulence les plus importants dans les maladies infectieuses, il confère une résistance aux antibiotiques, une protection contre les défenses de l’hôte, il accroît la virulence des bactéries pathogènes en favorisant leur système de communication (Quorum Sensing).
Dans la peau, des bio films ont été décrits dans différentes pathologies ou troubles : l’acné, la rosacée, la dermatite atopique. Les biofïlms sont également susceptibles de perturber les mécanismes de cicatrisation.
Les bactéries qui s’associent en bio film ont une résistance innée aux antibiotiques, aux désinfectants et aux systèmes de défense de l’hôte ; les biofilms favorisent ainsi la persistance des bactéries pathogènes et leur récalcitrance aux traitements.
Pour exemple, l’implication du biofïlm de staphylococcus aureus a été particulièrement décrit dans le cadre de la physiopathologie de la dermatite atopique. En effet, probablement en raison de l’altération de la surface de la peau qui lui permet d’adhérer, 5. aureus se trouve plus facilement sous forme de biofïlm dans les peaux atopiques ; cet état de biofilm favorise sa résistance aux traitements et augmente sa virulence qui se traduit par l’induction d’une inflammation chronique et d’un prurit, phénomènes qui contribuent au cercle vicieux de la pathogénèse de la dermatite atopique.
L’effet de l’extrait BCP selon la présente invention a été évalué sur la capacité de formation du biofilm de bactéries de la microflore cutanée. a) Matériels et Méthodes
- - Souches microbiennes à l’essai :
Staphylococcus epidermidis MFP04 : souche de peau humaine saine (souchier LMSM) caractérisée par analyse métabolique, AR 16S et séquençage génomique. C’est une souche plutôt décrite comme commensale.
Staphylococcus aureus MFP03 : souche de la peau humaine saine (souchier FMSM) caractérisée par analyse métabolique, AR 16S et séquençage génomique. C’est une souche commensale, pathogène « opportuniste », qui peut être responsable de certaines infections cutanées et largement décrite comme impliquée dans la physiopathologie de la dermatite atopique. Corynebacterium xerosis CIP 100653T/ATCC373 : souche issue des banques de données internationales. C’est une souche commensale, impliquée dans la production des odeurs axillaires.
Cutibacterium (propionibacterium) acnés HL045PA1/HM-516 ribotype 4 (RT4) : souche “acnéique” caractérisée par Fitz-Gibbon et al. et obtenue d’une banque de données internationales. C’est une souche pathogène, impliquée dans la pathogénèse de l’acné.
Cutibacterium (propionibacterium) acnés HL110PA3/HM-554 ribotype 6 (RT6) : souche “non-acnéique” caractérisée par Fitz-Gibbon et al. et obtenue d’une banque de données internationales. C’est une souche commensale. - Micrococcus luteus 0116 : souche de la peau humaine saine (souchier LMSM) caractérisée par analyse métabolique, ARN16S et séquençage génomique. C’est une souche commensale.
- Pré-étude de l’effet de l’actif BCP sur les cinétiques de croissance bactérienne : Une étude contrôle a été réalisée afin de vérifier l’absence d’effet de l’actif BCP sur la croissance des 6 souches étudiées.
L’actif dilué au l/50emea été ajouté dans le milieu dès le début de la culture. La croissance bactérienne a été suivie en microplaques sur 24h, 48h ou 72h selon les souches. L’absorbance a été mesurée en continu grâce à un lecteur/incubateur de microplaques.
- Étude de l’effet de l’actif BCP sur la formation de biofïlm par la technique au cristal violet :
La production de biofilm des espèces bactériennes a été étudiée en plaques multipuits (96) par la technique de coloration par le cristal violet après culture en présence de l’actif pendant 24h, 48h ou 72h selon les souches.
Les résultats sont exprimés en pourcentage en fonction de la valeur de formation de biofilm en milieu contrôle (sans actif). Les différences statistiques ont été établies à l’aide du test Mann-Whitney. b) Résultats
L’extrait BCP de polysaccharides de kapokier selon l’invention n’a pas modifié signifîcativement les cinétiques de croissance bactérienne dans les conditions de l’essai. L’étude de la production de biofïlm par les différentes souches bactériennes a mis en évidence les effets suivants de l’extrait de polysaccharides de kapokier (Cf figure 5) : une inhibition significative de la formation du biofïlm de S. aureus; - une induction de la formation du biofïlm de S. epidermis ; une absence de modulation significative de la formation des biofilms de M. luteus, de C. xerosis ou de C. acnés RT6 (souche non acnéique) ; une inhibition de la formation du biofilm de la souche acnéique C. acnés RT4 (souche acnéique). Avantageusement, l’extrait BCP de polysaccharides de kapokier inhibe la capacité de formation de biofïlm de souches bactériennes pathogènes (S. aureus et C. acnés RT6 notamment ), tout en préservant voire favorisant la capacité de bactéries commensales à former un biofilm.
Ces résultats sont en faveur de l’effet de l’actif sur la préservation de l’équilibre du microbiote, avec en particulier un bénéfice dans des pathologies telles que la dermatite atopique ou l’acné.

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, comprenant au moins 15% de polysaccharides par rapport au poids total de l’extrait sec, les polysaccharides présentant une masse moléculaire apparente comprise entre 1500 et 6000 kDaltons, avantageusement entre 3000 et 6000 kDaltons.
2. Extrait selon la revendication 1, comprenant au moins 30% en poids de polysaccharides, par rapport au poids total de l’extrait sec et avantageusement au moins 50% en poids de polysaccharides, par rapport au poids total de l’extrait sec.
3. Extrait selon Tune quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel les polysaccharides comprennent les monosaccharides et dérivés choisis dans le groupe constitué du galactose, du rhamnose, de l’acide galacturonique, de l’acide glucuronique, et leurs mélanges, avantageusement les polysaccharides comprennent un mélange de galactose, rhamnose, d’acide galacturonique, et d’acide glucuronique.
4. Extrait selon Tune quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les polysaccharides comprennent 10 à 16% de galactose ; 10 à 17% de Rhamnose ; 10 à 17% d’acide galacturonique ; et 3 à 7% d’acide glucuronique.
5. Extrait selon Tune quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il est obtenu par extraction solide/liquide des fleurs et particulièrement des calices, de Bombax costatum, dans l’eau.
6. Procédé de préparation d’un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, tel que défini selon Tune quelconque des revendications 1 à 4, comprenant au moins une étape d’extraction solide/liquide dans l’eau.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes successives suivantes : a) broyage des fleurs, notamment des calices, de Bombax costatum , b) extraction des fleurs, en particulier des calices, broyées dans l’eau ; c) séparation de la phase solide et de la phase liquide par décantation, et/ou centrifugation et/ou précipitation et/ou filtrations successives ; d) éventuellement, étape de décoloration de la phase liquide grâce à un adjuvant adapté ; e) éventuellement, séchage de l’extrait obtenu à l’étape c) ou d) ; et f) éventuellement, stabilisation physique et microbiologique de l’extrait obtenu à l’étape c), d) ou e).
8. Composition comprenant en tant que principe actif un extrait riche en polysaccharides de fleurs, de préférence de calices, de Bombax costatum, tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou susceptible d’être obtenu à partir du procédé selon les revendications 6 et 7, et avantageusement un excipient approprié.
9. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou composition selon la revendication 8, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter
- les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, avantageusement choisis parmi la dermatite atopique, l’eczéma, le développement de mauvaises odeurs axillaires, la fragilisation de la barrière cutanée, l’acné, le psoriasis, l’hidradénite suppuré, les folliculites, les croûtes de lait, les pellicules, les démangeaisons notamment du cuir chevelu, les irritations, la candidose et la vaginose bactérienne ; et/ou
- les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, en particulier les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR, la peau photosensibilisée, les troubles ou pathologies liées aux attaques microbiennes, les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, les troubles ou pathologies liées aux agressions mécaniques et/ou thermiques de la peau et/ou des muqueuse et/ou des phanères.
10. Procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état et/ou leur aspect, sur des sujets sains, avantageusement pour prévenir et/ou traiter les altérations de la barrière de la peau ; la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ou photo âgée ; le vieillissement cutané, notamment le photo vieillissement ; les désordres liés aux agressions mécaniques ou thermiques de la peau et les désordres liés à des attaques radicalaires liées à la pollution chimique ou atmosphérique, consistant à administrer un extrait tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 une composition telle que définie selon la revendication 8.
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