EP4615420A1 - Nanoclusters à base de zinc, leurs procédés d'obtention et leurs utilisations pour lutter contre les carences en zinc - Google Patents

Nanoclusters à base de zinc, leurs procédés d'obtention et leurs utilisations pour lutter contre les carences en zinc

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Publication number
EP4615420A1
EP4615420A1 EP23804675.9A EP23804675A EP4615420A1 EP 4615420 A1 EP4615420 A1 EP 4615420A1 EP 23804675 A EP23804675 A EP 23804675A EP 4615420 A1 EP4615420 A1 EP 4615420A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
zinc
nanoclusters
histidine
acetate dihydrate
selenium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23804675.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Ariane BOUDIER
Igor CLAROT
François FEILLET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Lorraine
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Hospitalier Universitaire de Nancy
Original Assignee
University of Lorraine
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Hospitalier Universitaire de Nancy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Lorraine, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Centre Hospitalier Universitaire de Nancy filed Critical University of Lorraine
Publication of EP4615420A1 publication Critical patent/EP4615420A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof

Definitions

  • Zinc-based nanoclusters their production processes and their uses to combat zinc deficiency
  • the present invention relates to the field of chemistry, and more particularly pharmaceutical chemistry.
  • the invention relates to zinc-based nanoclusters, their processes for obtaining them and their uses to combat zinc deficiencies.
  • the zinc-based nanoclusters described in the present invention are more particularly nanoclusters comprising a metallic core consisting solely of zinc or a metallic core consisting of a mixture of zinc and selenium, however with a clear majority of zinc within said core ( from 80 to 99.99% zinc).
  • Zinc is an essential trace element in the human body, which is why its deficiency can have many consequences on health. Zinc activates more than 200 enzymes. It plays a major role in all stages of protein synthesis, it activates DNA and RNA polymerases and is essential for the regulation of histones. It is involved in the metabolism of polyunsaturated fatty acids and in the synthesis of prostaglandins. It is also involved in stabilizing the structure of certain peptide hormones (insulin, glustin, thymulin) and plays an antioxidant role via different mechanisms. Zinc is also necessary for carbohydrate and lipid metabolism, and plays a major role in cell growth and immune system function. Finally, zinc also has its importance in the perception of different flavors. Via these different mechanisms, zinc makes the body more resistant, particularly during growth and aging. In conclusion, zinc has beneficial effects on health and strengthens natural immune defenses.
  • Zinc deficiency is common, particularly in all situations of malnutrition. It manifests itself by immune disorders, oligospermia, skin lesions, particularly at the periorificial level, hair loss, delays in healing, diarrhea as well as vision and smell disorders. and taste generating anorexia. In pregnant women, zinc deficiency can lead to malformations or fetal hypotrophy. Finally, in children, zinc deficiency is accompanied by delayed growth and sexual maturation.
  • zinc deficiency Treatment of zinc deficiency is carried out with zinc preparations/supplements taken orally.
  • taking zinc may be associated with the occurrence of digestive disorders, such as stomach aches, diarrhea, abdominal cramps.
  • zinc can also leave a metallic taste in the mouth several hours after taking the zinc preparation orally.
  • zinc preparations can interfere with the intestinal absorption of copper (zinc is an oral treatment for Wilson's disease) and cause transient hypocupremia.
  • a zinc deficiency can also be accompanied by a selenium deficiency.
  • Selenium like zinc, is an essential trace element for the human body and plays a key role throughout the body.
  • selenium Most of the biological functions of selenium pass through selenoproteins, including glutathione peroxidases which have a key role in the body's antioxidant system. Their activities are directly linked to dietary selenium intake. Selenium is also involved in the synthesis of thyroid hormones.
  • Keshan disease The disease classically attributed to severe selenium deficiency is referred to as Keshan disease. It occurs with very low dietary selenium intake ( ⁇ 10 pg/day) and causes dilated cardiomyopathy with severe heart failure. Its description comes from a region of China where food intake is very low (soils poor in selenium).
  • nanoclusters based on zinc which are zinc nanoclusters or nanoclusters of zinc and selenium, said nanoclusters having particularly suitable characteristics for combating respectively against zinc deficiencies and against zinc and selenium deficiencies. It is also to the merit of the Inventors to have developed an original synthesis process for zinc-based nanoclusters, namely zinc nanoclusters and zinc and selenium nanoclusters.
  • ⁇ they comprise a metallic core based on zinc covered over its entire surface with a mixed layer comprising histidine (His), acetate ions (Ac) and ascorbate ions (Asc), said metallic core being consisting of zinc (Zn) or a mixture of zinc and selenium (ZnSe), the quantity of zinc within said mixture ranging from 80 to 99.99% and the quantity of selenium within said mixture ranging from 0.01 to 20%, the percentages being percentages by weight relative to the total weight of the mixture,
  • nanoclusters have a stability over time of at least 12 months, and preferably 12 to 18 months when the nanoclusters are in dry form and are stored at a temperature of 4°C and under nitrogen,
  • said zinc-based nanoclusters can also be designated by the formula “ZnNC@HisAcAsc” or “ZnSeNC@HisAcAsc” depending on whether the metallic core consists of zinc or a mixture of zinc and selenium.
  • nanoclusters of the invention may, however, be referred to in the following as “nanoclusters”, “zinc-based nanoclusters”, “zinc nanoclusters”, “zinc and selenium nanoclusters”, “ZnNC nanoclusters”, “ZnNC” (“ZnNC” meaning “zinc nanocluster”), “ZnSeNC nanoclusters”, “ZnSeNC” (“ZnSeNC” meaning “zinc and selenium nanocluster”), “ZnNC@HisAcAsc nanoclusters”,
  • the invention also relates to a process for preparing said zinc-based nanoclusters which comprises the following steps:
  • the invention also relates to zinc-based nanoclusters as defined above, for use to combat zinc deficiencies or against zinc and selenium deficiencies.
  • the invention also relates to a composition comprising the zinc-based nanoclusters of the invention, said composition being a drug, a food supplement or a food composition.
  • composition of the invention is further characterized in that it is in a form suitable for oral administration.
  • Figure 1 is a schematic representation of a zinc nanocluster “ZnNC@HisAcAsc” of the invention, consisting of a metallic zinc core surrounded by a mixed corona comprising histidine, acetate and ascorbate ions.
  • Figure 2 is a high-performance liquid chromatography analysis (reverse phase partitioning) of zinc nanoclusters, showing the presence of acetate ions on the surface of the zinc metal core.
  • the chromatogram was obtained on previously purified fractions (size exclusion chromatography) of zinc nanoclusters. A chromatogram of a sodium acetate reference solution was also carried out.
  • Figure 3 is a high-performance liquid chromatography analysis (reverse phase partitioning) of zinc nanoclusters, showing the presence of histidine and ascorbate ions on the surface of the zinc metal core.
  • Figure 5 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometers) of the zinc nanoclusters evaluated by Taylor dispersion.
  • Figure 6 is a UV-Visible spectrum of zinc nanoclusters.
  • Figure 7 is a fluorescence spectrum of zinc nanoclusters.
  • Figure 8 is a schematic representation of a zinc and selenium nanocluster “ZnSeNC@HisAcAsc” of the invention, consisting of a core of zinc and selenium surrounded by a mixed crown comprising histidine, acetate ions and ascorbate.
  • Figure 9 is a high-performance liquid chromatography analysis (reverse phase partitioning) of zinc and selenium nanoclusters, showing the presence of acetate ions on the surface of the zinc and selenium core.
  • Figure 10 is a high-performance liquid chromatography analysis (reverse phase partitioning) of zinc and selenium nanoclusters, showing the presence of histidine and ascorbate ion on the surface of the zinc and selenium core.
  • Figure 11 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometers) of the zinc and selenium nanoclusters evaluated by dynamic light scattering.
  • Figure 12 is a UV-Visible spectrum of zinc and selenium nanoclusters.
  • Figure 13 is a fluorescence spectrum of zinc and selenium nanoclusters.
  • - comprise a metallic core based on zinc covered over its entire surface with a mixed layer comprising histidine (His), acetate ions (Ac) and ascorbate ions (Asc), said metallic core being constituted zinc (Zn) or a mixture of zinc and selenium (ZnSe), the quantity of zinc within said mixture ranging from 80 to 99.99% and the quantity of selenium within said mixture ranging from 0.01 to 20 %, the percentages being percentages by weight relative to the total weight of the mixture,
  • hydrodynamic diameter ranging from 0.6 to 2.0 nm, and preferably less than 1.0 nm
  • - have a metallic core diameter ranging from 0.5 to 1.5 nm, and preferably less than 1.0 nm,
  • - have stability over time ranging from 5 to 20 weeks when the nanoclusters are in liquid form and are stored at a temperature of 4°C
  • - have a stability over time of at least 12 months, and preferably 12 to 18 months when the nanoclusters are in dry form and are stored at a temperature of 4°C and under nitrogen
  • said zinc-based nanoclusters can also be designated by the formula “ZnNC@HisAcAsc” or “ZnSeNC@HisAcAsc” depending on whether the metallic core consists of zinc or a mixture of zinc and selenium.
  • the zinc-based nanoclusters which are the subject of the invention are metal nanoclusters.
  • a metallic nanocluster consists of the association of tens of atoms of metallic element (in this case zinc alone or zinc mixed with selenium in the invention) with a metallic core diameter less than or equal to 2.0 nanometers (nm).
  • a metallic core based on zinc means in the present application that the metallic core is a zinc core or a zinc and selenium core.
  • a nanocluster based on zinc can designate a nanocluster of zinc, or, a nanocluster of zinc and selenium, it being understood that the core of said nanocluster of zinc and selenium comprises a quantity of zinc ranging from 80 to 99.99% by weight for a quantity of selenium ranging from 0.01 to 20% by weight relative to the total weight of the nucleus.
  • the nanoclusters of the invention consist of a zinc-based metal core covered/covered/surrounded by a mixed layer/crown comprising histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • corona or layer surrounding the zinc core includes both histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the verbs “cover/cover/surround” can be used interchangeably to indicate that the zinc-based core comprises over its entire surface a layer/crown of histidine, acetate ions and ascorbate ions. .
  • the entire zinc-based nanocluster has a spherical shape.
  • ZnNC@HisAcAsc and “ZnSeNC@HisAcAsc” within the meaning of the invention respectively designate a nanocluster consisting of a metallic zinc core covered with said mixed layer of histidine, acetate and ascorbate ions and a nanocluster consisting a metallic core of zinc and selenium covered with said mixed layer of histidine, acetate and ascorbate ions.
  • the zinc-based nanoclusters thus advantageously comprise three ligands on the surface of the zinc-based core, namely histidine, acetate and ascorbate ions. These three ligands are linked to the metallic core by coordination bonds.
  • the mixed crown comprising histidine, acetate and ascorbate ions in particular gives the nanoclusters of the invention very high stability and low reactivity.
  • Low reactivity means low degradation, particularly linked to oxidation (for example due to oxygen in the air).
  • the stability of the nanoclusters of the invention means maintaining the structure and properties of the nanoclusters over time at a storage temperature of 4°C. Maintaining the structure means in particular that the composition of the nanocluster (metallic core surrounded by the mixed layer/crown as defined above), its shape and its diameter (of the metallic and hydrodynamic core) are preserved over time.
  • the “liquid form” of zinc-based nanoclusters refers to a solution or liquid mixture of zinc-based nanoclusters.
  • the stability of 5 to 20 weeks mentioned above concerns zinc-based nanoclusters in liquid form when stored at a conservation temperature of 4°C.
  • “Dry form” means a solid form which can be reduced to powder if necessary.
  • the 12 to 18 month stability mentioned above concerns zinc-based nanoclusters in dry form when stored at a conservation temperature of 4°C and under nitrogen.
  • the nanoclusters of the invention exhibit spectrophotometric properties, in particular fluorescence, which are characteristic of this scale, namely a metallic core diameter less than or equal to 2 nm, which is intermediate between the molecule and the nanoparticle.
  • the metal core diameter or metal diameter designates, as its name indicates, the diameter formed solely by the zinc-based metal.
  • the hydrodynamic diameter takes into account the diameter of the metallic core plus the layer/crown comprising histidine, acetate and ascorbate ions.
  • the hydrodynamic diameter therefore designates the diameter of the entire zinc-based nanocluster.
  • the zinc-based nanoclusters have an almost equivalent metallic core diameter and a hydrodynamic diameter, preferably less than 1.0 nm.
  • the metallic core diameter will of course always be less than the hydrodynamic diameter.
  • the zinc-based nanoclusters are zinc nanoclusters comprising a metallic core made of zinc, said nanoclusters being able to be designated by the formula “ZnNC@HisAcAsc”.
  • the zinc-based nanoclusters are zinc and selenium nanoclusters comprising a metallic core consisting of a mixture of zinc and selenium, said nanoclusters being able to be designated by the formula “ZnSeNC@ HisAcAsc”.
  • the zinc and selenium nanoclusters comprise a core consisting of 99% zinc for 1% selenium.
  • the zinc-based nanoclusters are in liquid form or in dry form.
  • the dry form of nanoclusters is advantageous in particular in that it allows easy storage, preservation and transport.
  • the zinc-based nanoclusters of the invention are characterized in that they have at least one of the following characteristics:
  • the zinc-based nanoclusters of the invention have all of the characteristics described above.
  • nanoclusters of the invention are not sequestered in said organs is in particular due to their small size (hydrodynamic diameter less than or equal to 2.0 nm, and preferably less than 1.0 nm).
  • the size of the nanoclusters of the invention allows longer circulation in the blood, compared to larger compounds.
  • nanoclusters allow them to cross membranes (in particular digestive) without passing through physiological absorption systems via a persorption phenomenon (spontaneous passage via the pores of a physiological system).
  • This persorption phenomenon is at the origin of the risks of toxicity of nanoclusters, but it becomes a therapeutic modality if we control the quantitative aspect of the contributions of nanoclusters.
  • the nanoclusters of the invention have surface properties making them capable of crossing the intestinal barrier, which represents an important advantage compared to oral zinc preparations which are often incapable of passing the intestinal barrier.
  • “Good bioavailability” means that orally administered nanoclusters reach the general circulation well and are well distributed to target organs.
  • biocompatibility we mean the fact that zinc-based nanoclusters are well accepted by the various organs of the body without being toxic to these organs.
  • nanoclusters are biodegradable means that their degradation releases substances that are metabolized or eliminated without problem by the body (zinc, selenium, histidine, acetate and ascorbate).
  • the nanoclusters are freeze-dryable. It is in fact possible to freeze-dry them because they are perfectly stable. Freeze-drying thus makes it possible to easily store, preserve and transport nanoclusters.
  • the stability of the nanoclusters is as defined above.
  • the advantageous properties of the nanoclusters of the invention are in particular due to the original combination of its constituents, namely zinc, histidine, acetate and ascorbate ions, or zinc, selenium, histidine, acetate ions. and ascorbate.
  • zinc-based nanoclusters comprising a mixed crown/layer of histidine, acetate and ascorbate ions surrounding a metallic core of zinc or zinc and selenium and which have the advantageous properties described above.
  • nanoclusters are obtained comprising three ligands on the surface of the zinc-based core, these three ligands being linked to the surface of the zinc-based core by coordination bonds.
  • Ascorbic acid is a reducing agent.
  • the reaction between the mixture of zinc (II) acetate dihydrate (and possibly sodium selenite) and histidine with ascorbic acid is more particularly a reduction reaction of the mixture of zinc (II) acetate dihydrate ( and optionally sodium selenite) and histidine with ascorbic acid.
  • Ascorbic acid makes it possible to obtain zinc-based nanoclusters devoid of any toxicity.
  • the present invention results in particular from the unexpected discovery of the Inventors that the original combination of the reagents used, namely zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite, histidine and ascorbic acid, and in the proportions such as defined above, makes it possible to obtain zinc-based nanoclusters with particularly advantageous properties.
  • the original combination of the reagents used namely zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite, histidine and ascorbic acid, and in the proportions such as defined above, makes it possible to obtain zinc-based nanoclusters with particularly advantageous properties.
  • the excellent stability of the nanoclusters of the invention is an example of this.
  • the zinc-based nanoclusters can be more particularly prepared according to the “in solution” protocol or according to the “solid phase” protocol. Each of these two synthesis routes conforms to the process described above.
  • the preparation process as defined above is more particularly characterized in that it is carried out under inert gas and in that:
  • the solution of zinc (II) acetate dihydrate and histidine is adjusted to a pH value ranging from 11 to 13, and preferably is 12,
  • a solution of zinc (II) acetate dihydrate, histidine and ascorbic acid or, a solution of zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite, histidine and ascorbic acid, is prepared by adding ascorbic acid to the solution of zinc (II) acetate dihydrate and histidine, or, to the solution of zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite and histidine, of which the pH was adjusted to the aforementioned values
  • the solution of zinc (II) acetate dihydrate, histidine and ascorbic acid, or, the solution of zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite, histidine and ascorbic acid is stirred for 2 to 6 hours, and preferably 4 hours, at a temperature ranging from 35 to 45°C, and preferably 40°C,
  • the solution which comprises the zinc-based nanoclusters is optionally dialyzed in order to obtain a purified solution of zinc-based nanoclusters, namely a purified solution of zinc nanoclusters or of zinc and selenium nanoclusters,
  • the solution which comprises the zinc-based nanoclusters, optionally dialyzed, is optionally freeze-dried in order to obtain a dry form of zinc-based nanoclusters, namely a dry form of zinc nanoclusters or zinc and selenium nanoclusters.
  • the solution comprising the zinc-based nanoclusters, optionally dialyzed, has a stability over time ranging from 5 to 20 weeks at a storage temperature of 4°C.
  • Dialysis makes it possible in particular to remove everything that is not linked to the zinc-based metallic core, such as for example possibly an excess of histidine or ascorbic acid or even residual zinc or selenium possibly present in the solution of zinc-based nanoclusters.
  • the layer comprising histidine, acetate and ascorbate ions is linked to the zinc-based metal core by coordination bonds.
  • the dry form of the zinc-based nanoclusters obtained after freeze-drying, has a stability over time of at least 12 months, and preferably 12 to 18 months, at a storage temperature of 4°C. and under nitrogen.
  • the dry form of zinc-based nanoclusters can be reconstituted at any time, by mixing in a reconstitution solvent, such as purified water.
  • a reconstitution solvent such as purified water.
  • reconstitute/reconstitute is meant the operation of simple mixing of the dry form or the lyophilisate with a solvent.
  • the zinc-based nanocluster solution obtained after reconstitution of the dry form, has a stability over time ranging from 5 to 12 weeks at a storage temperature of 4°C, and preferably under nitrogen.
  • the inert gas is nitrogen
  • the zinc (II) acetate dihydrate solution is prepared by adding zinc (II) acetate dihydrate to ultra-pure filtered water,
  • the sodium selenite solution is prepared by adding sodium selenite to filtered ultra-pure water,
  • the zinc (II) acetate dihydrate solution has a concentration ranging from 0.5 to 5.0 mM
  • the sodium selenite solution has a concentration ranging from 0.07 to 140 mM
  • the concentration of histidine is greater than the concentration of the zinc (II) acetate dihydrate solution
  • the concentration of histidine is greater than the concentration of the sodium selenite solution
  • the concentration of ascorbic acid is equal to the concentration of histidine
  • the solution which includes the zinc nanoclusters, optionally dialyzed, has a zinc concentration ranging from 16 to 164 pg/mL,
  • the solution which comprises the nanoclusters of zinc and selenium, optionally dialyzed has a zinc concentration ranging from 16 to 164 pg/mL and a selenium concentration ranging from 0.003 to 5,500 pg/mL
  • - the solution which comprises the zinc-based nanoclusters, optionally dialyzed is freeze-dried in order to obtain a dry form of zinc-based nanoclusters, namely a dry form of zinc nanoclusters or zinc and selenium nanoclusters.
  • the process for preparing zinc-based nanoclusters as defined above is more particularly characterized in that:
  • a powdery mixture of zinc (II) acetate dihydrate and histidine or, a powdery mixture of zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite and histidine is obtained by mixing each of the powders of zinc (II) acetate dihydrate and histidine, or zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite and histidine,
  • - ascorbic acid is added to the reactor comprising the homogeneous powder mixture of zinc (II) acetate dihydrate and histidine, or, zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite and histidine,
  • the mixture of zinc (II) acetate dihydrate, histidine, ascorbic acid and water, or, the mixture of zinc (II) acetate dihydrate, sodium selenite, histidine, d the ascorbic acid and water is kept stirring in the reactor for 16 to 36 hours, and preferably 24 hours,
  • a liquid mixture which includes the zinc-based nanoclusters is obtained at the end of the previous stirring step, namely a liquid mixture of zinc nanoclusters or of zinc and selenium nanoclusters
  • the liquid mixture which comprises the zinc-based nanoclusters is optionally dialyzed in order to obtain a purified liquid mixture of zinc-based nanoclusters, namely a purified mixture of zinc nanoclusters or zinc and selenium nanoclusters
  • the liquid mixture which comprises the zinc-based nanoclusters, optionally dialyzed is optionally freeze-dried in order to obtain a dry form of zinc-based nanoclusters, namely a dry form of zinc nanoclusters, or of zinc and selenium nanoclusters .
  • the concentration of histidine is greater than the concentration of zinc (II) acetate dihydrate
  • the concentration of histidine is greater than the concentration of sodium selenite
  • the concentration of ascorbic acid is equal to the concentration of histidine
  • the water added to the reactor is ultra-pure filtered water
  • the inert gas is nitrogen
  • the liquid mixture which includes the zinc nanoclusters, optionally dialyzed has a zinc concentration ranging from 1370 to 13700 pg/mL,
  • the liquid mixture which comprises the nanoclusters of zinc and selenium, optionally dialyzed has a zinc concentration ranging from 1370 to 13700 pg/mL and a selenium concentration ranging from 0.16 to 3300 pg/mL,
  • the liquid mixture which comprises the zinc-based nanoclusters is freeze-dried in order to obtain a dry form of zinc-based nanoclusters, namely a dry form of zinc nanoclusters or zinc and selenium nanoclusters.
  • the dry form of zinc-based nanoclusters is stored under nitrogen, preferably in bottles, and preferably at 4°C, said powder being able to be stored for a period of at least least 12 months, and preferably 12 to 18 months, without alteration of the stability of the zinc-based nanoclusters.
  • the invention also relates to nanoclusters based on zinc as defined above or obtained according to the processes as defined above, for use as a medicine.
  • the subject of the invention is nanoclusters based on zinc as defined above or obtained according to the processes as defined above, for use in combating zinc deficiencies.
  • the zinc-based nanoclusters are more particularly zinc nanoclusters.
  • the subject of the invention is zinc-based nanoclusters as defined above or obtained according to the processes as defined above, for use in combating zinc and selenium deficiencies. .
  • the zinc-based nanoclusters are more particularly zinc and selenium nanoclusters.
  • Another object of the invention lies in a composition characterized in that it comprises nanoclusters based on zinc such as defined above or obtained according to the processes such as defined above.
  • composition of the invention more particularly comprises zinc nanoclusters or zinc and selenium nanoclusters.
  • composition of the invention may be a medicine, a food supplement or a food composition.
  • the quantity of zinc or the quantity of zinc and selenium present in the composition of the invention determines whether it is rather a food supplement or rather a medicine.
  • a food supplement will include a quantity of zinc, or, a quantity of zinc and selenium, less than the quantity of zinc or the quantity of zinc and selenium present in a medication.
  • the composition is in a form suitable for oral administration.
  • Zinc-based nanoclusters can advantageously be administered orally because they are able to pass the intestinal barrier without difficulty, particularly due to their small size.
  • the composition of the invention comprising the zinc nanoclusters comprises a quantity of zinc less than the quantity of zinc usually present in a conventional oral preparation of zinc, whether a medicine or food supplement.
  • This example respectively describes the two possible synthesis routes for preparing the zinc nanoclusters of the invention, namely the “solution protocol” and the “solid phase protocol”.
  • the synthesis is carried out under inert gas (nitrogen).
  • the glassware is washed with aqua regia (1 volume of 65% nitric acid for 2 volumes of 37% hydrochloric acid).
  • Ultrapure water is used and filtered through a 0.2 pm pore diameter filter.
  • a quantity of 55.0 mg of zinc acetate is placed in a 100 mL volumetric flask. Ultrapure filtered water is added up to the mark of the flask. A solution of zinc acetate with a concentration of 2.5 mM is obtained.
  • the zinc acetate solution is transferred into a suitable bottle. This solution can be stored for one month in the refrigerator at 4°C.
  • a quantity of 500 ⁇ L of the zinc acetate stock solution as prepared in the previous step is added to a round-necked flask that can hold up to 50 mL of solution. Then, a quantity of 4500 ⁇ L of ultra-pure filtered water is added to the flask.
  • the zinc acetate solution obtained is called 1x.
  • the 1x zinc acetate solution is stirred at 130 rpm with the multi-plate shaker. A quantity of 39 mg of histidine is added to the zinc acetate solution. The solution of zinc acetate and histidine is stirred for 15 minutes. The solution is colorless.
  • the solution of zinc nanoclusters obtained at the end of the synthesis is colorless. It is called 1x and has a zinc concentration of 16 pg/mL. It is kept cool, at 4°C.
  • Zinc nanocluster solutions can be freeze-dried.
  • Zinc acetate solutions with a concentration ranging from 1x to 10x are prepared to obtain 1x to 10x zinc nanocluster solutions which have a zinc concentration ranging from 16 to 164 pg/mL.
  • a 2x zinc acetate solution is prepared by placing a quantity of 1000 ⁇ L of zinc acetate stock solution in the flask and making up to 5000 ⁇ L with filtered ultra-pure water.
  • a 4x zinc acetate solution is prepared by placing a quantity of 2000 ⁇ L of zinc acetate stock solution in the flask and making up to 5000 ⁇ L with filtered ultrapure water etc.
  • the 1x zinc nanocluster solution obtained in the previous step is purified by dialysis.
  • a dialysis cell is prepared (X12 Float a lyzer G2 CE MWCO 100-500 D, Reference 1511160), and a 150 mL beaker is filled with 100 mL of filtered ultrapure water.
  • the dialysis cell is filled with ultrapure water filtered using a Pasteur pipette.
  • the dialysis cell is placed in the beaker with stirring (130 rpm). The cell is allowed to hydrate and wash for 1 hour.
  • the water is then replaced with a new volume of 100 mL of ultra-pure filtered water.
  • the dialysis cell is emptied using a pasteur pipette then is filled with the 1x zinc nanocluster solution, which is left stirring overnight (for 12 hours) at a temperature between 2 and 6°C.
  • the dialyzed solution of 1x zinc nanoclusters thus obtained is transferred into a suitable bottle and is stored at a temperature of 4°C.
  • Dialysis does not influence the zinc concentration of the nanoclusters.
  • the zinc concentrations of dialyzed zinc nanocluster solutions are identical to those of non-dialyzed solutions.
  • Zinc nanocluster solutions optionally dialyzed, can be freeze-dried.
  • the zinc concentrations of dialyzed zinc nanocluster solutions are identical to those of non-dialyzed solutions, and range from 16 to 164 pg/mL for zinc acetate solutions ranging from 1x to 10x.
  • Zinc(II) acetate dihydrate, L(-)-Histidine, and ascorbic acid are the same as those used in the solution protocol.
  • sodium hydroxide is not necessary.
  • a quantity of 23 mg of zinc acetate is weighed and then placed inside an agate mortar.
  • a quantity of 1.7 g of histidine is then weighed.
  • One volume of histidine powder for one volume of zinc acetate powder is added, taking care to grind the powders well using the pestle until a mixture of color and homogeneous appearance is obtained. This operation is repeated as long as there is histidine.
  • the final mixture of the two powders should have a white color and the powder should be homogeneous.
  • the mixture of the two powders is then transferred into a 50 mL single-neck flask (ground neck NS 19/26) using a spatula.
  • a quantity of 3 g of ascorbic acid is weighed and transferred into the flask.
  • An olive-shaped magnetic stirrer is placed at the bottom of the flask.
  • a quantity of 5 mL of ultrapure water is filtered using a 5 mL plastic syringe and is added dropwise into the reactor. A liquid mixture is obtained.
  • the reactor is closed using a cap with a folding skirt (diameter 19.4 mm) and is placed under nitrogen without creating excess pressure using a balloon.
  • the reactor is surrounded by aluminum foil and then placed under stirring (200 rpm) for the duration of the reaction. You must wait 24 hours before the reaction ends.
  • the product obtained which is in the form of a liquid, has a gray color.
  • the liquid obtained, comprising the zinc nanoclusters, has a zinc concentration of 1370 pg/mL and is called 100x.
  • the zinc concentration of the nanoclusters is of course dependent on the quantity of zinc acetate used at the start of the process of the invention.
  • the liquid obtained including the zinc nanoclusters is then transferred into a suitable plastic bottle (the final volume is not 5 ml but a little more, around 8.5 ml).
  • the liquid comprising the zinc nanoclusters is either stored at 4°C or transferred to the freeze dryer. Lyophilization is carried out in 1 mL fractions, without adding additional reagents. After freeze-drying, the contents of the vial (which includes the zinc nanoclusters in dry form) are placed under nitrogen and stored at 4°C.
  • the dry form of zinc nanoclusters can be reconstituted at any time in 1 mL of purified water.
  • the solution of zinc nanoclusters thus reconstituted is stored at 4°C, preferably under nitrogen.
  • Zinc(II) acetate dihydrate, L(-)-Histidine, ascorbic acid, and sodium hydroxide are the same as those used in the solution protocol for the preparation of zinc nanoclusters.
  • the zinc acetate stock solution is prepared as described in the solution protocol paragraph for zinc nanoclusters.
  • a quantity of 12.0 mg of sodium selenite is placed in a 100 mL volumetric flask. Ultrapure filtered water is added up to the mark of the flask. A 0.71 mM sodium selenite solution is obtained.
  • the sodium selenite solution is transferred into a suitable bottle. This solution can be stored for one month in the refrigerator at 4°C.
  • a tenth dilution of the sodium selenite solution obtained in the previous step in 1 mL of water is carried out (100 pL of sodium selenite stock solution + 900 pL ultra pure water).
  • the tenth diluted solution of sodium selenite is called 0.1% selenium solution.
  • a quantity of 2000 ⁇ L of the zinc acetate stock solution as prepared in the previous step is added to a round-neck flask which can contain up to 50 mL of solution. Then, a quantity of 3000 ⁇ L of ultra-pure filtered water is added to the flask. The resulting zinc acetate solution is called 4x. A quantity of 100 ⁇ L of the diluted sodium selenite solution (0.1% selenium) is added to 2000 ⁇ L of the 4x zinc acetate solution.
  • the molar ratio of the element selenium to the element zinc is 1 to 1000 in the solution of zinc acetate and sodium selenite thus prepared.
  • a quantity of 39 mg of histidine is added to the solution of zinc acetate and sodium selenite.
  • the solution of zinc acetate, sodium selenite and histidine is stirred for 15 minutes at the same stirring speed.
  • the solution is colorless.
  • a quantity of 139 mg of ascorbic acid is added to the reaction mixture. We wait 2 minutes for the ascorbic acid to completely solubilize.
  • the flask (reactor) is placed in a water bath at 40°C with stirring (speed set to 6) for 4 hours.
  • the mass ratio of zinc and selenium within the bimetallic core of the zinc and selenium nanoclusters is in this example 99.9% zinc for 0.1% selenium.
  • the solution of zinc and selenium nanoclusters is kept cool at 4°C.
  • the solution can also be freeze-dried.
  • the same synthesis protocol can be used by adding 100 ⁇ L of a 0.71 mM sodium selenite solution diluted 100 times in water. A solution of sodium selenite 0.01% selenium is obtained.
  • a quantity of 100 ⁇ L of the diluted sodium selenite solution (0.01% selenium) is added to 2000 ⁇ L of the 4x zinc acetate solution.
  • the molar ratio of the element selenium to the element zinc is 1 to 10,000 in the solution of zinc acetate and sodium selenite thus prepared.
  • Zinc acetate solutions with a concentration ranging from 1x to 10x as well as diluted sodium selenite solutions comprising 0.01% to 20% selenium are prepared.
  • the zinc concentrations of zinc and selenium nanocluster solutions range from 16 to 164 pg/mL for zinc acetate solutions ranging from 1x to 10x.
  • the selenium concentrations of zinc and selenium nanocluster solutions range from 0.003 to 5.5 pg/mL for diluted sodium selenite solutions comprising 0.01% to 20% selenium.
  • the solution of zinc and selenium nanoclusters obtained in the previous step can be purified by dialysis according to the same protocol as that described in the paragraph “dialysis of zinc nanoclusters” in the solution protocol for zinc nanoclusters.
  • the zinc concentrations of dialyzed zinc and selenium nanocluster solutions are identical to those of non-dialyzed solutions, and range from 16 to 164 pg/mL for zinc acetate solutions ranging from 1x to 10x.
  • the selenium concentrations of dialyzed zinc and selenium nanocluster solutions are identical to those of non-dialyzed solutions, and range from 0.003 to 5.5 pg/mL for diluted sodium selenite solutions comprising 0.01% to 20%. of selenium.
  • Zinc(II) acetate dihydrate, L(-)-Histidine, and ascorbic acid are the same as those used in the solution protocol.
  • sodium hydroxide is not necessary.
  • a quantity of 10 mg of sodium selenite is placed in an agate mortar.
  • a quantity of 1.27 g of zinc acetate is weighed.
  • One volume of zinc acetate powder for one volume of sodium selenite powder is added, taking care to grind the powders well using the pestle until a mixture of color and homogeneous appearance is obtained. This operation is repeated as long as there is zinc acetate.
  • a quantity of 23 mg of the previous powder mixture is weighed and then placed inside an agate mortar.
  • a quantity of 1.7 g of histidine is then weighed.
  • a volume of histidine powder for a volume of zinc acetate powder and sodium selenite is added, taking care to grind the powders well using the pestle until a mixture of color and appearance is obtained. homogeneous. This operation is repeated as long as there is histidine.
  • the final mixture of the two powders should have a white color and the powder should be homogeneous.
  • the mixture of the two powders is then transferred into a 50 mL single-neck flask (NS 19/26 ground neck) using a spatula.
  • a quantity of 3 g of ascorbic acid is weighed and transferred into the flask.
  • An olive-shaped magnetic stirrer is placed at the bottom of the balloon.
  • a quantity of 5 mL of ultrapure water is filtered using a 5 mL plastic syringe and is added dropwise into the reactor. A liquid mixture is obtained.
  • the reactor is closed using a cap with a folding skirt (diameter 19.4 mm) and is placed under nitrogen without creating excess pressure using a balloon.
  • the reactor is surrounded by aluminum foil and then placed under stirring (200 rpm) for the duration of the reaction. You must wait 24 hours before the reaction ends.
  • the product obtained which is in the form of a liquid, has a gray color.
  • the liquid obtained comprising the zinc and selenium nanoclusters, has a concentration:
  • the zinc and selenium concentrations of the zinc and selenium nanoclusters are of course dependent on the quantities of zinc acetate and sodium selenite used at the start of the process of the invention.
  • the liquid comprising the zinc and selenium nanoclusters is either stored at 4°C or transferred to the freeze dryer.
  • Lyophilization is carried out in 1 mL fractions, without adding additional reagents. After freeze-drying, the contents of the vial (which includes the zinc and selenium nanoclusters in dry form) are placed under nitrogen and stored at 4°C.
  • the dry form of zinc and selenium nanoclusters can be reconstituted at any time in 1 mL of purified water.
  • the solution of zinc and selenium nanoclusters thus reconstituted is stored at 4°C, preferably under nitrogen.
  • the zinc nanoclusters as obtained in Example 1, whether the solution protocol or the solid phase protocol, are characterized with regard to their structure, their sizes, their spectrophotometric properties and their stability.
  • the zinc nanoclusters of the invention more particularly have a spherical shape. They consist of a metallic zinc core covered with a mixed corona comprising histidine, acetate and ascorbate ions.
  • Figure 1 is a schematic representation of a zinc nanocluster of the invention, which can also be designated by the formula “ZnNC@HisAcAsc”.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the zinc nanoclusters of the 1x dialyzed solution which has a zinc concentration of 16 pg/mL (as obtained in Example 1, point 1.1/ “Protocol in solution”), are destroyed (total dissolution and return to the different elements composing the structure of the nanoclusters) by a chemical process, namely dissolved in a concentrated acid (HCl) then a concentrated base (NaOH), then are analyzed by reversed phase polarity partition chromatography in comparison to a control sodium acetate (retention of ligands on apolar column, separation, identification and quantification (external calibration) of acetate ions by UV spectrophotometry).
  • HCl concentrated acid
  • NaOH concentrated base
  • histidine and ascorbate ions on the surface of the zinc nanoclusters was also demonstrated by high performance liquid chromatography, more particularly after purification of the nanoclusters in solution by size exclusion chromatography, in comparison with a histidine and acid control. ascorbic.
  • the hydrodynamic diameter (Dh) of the zinc nanoclusters was evaluated by dynamic light scattering (figure 4) (angle 173°, 530 nm laser, temperature 25°C on Nanosizer Malvern) and by Taylor dispersion analysis (figure 5 ).
  • the dynamic light scattering analysis method consists of analyzing the Brownian motion of particles and modeling it using the Stokes-Einstein equation.
  • the Taylor dispersion analysis method consists of injecting a band of solute into an open capillary tube (50 pm) and mobilizing it under the influence of a hydrodynamic flow (positive pressure 1 psi, parabolic velocity profile).
  • the principle of determining the hydrodynamic radius is based on the Taylor-Aris relationship which establishes the link between the spreading of the solute peak (modeling a Gaussian) and the molecular diffusion coefficient.
  • the metallic diameter of the zinc nanoclusters was evaluated by transmission electron microscopy (deposition on nickel grids, observations under beams operating at 200 kV (LaB6 cathode) Philips CM 200).
  • the diameters (hydrodynamic and metallic) of the zinc nanoclusters were respectively evaluated immediately after their synthesis, whether using the solution or solid phase protocol.
  • the average hydrodynamic diameter of the zinc nanoclusters is less than 1.0 nm. More particularly, it appears from Figures 4 and 5 that in dynamic light scattering (fig. 4) and in Taylor dispersion (fig. 5) the hydrodynamic diameter of the zinc nanoclusters is equal to 0.72 ⁇ 0.05 nm.
  • the UV-vis spectrum shows a shoulder at 300 ⁇ 15 nm (fig. 6), which confirms the existence of nanoclusters.
  • the zinc nanoclusters of the invention have optical properties, in particular fluorescence, characteristic of this intermediate scale between the molecule and the nanoparticle. Stability of zinc nanoclusters
  • the analyzes were carried out on the zinc nanoclusters obtained according to the solution protocol and according to the solid phase protocol.
  • the hydrodynamic diameter of the zinc nanoclusters in the freeze-dried samples is 1.73 nm after more than 5 weeks of storage under nitrogen.
  • the hydrodynamic diameter of the zinc nanoclusters of the reconstituted samples is 1.58 nm, which once again demonstrates their excellent stability.
  • the zinc and selenium nanoclusters as obtained in example 1 point 2/ are characterized with regard to their structure, their sizes, their spectrophotometric properties and their stability.
  • Zinc and selenium nanoclusters have a spherical shape. They consist of a bimetallic core of zinc and selenium covered with a mixed corona including histidine, acetate and ascorbate ions.
  • Figure 8 is a schematic representation of a zinc and selenium nanocluster of the invention, which can also be designated by the formula “ZnSeNC@HisAcAsc”.
  • the zinc and selenium nanoclusters of the dialyzed solution obtained in Example 1, point 2.1/ “Protocol in solution”, are destroyed (total dissolution and return to the different elements composing the structure of the nanoclusters) by a chemical process, namely dissolved in a concentrated acid (HCl) then a concentrated base (NaOH), then analyzed by reversed phase polarity partition chromatography in comparison with a sodium acetate control (retention of the anions making up the nanocluster on a cationic exchange resin , separation, identification and quantification (external calibration) of acetate ions by conductometry with the help of a suppressor).
  • HCl concentrated acid
  • NaOH concentrated base
  • histidine and ascorbate ions on the surface of zinc and selenium nanoclusters was also demonstrated by high performance liquid chromatography, more particularly after purification of the nanoclusters in solution by size exclusion chromatography, in comparison with a histidine control. and ascorbic acid.
  • the hydrodynamic diameter (Dh) of the zinc and selenium nanoclusters was evaluated by dynamic light scattering (figure 11) (angle 173°, 530 nm laser, temperature 25°C on Nanosizer Malvern).
  • the diameters of the zinc and selenium nanoclusters were evaluated immediately after their synthesis, whether using the solution or solid phase protocol.
  • the hydrodynamic diameters were more particularly evaluated on the solution of zinc and selenium nanoclusters, non-dialyzed and non-lyophilized, obtained in point 2.1/ of Example 1, which has a zinc concentration of 65 pg /mL (4x) and selenium of 0.1 pg/mL (0.1% Se).
  • the hydrodynamic diameters were evaluated on the lyophilized samples obtained in point 2.2/ of Example 1, which has a zinc concentration of 1370 pg/mL (100x) and selenium of 16 pg/ mL (1% Se). It can be seen from Figure 11 that the average hydrodynamic diameter of the zinc and selenium nanoclusters is 0.69 ⁇ 0.06 nm.
  • the spectrophotometric properties of the zinc and selenium nanoclusters were evaluated by UV-Visible spectroscopy (figure 12) and by fluorescence spectroscopy (figure 13), immediately after their synthesis.
  • the U-vis spectrum shows a shoulder at 300 ⁇ 15 nm (fig. 12), which confirms the existence of nanoclusters.
  • the zinc and selenium nanoclusters of the invention have optical properties, in particular fluorescence, characteristic of this intermediate scale between the molecule and the nanoparticle.
  • the stability of the zinc and selenium nanoclusters was evaluated by measuring their hydrodynamic diameter in dynamic light scattering (angle 173°, 530 nm laser, temperature 25°C on Nanosizer Malvern).
  • the analyzes were carried out on the zinc and selenium nanoclusters obtained according to the solution protocol and according to the solid phase protocol.
  • the hydrodynamic diameter of the zinc and selenium nanoclusters was found to be 0.69 ⁇ 0.06 nm more than 5 weeks after their synthesis, demonstrating their excellent stability.
  • the hydrodynamic diameter of the zinc and selenium nanoclusters in the freeze-dried samples is 0.70 nm after more than 5 weeks of storage under nitrogen.
  • the hydrodynamic diameter of the zinc and selenium nanoclusters of the reconstituted samples is 0.70 nm, which once again demonstrates their excellent stability.

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Abstract

La présente invention concerne des nanoclusters à base de zinc qui présentent les caractéristiques suivantes : - ils comprennent un cœur métallique à base de zinc recouvert sur l'ensemble de sa surface d'une couche mixte comprenant de l'histidine (His), des ions acétate (Ac) et des ions ascorbate (Asc), ledit cœur métallique étant constitué de zinc (Zn) ou d'un mélange de zinc et sélénium (ZnSe), la quantité de zinc au sein dudit mélange allant de 80 à 99,99% et la quantité de sélénium au sein dudit mélange allant de 0,01 à 20%, les pourcentages étant des pourcentages en poids par rapport au poids total du mélange, - ils présentent une forme sphérique, - ils présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence inférieur à 1,0 nm, - ils présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1,5 nm, et de préférence inférieur à 1,0 nm, - ils présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 20 semaines lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide et sont stockés à une température de 4°C, - ils présentent une stabilité dans le temps d'au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche et sont stockés à une température de 4°C et sous azote, - ils présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV-Visible à 300 ± 15 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d'onde d'excitation de 364 ± 15 nm et des longueurs d'onde d'émission de 415 ± 15 nm, lesdits nanoclusters à base de zinc pouvant encore être désignés par la formule « ZnNC@HisAcAsc » ou « ZnSeNC@HisAcAsc » selon que le cœur métallique soit constitué de zinc ou d'un mélange de zinc et sélénium. L'invention concerne également un procédé de préparation desdits nanoclusters à base de zinc, et leurs utilisations pour lutter contre les carences en zinc ou contre les carences en zinc et sélénium.

Description

Nanoclusters à base de zinc, leurs procédés d’obtention et leurs utilisations pour lutter contre les carences en zinc
Domaine technique
La présente invention relève du domaine de la chimie, et plus particulièrement de la chimie pharmaceutique. L’invention concerne des nanoclusters à base de zinc, leurs procédés d’obtention et leurs utilisations pour lutter contre les carences en zinc.
Les nanoclusters à base de zinc décrits dans la présente invention sont plus particulièrement des nanoclusters comprenant un noyau métallique constitué uniquement de zinc ou alors un noyau métallique constitué d’un mélange de zinc et sélénium avec cependant une nette majorité de zinc au sein dudit noyau (de 80 à 99,99% de zinc).
Technique antérieure
Le zinc est un oligoélément essentiel au corps humain, c’est pourquoi son déficit peut avoir de nombreuses conséquences sur la santé. Ainsi, le zinc active plus de 200 enzymes. Il joue un rôle majeur dans toutes les étapes de la synthèse protéique, il active les ADN et les ARN polymérases et est indispensable à la régulation des histones. Il intervient dans le métabolisme des acides gras polyinsaturés et dans la synthèse des prostaglandines. Il intervient également dans la stabilisation de la structure de certaines hormones peptidiques (insuline, glustine, thymuline) et joue un rôle antioxydant via différents mécanismes. Le zinc est également nécessaire au métabolisme des glucides et des lipides, et joue un rôle majeur dans la croissance cellulaire et dans le fonctionnement du système immunitaire. Enfin le zinc a aussi son importance dans la perception des différentes saveurs. Via ces différents mécanismes le zinc rend l’organisme plus résistant, en particulier pendant la croissance et pendant le vieillissement. En conclusion, le zinc a des effets bénéfiques sur la santé et renforce les défenses immunitaires naturelles.
La carence en zinc est fréquente, en particulier dans toutes les situations de malnutrition. Elle se manifeste par des troubles de l’immunité, une oligospermie, des lésions de la peau, en particulier au niveau périorificiel, une chute des cheveux, des retards de cicatrisation, des diarrhées ainsi que des troubles de la vision, de l’odorat et du goût générant une anorexie. Chez la femme enceinte, le déficit en zinc peut conduire à des malformations ou à une hypotrophie fœtale. Enfin, chez l’enfant, la carence en zinc s’accompagne d’un retard de croissance et de la maturation sexuelle.
Il existe un déficit génétique du transporteur intestinal de zinc : l’acrodermatitis entéropathica (déficit en SLC39A4). Ce déficit entraine une symptomatologie grave et précoce liée au déficit en zinc (atteinte cutanée, digestive et neurologique). Par ailleurs, toutes les formes de malnutritions sont souvent accompagnées d’un déficit en zinc, que ce soit la malnutrition protéino-énergétique de l’enfant, ou celle liée à la chirurgie bariatrique pour obésité. Il est donc recommandé de veiller à un apport suffisant en zinc, en particulier pendant la grossesse et la croissance, ainsi que pour les personnes âgées ou malades.
Etant donné la moins bonne biodisponibilité du zinc lié aux protéines végétales par rapport à celui lié aux protéines animales, la carence en zinc est un risque inhérent aux régimes végétariens et surtout végétaliens.
Par ailleurs différentes denrées alimentaires comme le coca ou la limonade freinent la bonne assimilation du zinc. La prise de différents médicaments tels que la pilule contraceptive ou des préparations à base de cortisone peuvent aussi entraîner une carence. Celle-ci peut aussi se manifester dans le cas de diabète ou de troubles héréditaires du métabolisme du zinc.
Le traitement de la carence en zinc est effectué par des préparations/suppléments en zinc pris par la voie orale. La prise de zinc peut cependant être associée à la survenue de troubles digestifs, comme par exemple des maux d'estomac, des diarrhées, des crampes abdominales. En outre le zinc peut également laisser un goût métallique dans la bouche plusieurs heures après la prise orale de la préparation en zinc. Enfin, les préparations de zinc peuvent interférer avec l’absorption intestinale de cuivre (le zinc est un traitement peros de la maladie de Wilson) et entraîner une hypocuprémie transitoire.
Il subsiste donc toujours à ce jour la nécessité de mettre au point des préparations orales à base de zinc destinées à lutter contre les carences en zinc, et qui ne présentent pas les inconvénients susmentionnés.
Par ailleurs, chez certains sujets, une carence en zinc peut également être accompagnée d’une carence en sélénium. Le sélénium, tout comme le zinc, est un oligo-élément indispensable à l’organisme humain et joue un rôle clé dans l'ensemble de l'organisme.
La plupart des fonctions biologiques du sélénium passent par l’intermédiaire des sélénoprotéines parmi lesquelles il faut noter les glutathion péroxydases qui ont un rôle clé dans le système antioxydant de l’organisme. Leurs activités sont directement liées aux apports alimentaires en sélénium. Le sélénium intervient également dans la synthèse des hormones thyroïdiennes.
La maladie classiquement attribuée à une carence grave en sélénium est désignée par la maladie de Keshan. Elle survient pour des apports alimentaires en sélénium très faibles (< 10 pg/j) et entraine une cardiomyopathie dilatée avec insuffisance cardiaque sévère. Sa description vient d’une région de Chine où les apports alimentaires sont très faibles (sols pauvres en sélénium).
Etant donné que la biodisponibilité du sélénium est meilleure quand les apports sont liés aux protéines animales, il y a un risque de carence dans les alimentations végétariennes et encore plus végétaliennes. Les différentes formes de malnutrition (incluant les conséquences de la chirurgie bariatrique) sont également à risque de carence en sélénium.
Il faut également mentionner la situation particulière des patients porteurs d’une maladie héréditaire du métabolisme nécessitant un régime hypoprotidique strict avec l’obligation de prendre des substituts d’acides aminés. Ces substituts d’acides aminés contiennent, a priori, des quantités suffisantes de zinc et de sélénium, mais leurs biodisponibilités et une probable compétition d’absorption intestinale font que ces patients sont très souvent déficitaires en zinc et en sélénium.
Dans une étude belge publiée en septembre 2021 (Nutrients 2021, 13, 3304. https://doi.org/10.3390/nu13103304) il a été montré que des carences en zinc et sélénium étaient liées à la sévérité et au risque de décès de la COVID-19. Ainsi il est indiqué que tous les patients qui sont tombés gravement malades ou qui sont mort à l’hôpital présentaient tous une grave carence en zinc et sélénium dans leur sang lors de leur admission à l’hôpital. En introduction de cette étude il est rappelé que le zinc et le sélénium sont des oligoéléments essentiels au bon fonctionnement du système immunitaire, à la signalisation cellulaire et à la défense antivirale.
Ainsi, il est toujours nécessaire à ce jour de mettre au point de nouvelles préparations orales comprenant à la fois du zinc et du sélénium afin de lutter à la fois contre les carences en zinc et en sélénium.
Il est du mérite des Inventeurs d’avoir mis au point des nanoclusters à base de zinc qui sont des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium, lesdits nanoclusters présentant des caractéristiques particulièrement appropriées pour lutter respectivement contre les carences en zinc et contre les carences en zinc et sélénium. Il est également du mérite des Inventeurs d’avoir mis au point un procédé de synthèse original des nanoclusters à base de zinc, à savoir des nanoclusters de zinc et des nanoclusters de zinc et sélénium.
Résumé
La présente invention concerne des nanoclusters à base de zinc qui présentent les caractéristiques suivantes :
- ils comprennent un cœur métallique à base de zinc recouvert sur l’ensemble de sa surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine (His), des ions acétate (Ac) et des ions ascorbate (Asc), ledit cœur métallique étant constitué de zinc (Zn) ou d’un mélange de zinc et sélénium (ZnSe), la quantité de zinc au sein dudit mélange allant de 80 à 99,99% et la quantité de sélénium au sein dudit mélange allant de 0,01 à 20%, les pourcentages étant des pourcentages en poids par rapport au poids total du mélange,
- ils présentent une forme sphérique, - ils présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence inférieur à 1 ,0 nm,
- ils présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1,5 nm, et de préférence inférieur à 1 ,0 nm,
- ils présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 20 semaines lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide et sont stockés à une température 4°C,
- ils présentent une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche et sont stockés à une température de 4°C et sous azote,
- ils présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV-Visible à 300 ± 15 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation de 364 ± 15 nm et des longueurs d’onde d’émission de 415 ± 15 nm, lesdits nanoclusters à base de zinc pouvant encore être désignés par la formule « ZnNC@HisAcAsc » ou « ZnSeNC@HisAcAsc » selon que le cœur métallique soit constitué de zinc ou d’un mélange de zinc et sélénium.
Les nanoclusters de l’invention pourront cependant indifféremment être désignés dans ce qui suit par « nanoclusters », « nanoclusters à base de zinc », « nanoclusters de zinc », « nanoclusters de zinc et sélénium », « nanoclusters ZnNC », « ZnNC » (« ZnNC » signifiant « nanocluster de zinc »), « nanoclusters ZnSeNC », « ZnSeNC » (« ZnSeNC » signifiant « nanocluster de zinc et sélénium »), « nanoclusters ZnNC@HisAcAsc »,
« ZnNC@HisAcAsc », « nanoclusters ZnSeNC@HisAcAsc », « ZnSeNC@HisAcAsc ».
Les formules « ZnNC@HisAcAsc » ou « ZnSeNC@HisAcAsc » étant les plus explicites puisqu’elles décrivent que le nanocluster de zinc ou le nanocluster de zinc et sélénium comprend à sa surface une couche comprenant à la fois de l’histidine, des ions acétate et ascorbate.
L’invention concerne également un procédé de préparation desdits nanoclusters à base de zinc qui comprend les étapes suivantes :
- réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate avec de l’histidine, ou, réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate et du sélénite de sodium avec de l’histidine, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, le ratio molaire histidine/acétate de zinc (II) dihydrate ou le ratio molaire histidine/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 10, de préférence va de 10 à 200, et plus préférentiellement encore va de 100 à 200,
- réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine avec de l’acide ascorbique, ou, réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine avec de l’acide ascorbique, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, le ratio molaire acide ascorbique/acétate de zinc (II) dihydrate, ou, le ratio molaire acide ascorbique/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 16, de préférence va de 16 à 700, et plus préférentiellement encore va de 160 à 700,
- récupération des nanoclusters à base de zinc recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbates, à savoir plus particulièrement des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbate.
L’invention concerne encore les nanoclusters à base de zinc tels que définis ci-dessus, pour une utilisation pour lutter contre les carences en zinc ou contre les carences en zinc et sélénium.
Enfin, l’invention concerne également une composition comprenant les nanoclusters à base de zinc de l’invention, ladite composition étant un médicament, un complément alimentaire ou une composition alimentaire.
La composition de l’invention est encore caractérisée en ce qu’elle se trouve sous une forme adaptée pour une administration par voie orale.
Brève description des dessins
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et à l’analyse des figures annexées.
La figure 1 est une représentation schématique d’un nanocluster de zinc « ZnNC@HisAcAsc » de l’invention, constitué d’un cœur métallique de zinc entouré d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbate.
La figure 2 est une analyse par chromatographie liquide haute performance (partage en phases inversées) des nanoclusters de zinc, montrant la présence d’ions d’acétate à la surface du cœur métallique de zinc.
Le chromatogramme a été obtenu sur des fractions préalablement purifiées (chromatographie d’exclusion stérique) de nanoclusters de zinc. Un chromatogramme d’une solution de référence d’acétate de sodium a également été effectué.
La figure 3 est une analyse par chromatographie liquide haute performance (partage en phases inversées) des nanoclusters de zinc, montrant la présence d’histidine et d’ions ascorbate à la surface du cœur métallique de zinc.
Le chromatogramme a été obtenu sur des fractions préalablement purifiées (chromatographie d’exclusion stérique) de nanoclusters de zinc. Un chromatogramme d’une solution de référence d’histidine et d’acide ascorbique a également été effectué. La figure 4 illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre) des nanoclusters de zinc évalué par diffusion dynamique de la lumière.
La figure 5 illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre) des nanoclusters de zinc évalué par dispersion de Taylor.
La figure 6 est un spectre UV-Visible des nanoclusters de zinc.
La figure 7 est un spectre de fluorescence des nanoclusters de zinc.
La figure 8 est une représentation schématique d’un nanocluster de zinc et sélénium « ZnSeNC@HisAcAsc » de l’invention, constitué d’un cœur de zinc et sélénium entouré d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbate.
La figure 9 est une analyse par chromatographie liquide haute performance (partage en phases inversées) des nanoclusters de zinc et sélénium, montrant la présence d’ions d’acétate à la surface du cœur de zinc et sélénium.
La figure 10 est une analyse par chromatographie liquide haute performance (partage en phases inversées) des nanoclusters de zinc et sélénium, montrant la présence d’histidine et d’ion ascorbate à la surface du cœur de zinc et de sélénium.
La figure 11 illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre) des nanoclusters de zinc et sélénium évalué par diffusion dynamique de la lumière.
La figure 12 est un spectre UV-Visible des nanoclusters de zinc et sélénium.
La figure 13 est un spectre de fluorescence des nanoclusters de zinc et sélénium.
Description détaillée
Les nanoclusters à base de zinc
Ainsi la présente invention concerne des nanoclusters à base de zinc caractérisés en ce qu’ils :
- comprennent un cœur métallique à base de zinc recouvert sur l’ensemble de sa surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine (His), des ions acétate (Ac) et des ions ascorbate (Asc), ledit cœur métallique étant constitué de zinc (Zn) ou d’un mélange de zinc et sélénium (ZnSe), la quantité de zinc au sein dudit mélange allant de 80 à 99,99% et la quantité de sélénium au sein dudit mélange allant de 0,01 à 20%, les pourcentages étant des pourcentages en poids par rapport au poids total du mélange,
- présentent une forme sphérique,
- présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence inférieur à 1 ,0 nm,
- présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1 ,5 nm, et de préférence inférieur à 1 ,0 nm,
- présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 20 semaines lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide et sont stockés à une température 4°C, - présentent une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche et sont stockés à une température de 4°C et sous azote,
- présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV- Visible à 300 ± 15 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation de 364 ± 15 nm et des longueurs d’onde d’émission de 415 ± 15 nm, lesdits nanoclusters à base de zinc pouvant encore être désignés par la formule « ZnNC@HisAcAsc » ou « ZnSeNC@HisAcAsc » selon que le cœur métallique soit constitué de zinc ou d’un mélange de zinc et sélénium.
Les nanoclusters à base de zinc objets de l’invention sont des nanoclusters métalliques. Un nanocluster métallique consiste en l’association de dizaines d’atome d’élément métallique (en l’occurrence le zinc seul ou le zinc mélangé à du sélénium dans l’invention) avec un diamètre de cœur métallique inférieur ou égal à 2,0 nanomètres (nm).
L’expression « un cœur métallique à base de zinc » signifie dans la présente demande que le cœur métallique est un cœur de zinc ou un cœur de zinc et sélénium.
Ainsi un nanocluster à base de zinc peut désigner un nanocluster de zinc, ou, un nanocluster de zinc et sélénium, étant entendu que le noyau dudit nanocluster de zinc et sélénium comprend une quantité de zinc allant de 80 à 99,99% en poids pour une quantité de sélénium allant de 0,01 à 20% en poids par rapport au poids total du noyau.
Les nanoclusters de l’invention sont constitués d’un cœur métallique à base de zinc couvert/recouvert/entouré d’une couche/couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate.
On peut employer indifféremment dans la demande les termes « couronne » ou « couche ».
Le terme « mixte » est employé pour indiquer que la couronne ou la couche qui entoure le cœur à base de zinc comprend à la fois de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate. De même, on peut employer indifféremment les verbes « couvrir/recouvrir/entourer » pour indiquer que le cœur à base de zinc comprend sur l’ensemble de sa surface une couche/couronne d’histidine, d’ions acétate et d’ions ascorbate.
L’ensemble du nanocluster à base de zinc présente une forme sphérique.
Les formules « ZnNC@HisAcAsc » et « ZnSeNC@HisAcAsc » au sens de l’invention désignent respectivement un nanocluster constitué d’un cœur métallique de zinc recouvert de ladite couche mixte d’histidine, d’ions acétate et ascorbate et un nanocluster constitué d’un cœur métallique de zinc et sélénium recouvert de ladite couche mixte d’histidine, d’ions acétate et ascorbate.
Les nanoclusters à base de zinc comprennent ainsi avantageusement trois ligands à la surface du cœur à base de zinc, à savoir l’histidine, les ions acétate et ascorbate. Ces trois ligands sont liés au cœur métallique par des liaisons de coordination. La couronne mixte comprenant l’histidine, les ions acétate et ascorbate confère notamment aux nanoclusters de l’invention une très grande stabilité et une faible réactivité.
Une « faible réactivité » signifie une faible dégradation en particulier liée à l’oxydation (par exemple due au dioxygène de l’air).
La stabilité des nanoclusters de l’invention signifie un maintien de la structure et des propriétés des nanoclusters dans le temps à une température de conservation de 4°C. Le maintien de la structure signifie notamment que la composition du nanocluster (cœur métallique entouré de la couche/couronne mixte telle que ci-dessus définie), sa forme et son diamètre (de cœur métallique et hydrodynamique) sont conservés au cours du temps.
La « forme liquide » des nanoclusters à base de zinc désigne une solution ou un mélange liquide de nanoclusters à base de zinc. La stabilité de 5 à 20 semaines mentionnée ci- dessus concerne les nanoclusters à base de zinc sous forme liquide lorsqu’ils sont stockés à une température de conservation de 4°C.
On entend par « forme sèche » une forme solide qui peut être réduite en poudre si nécessaire. La stabilité de 12 à 18 mois mentionnée ci-dessus concerne les nanoclusters à base de zinc sous forme sèche lorsqu’ils sont stockés à une température de conservation de 4°C et sous azote.
En fonction de leur forme (liquide ou solide), leur stabilité dans le temps sera donc différente. Les nanoclusters de l’invention présentent des propriétés spectrophotométriques, en particulier de fluorescence, qui sont caractéristiques de cette échelle, à savoir un diamètre de cœur métallique inférieur ou égal à 2 nm, qui est intermédiaire entre la molécule et la nanoparticule.
Le diamètre de cœur métallique ou diamètre métallique désigne, comme son nom l’indique, le diamètre formé uniquement par le métal à base de zinc.
Le diamètre hydrodynamique prend en compte le diamètre du cœur métallique additionné de la couche/couronne comprenant l’histidine, les ions acétate et ascorbate. Le diamètre hydrodynamique désigne donc le diamètre de la globalité du nanocluster à base de zinc.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters à base de zinc présentent un diamètre de cœur métallique et un diamètre hydrodynamique quasi équivalents, de préférence inférieur à 1,0 nm.
Cependant le diamètre de cœur métallique sera bien entendu toujours inférieur au diamètre hydrodynamique.
Le diamètre de cœur métallique est évalué par microscopie électronique à transmission alors que le diamètre hydrodynamique est évalué par diffusion dynamique de la lumière et/ou par dispersion de Taylor. Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, les nanoclusters à base de zinc sont des nanoclusters de zinc comprenant un cœur métallique constitué de zinc, lesdits nanoclusters pouvant être désigné par la formule « ZnNC@HisAcAsc ».
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, les nanoclusters à base de zinc sont des nanoclusters de zinc et sélénium comprenant un cœur métallique constitué d’un mélange de zinc et sélénium, lesdits nanoclusters pouvant être désigné par la formule « ZnSeNC@HisAcAsc ».
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention les nanoclusters de zinc et sélénium comprennent un noyau constitué de 99% de zinc pour 1% de sélénium.
Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters à base de zinc se présentent sous forme liquide ou sous forme sèche.
La forme sèche des nanoclusters est avantageuse notamment en ce qu’elle permet un stockage, une conservation et un transport facile.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, les nanoclusters à base de zinc de l’invention sont caractérisés en qu’ils présentent au moins une des caractéristiques suivantes:
- ils sont aptes à passer la barrière intestinale,
- ils présentent une bonne biodisponibilité,
- ils sont biocompatibles,
- ils sont biodégradables,
- ils sont lyophilisables,
- ils ne sont pas toxiques pour l’organisme humain,
- ils ne s’accumulent pas dans les organes tels que le foie, la rate, les reins ou les poumons. Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoclusters à base de zinc de l’invention présentent l’ensemble des caractéristiques ci-dessus décrites.
Le fait que les nanoclusters de l’invention ne soient pas séquestrés dans les dits organes est notamment dû à leur faible taille (diamètre hydrodynamique inférieur ou égal à 2,0 nm, et de préférence inférieur à 1 ,0 nm). La taille des nanoclusters de l’invention permet une circulation dans le sang plus longue, comparée à des composés de taille plus importante.
Plus particulièrement, la petite taille des nanoclusters leur permet de traverser les membranes (en particulier digestive) sans passer par les systèmes d’absorption physiologique via un phénomène de persorption (passage spontané via les pores d’un système physiologique). Ce phénomène de persorption est à l’origine des risques de toxicité des nanoclusters, mais il devient une modalité thérapeutique si on contrôle l’aspect quantitatif des apports de nanoclusters. Les nanoclusters de l’invention possèdent des propriétés de surface les rendant capable de traverser la barrière intestinale, ce qui représente un avantage important par rapport à des préparations orales de zinc souvent inaptes à passer la barrière intestinale.
La « bonne biodisponibilité » signifie que les nanoclusters administrés par voie orale atteignent bien la circulation générale et sont bien distribués aux organes cibles.
On entend par « biocompatibilité » le fait que les nanoclusters à base de zinc sont bien acceptés par les différents organes de l’organisme sans être toxiques pour ces organes.
Le fait que les nanoclusters soient biodégradables signifie que leur dégradation libère des substances qui sont métabolisées ou éliminées sans problème par l’organisme (zinc, sélénium, histidine, acétate et ascorbate).
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention les nanoclusters sont lyophilisables. Il est en effet possible de les lyophiliser car ils sont parfaitement stables. La lyophilisation permet ainsi de stocker, conserver et transporter facilement les nanoclusters. La stabilité des nanoclusters est telle que définie ci-dessus.
Les propriétés avantageuses des nanoclusters de l’invention sont notamment dues à la combinaison originale de ses constituants, à savoir le zinc, l’histidine, les ions acétate et ascorbate, ou, le zinc, le sélénium, l’histidine, les ions acétate et ascorbate.
A la connaissance des Inventeurs il n’a en effet jamais été décrit à ce jour des nanoclusters à base de zinc, comprenant une couronne/couche mixte d’histidine, d’ions acétate et ascorbate entourant un noyau métallique de zinc ou de zinc et sélénium et qui présentent les propriétés avantageuses ci-dessus décrites.
Le procédé de préparation des nanoclusters à base de zinc
La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation de nanoclusters à base de zinc tels que ci-dessus définis, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate avec de l’histidine, ou, réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate, du sélénite de sodium avec de l’histidine, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, le ratio molaire histidine/acétate de zinc (II) dihydrate ou le ratio molaire histidine/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 10, de préférence va de 10 à 200, et plus préférentiellement va de 100 à 200,
- réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine avec de l’acide ascorbique, ou, réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine avec de l’acide ascorbique, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, le ratio molaire acide ascorbique/acétate de zinc (II) dihydrate, ou le ratio molaire acide ascorbique/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 16, de préférence va de 16 à 700, et plus préférentiellement va de 160 à 700,
- récupération des nanoclusters à base de zinc, à savoir plus particulièrement récupération des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium.
Les ratios molaires tels que définis ci-dessus, respectivement entre :
- l’histidine et l’acétate de zinc (II) dihydrate, ou, entre l’histidine et l’acétate de zinc (II) dihydrate additionné du sélénite de sodium, et entre,
- l’acide ascorbique et l’acétate de zinc (II) dihydrate, ou, entre l’acide ascorbique et l’acétate de zinc (II) dihydrate additionné du sélénite de sodium, sont importants en ce sens qu’ils permettent aux ligands histidine, ions acétate et ascorbate de se lier au cœur métallique à base de zinc. On obtient de cette manière des nanoclusters comprenant trois ligands à la surface du cœur à base de zinc, ces trois ligands étant liés à la surface du cœur à base de zinc par des liaisons de coordination.
L’acide ascorbique est un réducteur. La réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate (et éventuellement de sélénite de sodium) et d’histidine avec l’acide ascorbique est plus particulièrement une réaction de réduction du mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate (et éventuellement de sélénite de sodium) et d’histidine avec de l’acide ascorbique. L’acide ascorbique permet notamment d’obtenir des nanoclusters à base de zinc dépourvus de toute toxicité.
La présente invention résulte notamment de la découverte inattendue des Inventeurs que la combinaison originale des réactifs utilisés, à savoir l’acétate de zinc (II) dihydrate, le sélénite de sodium, l’histidine et l’acide ascorbique, et dans les proportions telles que ci-dessus définies, permet d’obtenir des nanoclusters à base de zinc aux propriétés particulièrement avantageuses.
L’excellente stabilité des nanoclusters de l’invention en est un exemple.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters à base de zinc peuvent être plus particulièrement préparés selon le protocole « en solution » ou selon le protocole « en phase solide ». Chacune de ces deux voies de synthèse est conforme au procédé ci-dessus décrit.
1/ Protocole en solution
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le procédé de préparation tel que ci- dessus défini est plus particulièrement caractérisé en ce qu’il est effectué sous gaz inerte et en ce que :
- l’acétate de zinc (II) dihydrate, le sélénite de sodium est sous forme de solution et l’histidine est sous forme de poudre, - une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est préparée par ajout d’histidine dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, ou, dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et de sélénite de sodium,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est ajustée à une valeur de pH allant de 11 à 13, et de préférence est de 12,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, est préparée par ajout d’acide ascorbique dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, dont le pH a été ajusté aux valeurs susmentionnées,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, est agitée pendant 2 à 6h, et de préférence 4h, à une température allant de 35 à 45°C, et de préférence 40°C,
- une solution comprenant des nanoclusters à base de zinc est obtenue à l’issue de l’étape d’agitation, à savoir une solution comprenant des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium,
- la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc est éventuellement dialysée afin d’obtenir une solution purifiée de nanoclusters à base de zinc, à savoir une solution purifiée de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium,
- la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysée, est éventuellement lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
La solution comprenant les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysée, présente une stabilité dans le temps allant de 5 à 20 semaines à une température de conservation de 4°C.
La dialyse permet notamment de supprimer tout ce qui n’est pas lié au cœur métallique à base de zinc, comme par exemple éventuellement un excès d’histidine ou d’acide ascorbique ou encore du zinc ou du sélénium résiduel éventuellement présent dans la solution de nanoclusters à base de zinc. La couche comprenant l’histidine, les ions acétate et ascorbate est liée au cœur métallique à base de zinc par des liaisons de coordination.
La forme sèche des nanoclusters à base de zinc, obtenue à l’issue de la lyophilisation, présente une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, à une température de conservation de 4°C et sous azote. La forme sèche des nanoclusters à base de zinc peut être reconstituée à tout moment, par mélange dans un solvant de reconstitution, comme par exemple de l’eau purifiée. On entend par « reconstituer/reconstitution » l’opération de mélange simple de la forme sèche ou du lyophilisât avec un solvant.
L’analyse de la solution de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium, obtenue à l’issue de la reconstitution de la forme sèche, montre que les nanoclusters de zinc ou les nanoclusters de zinc et sélénium présentent l’ensemble des propriétés définies ci- dessus et sont donc exactement les mêmes que ceux directement obtenus à l’issue de leur procédé de préparation.
La solution de nanoclusters à base de zinc, obtenue à l’issue de la reconstitution de la forme sèche, présente une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines à une température de conservation de 4°C, et de préférence sous azote.
Le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est encore caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- le gaz inerte est de l’azote,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate est préparée par ajout d’acétate de zinc (II) dihydrate dans de l’eau ultra pure filtrée,
- la solution de sélénite de sodium est préparée par ajout de sélénite de sodium dans de l’eau ultra pure filtrée,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate présente une concentration allant de 0,5 à 5,0 mM,
- la solution de sélénite de sodium présente une concentration allant de 0,07 à 140 mM,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution sélénite de sodium,
- le pH de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine,
- la solution qui comprend les nanoclusters de zinc, éventuellement dialysée, présente une concentration en zinc allant de 16 à 164 pg/mL,
- la solution qui comprend les nanoclusters de zinc et sélénium, éventuellement dialysée, présente une concentration en zinc allant de 16 à 164 pg/mL et une concentration en sélénium allant de 0,003 à 5,500 pg/mL, - la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysée, est lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
2/ Protocole en phase solide
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, le procédé de préparation des nanoclusters à base de zinc tel que ci-dessus défini est plus particulièrement caractérisé en ce que :
- l’acétate de zinc (II) dihydrate, le sélénite de sodium et l’histidine sont chacun sous forme de poudre,
- un mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, un mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est obtenu par mélange de chacune des poudres d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est broyé jusqu’à obtention d’un mélange pulvérulent homogène en couleur et en aspect,
- le mélange pulvérulent homogène d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est placé dans un réacteur,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- l’acide ascorbique est ajouté dans le réacteur comprenant le mélange pulvérulent homogène d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique ainsi obtenu est mis sous agitation, puis de l’eau est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur, ladite eau étant de l’eau ultra pure filtrée,
- le réacteur est mis sous gaz inerte et à l’abri de la lumière,
- le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau, ou, le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau est maintenu sous agitation dans le réacteur pendant 16 à 36 h, et de préférence 24h,
- un mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc est obtenu à l’issue de l’étape précédente d’agitation, à savoir un mélange liquide de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium, - le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc est éventuellement dialysé afin d’obtenir un mélange liquide purifié de nanoclusters à base de zinc, à savoir un mélange purifié de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysé, est éventuellement lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc, ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
Le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est encore caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration d’acétate de zinc (II) dihydrate,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de sélénite de sodium,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine,
- l’eau ajoutée dans le réacteur est de l’eau ultra pure filtrée,
- le gaz inerte est de l’azote,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de zinc, éventuellement dialysé, présente une concentration en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de zinc et sélénium, éventuellement dialysé, présente une concentration en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL et une concentration en sélénium allant de 0,16 à 3300 pg/mL,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysé, est lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la forme sèche de nanoclusters à base de zinc est conservée sous azote, de préférence dans des flacons, et de préférence à 4°C, ladite poudre pouvant être conservée pendant une durée d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, sans altération de la stabilité des nanoclusters à base de zinc.
La reconstitution de la poudre de nanoclusters à l’issue de cette période montre que les nanoclusters sont les mêmes que ceux directement obtenus à l’issue de leur préparation (selon le protocole « solution » ou le protocole « en phase solide »). En effet les nanoclusters à base de zinc présentent l’ensemble des propriétés définies ci-dessus.
L’utilisation des nanoclusters à base de zinc
L’invention a encore pour objet les nanoclusters à base de zinc tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis, pour une utilisation comme médicament. Selon un mode de réalisation avantageux, l’invention a pour objet des nanoclusters à base de zinc tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis, pour une utilisation pour lutter contre les carences en zinc.
Dans ce cas de figure les nanoclusters à base de zinc sont plus particulièrement des nanoclusters de zinc.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l’invention a pour objet des nanoclusters à base de zinc tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis, pour une utilisation pour lutter contre les carences en zinc et sélénium.
Dans ce cas de figure les nanoclusters à base de zinc sont plus particulièrement des nanoclusters de zinc et sélénium.
Un autre objet de l’invention réside en une composition caractérisée en ce qu’elle comprend des nanoclusters à base de zinc tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis.
La composition de l’invention comprend plus particulièrement des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium.
La composition de l’invention pourra être un médicament, un complément alimentaire ou une composition alimentaire.
La quantité de zinc ou la quantité de zinc et sélénium présente dans la composition de l’invention détermine s’il s’agit plutôt d’un complément alimentaire ou plutôt d’un médicament. Ainsi, un complément alimentaire comprendra une quantité de zinc, ou, une quantité de zinc et sélénium, moindre que la quantité de zinc ou la quantité de zinc et sélénium présente dans un médicament.
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition se trouve sous une forme adaptée pour une administration par voie orale.
Les nanoclusters à base de zinc peuvent avantageusement être administrés par la voie orale car ils sont aptes à passer la barrière intestinale sans difficulté, notamment du fait de leur petite taille.
Selon encore un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition de l’invention comprenant les nanoclusters de zinc comprend une quantité de zinc inférieure à la quantité de zinc habituellement présente dans une préparation orale classique de zinc, qu’il s’agisse d’un médicament ou d’un complément alimentaire.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition de l’invention comprenant les nanoclusters de zinc et sélénium comprend une quantité de zinc et sélénium inférieure à la quantité de zinc et sélénium habituellement présente dans une préparation orale classique de zinc et sélénium, qu’il s’agisse d’un médicament ou d’un complément alimentaire. Exemples
Les exemples ci-après illustrent l’invention, ils ne la limitent en aucune façon.
Exemple 1
1/ Préparation des nanoclusters de zinc
Cet exemple décrit respectivement les deux voies de synthèse possibles pour préparer les nanoclusters de zinc de l’invention, à savoir le « protocole en solution » et le « protocole en phase solide ».
1.1/ Protocole en solution
Réactifs utilisés :
- Acétate de zinc (II) dihydrate [Zn(CH3COO)2, 2H2O], M = 219,51 g/mol (Sigma Aldrich, Cas 5970-45-6) ;
- L(-)-Histidine, M=155,15 g/mol (Merck, Cas 71-00-1) ;
- Acide ascorbique, M= 176,12 g/mol (Sigma Aldrich, Cas 50-81-7);
- Solution de NaOH 1M, M= 40,00 g/mol (VWR, Cas 1310-73-2).
Précautions à prendre
La synthèse est réalisée sous gaz inerte (azote). La verrerie est lavée à l’eau régale (1 volume d’acide nitrique 65% pour 2 volumes d’acide chlorhydrique 37%).
L’eau ultra pure est utilisée et est filtrée sur un filtre de diamètre de pores 0,2 pm.
Préparation d’une solution mère d'acétate de zinc 2,5 mM
Une quantité de 55,0 mg d’acétate de zinc est disposée dans une fiole jaugée de 100 mL. De l’eau ultra pure filtrée est ajoutée jusqu’au trait de jauge de la fiole. Une solution d'acétate de zinc d’une concentration de 2,5 mM est obtenue.
Après complète solubilisation, la solution d’acétate de zinc est transvasée dans un flaconnage adapté. Cette solution peut être conservée pendant un mois dans le réfrigérateur à 4°C.
Synthèse des nanoclusters de zinc stabilisés avec de l'histidine
Une quantité de 500 pL de la solution mère d’acétate de zinc telle que préparée à l’étape précédente est ajoutée dans un ballon à col rond pouvant contenir jusqu’à 50 mL de solution. Puis, une quantité de 4500 pL d’eau ultra pure filtrée est ajoutée dans le ballon. La solution d’acétate de zinc obtenue est appelée 1x.
La solution d’acétate de zinc 1x est agitée à 130 rpm avec l’agitateur multi plaques. Une quantité de 39 mg d’histidine est ajoutée à la solution d’acétate de zinc. La solution d’acétate de zinc et d’histidine est agitée pendant 15 minutes. La solution est incolore.
Après agitation le pH de la solution d’acétate de zinc et d’histidine est ajusté à 12 avec 10 gouttes de NaOH 1M. Une quantité de 139 mg d’acide ascorbique est ajoutée au mélange réactionnel. On attend 2 minutes la complète solubilisation de l’acide ascorbique. Le ballon (réacteur) est placé dans un bain marie à 40°C sous agitation (vitesse réglée à 6) pendant 4 heures.
La solution de nanoclusters de zinc obtenue à l’issue de la synthèse est incolore. Elle est appelée 1x et présente une concentration en zinc de 16 pg/mL. Elle est conservée au frais, à 4°C.
Les solutions de nanoclusters de zinc peuvent être lyophilisées.
Des solutions d’acétate de zinc d’une concentration allant de 1x à 10x sont préparées afin d’obtenir des solutions de nanoclusters zinc 1x à 10x qui présentent une concentration en zinc allant de 16 à 164 pg/mL.
A titre indicatif une solution d’acétate de zinc 2x est préparée en disposant une quantité de 1000 pL de solution mère d’acétate de zinc dans le ballon et en complétant à 5000 pL avec de l’eau ultra pure filtrée. Une solution d’acétate de zinc 4x est préparée en disposant une quantité de 2000 pL de solution mère d’acétate de zinc dans le ballon et en complétant à 5000 pL avec de l’eau ultra pure filtrée etc.
Les solutions de nanoclusters de zinc 1x à 10x ainsi obtenues sont conservées au frais, à 4°C.
Dialyse des nanoclusters de zinc
La solution de nanoclusters de zinc 1x obtenue à l’étape précédente est purifiée par dialyse.
Une cellule de dialyse est préparée (X12 Float a lyzer G2 CE MWCO 100-500 D, Référence 1511160), et un bêcher de 150 mL est rempli avec 100 mL d’eau ultra pure filtrée. La cellule de dialyse est remplie avec de l’eau ultrapure filtrée à l’aide d’une pipette pasteur. La cellule de dialyse est placée dans le bêcher sous agitation (130 rpm). On laisse la cellule s’hydrater et se laver pendant 1h.
L’eau est ensuite remplacée par un nouveau volume de 100 mL d’eau ultra pure filtrée. La cellule de dialyse est vidée à l’aide d’une pipette pasteur puis est remplie avec la solution de nanoclusters de zinc 1x, qui est laissée sous agitation toute la nuit (pendant 12h) à une température entre 2 et 6°C.
La solution dialysée de nanoclusters de zinc 1x ainsi obtenue est transférée dans un flaconnage adapté et est conservée à une température de 4°C.
La dialyse n’influe pas sur la concentration en zinc des nanoclusters. Ainsi, les concentrations en zinc des solutions de nanoclusters de zinc dialysées sont identiques à celles des solutions non dialysées.
Les solutions de nanoclusters de zinc, éventuellement dialysées, peuvent être lyophilisées.
Les concentrations en zinc des solutions de nanoclusters de zinc dialysées sont identiques à celles des solutions non dialysées, et vont de 16 à 164 pg/mL pour des solutions d’acétate de zinc allant de 1x à 10x. 1.2/ Protocole en phase solide
Réactifs utilisés et précautions à prendre
L’acétate de zinc (II) dihydrate, la L(-)-Histidine et l’acide ascorbique sont les mêmes que ceux utilisés dans le protocole solution. Dans le protocole en phase solide l’hydroxyde de sodium n’est pas nécessaire.
Les précautions à prendre sont les mêmes que pour le protocole en solution.
Synthèse des nanoclusters de zinc stabilisés avec de l'histidine
Une quantité de 23 mg d’acétate de zinc est pesée puis est placée à l’intérieur d’un mortier en agate. Une quantité de 1,7 g d’histidine est ensuite pesée. Un volume de poudre d’histidine pour un volume de poudre d’acétate de zinc est ajouté en prenant soin de bien broyer les poudres à l’aide du pilon jusqu’à obtenir un mélange de couleur et d’aspect homogène. Cette opération est répétée tant qu’il y a de l’histidine.
Le mélange final des deux poudres doit avoir une couleur blanche et la poudre doit être homogène. Le mélange des deux poudres est ensuite transféré dans un ballon monocol de 50 mL (col rodé NS 19/26) à l’aide d’une spatule. Une quantité de 3 g d’acide ascorbique est pesée et transférée dans le ballon. Un agitateur magnétique en forme d’olive est placé au fond du ballon. Une quantité de 5 mL d’eau ultra pure est filtrée à l’aide d’une seringue en plastique de 5 mL et est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur. Un mélange liquide est obtenu.
Le réacteur est fermé à l’aide d’un bouchon à jupe rabattable (diamètre 19,4 mm) et est mis sous azote sans créer de surpression à l’aide d’un ballon de baudruche. Le réacteur est entouré d’un papier aluminium puis est placé sous agitation (200 rpm) le temps de la réaction. Il faut attendre 24h avant la fin de la réaction. A la fin de la réaction, le produit obtenu, qui se trouve sous la forme d’un liquide, a une couleur grise.
Le liquide obtenu, comprenant les nanoclusters de zinc, présente une concentration en zinc de 1370 pg/mL et est appelé 100x.
La concentration en zinc des nanoclusters est bien entendu dépendante de la quantité d’acétate de zinc utilisée au départ du procédé de l’invention.
Les opérations ci-dessus décrites sont répétées de sorte à obtenir des concentrations en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL (100x à 1000x) pour des quantités d’acétate de zinc au départ du procédé de l’invention (protocole en phase solide) allant de 23 mg à 230 mg.
Le liquide obtenu comprenant les nanoclusters de zinc est ensuite transféré dans un flaconnage en plastique adapté (le volume final n’est pas de 5 ml mais d’un peu plus, environ 8,5 mL). Le liquide comprenant les nanoclusters de zinc est soit stocké à 4°C, soit transféré au lyophilisateur. La lyophilisation est effectuée par fractions de 1 mL, sans ajout de réactifs supplémentaires. Après la lyophilisation, le contenu du flacon (qui comprend les nanoclusters de zinc sous forme sèche) est placé sous azote et est stocké à 4°C.
La forme sèche des nanoclusters de zinc peut être reconstituée à tout moment dans 1 mL d’eau purifiée. La solution de nanoclusters de zinc ainsi reconstituée est conservée à 4°C, de préférence sous azote.
2/ Préparation des nanoclusters de zinc et sélénium
2.1/ Protocole en solution
Réactifs utilisés :
L’acétate de zinc (II) dihydrate, la L(-)-Histidine, l’acide ascorbique et l’hydroxyde de sodium sont les mêmes que ceux utilisés dans le protocole solution pour la préparation des nanoclusters de zinc.
Il est en outre utilisé dans cet exemple le sélénite de sodium [IX^SeCh] M = 172,948 g/mol (Sigma Aldrich, Cas 10102-18-8).
Les précautions à prendre sont les mêmes que celles décrites pour le protocole en solution des nanoclusters de zinc.
Préparation d’une solution mère d'acétate de zinc 2,5 mM
La solution mère d’acétate de zinc est préparée de la manière décrite dans le paragraphe protocole en solution pour les nanoclusters de zinc.
Préparation d’une solution mère de sélénite de sodium 0,71 mM
Une quantité de 12,0 mg de sélénite de sodium est disposée dans une fiole jaugée de 100 mL. De l’eau ultra pure filtrée est ajoutée jusqu’au trait de jauge de la fiole. Une solution de sélénite de sodium 0,71 mM est obtenue.
Après complète solubilisation, la solution de sélénite de sodium est transvasée dans un flaconnage adapté. Cette solution peut être conservée pendant un mois dans le réfrigérateur à 4°C.
Synthèse des nanoclusters de zinc et de sélénium stabilisés avec de l'histidine
Pour la synthèse des nanoclusters bimétallique de zinc et de sélénium, une dilution au dixième de la solution de sélénite de sodium obtenue à l’étape précédente dans 1 mL d’eau est réalisée (100 pL de solution mère de sélénite de sodium + 900 pL d’eau ultra pure). La solution diluée au dixième de sélénite de sodium est appelée solution 0,1% de sélénium.
Une quantité de 2000 pL de la solution mère d’acétate de zinc telle que préparée à l’étape précédente est ajoutée dans un ballon à col rond pouvant contenir jusqu’à 50 mL de solution. Puis, une quantité de 3000 pL d’eau ultra pure filtrée est ajoutée dans le ballon. La solution d’acétate de zinc obtenue est appelée 4x. Une quantité de 100 pL de la solution diluée de sélénite de sodium (0,1% sélénium) est ajoutée à 2000 pL de la solution d’acétate de zinc 4x.
Le rapport molaire de l’élément sélénium par rapport à l’élément zinc est de 1 pour 1000 dans la solution d’acétate de zinc et de sélénite de sodium ainsi préparée.
La solution d’acétate de zinc et de sélénite de sodium est agitée à 250 rpm avec l’agitateur multi plaques pendant 5 minutes.
Une quantité de 39 mg d’histidine est ajoutée à la solution d’acétate de zinc et de sélénite de sodium. La solution d’acétate de zinc, de sélénite de sodium et d’histidine est agitée pendant 15 minutes à la même vitesse d’agitation. La solution est incolore.
Après 15 minutes d’agitation le pH de la solution d’acétate de zinc, de sélénite de sodium et d’histidine est ajusté à 12 avec 10 gouttes de NaOH 1M.
Une quantité de 139 mg d’acide ascorbique est ajoutée au mélange réactionnel. On attend 2 minutes la complète solubilisation de l’acide ascorbique. Le ballon (réacteur) est placé dans un bain marie à 40°C sous agitation (vitesse réglée à 6) pendant 4 heures.
La solution de nanoclusters de zinc et sélénium obtenue à l’issue de la synthèse est incolore et présente :
- une concentration en zinc de 65 pg/mL pour une solution d’acétate de zinc 4x,
- une concentration en sélénium de 0,1 pg/mL pour une solution de sélénite de sodium 0,1% de sélénium.
Le rapport massique de zinc et de sélénium au sein du noyau bimétallique des nanoclusters de zinc et sélénium est dans cet exemple de 99,9% de zinc pour 0,1% de sélénium.
La solution de nanoclusters de zinc et sélénium est conservée au frais à 4°C. La solution peut également être lyophilisée.
Le même protocole de synthèse peut être utilisé en ajoutant 100 pL d’une solution de sélénite de sodium 0,71 mM diluée 100 fois dans l’eau. Une solution de sélénite de sodium 0,01% de sélénium est obtenue.
Une quantité de 100 pL de la solution diluée de sélénite de sodium (0,01% sélénium) est ajoutée à 2000 pL de la solution d’acétate de zinc 4x.
Le rapport molaire de l’élément sélénium par rapport à l’élément zinc est de 1 pour 10 000 dans la solution d’acétate de zinc et de sélénite de sodium ainsi préparée.
Des solutions d’acétate de zinc d’une concentration allant de 1x à 10x ainsi que des solutions de sélénite de sodium diluées comprenant de 0,01% à 20% de sélénium sont préparées.
Les concentrations en zinc des solutions de nanoclusters de zinc et sélénium vont de 16 à 164 pg/mL pour des solutions d’acétate de zinc allant de 1x à 10x. Les concentrations en sélénium des solutions de nanoclusters de zinc et sélénium vont de 0,003 à 5,5 pg/mL pour des solutions de sélénite de sodium diluées comprenant de 0,01% à 20% de sélénium.
Dialyse des nanoclusters de zinc et de sélénium
La solution de nanoclusters de zinc et sélénium obtenue à l’étape précédente peut être purifiée par dialyse selon le même protocole que celui décrit dans le paragraphe « dialyse des nanoclusters de zinc » dans le protocole en solution des nanoclusters de zinc.
Les concentrations en zinc des solutions de nanoclusters de zinc et sélénium dialysées sont identiques à celles des solutions non dialysées, et vont de 16 à 164 pg/mL pour des solutions d’acétate de zinc allant de 1x à 10x.
Les concentrations en sélénium des solutions de nanoclusters de zinc et sélénium dialysées sont identiques à celles des solutions non dialysées, et vont de 0,003 à 5,5 pg/mL pour des solutions de sélénite de sodium diluées comprenant de 0,01% à 20% de sélénium.
2.2/ Protocole en phase solide
Réactifs utilisés et précautions à prendre
L’acétate de zinc (II) dihydrate, la L(-)-Histidine et l’acide ascorbique sont les mêmes que ceux utilisés dans le protocole solution. Dans le protocole en phase solide l’hydroxyde de sodium n’est pas nécessaire. Il est en outre utilisé dans cet exemple le sélénite de sodium [Na2SeO3] M = 172,948 g/mol (SIGMA ALDRICH, CAS 10102-18-8).
Les précautions à prendre sont les mêmes que pour le protocole en solution.
Synthèse des nanoclusters de zinc et de sélénium stabilisés avec de l'histidine
Une quantité de 10 mg de sélénite de sodium est placée dans un mortier en agate. Une quantité de 1,27 g d’acétate de zinc est pesée. Un volume de poudre d’acétate de zinc pour un volume de poudre de sélénite de sodium est ajouté en prenant soin de bien broyer les poudres à l’aide du pilon jusqu’à obtenir un mélange de couleur et d’aspect homogène. Cette opération est répétée tant qu’il y a de l’acétate de zinc.
Une quantité de 23 mg du mélange de poudre précédent est pesée puis est placée à l’intérieur d’un mortier en agate. Une quantité de 1 ,7 g d’histidine est ensuite pesée. Un volume de poudre d’histidine pour un volume de poudre d’acétate de zinc et de sélénite de sodium est ajouté en prenant soin de bien broyer les poudres à l’aide du pilon jusqu’à obtenir un mélange de couleur et d’aspect homogène. Cette opération est répétée tant qu’il y a de l’histidine.
Le mélange final des deux poudres doit avoir une couleur blanche et la poudre doit être homogène. Le mélange des deux poudres est ensuite transféré dans un ballon monocol de 50 mL (col rodé NS 19/26) à l’aide d’une spatule. Une quantité de 3 g d’acide ascorbique est pesée et transférée dans le ballon. Un agitateur magnétique en forme d’olive est placé au fond du ballon. Une quantité de 5 mL d’eau ultra pure est filtrée à l’aide d’une seringue en plastique de 5 mL et est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur. Un mélange liquide est obtenu.
Le réacteur est fermé à l’aide d’un bouchon à jupe rabattable (diamètre 19,4 mm) et est mis sous azote sans créer de surpression à l’aide d’un ballon de baudruche. Le réacteur est entouré d’un papier aluminium puis est placé sous agitation (200 rpm) le temps de la réaction. Il faut attendre 24h avant la fin de la réaction. A la fin de la réaction, le produit obtenu, qui se trouve sous la forme d’un liquide, a une couleur grise.
Le liquide obtenu, comprenant les nanoclusters de zinc et de sélénium, présente une concentration :
- en zinc de 1370 pg/mL correspondant à une concentration en zinc encore appelée 100x,
- en sélénium de 16 pg/mL correspondant à une concentration en sélénium encore appelée 1%.
Les concentrations en zinc et en sélénium des nanoclusters de zinc et sélénium sont bien entendu dépendantes des quantités d’acétate de zinc et de sélénite de sodium utilisées au départ du procédé de l’invention.
Les opérations décrites ci-dessus sont répétées de sorte à obtenir des nanoclusters de zinc et sélénium comprenant :
- des concentrations en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL correspondants à des concentrations en zinc 100x à 1000x,
- des concentrations en sélénium allant de 0,16 à 3300 pg/mL correspondants à des concentrations en sélénium de 0,01% à 20%.
Le liquide comprenant les nanoclusters de zinc et sélénium est soit stocké à 4°C, soit transféré au lyophilisateur.
La lyophilisation est effectuée par fractions de 1 mL, sans ajout de réactifs supplémentaires. Après la lyophilisation, le contenu du flacon (qui comprend les nanoclusters de zinc et de sélénium sous forme sèche) est placé sous azote et est stocké à 4°C.
La forme sèche des nanoclusters de zinc et de sélénium peut être reconstituée à tout moment dans 1 mL d’eau purifiée. La solution de nanoclusters de zinc et de sélénium ainsi reconstituée est conservée à 4°C, de préférence sous azote.
Exemple 2
1/ Caractérisation des nanoclusters de zinc
Les nanoclusters de zinc tels qu’obtenus à l’exemple 1, qu’il s’agisse du protocole en solution ou du protocole en phase solide, sont caractérisés quant à leur structure, leurs tailles, leurs propriétés spectrophotométriques et leur stabilité.
Structure des nanoclusters de zinc Les nanoclusters de zinc de l’invention présentent plus particulièrement une forme sphérique. Ils sont constitués d’un cœur métallique de zinc couvert d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbate. La figure 1 est une représentation schématique d’un nanocluster de zinc de l’invention, qui peut encore être désigné par la formule « ZnNC@HisAcAsc ».
La présence d’ions acétate à la surface des nanoclusters de zinc a été démontrée par chromatographie liquide haute performance (CLHP), plus particulièrement par chromatographie de partage à polarité de phases inversées.
Les nanoclusters de zinc de la solution dialysée 1x, qui présente une concentration en zinc de 16 pg/mL (telle qu’obtenue à l’exemple 1 , point 1.1/ « Protocole en solution »), sont détruits (dissolution totale et retour aux différents éléments composant la structure des nanoclusters) par un procédé chimique, à savoir mise en solution dans un acide concentré (HCl) puis une base concentrée (NaOH), puis sont analysés par chromatographie de partage à polarité de phases inversées en comparaison à un témoin acétate de sodium (rétention des ligands sur colonne apolaire, séparation, identification et quantification (étalonnage externe) des ions acétate par spectrophotométrie UV).
Les résultats obtenus sont illustrés dans le chromatogramme de la figure 2. Le pic à 3,58 min associé aux ions acétate (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’ions acétate à la surface du cœur métallique de zinc.
La présence d’histidine et d’ions ascorbate à la surface des nanoclusters de zinc a également été démontrée par chromatographie liquide haute performance, plus particulièrement après purification des nanoclusters en solution par chromatographie d’exclusion stérique, en comparaison à un témoin histidine et acide ascorbique.
Les résultats obtenus sont illustrés dans le chromatogramme de la figure 3.
Le pic à 2,13 min associé à l’histidine (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’histidine à la surface du cœur métallique.
Le pic à 2,96 min associé aux ions ascorbate (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’ions ascorbate à la surface du cœur métallique.
Taille des nanoclusters de zinc
Le diamètre hydrodynamique (Dh) des nanoclusters de zinc a été évalué par diffusion dynamique de la lumière (figure 4) (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern) et par analyse par dispersion de Taylor (figure 5). La méthode d’analyse par diffusion dynamique de la lumière consiste La méthode d’analyse par diffusion dynamique de la lumière consiste à analyser le mouvement Brownien des particules et de le modéliser à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein.
La méthode d’analyse par dispersion de Taylor consiste à injecter une bande de soluté dans un tube capillaire ouvert (50 pm) et à la mobiliser sous l’influence d’un flux hydrodynamique (pression positive 1 psi, profil de vitesse parabolique). Le principe de la détermination du rayon hydrodynamique repose sur la relation de Taylor-Aris qui établit le lien entre l’étalement du pic de soluté (modélisation d’une gaussienne) et le coefficient de diffusion moléculaire.
Le diamètre métallique des nanoclusters de zinc a été évalué par microscopie électronique à transmission (dépôt sur grilles en nickel, observations sous faisceaux opérant à 200 kV (LaB6 cathode) Philips CM 200).
Les diamètres (hydrodynamique et métallique) des nanoclusters de zinc ont respectivement été évalués immédiatement à l’issue de leur synthèse, qu’il s’agisse du protocole en solution ou en phase solide.
Concernant le protocole en solution, les diamètres hydrodynamique et métallique ont été évalués sur la solution de nanoclusters de zinc 1x, non dialysée et non lyophilisée, obtenue au point 1.1/ de l’exemple 1, qui présente une concentration en zinc de 16 pg/mL.
Concernant le protocole en phase solide, les diamètres hydrodynamique et métallique ont été évalués sur les échantillons lyophilisés obtenus obtenue au point 1.2/ de l’exemple 1, présentant une concentration en zinc de 1370 pg/mL (100x).
Le diamètre hydrodynamique moyen des nanoclusters de zinc, tout comme le diamètre métallique, est inférieur à 1,0 nm. Plus particulièrement, il ressort des figures 4 et 5 qu’en diffusion dynamique de la lumière (fig. 4) et en dispersion de Taylor (fig. 5) le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc est égal à 0,72 ± 0,05 nm.
Les propriétés spectrophotométriques des nanoclusters de zinc ont été évaluées par spectroscopie UV-Visible (figure 6) et par spectroscopie de fluorescence (figure 7), immédiatement à l’issue de leur synthèse.
Le spectre UV-vis montre un épaulement à 300 ± 15 nm (fig. 6), ce qui confirme l’existence des nanoclusters.
Une fluorescence des nanoclusters de zinc existe avec (fig. 7) une longueur d’onde d’excitation de 364 ± 15 nm et une longueur d’onde d’émission de 415 ± 15 nm, ce qui confirme également l’existence des nanoclusters.
Les nanoclusters de zinc de l’invention présentent des propriétés optiques, en particulier de fluorescence, caractéristiques de cette échelle intermédiaire entre la molécule et la nanoparticule. Stabilité des nanoclusters de zinc
La stabilité des nanoclusters de zinc a été évaluée par mesure de leur diamètre hydrodynamique en diffusion dynamique de la lumière (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern).
Les analyses ont été effectuées sur les nanoclusters de zinc obtenus selon le protocole en solution et selon le protocole en phase solide.
Concernant le protocole en solution, les analyses ont été effectuées sur les solutions de nanoclusters de zinc 1x présentant une concentration en zinc de 16 pg/mL. La stabilité a été évaluée un peu plus de 5 semaines après la synthèse desdites solutions.
Il a été constaté que le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc était toujours de 0,72 ± 0,05 nm plus de 5 semaines après leur synthèse, ce qui démontre leur excellente stabilité.
Concernant le protocole en phase solide, les analyses ont été effectuées sur :
- les échantillons lyophilisés obtenus à partir du liquide de nanoclusters de zinc, non dialysé, présentant une concentration en zinc de 1370 pg/mL (100x),
- les solutions reconstituées après lyophilisation desdits échantillons, dans le même volume que celui de la lyophilisation.
Le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc des échantillons lyophilisés est de 1 ,73 nm après plus de 5 semaines de conservation sous azote.
Après reconstitution des échantillons, dans le même volume que celui de la lyophilisation, le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc des échantillons reconstitués est de 1 ,58 nm, ce qui démontre encore une fois leur excellente stabilité.
2/ Caractérisation des nanoclusters de zinc et de sélénium
Les nanoclusters de zinc et sélénium tels qu’obtenus à l’exemple 1 point 2/, qu’il s’agisse du protocole en solution ou du protocole en phase solide, sont caractérisés quant à leur structure, leurs tailles, leurs propriétés spectrophotométriques et leur stabilité.
Structure des nanoclusters de zinc et sélénium
Les nanoclusters de zinc et de sélénium présentent une forme sphérique. Ils sont constitués d’un cœur bimétallique de zinc et sélénium couvert d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et ascorbate. La figure 8 est une représentation schématique d’un nanocluster de zinc et sélénium de l’invention, qui peut encore être désigné par la formule « ZnSeNC@HisAcAsc ».
La présence d’ions acétate à la surface des nanoclusters bimétalliques de zinc et de sélénium a été démontrée par chromatographie liquide haute performance (CLHP), plus particulièrement par chromatographie de partage à polarité de phases inversées. Tl
Les nanoclusters de zinc et de sélénium de la solution dialysée obtenue à l’exemple 1, point 2.1/ « Protocole en solution », sont détruits (dissolution totale et retour aux différents éléments composant la structure des nanoclusters) par un procédé chimique, à savoir mise en solution dans un acide concentré (HCl) puis une base concentrée (NaOH), puis sont analysés par chromatographie de partage à polarité de phases inversées en comparaison à un témoin acétate de sodium (rétention des anions composant le nanocluster sur une résine échangeuse cationique, séparation, identification et quantification (étalonnage externe) des ions acétate par conductimétrie avec l’aide un suppresseur).
Les résultats obtenus sont illustrés dans le chromatogramme de la figure 9. Le pic à 3,44 min associé aux ions acétate (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc et sélénium (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’ions acétate à la surface du cœur bimétallique de zinc et sélénium.
La présence d’histidine et d’ions ascorbate à la surface des nanoclusters de zinc et sélénium a également été démontrée par chromatographie liquide haute performance, plus particulièrement après purification des nanoclusters en solution par chromatographie d’exclusion stérique, en comparaison à un témoin histidine et acide ascorbique.
Les résultats obtenus sont illustrés dans le chromatogramme de la figure 10.
Le pic à 2,07 min associé à l’histidine (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc et sélénium (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’histidine à la surface du cœur bimétallique de zinc et sélénium.
Le pic à 2,85 min associé aux ions ascorbate (témoin, voir tracé du bas) est retrouvé dans les nanoclusters de zinc et sélénium (voir tracé du haut), montrant ainsi la présence d’ions ascorbate à la surface du cœur bimétallique de zinc et de sélénium.
Taille des nanoclusters de zinc et sélénium
Le diamètre hydrodynamique (Dh) des nanoclusters de zinc et sélénium a été évalué par diffusion dynamique de la lumière (figure 11) (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern).
Les diamètres des nanoclusters de zinc et sélénium ont été évalués immédiatement à l’issue de leur synthèse, qu’il s’agisse du protocole en solution ou en phase solide.
Concernant le protocole en solution, les diamètres hydrodynamiques ont plus particulièrement été évalués sur la solution de nanoclusters de zinc et sélénium, non dialysée et non lyophilisée, obtenue au point 2.1/ de l’exemple 1 , qui présente une concentration en zinc de 65 pg/mL (4x) et en sélénium de 0,1 pg/mL (0,1% Se).
Concernant le protocole en phase solide, les diamètres hydrodynamiques ont été évalués sur les échantillons lyophilisés obtenus au point 2.2/ de l’exemple 1, qui présente une concentration en en zinc de 1370 pg/mL (100x) et en sélénium de 16 pg/mL (1% Se). Il ressort de la figure 11 que le diamètre hydrodynamique moyen des nanoclusters de zinc et de sélénium est de 0,69 ± 0,06 nm.
Propriétés spectrophotométriques
Les propriétés spectrophotométriques des nanoclusters de zinc et de sélénium ont été évaluées par spectroscopie U V- Visible (figure 12) et par spectroscopie de fluorescence (figure 13), immédiatement à l’issue de leur synthèse.
Le spectre U -vis montre un épaulement à 300 ± 15 nm (fig. 12), ce qui confirme l’existence des nanoclusters.
Une fluorescence des nanoclusters de zinc et sélénium existe avec (fig. 13) une longueur d’onde d’excitation de 364 ± 15 nm et une longueur d’onde d’émission de 415 ± 15 nm, ce qui confirme également l’existence des nanoclusters.
Les nanoclusters de zinc et sélénium de l’invention présentent des propriétés optiques, en particulier de fluorescence, caractéristiques de cette échelle intermédiaire entre la molécule et la nanoparticule.
Stabilité des nanoclusters de zinc et sélénium
La stabilité des nanoclusters de zinc et sélénium a été évaluée par mesure de leur diamètre hydrodynamique en diffusion dynamique de la lumière (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern).
Les analyses ont été effectuées sur les nanoclusters de zinc et sélénium obtenus selon le protocole en solution et selon le protocole en phase solide.
Concernant le protocole en solution, les analyses ont été effectuées sur les solutions de nanoclusters de zinc et sélénium telles qu’obtenue au point 2.1/ de l’exemple 1.
Il a été constaté que le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc et de sélénium était de 0,69 ± 0,06 nm plus de 5 semaines après leur synthèse, ce qui démontre leur excellente stabilité.
Concernant le protocole en phase solide, les analyses ont été effectuées sur :
- les échantillons lyophilisés obtenus au point 2.2/ de l’exemple 1 ,
- les solutions reconstituées après lyophilisation desdits échantillons, telles qu’obtenues au point 2.2/ de l’exemple 1.
Le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc et de sélénium des échantillons lyophilisés est de 0,70 nm après plus de 5 semaines de conservation sous azote.
Après reconstitution des échantillons, dans le même volume que celui de la lyophilisation, le diamètre hydrodynamique des nanoclusters de zinc et de sélénium des échantillons reconstitués est de 0,70 nm, ce qui démontre encore une fois leur excellente stabilité.

Claims

REVENDICATIONS Nanoclusters à base de zinc, caractérisés en ce qu’ils :
- comprennent un cœur métallique à base de zinc recouvert sur l’ensemble de sa surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine (His), des ions acétate (Ac) et des ions ascorbate (Asc), ledit cœur métallique étant constitué de zinc (Zn) ou d’un mélange de zinc et sélénium (ZnSe), la quantité de zinc au sein dudit mélange allant de 80 à 99,99% et la quantité de sélénium au sein dudit mélange allant de 0,01 à 20%, les pourcentages étant des pourcentages en poids par rapport au poids total du mélange,
- présentent une forme sphérique,
- présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence inférieur à 1,0 nm,
- présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1,5 nm, et de préférence inférieur à 1,0 nm,
- présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 20 semaines lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide et sont stockés à une température 4°C,
- présentent une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche et sont stockés à une température de 4°C et sous azote,
- présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre U - isible à 300 ± 15 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation de 364 ± 15 nm et des longueurs d’onde d’émission de 415 ± 15 nm, lesdits nanoclusters à base de zinc pouvant encore être désignés par la formule « ZnNC@HisAcAsc » ou « ZnSeNC@HisAcAsc » selon que le cœur métallique soit constitué de zinc ou d’un mélange de zinc et sélénium. Nanoclusters à base de zinc selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il s’agit de nanoclusters de zinc comprenant un cœur métallique constitué de zinc, lesdits nanoclusters pouvant être désigné par la formule « ZnNC@HisAcAsc ». Nanoclusters à base de zinc selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il s’agit de nanoclusters de zinc et sélénium comprenant un cœur métallique constitué d’un mélange de zinc et sélénium, lesdits nanoclusters pouvant être désigné par la formule « ZnSeNC@HisAcAsc ».
4. Nanoclusters à base de zinc selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu’ils se présentent sous forme liquide ou sous forme sèche.
5. Nanoclusters à base de zinc selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en qu’ils présentent au moins une des caractéristiques suivantes :
- ils sont aptes à passer la barrière intestinale,
- ils présentent une bonne biodisponibilité,
- ils sont biocompatibles,
- ils sont biodégradables,
- ils sont lyophilisables,
- ils ne sont pas toxiques pour l’organisme humain,
- ils ne s’accumulent pas dans les organes tels que le foie, la rate, les reins ou les poumons.
6. Procédé de préparation de nanoclusters à base de zinc selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate avec de l’histidine, ou, réaction entre de l’acétate de zinc (II) dihydrate, du sélénite de sodium avec de l’histidine, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, le ratio molaire histidine/acétate de zinc (II) dihydrate ou le ratio molaire histidine/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 10, de préférence va de 10 à 200, et plus préférentiellement encore va de 100 à 200,
- réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine avec de l’acide ascorbique, ou, réaction entre le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine avec de l’acide ascorbique, afin d’obtenir un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, un mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, le ratio molaire acide ascorbique/acétate de zinc (II) dihydrate, ou le ratio molaire acide ascorbique/(acétate de zinc (II) dihydrate + sélénite de sodium) étant supérieur ou égal à 16, de préférence va de 16 à 700, et plus préférentiellement encore va de 160 à 700,
- récupération des nanoclusters à base de zinc, à savoir plus particulièrement récupération des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium.
7. Procédé de préparation selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il est effectué sous gaz inerte et en ce que : - l’acétate de zinc (II) dihydrate, le sélénite de sodium est sous forme de solution et l’histidine est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est préparée par ajout d’histidine dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, ou, dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et de sélénite de sodium,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est ajustée à une valeur de pH allant de 11 à 13, et de préférence est de 12,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, une solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique est préparée par ajout d’acide ascorbique dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, dans la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, dont le pH a été ajusté aux valeurs susmentionnées,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique, est agitée pendant 2 à 6h, et de préférence 4h, à une température allant de 35 à 45°C, et de préférence 40°C,
- une solution comprenant des nanoclusters à base de zinc est obtenue à l’issue de l’étape précédente d’agitation, à savoir une solution comprenant des nanoclusters de zinc ou des nanoclusters de zinc et sélénium,
- la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc est éventuellement dialysée afin d’obtenir une solution purifiée de nanoclusters à base de zinc, à savoir une solution purifiée de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium,
- la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysée, est éventuellement lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- le gaz inerte est de l’azote,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate est préparée par ajout d’acétate de zinc (II) dihydrate dans de l’eau ultra pure filtrée, - la solution de sélénite de sodium est préparée par ajout de sélénite de sodium dans de l’eau ultra pure filtrée,
- la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate présente une concentration allant de 0,5 à 5,0 mM,
- la solution de sélénite de sodium présente une concentration allant de 0,07 à 140 mM,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution sélénite de sodium,
- le pH de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, de la solution d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine,
- la solution qui comprend les nanoclusters de zinc, éventuellement dialysée, présente une concentration en zinc allant de 16 à 164 pg/mL,
- la solution qui comprend les nanoclusters de zinc et sélénium, éventuellement dialysée, présente une concentration en zinc allant de 16 à 164 pg/mL et une concentration en sélénium allant de 0,003 à 5,500 pg/mL,
- la solution qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysée, est lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
9. Procédé de préparation selon la revendication 6, caractérisé en ce que :
- l’acétate de zinc (II) dihydrate, le sélénite de sodium et l’histidine sont chacun sous forme de poudre,
- un mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, un mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est obtenu par mélange de chacune des poudres d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine, est broyé jusqu’à obtention d’un mélange pulvérulent homogène en couleur et en aspect,
- le mélange pulvérulent homogène d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine est placé dans un réacteur, - l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- l’acide ascorbique est ajouté dans le réacteur comprenant le mélange pulvérulent homogène d’acétate de zinc (II) dihydrate et d’histidine, ou, d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine et d’acide ascorbique, ou, le mélange pulvérulent d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine et d’acide ascorbique ainsi obtenu est mis sous agitation, puis de l’eau est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur, ladite eau étant de l’eau ultra pure filtrée,
- le réacteur est mis sous gaz inerte et à l’abri de la lumière,
- le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau, ou, le mélange d’acétate de zinc (II) dihydrate, de sélénite de sodium, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau est maintenu sous agitation dans le réacteur pendant 16 à 36 h, et de préférence 24h,
- un mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc est obtenu à l’issue de l’étape précédente d’agitation, à savoir un mélange liquide de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc est éventuellement dialysé afin d’obtenir un mélange liquide purifié de nanoclusters à base de zinc, à savoir un mélange purifié de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysé, est éventuellement lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc, ou de nanoclusters de zinc et sélénium. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration d’acétate de zinc (II) dihydrate,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de sélénite de sodium,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine,
- l’eau ajoutée dans le réacteur est de l’eau ultra pure filtrée,
- le gaz inerte est de l’azote,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de zinc, éventuellement dialysé, présente une concentration en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL, - le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de zinc et sélénium, éventuellement dialysé, présente une concentration en zinc allant de 1370 à 13700 pg/mL et une concentration en sélénium allant de 0,16 à 3300 pg/mL,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters à base de zinc, éventuellement dialysé, est lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters à base de zinc, à savoir une forme sèche de nanoclusters de zinc ou de nanoclusters de zinc et sélénium.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que la forme sèche des nanoclusters à base de zinc est conservée sous azote, de préférence dans des flacons, et de préférence à 4°C, ladite poudre pouvant être conservée pendant une durée d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, sans altération de la stabilité des nanoclusters à base de zinc.
12. Nanoclusters à base de zinc tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à
5 ou tels qu’obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications 6 à 11, pour une utilisation comme médicament.
13. Nanoclusters à base de de zinc tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à 2 et 4 à 5 ou tels qu’obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications 6 à 11, pour une utilisation pour lutter contre les carences en zinc.
14. Nanoclusters à base de de zinc tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 et 3 à 5 ou tels qu’obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications
6 à 11, pour une utilisation pour lutter contre ou les carences en zinc et sélénium.
15. Composition caractérisée en ce qu’elle comprend des nanoclusters à base de zinc tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou tels qu’obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications 6 à 11.
16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu’il s’agit d’un médicament, d’un complément alimentaire ou d’une composition alimentaire.
17. Composition selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce qu’elle se trouve sous une forme adaptée pour une administration par voie orale.
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