EP4551214A1 - Utilisation de l'ebselen ou l'un de ses derives pour traiter des pathologies ou dysfonctionnements des mitochondries - Google Patents

Utilisation de l'ebselen ou l'un de ses derives pour traiter des pathologies ou dysfonctionnements des mitochondries

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Publication number
EP4551214A1
EP4551214A1 EP23738725.3A EP23738725A EP4551214A1 EP 4551214 A1 EP4551214 A1 EP 4551214A1 EP 23738725 A EP23738725 A EP 23738725A EP 4551214 A1 EP4551214 A1 EP 4551214A1
Authority
EP
European Patent Office
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disease
syndrome
composition
mitochondrial
ebselen
Prior art date
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Pending
Application number
EP23738725.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Déborah TRIBOUILLARD-TANVIER
Stéphane AZOULAY
Vincent Procaccio
Carole SELLEM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Association Francaise Contre les Myopathies
Universite de Bordeaux
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire dAngers
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Association Francaise Contre les Myopathies
Universite de Bordeaux
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire dAngers
Universite Paris Saclay
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite dAngers, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Association Francaise Contre les Myopathies, Universite de Bordeaux, Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA, Centre Hospitalier Universitaire dAngers, Universite Paris Saclay filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4551214A1 publication Critical patent/EP4551214A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention aims to provide new pharmacological tools for treating mitochondrial diseases or dysfunctions, in particular those associated with mitochondrial complex I deficiencies.
  • Mitochondrial diseases are common metabolic pathologies characterized by strong clinical and genetic heterogeneity, which result in the mitochondria failing to produce enough energy to allow the body to function properly. Mitochondrial diseases can be present at birth but also appear at any age. On a genetic level, the mitochondrion has the particularity of having its own DNA (or mitochondrial DNA) but the majority of mitochondrial proteins are dependent on the nuclear genome. Thus, both genetic abnormalities carried by the mitochondrial and nuclear genome are responsible for mitochondrial diseases, reflecting the very great clinical and genetic heterogeneity. It is estimated that one in 4,300 people suffer from mitochondrial disease (Gorman et al., 2015, Ann Neurol. 77(5):753-9).
  • Mitochondrial diseases can affect almost any part of the body, including cells in the brain, nerves, muscles, kidneys, heart, liver, eyes, ears, or pancreas.
  • the symptoms of mitochondrial diseases depend on the organs affected, preferentially affecting tissues with high energy consumption such as muscles, brain and heart. Patients' symptoms can be moderate to severe, affecting one or more organs.
  • Symptoms of mitochondrial diseases may include:
  • Mitochondrial dysfunction can also occur when mitochondria are not functioning properly, possibly due to another disease or condition. Many conditions can lead to secondary mitochondrial dysfunction, including Alzheimer's or Parkinson's diseases, muscular dystrophies, Lou Gehrig's disease, diabetes and cancer. People with secondary mitochondrial dysfunction do not have a primary mitochondrial disease of genetic origin but have similar symptoms. Additionally, certain medications can target and damage mitochondria.
  • Mitochondrial complex I deficiency is the most commonly observed defect in more than 30% of mitochondrial diseases. Of these, the two most common clinical phenotypes linked to complex I deficiencies are Leigh syndrome, which is often fatal, or more mild phenotypes such as Leber hereditary optic neuropathy (LHON). MELAS syndrome has also been considered a common mitochondrial disease due to mutations in the mitochondrial genome and associated with a severe reduction in mitochondrial complex I activity.
  • Complex I is composed of at least 44 subunits, seven of which, namely ND1 to 6 and ND4L, are encoded by mitochondrial genes, while the rest are encoded by nuclear genes. Therefore, the clinical and molecular features associated with inherited complex I deficiency are highly variable.
  • complex I deficiency has been identified in secondary mitochondrial dysfunction associated with age-related neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease.
  • the goal of current treatments is to improve symptoms and slow the progression of the disease or dysfunction with, for example, the following recommendations:
  • Document WO2014/150688 describes the treatment of cancer using molecules capable of inhibiting enzymes of the mitochondrial (1-C) pathway such as ebselen, in particular the MTHFD2 enzyme.
  • JIA ZHI-QIANG et al. report the beneficial effect of ebselen in the management of an acute spinal cord injury, with a neuroprotective effect and improvement in function mitochondrial.
  • ARAKAWA MOTOKI et al. (Cerebellum, 2007, 6(4), pp 308-14) relates to neurodegenerative diseases such as Alzheimer's or Parkinson's disease, described as associated with mitochondrial alterations.
  • This document focuses on the positive effect of NAC (N-acetylcysteine) against the toxicity induced by 4-hydroxynonenal (HNE) on neurons, and mentions a neuroprotective effect of ebselen and its possible use in combination with NAC .
  • NAC N-acetylcysteine
  • HNE 4-hydroxynonenal
  • the CAPPER MICHAEL et al. (Nature Communications, 2018, 9(1)) focuses on the effect of ebselen on the enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1), mutations of which can lead to pathologies such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • SOD1 superoxide dismutase 1
  • ebselen a drug currently used in particular in clinical trials for the treatment of hearing disorders such as Méimba's disease, but also its derivatives, such as ethasalen, were active in the context of the treatment of hearing disorders.
  • diseases associated with mitochondrial dysfunction in particular diseases of the mitochondrial respiratory chain, advantageously associated with a deficiency of complex I.
  • this work opens the way to the use of a new family of compounds in this context.
  • isolated means extracted or removed from its environment or natural state.
  • an isolated nucleic acid or peptide is a nucleic acid or peptide that has been extracted from the natural environment in which it is usually found, whether in a living plant or animal for example.
  • a nucleic acid or a peptide for example which is naturally present in a living animal is not an isolated nucleic acid or peptide within the meaning of the invention, whereas the same nucleic acid or peptide partially or completely separated from the other components present in its natural environment is itself “isolated” in the sense of the invention.
  • An isolated nucleic acid or protein may exist in a substantially purified form, or may exist in a non-native environment such as, for example, a host cell.
  • abnormal when used in the context of organisms, tissues, cells or components thereof, means organisms, tissues, cells or components thereof that differ in at least one observable or detectable characteristic (e.g., age, treatment, time of day, etc.) of organisms, tissues, cells or components thereof that exhibit the respective "normal” (expected) characteristic. Characteristics that are normal or expected for one cell or tissue type may be abnormal for another cell or tissue type.
  • patient refers to any animal or cell thereof, in vitro or in situ, which may be subjected to the methods described herein. document.
  • the patient, subject or individual is an animal, preferably a mammal, more preferably a human, both female and male. It can also be a mouse, rat, pig, dog or non-human primate (NHP), such as the macaque monkey.
  • NEP non-human primate
  • a “disease” or “pathology” is a state of health of an animal in which its homeostasis is negatively affected and which, if the disease is not treated, continues to deteriorate.
  • a “disorder” or “dysfunction” is a state of health in which the animal is capable of maintaining its homeostasis but in which the state of health of the animal is less favorable than it would be in the absence of the disorder. If left untreated, a disorder does not necessarily lead to a deterioration in the animal's health over time.
  • a disease or disorder is "mitigated”("reduced") or “improved” if the severity of a symptom of the disease or disorder, the frequency with which that symptom is experienced by the subject, or both, are reduced . It also includes the disappearance of disease progression, that is, stopping the progression of the disease or disorder.
  • a disease or disorder is "cured”("recovered") if the severity of a symptom of the disease or disorder, the frequency with which such a symptom is experienced by the patient, or both, are eliminated.
  • a “therapeutic” treatment is a treatment administered to a subject who presents the symptoms (signs) of a pathology, with the aim of reducing or eliminating these symptoms.
  • treatment of a disease or disorder means reducing the frequency or severity of at least one sign or symptom of a disease or disorder experienced by the subject.
  • a treatment is said to be prophylactic when it is administered to prevent the development, spread or worsening of a disease, particularly if the subject does not or does not yet show symptoms of the disease and/or for which the disease does not was not diagnosed.
  • to “treat a disease or disorder” means to reduce the frequency or severity of at least one sign or symptom of a disease or disorder experienced by a subject.
  • Disease and disorder are used interchangeably in the context of the treatment according to the invention.
  • an “effective quantity” or an “effective quantity” of a compound is the quantity of compound which is sufficient to provide a beneficial effect to the subject to whom the compound is administered.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to an amount that is sufficient or effective to prevent or treat (in other words delay or prevent the development, prevent progression, inhibit, reduce, diminish or reverse) a disease or disorder, including relief of the symptoms of that disease or disorder.
  • halogen which is preferably selected from F, Cl and Br
  • C1-C4 alkyl such as a C1-C2 alkyl or a Cl alkyl, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br;
  • the invention relates to a compound having a group of formula: in which
  • each of the phenyl rings A and B is optionally substituted by one or more substituents, in which each substituent is independently selected from:
  • halogen which is preferably selected from F, Cl and Br
  • C1-C4 alkyl such as a C1-C2 alkyl or a Cl alkyl, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br;
  • the invention relates to a method of treating a disease associated with mitochondrial dysfunction comprising the administration of a compound having a group of formula: or formula in which
  • each of the phenyl rings A and B is optionally substituted by one or more substituents, in which each substituent is independently selected from:
  • halogen which is preferably selected from F, Cl and Br
  • C1-C4 alkyl such as a C1-C2 alkyl or a Cl alkyl, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br;
  • a C1-C4 alkoxy such as a C1-C2 alkoxy or a Cl alkoxy, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br or a pharmaceutical composition comprising such a compound, in a subject.
  • a compound used in the context of the invention may exhibit inositol monophosphatase (IMPase) inhibitory activity, said activity being able to be tested as described by Singh et al. (Nat Commun. 2013;4:1332. doi:10.1038/ncomms2320). According to a particular embodiment, such a compound is not valproic acid or carbamazepine.
  • IMPase inositol monophosphatase
  • a compound used in the context of the invention may exhibit antioxidant activity, said activity being able to be tested as described by Noguchi et al. (Biochem Pharmacol 1992; 44: 39-44) and Nakamura et al. (J Biol Chem., 2002; 277(4):2687-94).
  • such a compound is not ascorbic acid.
  • a compound used in the context of the invention having a group of formula: is ethaselen or one of its derivatives or analogues, as defined below.
  • Ethaselen or BBSKE (CAS No.: 217798-39-5) has the following formula:
  • a derivative or analogue of ethaselen is for example the chlorinated derivative MAD423 of formula:
  • each of the phenyl rings A and B is optionally substituted by one or more substituents, in which each substituent is independently selected from:
  • halogen which is preferably selected from F, Cl and Br
  • C1-C4 alkyl such as a C1-C2 alkyl or a Cl alkyl, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br;
  • C1-C4 alkoxy such as a C1-C2 alkoxy or a Cl alkoxy, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br.
  • a compound used in the context of the invention is as described in document WO2012/107735, namely a compound of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which formula I is: in which
  • each of the phenyl rings A and B is optionally substituted by one or more substituents, in which each substituent is independently selected from:
  • halogen which is preferably selected from F, Cl and Br
  • C1-C4 alkyl such as a C1-C2 alkyl or a Cl alkyl, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br;
  • C1-C4 alkoxy such as a C1-C2 alkoxy or a Cl alkoxy, optionally substituted by one or more halogen atoms, each of which is preferably selected from F, Cl and Br.
  • such a compound is:
  • Preferred compounds according to the invention are ebselen and ebselen oxide, advantageously ebselen, and their derivatives or analogues as defined below.
  • Ebselen (2-phenyl-l,2-benzoselenazol-3(2H)-one; CAS number: 60940-34-3), also called PZ 51, DR3305 and SPI-1005, is a synthetic molecule capable of mimicking the glutathione peroxidase. Therapeutic activity of this molecule has been described in connection with ischemic lesions, cardiovascular accidents, hearing loss and bipolar disorders. It could also be effective in treating Clostridioides difficile infections and has antifungal activity against Aspergillus fumigatus.
  • this molecule is the subject of phase III clinical trials for the treatment of Menière's disease, a hearing disorder.
  • Ebselen is administered orally in various doses from 200 mg to 600 mg (in the form of 200 mg capsules) per day for at least 21 days.
  • derivatives or analogues of these compounds having the same biological activity, namely that reported in the examples, in particular the restoration of respiratory growth, cellular respiration or the level of mitochondrial ATP, both in yeast models, in particular Saccharomyces cerevisiae. of filamentous fungus, in particular Podospora anserina, as well as on human cells, in particular fibroblasts or myoblasts from patients suffering from these pathologies.
  • derivatives includes derivatives and metabolites, as well as pharmaceutically acceptable salts.
  • a derivative is a compound originating from another (the precursor, with a typically similar chemical structure) after transformation of the latter. The derivative may differ in one or more atoms or functional groups.
  • a metabolite is a stable intermediate compound or a compound resulting from the biochemical transformation of an initial molecule by metabolism.
  • salts are meant the addition salts of the compound, which can be obtained by reaction of this compound with a mineral or organic acid according to a method known per se.
  • acids conventionally used for this purpose, mention may be made of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, 4-toluene sulfonic, methane sulfonic, cyclohexyl sulfamic, oxalic, succinic, formic, fumaric, maleic, citric, aspartic, cinnamic, lactic acids.
  • the compound is not in the form of a salt.
  • Said compounds in particular ebselen, can be modified to increase their stability, their bioavailability and/or their ability to reach target tissues, in particular mitochondria.
  • said compounds in particular ebselen, may be present in the composition in a naked (free) form or contained in delivery systems which increase stability, targeting and/or bioavailability.
  • delivery systems which increase stability, targeting and/or bioavailability.
  • liposomes or incorporated into supports such as hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, bioadhesive microspheres, vectors or in combination with a cationic peptide.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing as active principle at least one compound as defined above, as well as the use of this compound or this composition as a drug or medicinal product.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions comprising a compound according to the invention for the intended use.
  • these compositions comprise a therapeutically effective quantity of said compound, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the United States or European Pharmacopoeia or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals and humans.
  • carrier means a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the therapeutic product is administered.
  • These pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and others.
  • Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions.
  • Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene glycol, water, ethanol and others.
  • compositions may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, sustained release formulations and others. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin. These compositions contain a therapeutically effective amount of the therapeutic agent, preferably in purified form, together with an appropriate amount of carrier so as to provide the form for adequate administration to the subject.
  • the composition is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition suitable, for example, for oral administration to humans.
  • the compositions for oral administration are in the form of tablets, optionally scored tablets or effervescent tablets, further containing excipients suitable for the solid dosage form and for administration in humans.
  • ebselen can be in the form of powder packaged in tablets that can contain 200 mg of the active ingredient. These tablets can be crushed and mixed with liquids.
  • the composition may be in liquid form, advantageously an aqueous composition. Any other suitable solvent may be used.
  • the amount of the therapeutic agent of the invention i.e. a compound as described above, which will be effective in the treatment of a disease can be determined by standard clinical techniques. Additionally, in vivo and/or in vitro assays, such as those described in the examples below, may potentially be used to help predict optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the formulation will also depend on the route of administration, weight and severity of the disease, and must be decided according to the judgment of the practitioner and the conditions of the individual patient.
  • the composition of the invention is in a solid form, advantageously a tablet, which can contain 200 mg of the active compound, in particular ebselen.
  • the composition of the invention is in liquid form and advantageously comprises less than 30 pM, 20 pM or even 15 pM of the active compound, in particular ebselen.
  • the composition of the invention is in liquid form and advantageously comprises 1 nM or more, or even 10 nM or more, 30 nM or more, or even 100 nM or more, with for example an optimal concentration. of 1 pM of the active compound, in particular ebselen.
  • An appropriate route of administration should enable delivery of a therapeutically effective amount of the therapeutic product to the target tissues, depending on the disease.
  • Ebselen and its derivatives can be administered in a pharmaceutically acceptable form by one of the known routes of administration for this type of active ingredient.
  • Available routes of administration are: topical (local), enteral (systemic action, but delivered through the gastrointestinal (GI) tract), or parenteral (systemic action, but delivered through routes other than the GI tract) .
  • the preferred route of administration of the compositions disclosed here is generally enteral, which includes oral, sublingual, buccal administration, preferably oral administration. According to other embodiments, it may be parenteral administration, in particular intramuscularly (i.e. in the muscle) or systemic (i.e. in the circulating system).
  • injection includes intravascular administration, in particular intravenous (IV), and intramuscular (IM). Injections are usually given using syringes or catheters.
  • the composition is administered orally, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, topically, locally or intravascularly, advantageously orally.
  • the composition is intended for oral administration.
  • a composition according to the invention is preferably presented in a solid dosage form suitable for oral administration, advantageously in the form of one or more capsules, capsules or tablets.
  • they may be liquid preparations such as elixirs and suspensions containing various masking substances for coloring, flavoring and stabilization.
  • the composition is intended for oral administration.
  • the composition is administered per os, that is to say through the mouth.
  • composition according to the invention is administered orally, in particular in the form of capsules, capsules or tablets.
  • the active substance can be mixed with various conventional materials such as starch, calcium carbonate, lactose, sucrose and dicalcium phosphate to facilitate the process. encapsulation.
  • various conventional materials such as starch, calcium carbonate, lactose, sucrose and dicalcium phosphate to facilitate the process.
  • encapsulation Magnesium stearate, as an additive, provides a useful lubricating function if necessary.
  • composition according to the invention can be intended for the preparation of a pharmaceutical composition which can be administered by injection.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be dissolved or suspended in a sterile, pharmaceutically acceptable injectable liquid, such as sterile water, a sterile organic solvent or a mixture of these two liquids for intravenous administration.
  • a sterile, pharmaceutically acceptable injectable liquid such as sterile water, a sterile organic solvent or a mixture of these two liquids for intravenous administration.
  • routes of administration may include, but are not limited to, subcutaneous implants, as well as oral, sublingual, transdermal, topical, intranasal, or rectal administration.
  • Biodegradable and non-biodegradable delivery systems can also be used.
  • composition according to the invention is preferably presented in a solid dosage form suitable for oral administration, advantageously in the form of one or more capsules, capsules or tablets.
  • composition according to the invention is administered daily, for example once a day, or even two or more times a day. Treatment can last several weeks, several months, several years or even a lifetime.
  • the dosage of the therapeutic agent i.e. ebselen or any of its derivatives, varies depending on factors such as age, weight, height, gender, l general health and medical history of the subject.
  • the dose of the composition is less than or equal to 10 mg/kg or 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 mg/kg, or even less than or equal to 2.5, 2, 1.5 or 1 mg/kg, or even less than or equal to 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0, 5, 0.4, 0.3 or 0.1 mg/kg.
  • the patient is advantageously a human, in particular a newborn, a young child, a child, an adolescent or an adult, whatever their sex.
  • the therapeutic tool according to the invention can however be adapted and useful for the treatment of other animals, in particular pigs, mice, dogs or macaque monkeys.
  • the present invention relates to the treatment of mitochondrial diseases in general, that is to say diseases linked to or caused by mitochondrial dysfunction.
  • the expression “disease associated with mitochondrial dysfunction” is used to encompass all of these situations.
  • the diseases of particular interest are diseases of the mitochondrial respiratory chain.
  • NARP neuroopathy, ataxia, and retinitis pigmentosa
  • This NARP syndrome is caused by various mutations in the mitochondrial ATP6 gene, which encodes the a subunit of ATPase (complex V of the OXPHOS system). Mutations are often heteroplasmic (coexistence of mutated and wild-type (WT) mitochondrial DNA (mtDNA) in the same cell). Depending on the type of mutation and the percentage of mutated mtDNA (degree of heteroplasmy), the clinical consequences are more or less severe.
  • WT wild-type mitochondrial DNA
  • ATP6 m.8993T>C/G mutations are among the most frequent in NARP patients and result in severe forms of NARP syndrome.
  • FMC1 is a nuclear gene that encodes a protein required at high temperatures (35-37°C) for the assembly of the Fl sector of ATP synthase, thus mimicking the heteroplasmy observed in NARP patients. Indeed, when cultured at a restrictive temperature (35-37°C), the mitochondria of the fmclA mutant contain much fewer assembled ATP synthase complexes than a wild strain (WT), but those which assemble are fully functional. This heterogeneity is also found in patients with reduced levels of ATP synthase due to heteroplasmic mutations in the ATP6 gene.
  • the fmclA mutant constitutes a suitable model for this disease, particularly the equivalent of the mutant m.8993T ⁇ G (MR14, NARP) (Schon EA et al. (2001) Cell Dev Biol. 12(6):441-8).
  • the TAZ gene encodes tafazzin, a mitochondrial transacylase that catalyzes the remodeling of immature cardiolipin to its mature composition containing a predominance of tetralinoleoyl moieties. TAZ mutations result in Barth syndrome, an organic, in particular an excess of 3-methylglutaconic acid (Barth, P. G. et al. (1996) J Inherit Metab Dis, 19, 157-160).
  • the COX2 and SURF1 genes encode a subunit and an assembly factor of mitochondrial complex IV, respectively.
  • the mutations are associated with Leigh syndrome, a progressive and severe neurodegenerative disease that manifests in the first months or years of life responsible for early death. Affected individuals typically present with global developmental delay or developmental regression, hypotonia, ataxia, dystonia, and ophthalmologic abnormalities, such as nystagmus or optic atrophy (Barrientos, A. et al. (2002) EMBO J, 21, 43-52).
  • MPV1 7 encodes a mitochondrial inner membrane protein of unknown function.
  • Q MPV17 mutations cause:
  • Mitochondrial DNA depletion syndrome-6 an autosomal recessive disease characterized by the childhood onset of progressive liver failure, often leading to death within the first year of life. Those who survive develop progressive neurological impairment, including ataxia, hypotonia, dystonia and psychomotor regression (Spinazzola, A. et al. (2006) Nat Genet, 38, 570-575).
  • Manifestations include severe anesthesia leading to ulceration of the cornea, painless fractures and acral mutilation, muscle weakness, absent or markedly diminished deep tendon reflexes, without intellectual deficit (Karadimas, CL et al. ( 2006) Am J Hum Genet, 79, 544-548).
  • a disease selected from the group consisting of: MELAS syndrome, maternally inherited myopathy and cardiomyopathy, NARP or MILS syndrome, Leigh syndrome, Leber hereditary optic neuropathy (NHOL ), Barth syndrome, mitochondrial DNA depletion syndrome including 4A (Alpers type) and 4B (MNGIE type), mitochondrial recessive ataxia syndrome, sensory ataxic neuropathy, dysarthria and ophthalmoplegia, spinocerebellar ataxia with epilepsy, progressive external ophthalmoplegia, mitochondrial DNA depletion syndrome-6, Navajo-like neuropathy, Behr syndrome, mitochondrial DNA depletion syndrome-14, infantile cardioencephalomyopathy due to to cytochrome c oxidase deficiency (COA6 mutations), nuclear deficiency of mitochondrial complex III type 1, GRACILE syndrome and Bjomstad syndrome.
  • a disease selected from the group consisting of: MELAS syndrome, maternally inherited myopathy and cardiomyopathy, NARP
  • Complex I CI or NADH dehydrogenase or NADH coenzyme Q reductase
  • ND1 to ND6 and ND4L DNA mitochondrial
  • a compound according to the invention in particular ebselen, can be used to treat a so-called “primary” mitochondrial disease, that is to say due to a genetic anomaly identified in at least one subunit of the OXPHOS complexes (in particular complex I) linked to one or more mutations of mitochondrial or nuclear DNA.
  • primary mitochondrial disease that is to say due to a genetic anomaly identified in at least one subunit of the OXPHOS complexes (in particular complex I) linked to one or more mutations of mitochondrial or nuclear DNA.
  • the genetic anomaly does not directly involve the OXPHOS complexes but the pathology will affect mitochondrial functions and in particular can lead to a reduction in the enzymatic activity of this process.
  • Such disease can also be due to non-genetic causes such as exposure to environmental factors or aging. This is particularly the case for Parkinson's disease or other age-related neurodegenerative disorders.
  • the mitochondrial deficiency or dysfunction results from a genetic disease.
  • Genetic diseases are, by definition, diseases resulting from one or more genetic defects (abnormalities) (or mutations) in one or more genes. Genetic defects can affect mitochondrial DNA and/or nuclear genes. The genetic defects responsible for mitochondrial diseases can be point mutations, resulting in a codon change. However, diseases can be linked to the deletion or insertion of one or more bases or codons.
  • the disease results from one or more genetic deficiencies (or mutations) in one or more genes involved in the functionality of the OXPHOS complexes, in particular complex I.
  • the diseases to be treated in the context of the invention are linked or due to at least one genetic defect or mutations in at least one of the following genes: MTTL1, ATP6, FMC1, TAZ, COX2, SURF1, POLG, MPV17, OPA1, COA6, ND6 and BCS1L, advantageously ATP6, FMC1, TAZ, COX2, SURF1 or MPV17.
  • LHON syndrome or Leber's hereditary optic neuropathy generally appears in young adults. The onset is sudden with a rapid decline in vision in the center of the eye, corresponding to a reduction in central visual acuity. Most often, a peripheral visual field persists, like a halo of vision around a blind area. This disease is due to commonly homoplasmic mutations in the genes encoding the subunits of complex I of the respiratory chain.
  • mitochondrial DNA mutations m.H778G>A, m.3460G>A and m,14484T>C represent approximately 95% of LHON mutations.
  • Leigh syndrome (or LS) is a progressive and serious neurodegenerative disease. Affected individuals typically present with global developmental delay or developmental regression, hypotonia, ataxia, dystonia, and ophthalmologic abnormalities, such as nystagmus or optic atrophy. Leigh syndrome can also have adverse multi-systemic effects on the cardiac, hepatic, gastrointestinal and renal organs. Biochemical studies in patients with Leigh syndrome tend to show increased lactate and abnormalities in mitochondrial oxidative phosphorylation. Leigh syndrome may be associated with mutations in genes encoding complex I subunits, such as NDUFV1 mutations or the MTND5 m.13513 G>A mutation.
  • MELAS syndrome including mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes, is a genetically heterogeneous mitochondrial disease with variable clinical phenotype. This disorder is accompanied by features of central nervous system involvement, including seizures, hemiparesis, hemianopia, cortical blindness, and episodic vomiting.
  • This syndrome was first associated with the m.3243A>G mutation of mitochondrial DNA, that is to say of the tRNA Leu (UUR) gene (MTTLl), which induces an alteration in the translation of complex I mRNA in proteins and therefore, a reduction in the amount of structural proteins of complex I such as the mitochondrial subunit ND6.
  • UUR tRNA Leu
  • MELAS syndrome may also be associated with other mitochondrial DNA mutations such as the m.3260A>G mutation, which also affects tRNA Leu (UUR) ' This m.3260A>G mutation may also cause other clinical phenotypes, including maternally induced myopathy and cardiomyopathy.
  • a compound according to the invention in particular ebselen, can be used to treat mitochondrial dysfunction, in particular mitochondrial dysfunction associated with complex I deficiencies.
  • Mitochondrial dysfunction characterized by a loss of efficiency of the chain electron transport and reductions in the synthesis of high-energy molecules such as adenosine-5'-triphosphate (ATP), is a hallmark of aging and generally of all chronic diseases.
  • ATP adenosine-5'-triphosphate
  • These diseases include:
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gehrig's disease) and Friedreich's ataxia;
  • cardiovascular diseases such as atherosclerosis and other heart and vascular conditions
  • autoimmune diseases such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus and type 1 diabetes;
  • - fatigue diseases such as chronic fatigue syndrome and Gulf War illnesses
  • musculoskeletal diseases such as fibromyalgia and skeletal muscle hypertrophy/atrophy
  • - muscular dystrophies such as chronic fatigue syndrome and Gulf War illnesses
  • the treatment recommended by the present invention can also be combined with other treatments, intended to treat the same pathology or the same condition, or another disease.
  • this other treatment is based on the administration of another compound of interest.
  • composition according to the invention is associated with at least one other compound for the treatment of the same disease.
  • the composition according to the invention and said compound can be administered simultaneously or separately over time to take into account their particularities and in particular their bioavailability.
  • the present invention relates to a composition, advantageously a pharmaceutical composition or a medication containing a compound as described above and potentially other active molecules (other gene therapy molecules, chemical groups, peptides or proteins , etc.) for the treatment of the same disease or a different disease, advantageously the same disease.
  • active molecules other gene therapy molecules, chemical groups, peptides or proteins , etc.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention and at least one compound for the treatment of the same disease or a different disease are administered simultaneously, separately or spread over time to treat the same disease or a different disease.
  • another compound capable of improving mitochondrial function may be administered simultaneously or at different times. If administered simultaneously, the two compounds can be combined in the same composition.
  • additional compounds are natural supplements, such as L-carnitine, alpha-lipoic acid (a-lipoic acid [l,2-dithiolane-3-pentanoic acid]), coenzyme Q10 (CoQlO or ubiquinone ), riboflavin (vitamin B2) reduced to nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), L-arginine, possibly in combination.
  • natural supplements such as L-carnitine, alpha-lipoic acid (a-lipoic acid [l,2-dithiolane-3-pentanoic acid]), coenzyme Q10 (CoQlO or ubiquinone ), riboflavin (vitamin B2) reduced to nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), L-arginine, possibly in combination.
  • nitric oxide (NO) precursors such as L-arginine and citrulline.
  • a compound according to the invention in particular ebselen, is combined with one of the compounds described in documents WO2020/254632 and WO2022/018297, advantageously selected from the group consisting of: disulfiram, sodium diethyldithocarbamate, alverine and alverine citrate.
  • compositions according to the invention include all patients having a disease associated with mitochondrial dysfunction, in particular mitochondrial dysfunction associated with complex I deficiencies, diagnosed as carrying such a disease or at risk of developing a such disease.
  • a subject to be treated with a composition according to the invention can be selected on the basis of different criteria.
  • mitochondrial dysfunction particularly complex I deficiencies
  • several tests can be performed, for example:
  • An objective of the invention is to provide a safe (non-toxic) treatment. Another objective is to provide effective treatment that allows delay, slowdown or prevent the development of the disease, and possibly improve the patient's phenotype which can be monitored clinically as indicated below.
  • composition according to the invention can be used:
  • the invention relates to a method for improving mitochondrial function, in particular the activity of complex I, advantageously without adverse effects, comprising the administration to a subject in need of a therapeutic quantity of a composition as described above.
  • said improvements are observed up to 1 month after the start of treatment, or 3 months or 6 months or 9 months, more advantageously up to 1 year after the start of treatment, 2 years, 5 years, 10 years, or even throughout the subject's life.
  • said improvements result in a reduction in the severity and/or frequency of symptoms and/or delayed onset.
  • NMDAS score Newcastle Mitochondrial Disease Scale for Adults
  • SF-36 score Short Form Health Survey
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the claimed treatment makes it possible to improve the clinical condition and the various parameters disclosed above compared to an untreated subject.
  • the implementation of the present invention employs, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, cell biology, biochemistry and immunology, known to those skilled in the art. . These techniques are explained in detail in the literature, notably in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, fourth edition (Sambrook, 2012); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Culture of Animal Cells” (Freshney, 2010); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1997); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Short Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 2002); “Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting” (Babar, 2011); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 2002). Techniques that are particularly useful for particular embodiments will be discussed in the sections that follow.
  • EBS ebselen
  • EBS ebselen
  • ethaselen EBS
  • yeast strains tazl yeast strains tazl
  • Figure 4 Effect of EBS on the temperature-sensitive growth of a Podospora anserina model carrying a mitochondrial complex I mutation (Pa nuo-51 A357V ) A/ Effect on the growth halo
  • FIG. 5 Effect of EBS on the proliferation and viability of cells from a TAZ A patient / growth of fibroblasts from TAZ patients in the presence or absence of EBS (12.15 nM)
  • D/ mitochondrial ATP level in fibroblasts from TAZ patients incubated in the presence of Antimycin A (100 pM), Rotenone (0.5 pM) or oligomycin A (3 pM), and EBS, at the concentration of 12.15 nM.
  • Figure 6 Effect of EBS on the proliferation and viability of a HeLa cell line, in which the FMC1 gene has been deleted, in glucose Ig/L (A) or galactose (B) medium DO (UA): density optics in arbitrary units
  • Figure 7 Effect of EBS on mitochondrial respiration of cells from patients deficient for complex I (CI) of the mitochondrial respiratory chain, carrying mutations affecting the nuclear NDUFV1 gene of the complex
  • OCR oxygen consumption rate
  • Saccharomyces cerevisiae yeast strains used in these examples contains different specific mutations, modeling human mutations leading to mitochondrial diseases. To varying degrees, all of these mutant strains of yeast exhibit a growth defect when grown on a respiratory medium such as ethanol or glycerol at 28°C or 36°C (depending on the strain).
  • a respiratory medium such as ethanol or glycerol
  • this strain was constructed by replacing the open reading frame of TAZ1 with that of TRP1 in the strain W303-1A (MATa ade2-l ura3-l hisSll, 15 trpl-1 leu2-3,112 canl-100) (from Taffin de Tilques, M. et al. (2017) Dis Model Mech, 10, 439-450)
  • this mutant was constructed in strain CW252 containing the nuclear background of W303 and an intronless mitochondrial genome.
  • This gene is a homolog of the human SURF1 gene
  • this yeast strain was constructed by replacing the open reading frame of SYM1 by that of kanMXô in the strain W303-1 A MATa ade2-l ura3-l his311, 15 trpl-1 leu2-3,112 canl-100).
  • This gene is a homolog of the human MPV17 gene
  • the yeast strain used in these experiments includes tRNA-Leu A29G with a genetic background MA Ta, his3 11, ade2 1, leu2 3, 112, ura3 1, trpl-D2, canl- 100, syn.
  • NARP neuroopathy, ataxia, and retinitis pigmentosa syndrome causes a variable combination of developmental delay, retinitis pigmentosa, dementia, seizures, ataxia, proximal neurogenic muscle weakness, and sensory neuropathy.
  • NARP is caused by various mutations in the mitochondrial ATP6 gene, which encodes the a subunit of ATPase (complex V of the OXPHOS system). Mutations are often heteroplasmic (coexistence of mutated and wild-type (WT) mitochondrial DNA (mtDNA) in the same cells). Depending on the type of mutation and the percentage of mutated mtDNA (degree of heteroplasmy), the clinical consequences are more or less serious.
  • ATP6 m.8993T>C/G mutations are among the most frequent in NARP patients and result in severe forms of NARP syndrome.
  • FMC1 is a nuclear gene that encodes a protein required at high temperatures (35-37°C) for the assembly of the Fl sector of ATP synthase, thus mimicking the heteroplasmy observed in NARP patients. Indeed, when cultured at a restrictive temperature (35-37°C), the mitochondria of the fmclA mutant contain much fewer assembled ATP synthase complexes than a wild strain (WT), but those which assemble are fully functional. This heterogeneity is also found in patients with reduced levels of ATP synthase due to heteroplasmic ATP6 mutations.
  • the fmclA mutant constitutes a suitable model of these disorders (Lefebvre-Legendre, L. et al. (2001) J Biol Chem, 276, 6789-6796).
  • Various NARP strains of yeast, carrying homoplasmic mutations equivalent to the T8993G and T8993C mutations were also tested.
  • the TAZ gene encodes tafazzin, a mitochondrial transacylase that catalyzes the remodeling of immature cardiolipin to its mature composition containing a predominance of tetralinoleoyl moieties.
  • TAZ mutations result in Barth syndrome, an X-linked disease classically characterized by dilated cardiomyopathy (DCM) with endocardial fibroelastosis (EFE), predominantly proximal skeletal myopathy, growth retardation, neutropenia and organic aciduria, including excess 3-methylglutaconic acid (Barth, PG et al. (1996) J Inherit Metab Dis, 19, 157-160).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • EFE endocardial fibroelastosis
  • the COX2 and SURF1 genes encode a subunit and an assembly factor of mitochondrial complex IV, respectively.
  • the mutations are associated with Leigh syndrome, a progressive and severe neurodegenerative disorder that manifests in the first months or years of life and can lead to early death.
  • Affected individuals typically present with global developmental delay or developmental regression, hypotonia, ataxia, dystonia, and ophthalmologic abnormalities, such as nystagmus or optic atrophy (Barrientos, A. et al. (2002) EMBO J, 21, 43-52).
  • MPV17 (SYM1 gene in yeast) encodes a mitochondrial inner membrane protein of unknown function. QMPV17 mutations cause:
  • Mitochondrial DNA depletion syndrome-6 an autosomal recessive disease characterized by the childhood onset of progressive liver failure, often leading to death within the first year of life. Those who survive develop progressive neurological impairment, including ataxia, hypotonia, dystonia and psychomotor regression (Spinazzola, A. et al. (2006) Nat Genet, 38, 570-575).
  • - Navajo type neuropathy The manifestations mainly include severe sensory-motor peripheral neuropathy with hepatic and cerebral damage like leukoencephalopathy and comeal ulcerations. (Karadimas, C.L. et al. (2006) Am J Hum Genet, 79, 544-548).
  • the A30(29)G mutation in the A29G yeast mimics the human m.3260A>G mutation in the tRNALeu (UUR) gene responsible for the MELAS syndrome.
  • EXAMPLE 1 Effect of ebselen (EBS) and its derivatives on mutant yeast strains cultivated in a non-fermentable (respiratory) medium
  • the different mutant strains of yeast were spread on solid agar-based respiratory media (containing glycerol or ethanol as the sole carbon source) and exposed to filters on which was deposited the tested compound, in particular ebselen (EBS). The boxes have then incubated at the indicated temperature (which can be 28°C or 36°C depending on the strain used).
  • EBS ebselen
  • 0.125 OD of exponentially growing mutant cells were spread homogeneously with sterile glass beads on a square Petri dish (12cm x 12cm) containing solid respiratory medium (YPA Ethanol, 1% yeast extract, 0.5% Bacto Peptone, 40 mg/L Adenine, 2% Ethanol for syml and tazl or YPA Glycerol 2% for cox2, find, atp6, shyl and A29G).
  • Small sterile filters were then placed on the agar surface and increasing concentrations of the test compounds were added to the filters at the indicated amounts (30 and 90 nmoles).
  • DMSO buffer
  • DMSO buffer
  • the plates were then incubated at 28°C (for shyl or 36°C (for cox2, syml, find, atp6 tazl et A29G) for 4 to 5 days, then photographed. Improved growth was assessed after several days incubation by the appearance of a halo of improved growth around the filter where the active ingredient has been deposited.
  • EBS is active on all yeast mutant strains tested, in a dose-dependent manner.
  • Figure IC shows that ebselen oxide (100 nmoles) has an activity comparable to ebselen (100 nmoles) (Figure 1B), while no halo is observed in the presence of DMSO ( Figure 1D ).
  • EXAMPLE 2 Effect of ebselen (EBS) on the tazl mutant yeast strain
  • Respiratory intensity corresponds to the amount of oxygen consumed in relation to time and cell number. It reflects the mitochondrial oxidative metabolism of cells. Oxygen consumption is measured using an OROBOROS oxygraphic system. The cells are cultured for 7-8 generations at 28°C for 24 or 48 h in YPA Ethanol medium supplemented with DMSO or EBS (IpM). 10 7 cells are introduced into the oxygraph. CL consumption is recorded with or without CCCP (peak oxygen consumption rate). The CL consumption rate is calculated based on the linear part of the O 2 consumption.
  • Total protein extracts of the mutant yeast strain were analyzed by SDS-PAGE (50 pg per well) using antibodies against the indicated proteins. The gels presented are representative of at least 3 experiments. Protein levels were quantified using ImageJ software. Cox2 levels are normalized to Adel3p and expressed relative to wild-type (WT).
  • EBS is toxic from 27 pM and active between 1 nM and 3 pM, with an optimal concentration of 1 pM on the tazl mutant strain.
  • EBS IpM increases the accumulation of Cox2 protein, a subunit of complex IV of the mitochondrial respiratory chain, in the tazl mutant strain.
  • EXAMPLE 3 Effect of ebselen (EBS) on the syml mutant yeast strain
  • Example 2 The experiments described in Example 2 were carried out on the mutant yeast strain syml.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae used in Examples 1 to 3, does not possess complex I of the mitochondrial respiratory chain. EBS was therefore tested on the strict aerobic filamentous fungus model Podospora anserina.
  • the strain used in the following examples contains a specific mutation modeling a human mutation in the NDUF V 1 subunit of complex I resulting in mitochondrial disease. This strain exhibits a growth defect at a non-permissive temperature above 31.5°C.
  • nuo-51 A357V The A357V mutation was introduced into the nuo-51 gene of the wild strain S in association with a nourseothricin resistance cassette (NatR).
  • nourseothricin resistance cassette NaatR
  • the NDI-1 and AOX genes were inactivated (El-Khoury et al., (2008) Curr Genet. 53:249-58)
  • Genotype of the strain S, mat ⁇ , nuo-51 A35TV t ⁇ ndi-l, ⁇ aox, Naf, Hygrc
  • the temperature-sensitive Pa nuo-51 A357V mutant was spread homogeneously with sterile glass beads on a square Petri dish containing solid minimal medium (M2). Small sterile filters were then placed on the agar surface and 20 nmol of EBS was added. DMSO (the compound vehicle) is used as a negative control. The plate was then incubated at the non-permissive temperature of 33°C for 4-5 days, then photographed.
  • the Pa nuo-51 A357V mutant was then grown at 32°C where its growth was reduced compared to the wild strain (WT).
  • the effect of EBS on the growth rate of the mutant was determined on minimal medium supplemented or not with increasing concentrations of EBS and estimated in centimeters of growth per day (cm/day).
  • Figure 4 A shows a positive effect of EBS on the growth of the mutant. Specifically, between 0.003 and 0.03pM, EBS shows a significant improvement in the growth of the Pa nuo-51 A357V mutant ( Figure 4B).
  • EXAMPLE 5 Human cell model
  • the number of stars indicates the value of the p-value ⁇ 0.05 (*), ⁇ 0.001 (**), ⁇ 0.0001 (***), ⁇ 0.0001 (****).
  • EBS was tested for its effect on the respiratory growth of fibroblasts from TAZ patients, in this case fibroblasts from eight different patients carrying mutations in the TAZ gene (with Barth syndrome). Data represents percent growth from T0.
  • Proliferation rate was measured in low glucose medium (Ig/L; to force cells to use the OXPHOS system rather than glycolysis) in 384-well microtiter plates (1200 cells/well at T0) using the Sulforhodamine B (SRB) staining protocol at 24, 48, 72, or 96 hours after cell placement with or without 12.15 nM EBS.
  • SRB Sulforhodamine B
  • the proliferation rate was then measured under the same experimental conditions but with varying concentrations of EBS: The cells were analyzed 96 hours after treatment with increasing doses of EBS (from 150 pM to 234.9 pM). Data are the average of 8 patients or 3 controls in triplicate, in 4 independent experiments.
  • the proliferation rate was also measured under the same experimental conditions but with varying concentrations of ethaselen: Cells were analyzed 96 hours after treatment with increasing doses of ethaselen (from 150 pM to 26.1 pM). Bars represent the average of 4 replicates from 2 patients in 3 independent experiments.
  • Mitochondrial ATP levels in TAZ patient fibroblasts were assessed using the Promega CellTiter-Glo kit.
  • the cells in 96-well plates (5000/well) were treated or not with 12.15 nM of EBS for 96 hours then were incubated in the presence of Antimycin A (100 pM), Rotenone (0.5 pM ) or oligomycin A (3 pM).
  • EBS was also tested for its ability to restore cell growth to a line of patient myoblasts carrying mutations in the TAZ gene.
  • Proliferation rate was measured in low glucose medium in 384-well microtiter plates (1200 cells/well at T0) using the Sulforhodamine B (SRB) staining at 48, 72, 96 and 120 hours after cell placement.
  • the graph represents the growth rate at 120 hours, corresponding to the average of 3 independent experiments.
  • the HeLa KO FMC1 cell line mimicking human diseases linked to ATP synthase deficiency (NARP, MILS syndromes), was generated by the CRISPR-Cas9 method.
  • the HeLa KO FMC1 cell line is cultured in DMEM medium containing 4.5 g/L glucose and 110 mg/1 pyruvate and 50 mg/1 uridine.
  • the proliferation rate of this HeLa cell line in which the FMC1 gene was deleted was measured in a medium containing either a low glucose content (1 g/L) or galactose in 384-well microplates (4500 cells/ cm 2 at T0) using the Sulforhodamine B (SRB) staining protocol 96 hours after cell seeding and treatment. Bars represent the average of 8 replicates in 3 independent experiments. Data represents percent growth from T0.
  • SRB Sulforhodamine B
  • EBS was also tested for its ability to restore mitochondrial respiration to patient fibroblast lines carrying mutations in the nuclear mitochondrial complex I gene NDUFV1.
  • Human NDUFV1 lines mimicking human diseases linked to mitochondrial complex I deficiency (Leigh syndrome) carry genetic mutations affecting the NDUFV1 gene.
  • These cell lines are cultured in DMEM culture medium containing 1.0 g/L glucose and ImM sodium pyruvate and 50 pg/mL uridine (Sigma Aldrich, Lyon, France).
  • Respiration was measured using an XF96 Seahorse extracellular flux metabolic analyzer in 96-well plates according to the manufacturer's protocol (Agilent Technologies). The deficient cells were exposed for 48 hours to different concentrations with a dose response curve associating a range of concentrations from 25 nM to 10 pM.
  • A is shown the rate of oxygen consumption, in (B) basal respiration, in (C) ATP synthase-related respiration, and in (D) maximal respiration. Stars represent the average of 4 independent replicates.
  • fibroblasts in exponential phase of growth were detached by the addition of 2 ml of 0.05% trypsin. These fibroblasts were used to seed XF96 plates (30 x io 3 cells/well) kept in culture for 4 hours. Cells were then incubated in bicarbonate-free DMEM (Sigma-Aldrich) supplemented with 5.5 mM glucose, 2 mM L-glutamine, in a CO2-free incubator for 1 h.
  • bicarbonate-free DMEM Sigma-Aldrich
  • OCR oxygen consumption rate
  • ATP production-related respiration was estimated from the difference between basal and oligomycin-inhibited respiration rates, and proton leak respiration was obtained by subtracting non-mitochondrial respiration from the ROC measured after oligomycin treatment.
  • Maximum respiratory capacity was determined as the rate of respiration in the presence of the uncoupler FCCP. Results were normalized based on cell number.
  • FIG. 5A shows that EBS at 12.15 nM improves the respiratory growth of fibroblasts from TAZ patients. At this concentration, EBS is effective from 24 hours and the improvement in cell proliferation is more pronounced at the other three sampling times (48, 72 and 96 hours).
  • FIG. 5B shows that at 96 hours, EBS improves respiratory growth of TAZ patient fibroblasts in a wide range of concentrations: EBS has beneficial effects from 1.35 nM to 8.7 pM with toxicity at -beyond 234.9 pM, compared to the DMSO negative control.
  • Figure 5C shows that at 96 hours, ethasalen also enhanced the proliferation of cells from Barth syndrome patients in a wide concentration range from approximately 1 nM to 3 pM.
  • Figure 5D shows that EBS, at the concentration of 12.15 nM, increases mitochondrial ATP production in TAZ patient fibroblasts.
  • Figure 6 shows that ebselen improves the proliferation of ATP synthase deficiency model cells (NARP, MILS syndromes) in a dose-dependent manner and in a wide range of concentrations (pM to pM).
  • Figure 7 reveals that ebselen improves cellular respiration of model cells of mitochondrial pathologies linked to complex I from 25 nM to 100 nM and becomes toxic beyond 10 pM.
  • Disulfiram (DSF) and alverin (ALV) were reported in documents WO2020/254632 and WO2022/018297, respectively, as useful in the management of pathologies associated with mitochondrial dysfunction.
  • the tazl mutant yeast strain was plated on solid respiratory medium containing ethanol as a carbon source. The strain was then exposed to filters on which either disulfiram (DSF 5 nmoles), ebselen (EBS 30 nmoles) or alverin (ALV 30 nmoles) were deposited, alone or in combination in twos or threes. The boxes were then incubated at 36°C and then scanned after 5 days of incubation. DMSO (solvent) is used as a negative control (upper left filter).
  • DSF 5 nmoles disulfiram
  • EBS 30 nmoles ebselen
  • alverin alverin
  • Taz mammalian cell
  • EBS, ALV and DSF were tested for their synergistic effect on the respiratory growth of myoblasts from TAZ patients carrying mutations in the TAZ gene.
  • Proliferation rate was measured in low glucose medium (to encourage cells to use the OXPHOS system rather than glycolysis) in 384-well microtiter plates (1200 cells/well at T0) using the protocol staining with Sulforhodamine B (SRB) at 120 hours after seeding the cells with or without the different compounds alone or in combination at the indicated concentrations.
  • SRB Sulforhodamine B
  • Figure 8A shows that the combination of the 3 molecules EBS, ALV and DSF increases the growth halo around the filter where they were deposited in association, suggesting a synergistic effect of these 3 drug candidates on the respiratory growth of the yeast model deficient in tafazzine.
  • Figure 8B shows that the combination 1 pM ALV + 0.003 pM EBS significantly increases the growth of the Pa nuo-51 A357V mutant, compared to IpM ALV alone, suggesting a synergistic effect on the growth of this complex I mutant.
  • mice lacking the TAZ gene (KO, Barth syndrome model) or wild-type (WT) were gavaged twice daily with 10 mg/kg of Ebselen from the age of 51 days. Weight was monitored regularly during 1 month of treatment.
  • KO mice treated with EBS appear to gain more weight than mice treated with solvent.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de l'ebselen ou un de ses dérivés pour traiter des pathologies ou dysfonctionnements des mitochondries notamment associés à des déficiences du complexe I.

Description

UTILISATION DE L’EBSELEN OU L’UN DE SES DERIVES POUR TRAITER DES PATHOLOGIES OU DYSFONCTIONNEMENTS DES MITOCHONDRIES
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention vise à fournir de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter les maladies ou les dysfonctionnements mitochondriaux, en particulier ceux associés aux déficiences du complexe I mitochondrial.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE
Les maladies mitochondriales sont des pathologies fréquentes du métabolisme caractérisées par une forte hétérogénéité clinique et génétique, qui se traduisent par le fait que les mitochondries ne parviennent pas à produire suffisamment d’énergie pour permettre à l’organisme de fonctionner correctement. Les maladies mitochondriales peuvent être présentes à la naissance mais également apparaître à tout âge. Sur le plan génétique, la mitochondrie a la particularité de posséder son propre ADN (ou ADN mitochondrial) mais la majorité des protéines mitochondriales est sous la dépendance du génome nucléaire. Ainsi, aussi bien des anomalies génétiques portées par le génome mitochondrial que nucléaire sont responsables de maladies mitochondriales, reflétant la très grande hétérogénéité clinique et génétique. On estime qu'une personne sur 4300 est atteinte d’une maladie mitochondriale (Gorman ét al., 2015, Ann Neurol. 77(5):753-9).
Les maladies mitochondriales peuvent affecter presque toutes les parties du corps, notamment les cellules du cerveau, des nerfs, des muscles, des reins, du cœur, du foie, des yeux, des oreilles ou du pancréas. Les symptômes des maladies mitochondriales dépendent des organes touchés, affectant préférentiellement les tissus fortement consommateurs d’énergie comme les muscles, le cerveau et le cœur. Les symptômes des patients peuvent être modérés à sévères, concerner un ou plusieurs organes.
Les symptômes des maladies mitochondriales peuvent inclure :
- une mauvaise croissance
- une faiblesse musculaire, des douleurs musculaires, un faible tonus musculaire, une intolérance à l’effort
- des problèmes de vision et/ou d’audition - des difficultés d’apprentissage, des retards de développement, un retard mental
- l’autisme, ou des caractéristiques de l’autisme
- un dysfonctionnement cardiaque, une arythmie cardiaque ou des anomalies de la conduction cardiaque
- des maladies du foie ou des reins
- des troubles gastro-intestinaux, des difficultés à la déglutition, des diarrhées ou de la constipation, des vomissements inexpliqués, des crampes, un reflux gastro-intestinal
- des diabètes
- un risque accru d’infections
- des problèmes neurologiques, des crises d’épilepsie, des migraines, des accidents vasculaires cérébraux (AVC)
- des troubles de la mobilité
- un dysfonctionnement de la thyroïde et/ou des glandes surrénales
- des problèmes respiratoires
- une acidose lactique, c’est-à-dire une accumulation de lactate dans le sang ou les urines
- des démences.
Le dysfonctionnement mitochondrial peut également survenir lorsque les mitochondries ne fonctionnent pas correctement, possiblement en raison d’une autre maladie ou d’une autre affection. De nombreuses pathologies peuvent entraîner un dysfonctionnement mitochondrial secondaire, notamment les maladies d’Alzheimer ou de Parkinson, les dystrophies musculaires, la maladie de Lou Gehrig, le diabète et le cancer. Les personnes atteintes d’un dysfonctionnement mitochondrial secondaire ne souffrent pas d’une maladie mitochondriale primaire d’origine génétique mais présentent des symptômes similaires. En outre, certains médicaments peuvent cibler et endommager les mitochondries.
La déficience du complexe I mitochondrial est le défaut le plus couramment observé dans plus de 30 % des maladies mitochondriales. Parmi celles-ci, les deux phénotypes cliniques les plus fréquents liés aux déficiences du complexe I sont le syndrome de Leigh, qui est souvent fatal, ou des phénotypes plus modérés comme la neuropathie optique héréditaire de Leber (NOHL). Le syndrome de MELAS a également été considéré comme une maladie mitochondriale commune due à des mutations du génome mitochondrial et associé à une réduction sévère de l’activité du complexe I mitochondrial. Le complexe I est composé d’au moins 44 sous-unités, dont sept, à savoir ND1 à 6 et ND4L, sont codées par des gènes mitochondriaux, tandis que les autres sont codées par des gènes nucléaires. Par conséquent, les caractéristiques cliniques et moléculaires associées à une déficience héréditaire du complexe I sont très variables. Parmi ces sous- unités du complexe I, il a été démontré que les mutations ciblant le gène NDUFV1 sont responsables de phénotypes neurologiques sévères (Schuelke et al., 1999, Nat Genet. 21(3):260-61). Des mutations affectant la sous-unité NDUFS8 ont été associées au syndrome de Leigh (Procaccio étal., 2004, Neurology 62: 1899) et des mutations ciblant la sous-unité ND3 codée par l’ ADN mitochondrial ont été rapportées dans le syndrome de Leigh et dans la NOHL (Sarzi et al., 2007 American Journal of Medical Genetics 143: 33-41; Wang et al., 2009, Neurogenetics. 10: 337-345). En outre, des mutations affectant la sous-unité ND6 codée par l’ADN mitochondrial ont été rapportées dans la NHOL (Johns et al., 1992, Biochem Biophys Res Commun. 187(3): 1551 -7).
En outre, une déficience du complexe I a été identifiée dans le dysfonctionnement mitochondrial secondaire associé à des maladies neurodégénératives liées à l’âge, tels que la maladie de Parkinson.
Même si la plupart des maladies mitochondriales sont d’origine génétique, la thérapie génique semble difficile à mettre en œuvre en raison de la diversité génétique et clinique et de la complexité de ces maladies.
L’objectif des traitements actuels est d’améliorer les symptômes et de ralentir la progression de la maladie ou du dysfonctionnement avec, par exemple, les recommandations suivantes :
- utilisation de la vitaminothérapie
- conservation de l’énergie
- ralentissement des activités
- maintien de l’environnement à température ambiante
- protection à l’exposition de maladies intercurrentes (infections, stress)
- maintien d’une nutrition et d’une hydratation adaptées.
A noter que les documents WO2020/254632 et W02022/018297 ont récemment rapporté la prise en charge de ces pathologies ou déficiences à l’aide de disulfirame et d’alvérine, respectivement. Cependant, il reste nécessaire de trouver de nouvelles approches thérapeutiques et pharmacologiques pour traiter ce type de dysfonctionnements ou de maladies, basées sur un traitement causal et non symptomatique.
Le document WO2014/150688 décrit le traitement du cancer à l’aide de molécules capables d’inhiber des enzymes de la voie mitochondriale (1-C) telles que l’ebselen, en particulier l'enzyme MTHFD2.
JIA ZHI-QIANG et al. (Neurosc. Letters, 2018, vol. 678, pp 110-17) rapportent l’effet bénéfique de l’ebselen dans la prise en charge d’une lésion aigue de la moelle épinière, avec un effet neuroprotecteur et une amélioration de la fonction mitochondriale.
Le document ARAKAWA MOTOKI et al. (Cerebellum, 2007, 6(4), pp 308-14) a trait aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson, décrites comme associées à des altérations mitochondriales. Ce document se focalise sur l’effet positif du NAC (N-acétylcystéine) contre la toxicité induite par le 4- hydroxynonenal (HNE) sur les neurones, et mentionne un effet neuroprotecteur de l’ebselen et sa possible utilisation en combinaison avec le NAC.
Le document AZAD GAJENDRA et al. (Molecular Biology Reports, 2014, 41(8), pp 4865-79) est une revue dédiée à l’ebselen, décrit comme un médicament antioxydant prometteur. Le tableau 2 liste l’ensemble des pathologies qui peuvent être améliorées par l'administration d’ebselen.
Le document CAPPER MICHAEL et al. (Nature Communications, 2018, 9(1)) s'intéresse à l'effet de l’ebselen sur l’enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1), dont des mutations peuvent entraîner des pathologies telles que la sclérose latérale amyotrophique (ALS).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les inventeurs ont montré que l’ebselen, un médicament actuellement utilisé notamment dans des essais cliniques pour le traitement des troubles auditifs tels que la maladie de Ménière, mais également ses dérivés, tels que l’ethasalen, étaient actifs dans le contexte du traitement des maladies associées à un dysfonctionnement mitochondrial, en particulier les maladies de la chaine respiratoire mitochondriale, avantageusement associées à une déficience du complexe I. Ainsi, ces travaux ouvrent la voie à l’utilisation d’une nouvelle famille de composés dans ce contexte.
Définitions
Les définitions ci-dessous donnent le sens généralement utilisé dans le cadre de l’invention et doivent être prises en compte sauf si une autre définition est explicitement indiquée.
Les termes « environ », « à peu près », « de l’ordre de » ou « approximativement » utilisés dans le présent document pour désigner une valeur mesurable telle qu’une quantité, une durée et autres, doivent être compris comme englobant des variations de ± 20 % ou ± 10 %, de préférence ± 5 %, plus préférablement ± 1 %, et encore plus avantageusement ± 0,1 % par rapport à la valeur spécifiée.
Intervalles/plages : tout au long de cette divulgation, divers aspects de l’invention peuvent être présentés sous la forme d’un intervalle de valeurs (format de plage). Il faut comprendre que la description des valeurs sous la forme d’un intervalle n'est faite que par commodité et brièveté et ne doit pas être interprétée comme une limitation de la portée de l’invention. En conséquence, la description d’une gamme doit être considérée comme ayant spécifiquement divulgué toutes les sous-gammes possibles ainsi que les valeurs numériques individuelles dans cette gamme. Par exemple, la description d’une gamme telle que « de 1 à 6 » doit être considérée comme ayant spécifiquement divulgué des sous-gammes telles que de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc. ainsi que les nombres individuels à l’intérieur de cette gamme, par exemple 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5.3 et 6. Ceci s'applique quelle que soit l’étendue de la plage.
« Isolé » signifie extrait ou retiré de son environnement ou état naturel. Par exemple, un acide nucléique ou un peptide isolé est un acide nucléique ou un peptide qui a été extrait de l’environnement naturel dans lequel il se trouve habituellement, que ce soit dans une plante ou un animal vivant par exemple. Un acide nucléique ou un peptide par exemple qui est naturellement présent dans un animal vivant n’est pas un acide nucléique ou un peptide isolé au sens de l’invention, alors que le même acide nucléique ou peptide partiellement ou complètement séparé des autres composants présents dans son environnement naturel est lui-même « isolé » au sens de l’invention. Un acide nucléique ou une protéine isolé peut exister sous une forme sensiblement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte. Le terme « anormal », lorsqu’il est utilisé dans le contexte d’organismes, de tissus, de cellules ou de composants de ceux-ci, désigne les organismes, tissus, cellules ou composants de ceux-ci qui diffèrent par au moins une caractéristique observable ou détectable (par exemple, l’âge, le traitement, l’heure de la journée, etc.) des organismes, tissus, cellules ou composants de ceux-ci qui présentent la caractéristique respective « normale » (attendue). Les caractéristiques, qui sont normales ou attendues pour un type de cellule ou de tissu, peuvent être anormales pour un autre type de cellule ou de tissu.
Les termes « patient », « sujet », « individu » et autres sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document et désignent tout animal ou cellule de celui- ci, in vitro ou in situ, pouvant être soumis aux méthodes décrites dans le présent document. Dans certains modes de réalisation non limitatifs, le patient, le sujet ou l’individu est un animal, de préférence un mammifère, plus avantageusement un humain, aussi bien de sexe féminin que masculin. Il peut également s'agir d’une souris, d’un rat, d’un porc, d’un chien ou d’un primate non humain (PNH), tel que le singe macaque.
Au sens de l’invention, une « maladie » ou « pathologie » est un état de santé d’un animal dans lequel son homéostasie est affectée négativement et qui, si la maladie n’est pas traitée, continue à se détériorer. A l’inverse, au sens de l’invention, un « trouble » ou « dysfonctionnement » est un état de santé dans lequel l’animal est capable de maintenir son homéostasie mais dans lequel l’état de santé de l’animal est moins favorable qu’il ne le serait en l’absence du trouble. En l’absence de traitement, un trouble n’entraîne pas nécessairement une détérioration de l’état de santé de l’animal dans le temps.
Une maladie ou un trouble est « atténué » (« réduit ») ou « amélioré » si la gravité d’un symptôme de la maladie ou du trouble, la fréquence à laquelle ce symptôme est ressenti par le sujet, ou les deux, sont réduits. Cela inclut également la disparition de la progression de la maladie, c'est-à-dire l’arrêt de la progression de la maladie ou du trouble. Une maladie ou un trouble est « guéri » (« rétabli ») si la gravité d’un symptôme de la maladie ou du trouble, la fréquence à laquelle un tel symptôme est ressenti par le patient, ou les deux, sont éliminés. Dans le contexte de l’invention, un traitement « thérapeutique » est un traitement administré à un sujet qui présente les symptômes (signes) d’une pathologie, dans le but de réduire ou de supprimer ces symptômes. Dans le cadre de l’invention, le « traitement d’une maladie ou d’un trouble » signifie la réduction de la fréquence ou de la gravité d’au moins un signe ou symptôme d’une maladie ou d’un trouble ressenti par le sujet. Un traitement est dit prophylactique lorsqu’il est administré pour prévenir le développement, la propagation ou l’aggravation d’une maladie, notamment si le sujet ne présente pas ou pas encore les symptômes de la maladie et/ou pour laquelle la maladie n’a pas été diagnostiquée.
Tel qu'utilisé ici, « traiter une maladie ou un trouble » signifie réduire la fréquence ou la gravité d’au moins un signe ou symptôme d’une maladie ou d’un trouble ressenti par un sujet. Maladie et trouble sont utilisés de manière interchangeable dans le contexte du traitement selon l’invention.
Au sens de l’invention, une « quantité efficace » ou une « quantité effective » d’un composé est la quantité de composé qui est suffisante pour fournir un effet bénéfique au sujet auquel le composé est administré. L’expression « quantité thérapeutiquement efficace » se réfère à une quantité qui est suffisante ou efficace pour prévenir ou traiter (en d’autres termes retarder ou empêcher le développement, empêcher la progression, inhiber, réduire, diminuer ou inverser) une maladie ou un trouble, y compris le soulagement des symptômes de cette maladie ou de ce trouble.
La présente invention concerne donc l’utilisation d’un composé ayant un groupement de formule : ou un composé de formule : , , , , SeO (Se=O) chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ou une composition pharmaceutique le contenant, pour le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial, ou pour la préparation d’un médicament destiné au traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial. En d’autres termes, l’invention concerne un composé ayant un groupement de formule : dans laquelle
E est O, S, SO (S=O), SO2 (O=S=O), Se ou SeO (Se=O) chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ou une composition pharmaceutique le contenant, pour utilisation dans le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial. Selon un autre aspect, l’invention concerne une méthode de traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial comprenant l’administration d’un composé ayant un groupement de formule : ou de formule dans laquelle
E est O, S, SO (S=O), SO2 (O=S=O), Se ou SeO (Se=O) chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ou d’une composition pharmaceutique comprenant un tel composé, chez un sujet.
Un composé mis en œuvre dans le cadre de l’invention peut présenter une activité inhibitrice de l’inositol monophosphatase (IMPase), ladite activité pouvant être testée comme décrit par Singh et al. (Nat Commun. 2013;4: 1332. doi: 10.1038/ncomms2320). Selon un mode de réalisation particulier, un tel composé n’est pas l’acide valproïque ou la carbamazépine.
Un composé mis en œuvre dans le cadre de l’invention peut présenter une activité antioxydante, ladite activité pouvant être testée comme décrit par Noguchi et al. (Biochem Pharmacol 1992 ; 44 : 39-44) et Nakamura et al. (J Biol Chem., 2002; 277(4):2687-94).
Selon un mode de réalisation particulier, un tel composé n’est pas l’acide ascorbique.
Selon un premier mode de réalisation particulier, un composé mis en œuvre dans le cadre de l’invention ayant un groupe de formule : est l’ethaselen ou un de ses dérivés ou analogues, comme définis ci-dessous.
L’ethaselen ou BBSKE (CAS No. : 217798-39-5) présente la formule suivante :
Un dérivé ou analogue de l’ethaselen est par exemple le dérivé chloré MAD423 de formule :
Ainsi, un composé d’intérêt dans le cadre de l’invention présente la formule suivante :
E est O, S, SO, SO2, Se ou SeO chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br.
Selon un autre mode de réalisation, un composé mis en œuvre dans le cadre de l’invention est tel que décrit dans le document WO2012/107735, à savoir un composé de formule I, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans lequel la formule I est : dans laquelle
E est O, S, SO, SO2, Se ou SeO chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br.
Selon un mode de réalisation privilégié, un tel composé est :
- le 2-phényl-l, 2-benzisosélenazol-3(2H)-one ou ebselen de formule :
- le 2-phényl-l, 2-benzisothiazol-3(2H)-one ou ebselen soufre (2-phényl-2,3-dihydro- l,2-benzothiazol-3-one) de formule :
- le l-oxyde-2-phényl-l, 2-benzisosélenazol-3(2H)-one ou ebselen oxyde (oxyde d’ ebselen) ou ebselen sélénoxyde de formule :
- l’ebselen -OH ortho de formule : - le MAD309 (6-hydroxy-2-phenylbenzo[d][l,2]selenazol-3(2H)-one 1-oxide) de
- le MAD331 (6-chloro-2-phenylbenzo[d][l,2]selenazol-3(2H)-one) de formule :
- le MAD349 (2-(2,6-dichlorophenylbenzo[d][l,2]selenazol-3(2H)-one) de formule :
- le MAD383 (6-chloro-2-(3-trifluorométhyl)phényl)benzo[d][l,2]selenazol-3(2H)- one) de formule :
- le MAD385 (2-(3-difluoromethoxy)phényl)benzo[d][l,2]selenazol-3(2H)-one) de formule : - le MAD413 (6-chloro-2-phenylbenzo[d][l,2]selenazol-3(2H)-one 1 -oxide) de formule :
Des composés privilégiés selon l’invention sont l’ebselen et l’oxyde d’ebselen, avantageusement l’ebselen, et leurs dérivés ou analogues tels que définis ci-dessous.
L’ebselen (2-phényl-l,2-benzosélénazol-3(2H)-one ; numéro CAS : 60940-34-3), également appelé PZ 51, DR3305 et SPI-1005, est une molécule synthétique capable de mimer la glutathion peroxydase. Une activité thérapeutique de cette molécule a été décrite en lien avec les lésions ischémiques, les accidents cardio-vasculaires, les pertes d’audition et les troubles bipolaires. Elle pourrait également être efficace pour traiter les infections à Clostridioides difficile et présente une activité antifongique vis-à-vis de Aspergillus fumigatus.
En pratique, cette molécule fait l’objet d’essais cliniques de phase III pour le traitement de la maladie de Menière, un trouble auditif. L’ebselen est administrée par voie orale à différentes doses de 200 mg à 600 mg (sous forme de gélules de 200 mg) par jour pendant au moins 21 jours.
Sont également visés par la présente invention les dérivés ou analogues de ces composés, notamment de l’ebselen, ayant la même activité biologique, à savoir celle rapportée dans les exemples, notamment la restauration de la croissance respiratoire, de la respiration cellulaire ou du niveau d’ ATP mitochondrial, aussi bien dans des modèles de levure, en particulier Saccharomyces cerevisiae. de champignon filamenteux, en particulier Podospora anserina, que sur des cellules humaines, en particulier des fibroblastes ou des myoblastes de patients atteints de ces pathologies. Le terme « dérivés » (ou « analogues ») englobe les dérivés et les métabolites, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables. Un dérivé est un composé provenant d’un autre (le précurseur, avec une structure chimique typiquement similaire) après transformation de ce dernier. Le dérivé peut différer par un ou plusieurs atomes ou groupes fonctionnels. Un métabolite est un composé intermédiaire stable ou un composé résultant de la transformation biochimique d’une molécule initiale par métabolisme.
Par « sels pharmaceutiquement acceptables », on entend les sels d’addition du composé, qui peuvent être obtenus par réaction de ce composé avec un acide minéral ou organique selon une méthode connue en soi. Parmi les acides classiquement utilisés à cet effet, on peut citer les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphorique, 4-toluène sulfonique, méthane sulfonique, cyclohexyl sulfamique, oxalique, succinique, formique, fumarique, maléique, citrique, aspartique, cinnamique, lactique, glutamique, les acides N-acétyl-aspartique, N-acétyl-glutamique, ascorbique, malique, benzoïque, nicotinique et acétique. Selon un mode de réalisation privilégié, le composé ne se présente pas sous forme d’un sel.
Lesdits composés, notamment l’ebselen, peuvent être modifiés pour augmenter leur stabilité, leur biodisponibilité et/ou leur capacité à atteindre les tissus cibles, notamment les mitochondries.
De manière connue par l’homme du métier, lesdits composés, notamment l’ebselen, peuvent être présents dans la composition sous une forme nue (libre) ou contenus dans des systèmes de délivrance qui augmentent la stabilité, le ciblage et/ou la biodisponibilité, tels que des liposomes, ou incorporés dans des supports tels que des hydrogels, des cyclodextrines, des nanocapsules biodégradables, des microsphères bioadhésives, des vecteurs ou en combinaison avec un peptide cationique.
La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant en tant que principe actif au moins un composé tel que défini ci-dessus, ainsi que l’utilisation de ce composé ou de cette composition en tant que médicament ou produit médicinal. Ainsi, la présente invention vise des compositions pharmaceutiques comprenant un composé selon l’invention pour l’utilisation visée. Avantageusement, ces compositions comprennent une quantité thérapeutiquement efficace dudit composé, et un support pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier, le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par un organisme de réglementation du gouvernement fédéral ou d’un État ou inscrit dans la pharmacopée américaine ou européenne ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue pour une utilisation chez les animaux et les humains. Le terme « support » désigne un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel le produit thérapeutique est administré. Ces supports pharmaceutiques peuvent être des liquides stériles, comme l’eau et les huiles, y compris celles d’origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, comme l’huile d’arachide, l’huile de soja, l’huile minérale, l’huile de sésame et autres. Les solutions salines et les solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être employées comme supports liquides, notamment pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiques appropriés comprennent l’amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylèneglycol, l’eau, l’éthanol et autres.
La composition, le cas échéant, peut également contenir des quantités mineures d’agents mouillants ou émulsifiants, ou d’agents tampons du pH. Ces compositions peuvent prendre la forme de solutions, de suspensions, d’émulsions, de formulations à libération prolongée et autres. Des exemples de supports pharmaceutiques appropriés sont décrits dans « Remington’s Pharmaceutical Sciences » de E. W. Martin. Ces compositions contiennent une quantité thérapeutiquement efficace de l’agent thérapeutique, de préférence sous forme purifiée, ainsi qu'une quantité appropriée de support de manière à fournir la forme permettant une administration adéquate au sujet.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition est formulée conformément aux procédures de routine comme une composition pharmaceutique adaptée, par exemple, à l’administration orale à des êtres humains. Typiquement, les compositions pour l’administration orale sont sous la forme de comprimés, éventuellement de comprimés sécables ou de comprimés effervescents, contenant en outre des excipients adaptés à la forme posologique solide et à l’administration chez l’homme. A titre d’exemple, l’ebselen peut se présenter sous forme de poudre conditionnée dans des comprimés pouvant contenir 200 mg du principe actif. Ces comprimés peuvent être écrasés et mélangés à des liquides. Alternativement, la composition peut être sous une forme liquide, avantageusement une composition aqueuse. Tout autre solvant approprié peut être utilisé.
La quantité de l’agent thérapeutique de l’invention, c’est-à-dire un composé tel que décrit ci-dessus, qui sera efficace dans le traitement d’une maladie peut être déterminée par des techniques cliniques standard. En outre, des essais in vivo et/ou in vitro, tels que ceux décrits dans les exemples ci-dessous, peuvent éventuellement être utilisés pour aider à prédire les plages de dosage optimales. La dose précise à employer dans la formulation dépendra également de la voie d’administration, du poids et de la gravité de la maladie, et doit être décidée selon le jugement du praticien et les conditions de chaque patient.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition de l’invention se présente sous une forme solide, avantageusement un comprimé, pouvant contenir 200 mg du composé actif, notamment de l’ebselen.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention se présente sous une forme liquide et comprend avantageusement moins de 30 pM, 20 pM ou même 15 pM du composé actif, notamment de l’ebselen. Selon un autre mode de réalisation, la composition de l’invention se présente sous une forme liquide et comprend avantageusement 1 nM ou plus, voire 10 nM ou plus, 30 nM ou plus, voire 100 nM ou plus, avec par exemple une concentration optimale de 1 pM du composé actif, notamment de l’ebselen.
Une voie d’administration appropriée doit permettre la délivrance d’une quantité thérapeutiquement efficace du produit thérapeutique aux tissus cibles, en fonction de la maladie.
L’ebselen et ses dérivés peuvent être administrés sous une forme pharmaceutiquement acceptable par une des voies d’administration connues pour ce type de principe actif. Les voies d’administration disponibles sont les suivantes : topique (locale), entérale (action systémique, mais délivrée par le tractus gastro-intestinal (GI)), ou parentérale (action systémique, mais délivrée par des voies autres que le tractus GI). Dans le cas spécifique des maladies mitochondriales, la voie d’administration préférée des compositions divulguées ici est généralement entérale, ce qui inclut l’administration orale, sublinguale, buccale, préférentiellement une administration orale. Selon d’autres modes de réalisation, il peut s’agir d’une administration parentérale, notamment par voie intramusculaire (c'est-à-dire dans le muscle) ou systémique (c'est- à-dire dans le système circulant). Dans ce contexte, le terme « injection » (ou « perfusion » ou « infusion ») englobe l’administration intravasculaire, en particulier intraveineuse (IV), et intramusculaire (IM). Les injections sont généralement réalisées à l’aide de seringues ou de cathéters.
Selon un mode de réalisation, la composition est administrée par voie orale, intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée, topique, locale ou intravasculaire, avantageusement par voie orale. Selon un mode de réalisation préféré, la composition est destinée à une administration orale.
Une composition selon l’invention se présente de préférence sous une forme galénique solide adaptée à l’administration orale, avantageusement sous la forme d’une ou plusieurs gélules, capsules ou comprimés.
Alternativement, il peut s’agir de préparations liquides telles que des élixirs et des suspensions contenant diverses substances masquantes pour la coloration, la saveur et la stabilisation.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition est destinée à une administration orale. Avantageusement, la composition est administrée per os, c'est-à-dire par la bouche.
De préférence, une composition selon l’invention est administrée par voie orale, notamment sous forme de gélules, capsules ou comprimés.
Pour réaliser les formes galéniques orales selon l’invention, en particulier les gélules, la substance active peut être mélangée à diverses matières conventionnelles telles que l’amidon, le carbonate de calcium, le lactose, le saccharose et le phosphate dicalcique pour faciliter le processus d’encapsulation. Le stéarate de magnésium, en tant qu’ additif, assure une fonction lubrifiante utile si nécessaire.
Il peut, dans certains cas, être avantageux de prévoir des formes à libération contrôlée, notamment à libération prolongée à l’aide de formes galéniques connues. De même, une composition selon l’invention peut être destinée à la préparation d’une composition pharmaceutique qui peut être administrée par voie injectable.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut être dissoute ou mise en suspension dans un liquide injectable stérile, pharmaceutiquement acceptable, tel que l’eau stérile, un solvant organique stérile ou un mélange de ces deux liquides pour une administration intraveineuse.
D’autres voies d’administration peuvent inclure, sans s’y limiter, les implants sous- cutanés, ainsi que l’administration orale, sublinguale, transdermique, topique, intranasale ou rectale. Des systèmes d’administration biodégradables et non biodégradables peuvent également être utilisés.
Comme déjà mentionné, une composition selon l’invention se présente de préférence sous une forme galénique solide adaptée à l’administration orale, avantageusement sous la forme d’une ou plusieurs gélules, capsules ou comprimés.
Ceux-ci peuvent être pris avec un peu d’eau avant ou pendant le repas principal. Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l’invention est administrée quotidiennement, par exemple une fois par jour, voire deux ou plusieurs fois par jour. Le traitement peut durer plusieurs semaines, plusieurs mois, plusieurs années ou même toute la vie.
En général, le dosage de l’agent thérapeutique, c’est-à-dire l’ebselen ou l’un de ses dérivés, varie en fonction de facteurs tels que l’âge, le poids, la taille, le sexe, l’état de santé général et les antécédents médicaux du sujet. Typiquement, il est souhaitable de fournir au patient une dose individuelle de l’agent thérapeutique, qui est efficace sans être toxique.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la dose de la composition, avantageusement la dose quotidienne à prendre par voie orale par un humain, est inférieure ou égale à 10 mg/kg ou 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 mg/kg, voire inférieure ou égale à 2,5, 2, 1,5 ou 1 mg/kg, voire inférieure ou égale à 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 ou 0,1 mg/kg. Comme déjà indiqué, le patient est avantageusement un humain, notamment un nouveau-né, un jeune enfant, un enfant, un adolescent ou un adulte, quel que soit son sexe. L’outil thérapeutique selon l’invention peut toutefois être adapté et utile pour le traitement d’autres animaux, notamment le porc, la souris, le chien ou le singe macaque.
De manière générale, la présente invention concerne le traitement des maladies mitochondriales en général, c'est-à-dire les maladies liées ou causées par un dysfonctionnement mitochondrial. Dans le cadre de la présente demande, l’expression « maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial » est utilisée afin d’englober toutes ces situations.
En lien avec les exemples ci-dessous montrant un effet positif de l’ebselen ou de l’un de ses dérivés sur la chaîne respiratoire mitochondriale, les maladies présentant un intérêt particulier sont les maladies de la chaîne respiratoire mitochondriale.
Plusieurs maladies mitochondriales ont été documentées dans l’art antérieur :
Le syndrome NARP (neuropathie, ataxie et rétinite pigmentaire) induit une combinaison variable de retard de développement, de rétinite pigmentaire, de démence, de crises d’épilepsie, d’ataxie, de faiblesse musculaire neurogène proximale et de neuropathie sensorielle. Ce syndrome NARP est causé par diverses mutations du gène mitochondrial ATP6, qui code la sous-unité a de l’ATPase (complexe V du système OXPHOS). Les mutations sont souvent hétéroplasmiques (coexistence d’ADN mitochondrial (ADNmt) muté et sauvage (WT) dans la même cellule). Selon le type de mutation et le pourcentage d’ ADNmt muté (degré d’hétéroplasmie), les conséquences cliniques sont plus ou moins sévères. Les mutations ATP6 m.8993T>C/G sont parmi les plus fréquentes chez les patients NARP et entraînent des formes sévères du syndrome NARP. FMC1 est un gène nucléaire qui code une protéine requise à haute température (35-37°C) pour l’assemblage du secteur Fl de l’ATP synthase, mimant ainsi l’hétéroplasmie observée chez les patients NARP. En effet, lorsqu'elles sont cultivées à une température restrictive (35-37°C), les mitochondries du mutant fmclA contiennent beaucoup moins de complexes ATP synthase assemblés qu’une souche sauvage (WT), mais ceux qui s’assemblent sont pleinement fonctionnels. Cette hétérogénéité se retrouve également chez les patients présentant des niveaux réduits d’ATP synthase dus à des mutations hétéroplasmiques du gène ATP6. Par conséquent, le mutant fmclA constitue un modèle approprié pour cette maladie, en particulier l’équivalent du mutant m.8993T<G (MR14, NARP) (Schon EA et al. (2001) Cell Dev Biol. 12(6):441-8).
Le gène TAZ code la tafazzine, une transacylase mitochondriale qui catalyse le remodelage de la cardiolipine immature en sa composition mature contenant une prédominance de fragments tétralinoléoyles. Les mutations de TAZ entraînent le syndrome de Barth, une maladie liée au chromosome X classiquement caractérisée par une cardiomyopathie dilatée (CMD) avec une fibroélastose endocardique (EFE), une myopathie squelettique à prédominance proximale, un retard de croissance, une neutropénie et une acidurie organique, notamment un excès d’acide 3- méthylglutaconique (Barth, P. G. et al. (1996) J Inherit Metab Dis, 19, 157-160).
Les gènes COX2 et SURF1 codent une sous-unité et un facteur d’assemblage du complexe IV mitochondrial, respectivement. Les mutations sont associées au syndrome de Leigh, une maladie neurodégénérative progressive et sévère qui se manifeste dans les premiers mois ou les premières années de la vie responsable de décès précoces. Les personnes affectées présentent généralement un retard global de développement ou une régression du développement, une hypotonie, une ataxie, une dystonie et des anomalies ophtalmologiques, comme un nystagmus ou une atrophie optique (Barrientos, A. et al. (2002) EMBO J, 21, 43-52).
MPV1 7 code une protéine de la membrane interne mitochondriale de fonction inconnue. Les mutations Q MPV17 entraînent :
- Le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial-6, une maladie autosomique récessive caractérisée par l’apparition infantile d’une insuffisance hépatique progressive, conduisant souvent au décès dans la première année de vie. Ceux qui survivent développent une atteinte neurologique progressive, notamment une ataxie, une hypotonie, une dystonie et une régression psychomotrice (Spinazzola, A. et al. (2006) Nat Genet, 38, 570-575).
- Neuropathie type Navajo : Les manifestations comprennent une anesthésie grave entraînant une ulcération de la cornée, des fractures indolores et une mutilation acrale, une faiblesse musculaire, des réflexes tendineux profonds absents ou nettement diminués, sans déficit intellectuel (Karadimas, C.L. et al. (2006) Am J Hum Genet, 79, 544-548). D’intérêt particulier est le traitement d’une maladie choisie dans le groupe constitué par: le syndrome MELAS, la myopathie et cardiomyopathie héritées de la mère, le syndrome NARP ou MILS, le syndrome de Leigh, la neuropathie optique héréditaire de Leber (NHOL), le syndrome de Barth, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial notamment 4A (type Alpers) et 4B (type MNGIE), le syndrome d’ataxie récessive mitochondriale, la neuropathie ataxique sensorielle, la dysarthrie et l’ophtalmoplégie, l’ataxie spinocérébelleuse avec épilepsie, l’ophtalmoplégie externe progressive, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial-6, la neuropathie de type Navajo, le syndrome de Behr, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial 14, la cardioencéphalomyopathie infantile due à un déficit en cytochrome c oxydase (mutations COA6), la déficience nucléaire du complexe III mitochondrial de type 1, le syndrome de GRACILE et le syndrome de Bjomstad.
Le traitement des maladies associées à la déficience ou aux déficiences du complexe I mitochondrial présente un intérêt particulier. Certaines maladies sont uniquement liées à un dysfonctionnement du complexe I, alors que d’autres maladies sont associées à des déficits multiples, par exemple affectant plusieurs complexes mitochondriaux.
De manière connue, la chaîne respiratoire dans les mitochondries est impliquée dans la phosphorylation oxydative, qui est un processus cellulaire important qui utilise l’oxygène et les sucres simples pour créer de l’adénosine triphosphate (ATP), la principale source d’énergie de la cellule. Cinq complexes protéiques, constituant le système OXPHOS, composés de plusieurs protéines chacun, sont impliqués dans ce processus. Ces complexes sont nommés complexe I, complexe II, complexe III, complexe IV et complexe V, respectivement. Le complexe I (CI ou NADH déshydrogénase ou NADH coenzyme Q réductase), la première enzyme de la chaîne respiratoire, est un très grand complexe protéique (environ 1000 kDa) composé d’au moins 44 sous-unités dont 7 codées par l’ADN mitochondrial (ND1 à ND6 et ND4L). Selon un mode de réalisation particulier, un composé selon l’invention, en particulier l’ebselen, peut être utilisé pour traiter une maladie mitochondriale dite « primaire », c'est-à-dire due à une anomalie génétique identifiée dans au moins une sous-unité des complexes OXPHOS (notamment le complexe I) liée à une ou des mutations de l’ADN mitochondrial ou nucléaire. Ces pathologies sont associées à des symptômes neurologiques, cardio-musculaires ou ophtalmologiques, en lien avec les tissus ou organes les plus touchés dans ces maladies mitochondriales, même si d’autres organes ou tissus sont éventuellement touchés. Selon un autre mode de réalisation particulier, un composé selon l’invention, en particulier l’ebselen, peut être utilisé pour traiter une maladie mitochondriale dite « secondaire ». Dans ce cas, l’anomalie génétique n’implique pas directement les complexes OXPHOS mais la pathologie va affecter les fonctions mitochondriales et en particulier peut conduire à une réduction de l’activité enzymatique de ce processus. Une telle maladie peut également être due à des causes non génétiques telles que l’exposition à des facteurs environnementaux ou le vieillissement. C’est le cas notamment de la maladie de Parkinson ou d’autres troubles neurodégénératifs liés à l’âge.
Selon un mode de réalisation, la déficience ou le dysfonctionnement mitochondrial résulte d’une maladie génétique.
Les maladies génétiques sont, par définition, des maladies résultant d’un ou de plusieurs défauts (anomalies) génétiques (ou mutations) dans un ou plusieurs gènes. Les défauts génétiques peuvent affecter l’ADN mitochondrial et/ou les gènes nucléaires. Les défauts génétiques responsables des maladies mitochondriales peuvent être des mutations ponctuelles, entraînant un changement de codon. Cependant, les maladies peuvent être liées à la délétion ou à l’insertion d’une ou plusieurs bases ou codons.
Selon un mode de réalisation spécifique, la maladie résulte d’une ou plusieurs déficiences (ou mutations) génétiques dans un ou plusieurs gènes impliqués dans la fonctionnalité des complexes OXPHOS, notamment du complexe I.
Une liste non limitative de tels gènes comprend :
- les gènes structuraux du complexe I, en particulier MTND1 (ou ND/), MTND2 (ou ND2 MTND3 (ou ND 3), MTND4 (ou ND4), MTND5 (ou ND5), MTND6 (ou ND6), MTND4L (ou ND4E), NDUFA1, NDUFA2, NDUFA3, NDUFA4, NDUFA5, NDUFA6, NDUFA7, NDUFA8, NDUFA9, NDUFA10, NDUFA11, NDUFA12, NDUFA13, NDUFAB1, NDUFB1, NDUFB2, NDUFB3, NDUFB4, NDUFB5, NDUFB6, NDUFB7, NDUFB8, NDUFB9, NDUFB10, NDUFB11, NDUFC1, NDUFC2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS4, NDUFS5, NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NDUFV3
- les gènes d’assemblage du complexe I, notamment NDUFAF1, NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, NDUFAF5, NDUFAF6, NDUFAF7, NDUFAF8, NUBPL, ACAD9, TMEM70, TMEM126B, FOXRED1, ECSIT, AIF, TIA4MDC1. Selon un mode de réalisation particulier, les maladies à traiter dans le cadre de l’invention sont liées ou dues à au moins un défaut génétique ou mutations dans au moins un des gènes suivants : MTTL1, ATP6, FMC1, TAZ, COX2, SURF1, POLG, MPV17, OPA1, COA6, ND6 et BCS1L, avantageusement ATP6, FMC1, TAZ, COX2, SURF1 ou MPV17.
Plusieurs maladies mitochondriales d’origine génétique, notamment en relation avec des déficiences du complexe I mitochondrial, ont été documentées dans l’art antérieur : Le syndrome NOHL ou neuropathie optique héréditaire de Leber apparait généralement chez les jeunes adultes. Le début est brutal avec une baisse rapide de la vision au centre de l’œil, correspondant à une diminution de l’acuité visuelle centrale. Le plus souvent, un champ visuel périphérique persiste, comme un halo de vision autour d’une zone aveugle. Cette maladie est due à des mutations communément homoplasmiques dans les gènes codant pour les sous-unités du complexe I de la chaîne respiratoire. En pratique, les mutations de l’ADN mitochondrial m.H778G> A, m.3460G> A et m, 14484T> C représentent environ 95 % des mutations NOHL.
Le syndrome de Leigh (ou LS) est une maladie neurodégénérative progressive et grave. Les personnes atteintes présentent généralement un retard global de développement ou une régression du développement, une hypotonie, une ataxie, une dystonie et des anomalies ophtalmologiques, telles qu’un nystagmus ou une atrophie optique. Le syndrome de Leigh peut également avoir des effets multi systémiques néfastes sur les organes cardiaques, hépatiques, gastro-intestinaux et rénaux. Les études biochimiques chez les patients atteints du syndrome de Leigh ont tendance à montrer une augmentation du lactate et des anomalies de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Le syndrome de Leigh peut être associé à des mutations dans les gènes codant pour les sous-unités du complexe I, comme les mutations NDUFV1 ou la mutation MTND5 m.13513 G>A.
Le syndrome MELAS, comprenant la myopathie mitochondriale, l’encéphalopathie, l’acidose lactique et des épisodes de type AVC (« Stroke »), est une maladie mitochondriale génétiquement hétérogène dont le phénotype clinique est variable. Ce trouble s’accompagne de caractéristiques d’atteintes du système nerveux central, notamment des crises d’épilepsie, une hémiparésie, une hémianopsie, une cécité corticale et des vomissements épisodiques. Ce syndrome a d’abord été associé à la mutation m.3243A>G de l’ADN mitochondrial, c'est-à-dire du gène tRNALeu (UUR) (MTTLl), qui induit une altération de la traduction de l’ARNm du complexe I en protéines et donc, une réduction de la quantité de protéines structurelles du complexe I telles que la sous-unité mitochondriale ND6. Le syndrome MELAS peut également être associé à d’autres mutations de l’ADN mitochondrial telles que la mutation m.3260A>G, qui affecte également le tRNALeu (UUR)' Cette mutation m.3260A>G peut également entraîner d’autres phénotypes cliniques, notamment une myopathie et une cardiomyopathie d’origine maternelle.
Ainsi, le traitement des maladies génétiques dont il est démontré qu’elles sont associées à une déficience du complexe I, par exemple le syndrome MELAS, le syndrome de Leigh et la neuropathie optique héréditaire de Leber (NHOL), présente un intérêt particulier. Il est à noter que ces maladies peuvent être associées à d’autres symptômes tels que des phénotypes cliniques cardiaques, myopathiques ou neurologiques.
Plus généralement, un composé selon l’invention, notamment l’ebselen, peut être utilisé pour traiter le dysfonctionnement mitochondrial, en particulier le dysfonctionnement mitochondrial associé aux déficiences du complexe I. Le dysfonctionnement mitochondrial, caractérisé par une perte d’efficacité de la chaîne de transport des électrons et des réductions de la synthèse de molécules à haute énergie comme l’adénosine-5’ -triphosphate (ATP), est une caractéristique du vieillissement et généralement de toutes les maladies chroniques.
Ces maladies incluent :
- les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique (maladie de Lou Gehrig) et l’ataxie de Friedreich ;
- les maladies cardiovasculaires, telles que l’athérosclérose et d’autres affections cardiaques et vasculaires ;
- le diabète et le syndrome métabolique ;
- les maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux systémique et le diabète de type 1 ;
- les maladies neurocomportementales et psychiatriques, telles que les troubles du spectre autistique, la schizophrénie, les troubles bipolaires et de l’humeur ;
- les troubles gastro-intestinaux ;
- les maladies de la fatigue, telles que le syndrome de fatigue chronique et les maladies de la guerre du Golfe ; les maladies musculo-squelettiques, telles que la fibromyalgie et l’hypertrophie/atrophie des muscles squelettiques ; - les dystrophies musculaires,
- le cancer ; et
- les infections chroniques.
Le traitement préconisé par la présente invention, à base d’ebselen ou un de ses dérivés, peut également être associé à d’autres traitements, destinés à traiter la même pathologie ou le même état, ou une autre maladie.
Selon un mode de réalisation particulier, cet autre traitement est basé sur l’administration d’un autre composé d’intérêt.
Ainsi et selon cet aspect, la composition selon l’invention est associée à au moins un autre composé pour le traitement de la même maladie. La composition selon l’invention et ledit composé peuvent être administrés simultanément ou séparément dans le temps pour tenir compte de leurs particularités et notamment de leur biodisponibilité.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition, avantageusement une composition pharmaceutique ou un médicament contenant un composé tel que décrit ci-dessus et potentiellement d’autres molécules actives (autres molécules de thérapie génique, groupements chimiques, peptides ou protéines, etc.) pour le traitement de la même maladie ou d’une maladie différente, avantageusement de la même maladie.
De préférence, la composition pharmaceutique selon la présente invention et au moins un composé pour le traitement de la même maladie ou d’une maladie différente sont administrés simultanément, séparément ou de manière étalée dans le temps pour traiter la même maladie ou une maladie différente.
Plus généralement, en ce qui concerne les maladies mitochondriales, un autre composé capable d’améliorer la fonction mitochondriale peut être administré simultanément ou à des moments différents. En cas d’administration simultanée, les deux composés peuvent être associés dans la même composition.
Des exemples de tels composés supplémentaires sont des suppléments naturels, tels que la L-carnitine, l’acide alpha-lipoïque (acide a-lipoïque [acide l,2-dithiolane-3- pentanoïque]), le coenzyme Q10 (CoQlO ou ubiquinone), la riboflavine (vitamine B2) réduite en nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), la L-arginine, éventuellement en combinaison.
Des exemples de composés utilisés par exemple dans le cas du syndrome de MELAS sont les précurseurs de l’oxyde nitrique (NO) tels que la L-arginine et la citrulline.
Selon un mode de réalisation particulier et au vu des exemples démontrant un potentiel effet de synergie, un composé selon l’invention, en particulier l’ebselen, est combiné à un des composés décrits dans les documents WO2020/254632 et W02022/018297, avantageusement choisi dans le groupe constitué de : le disulfirame, le diéthyldithocarbamate de sodium, l’alvérine et le citrate d’alvérine.
Les sujets qui peuvent bénéficier des compositions selon l’invention comprennent tous les patients ayant une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial, en particulier un dysfonctionnement mitochondrial associé à des déficiences du complexe I, diagnostiqués comme porteurs d’une telle maladie ou risquant de développer une telle maladie.
Un sujet à traiter avec une composition selon l’invention peut être sélectionné sur la base de différents critères. En ce qui concerne le dysfonctionnement mitochondrial, en particulier les déficiences du complexe I, plusieurs tests peuvent être effectués, par exemple :
- Au niveau biochimique : à partir d’une biopsie, notamment musculaire ou cutanée du sujet, on peut mesurer la consommation d’CL et/ou l’activité du complexe I mitochondrial. L’activité des autres complexes de la chaîne respiratoire peut également être évaluée pour déterminer si le dysfonctionnement mitochondrial est uniquement dû à des déficiences du complexe I ;
- Au niveau génétique : le séquençage de l’ADN, mitochondrial ou nucléaire, extrait du sang, des cellules ou d’un échantillon de biopsie, par exemple de la peau, permet d’identifier une ou plusieurs anomalies moléculaires, notamment des mutations ou des délétions/insertions dans les gènes notamment énumérés ci-dessus. Alternativement, l’expression ou l’activité des protéines correspondantes peut être évaluée par toute méthode connue de l’homme du métier (par exemple par western blot).
Un objectif de l’invention est de fournir un traitement sûr (non toxique). Un autre objectif est de fournir un traitement efficace qui permet de retarder, de ralentir ou de prévenir le développement de la maladie, et éventuellement d’améliorer le phénotype du patient qui peut être surveillé au niveau clinique comme indiqué ci-dessous.
Chez un sujet, la composition selon l’invention peut être utilisée :
- pour améliorer la fonction mitochondriale, notamment la respiration mitochondriale ;
- pour améliorer la croissance ;
- pour améliorer la fonction musculaire ;
- pour améliorer la vision et/ou l’audition ;
- pour améliorer la fonction respiratoire ;
- pour améliorer les fonctions cardiaque, hépatique ou rénale ;
- pour améliorer les fonctions cérébrales ;
- pour améliorer la fonction digestive ; et/ou
- pour prolonger la survie, plus généralement pour améliorer la qualité et l’espérance de vie.
Selon un aspect, l’invention concerne une méthode pour améliorer la fonction mitochondriale, en particulier l’activité du complexe I, avantageusement sans effets indésirables, comprenant l’administration à un sujet qui en a besoin d’une quantité thérapeutique d’une composition telle que décrite ci-dessus.
Avantageusement, lesdites améliorations sont observées jusqu'à 1 mois après le début du traitement, ou 3 mois ou 6 mois ou 9 mois, plus avantageusement jusqu'à 1 an après le début du traitement, 2 ans, 5 ans, 10 ans, ou même pendant toute la vie du sujet.
Dans un mode de réalisation, lesdites améliorations se traduisent par une réduction de la sévérité et/ou de la fréquence des symptômes et/ou une apparition retardée.
Une amélioration peut être évaluée sur la base de méthodes connues dans l’art, par exemple dans le cas de MELAS :
- évaluation du taux de lactate, en particulier du lactate ventriculaire cérébral, mesuré par exemple par spectroscopie par résonance magnétique (SRM) ;
- évaluation de la qualité et/ou de l’espérance de vie par des échelles cliniques, par exemple le score NMDAS (Newcastle Mitochondrial Disease Scale for Adults) ou le score SF-36 (Short Form Health Survey) ;
- évaluation des modifications du cerveau, par exemple à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ;
- évaluation des modifications de l’activité musculaire à l’aide de tests physiques tels que le test de marche de six minutes ; - évaluation des changements dans le lactate veineux et la concentration de GDF 15 ;
- évaluation des modifications de l’hétéroplasmie de l’ADNmt dans l’urine et le sang.
Les paramètres adéquats pour un cas donné peuvent être adaptés en fonction de la maladie.
Ainsi, le traitement revendiqué permet d’améliorer l’état clinique et les différents paramètres divulgués ci-dessus par rapport à un sujet non traité.
La mise en œuvre de la présente invention emploie, sauf indication contraire, des techniques conventionnelles de biologie moléculaire (y compris les techniques de recombinaison), de microbiologie, de biologie cellulaire, de biochimie et d’immunologie, connues de l’homme du métier. Ces techniques sont expliquées en détail dans la littérature, notamment dans « Molecular Cloning : A Laboratory Manual », quatrième édition (Sambrook, 2012); « Oligonucleotide Synthesis » (Gait, 1984); « Culture of Animal Cells » (Freshney, 2010); « Methods in Enzymology » « Handbook of Experimental Immunology » (Weir, 1997) ; « Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells » (Miller and Calos, 1987); « Short Protocols in Molecular Biology » (Ausubel, 2002); « Polymerase Chain Reaction : Principles, Applications and Troubleshooting » (Babar, 2011); « Current Protocols in Immunology » (Coligan, 2002). Des techniques particulièrement utiles pour des modes de réalisation particuliers seront discutées dans les sections qui suivent.
Les divulgations de chaque brevet, demande de brevet et publication cités dans la présente demande sont incorporées par référence dans leur intégralité.
Sans autre description, il est considéré que l’homme du métier peut, en utilisant la description et les exemples illustratifs suivants, produire et utiliser les composés de la présente invention et mettre en œuvre les méthodes revendiquées.
EXEMPLES DE REALISATION
L’invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l’appui des figures annexées. Ceux-ci n’ont toutefois aucune portée limitative. LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 :
A/ Effet de l’ebselen (EBS) sur la croissance respiratoire de plusieurs modèles de levure de maladies mitochondriales sur milieu solide non fermentescible, détecté par le test des halos
C/ Effet (détecté par le test des halos) de l’ebselen oxyde sur la croissance respiratoire de la souche de levure mutante tazl sur milieu solide non fermentescible, en comparaison avec l’ebselen (B) et le DMSO (D)
E/ Effet de différents analogues de l’ebselen (EBS) et de l’ethaselen sur la croissance respiratoire des souches de levure tazl, find, cox2 et A29G.
Figure 2: Effet de l’ebselen (EBS) sur la souche de levure mutante tazl
A/ Croissance respiratoire sur milieu liquide
B/ Accumulation de la protéine Cox2
Figure 3 : Effet de l’ebselen (EBS) sur la souche de levure mutante syml
A/ Croissance respiratoire sur milieu liquide
B/ Respiration cellulaire
C/ Accumulation de la protéine Cox2
Figure 4 : Effet de l’EBS sur la croissance thermosensible d’un modèle de Podospora anserina portant une mutation du complexe I mitochondrial (Pa nuo-51A357V) A/ Effet sur le halo de croissance
B/ Effet dose-dépendant sur la croissance
Figure 5 : Effet de l’EBS sur la prolifération et la viabilité des cellules d’un patient TAZ A/ croissance des fibroblastes de patients TAZ en présence ou en absence d’EBS (12,15 nM)
B/ croissance respiratoire à 96 heures des fibroblastes de patients TAZ en fonction de la concentration en EBS (de 150 pM à 234,9 pM), par rapport au contrôle négatif DMSO. C/ croissance respiratoire à 96 heures des fibroblastes de patients TAZ en fonction de la concentration en ethaselen (de 150 pM à 26,1 pM), par rapport au contrôle négatif DMSO.
D/ niveau d’ATP mitochondrial dans les fibroblastes de patients TAZ, incubées en présence d’ Antimycine A (100 pM), de Roténone (0,5 pM) ou d’oligomycine A (3 pM), et d’EBS, à la concentration de 12,15 nM.
E/ croissance respiratoire à 120 heures des myoblastes d’un patient TAZ en fonction de la concentration en EBS (de 50 pM à 234,9 pM).
Figure 6 : Effet de l’EBS sur la prolifération et la viabilité d’une lignée cellulaire HeLa, dans laquelle le gène FMC1 a été délété, en milieu glucose Ig/L (A) ou galactose (B) D.O. (U A) : densité optique en unités arbitraires Figure 7 : Effet de l’EBS sur la respiration mitochondriale de cellules de patients déficients pour le complexe I (CI) de la chaine respiratoire mitochondriale, porteuses de mutations touchant le gène nucléaire NDUFV1 du complexe
A/ taux de consommation d’oxygène (OCR)
B/ respiration basale (routine)
C/ respiration liée F ATP synthase (R-O)
D/ respiration maximale
Figure 8 : Effets de synergie entre l’ebselen (EBS), le disulfirame (DSF) et l’alvérine (ALV)
A/ dans un modèle de levure mutante taz
B/ dans un mutant Pa nuo-51A357V : vitesse de croissance en présence d’EBS et ALV seuls ou en combinaison, par rapport au contrôle négatif DMSO (VEH)
Figure 9 : Effet de la prise d’EBS sur le poids de souris KO dépourvues du gène TAZ (modèle murin du syndrome de Barth)
EXEMPLES 1 A 3 : MODELE SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Chacune des souches de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisées dans ces exemples contient différentes mutations spécifiques, modélisant des mutations humaines entraînant des maladies mitochondriales. A des degrés divers, toutes ces souches mutantes de levure présentent un défaut de croissance lorsqu'elles sont cultivées sur un milieu respiratoire tel que l’éthanol ou le glycérol à 28° C ou 36° C (selon la souche).
Souches de levure mutées :
- fmcl: MC6 MATa ade2- 1 his3 11,15 trpl 1 leu2- -3,112 ura3 1 fmcl::HIS3
[Ai ER OR] (Schwimmer, C. et al. (2005) J Biol Chem, 280, 30751-30759) pour le premier criblage
- !MBA MATa ade2-l his3-ll,15 trpl-1 leu2-3,112 ura3-l CAN1 arg8::HIS3 p+ atp6- L173R or RKY20 MATa ade2-l his3-ll,15 trpl-1 leu2-3,112 ura3-l CAN1 arg8::HIS3 p+ atp6-L173P (Rak, M. et al. (2007) J Biol Chem, 282, 34039-34047) pour le second criblage
- tazlA : cette souche a été construite en remplaçant le cadre de lecture ouvert de TAZ1 par celui de TRP1 dans la souche W303-1A (MATa ade2-l ura3-l hisSll, 15 trpl-1 leu2-3,112 canl-100) (de Taffin de Tilques, M. et al. (2017) Dis Model Mech, 10, 439- 450)
- shyl-G137R-, ce mutant a été construit dans la souche CW252 contenant le fond nucléaire de W303 et un génome mitochondrial sans intron. Ce gène est un homologue du gène humain SURF1
- symlA : cette souche de levure a été construite en remplaçant le cadre de lecture ouvert de SYM1 par celui de kanMXô dans la souche W303-1 A MATa ade2-l ura3-l his311, 15 trpl-1 leu2-3,112 canl-100). Ce gène est un homologue du gène humain MPV17
- cox2: MATa Iys2 leu-2-3,112 ura.3-52 his3AHindIII arg8::hisG cox2-22 (Bonnefoy, N. et al. (2001) Mol Cell Biol, 21, 2359-2372.
- A29G : La souche de levure utilisée dans ces expériences inclut le tRNA-Leu A29G avec un fond génétique MA Ta, his3 11, ade2 1, leu2 3, 112, ura3 1, trpl-D2, canl- 100, syn .
Maladies mitochondriales associées :
Le syndrome NARP
Le syndrome NARP (neuropathie, ataxie et rétinite pigmentaire) induit une combinaison variable de retard de développement, de rétinite pigmentaire, de démence, de crises d’épilepsie, d’ataxie, de faiblesse musculaire neurogène proximale et de neuropathie sensorielle. NARP est causé par diverses mutations du gène mitochondrial ATP6, qui code la sous-unité a de l’ATPase (complexe V du système OXPHOS). Les mutations sont souvent hétéroplasmiques (coexistence d’ADN mitochondrial (ADNmt) muté et sauvage (WT) dans les mêmes cellules). Selon le type de mutation et le pourcentage d’ADNmt muté (degré d’hétéroplasmie), les conséquences cliniques sont plus ou moins graves. Les mutations ATP6 m.8993T>C/G sont parmi les plus fréquentes chez les patients NARP et entraînent des formes sévères du syndrome NARP. FMC1 est un gène nucléaire qui code une protéine requise à haute température (35-37°C) pour l’assemblage du secteur Fl de l’ATP synthase, mimant ainsi l’hétéroplasmie observée chez les patients NARP. En effet, lorsqu'elles sont cultivées à une température restrictive (35-37°C), les mitochondries du mutant fmclA contiennent beaucoup moins de complexes ATP synthase assemblés qu’une souche sauvage (WT), mais ceux qui s’assemblent sont pleinement fonctionnels. Cette hétérogénéité se retrouve également chez les patients présentant des niveaux réduits d’ ATP synthase dus à des mutations hétéroplasmiques ATP6. Par conséquent, le mutant fmclA constitue un modèle approprié de ces troubles (Lefebvre-Legendre, L. et al. (2001) J Biol Chem, 276, 6789-6796). Diverses souches NARP de levure, portant des mutations homoplasmiques équivalentes aux mutations T8993G et T8993C (Rak, M. et al., J Biol Chem. 2007 282(47):34039-47), ont également été testées.
TAZ
Le gène TAZ code la tafazzine, une transacylase mitochondriale qui catalyse le remodelage de la cardiolipine immature en sa composition mature contenant une prédominance de fragments tétralinoléoyles. Les mutations de TAZ entraînent le syndrome de Barth, une maladie liée au chromosome X classiquement caractérisée par une cardiomyopathie dilatée (CMD) avec une fibroélastose endocardique (EFE), une myopathie squelettique à prédominance proximale, un retard de croissance, une neutropénie et une acidurie organique, notamment un excès d’acide 3- méthylglutaconique (Barth, P. G. et al. (1996) J Inherit Metab Dis, 19, 157-160).
COX2 ET SURF1
Les gènes COX2 et SURF1 (gène SHY1 chez la levure) codent respectivement une sous- unité et un facteur d’assemblage du complexe IV mitochondrial. Les mutations sont associées au syndrome de Leigh, un trouble neurodégénératif progressif et sévère qui se manifeste dans les premiers mois ou les premières années de la vie et peut entraîner un décès précoce. Les personnes affectées présentent généralement un retard global de développement ou une régression du développement, une hypotonie, une ataxie, une dystonie et des anomalies ophtalmologiques, comme un nystagmus ou une atrophie optique (Barrientos, A. et al. (2002) EMBO J, 21, 43-52).
MPV17
MPV17 (gène SYM1 chez la levure) code une protéine de la membrane interne mitochondriale de fonction inconnue. Les mutations QMPV17 entraînent :
- Le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial-6, une maladie autosomique récessive caractérisée par l’apparition infantile d’une insuffisance hépatique progressive, conduisant souvent au décès dans la première année de vie. Ceux qui survivent développent une atteinte neurologique progressive, notamment une ataxie, une hypotonie, une dystonie et une régression psychomotrice (Spinazzola, A. et al. (2006) Nat Genet, 38, 570-575).
- Neuropathie de type Navajo : Les manifestations comprennent principalement une neuropathie périphérique sensitivo-motrice sévère avec des atteintes hépatique et cérébrale a type de leucoencéphalopathie et des ulcérations coméennes. (Karadimas, C.L. et al. (2006) Am J Hum Genet, 79, 544-548).
- le syndrome MELAS : La mutation A30(29)G chez la levure A29G mime la mutation humaine m.3260A>G du gène tRNALeu (UUR) responsable du syndrome MELAS.
EXEMPLE 1 : Effet de l’ebselen (EBS) et de ses dérivés sur des souches de levures mutantes cultivées sur un milieu non fermentescible (respiratoire)
MATERIEL ET METHODES
Comme décrit précédemment (WO2020/254632), les différentes souches mutantes de levure ont été étalées sur des milieux respiratoires solides à base de gélose (contenant du glycérol ou de l’éthanol comme unique source carbonée) et exposées à des filtres sur lesquels a été déposé le composé testé, notamment l’ebselen (EBS). Les boîtes ont ensuite été incubées à la température indiquée (qui peut être de 28 °C ou 36 °C selon la souche utilisée).
Plus précisément, 0,125 OD de cellules mutantes en croissance exponentielle ont été étalées de manière homogène avec des billes de verre stériles sur une boîte de Petri carrée (12 cm x 12cm) contenant un milieu respiratoire solide (YPA Ethanol, 1% extrait de levure, 0.5% Bacto Peptone, 40 mg/L Adénine, 2% Ethanol pour syml et tazl ou YPA Glycérol 2% pour cox2, find, atp6, shyl et A29G). De petits filtres stériles ont ensuite été placés sur la surface de la gélose et des concentrations croissantes des composés à tester ont été ajoutées aux filtres aux quantités indiquées (30 et 90 nmoles). Sur chaque boîte, le DMSO (tampon) est utilisé comme contrôle négatif (filtre supérieur gauche). Les boîtes ont ensuite été incubées à 28°C (pour shyl ou 36°C (pour cox2, syml, find, atp6 tazl etA29G) pendant 4 à 5 jours, puis photographiées. L’amélioration de la croissance a été évaluée après plusieurs jours d’incubation par l’apparition d’un halo de croissance améliorée autour du filtre où l’actif a été déposé.
RESULTATS
Comme il ressort de la Figure IA, l’EBS est actif sur toutes les souches mutantes de levure testées, de manière dose-dépendante.
Pour le mutant tazl, la figure IC montre que l’ebselen oxyde (100 nmoles) aune activité comparable à l’ebselen (100 nmoles) (Figure IB), alors qu’aucun halo n’est observé en présence de DMSO (Figure 1D).
Plus généralement, différents analogues de l'EBS et de l’ethaselen ont été évalués sur différents mutants (tazl, find, cox2 et A29G1). Comme le révèle la figure 1E, tous les analogues testés sont actifs sur les souches testées.
EXEMPLE 2 : Effet de l’ebselen (EBS) sur la souche de levure mutante tazl
MATERIEL ET METHODES
Croissance respiratoire en culture liquide :
Afin de déterminer la concentration optimale d’EBS conduisant à la suppression du défaut de croissance respiratoire de la souche de levure mutante, des cellules en croissance exponentielle ont été inoculées dans des milieux frais non fermentescibles YPA Ethanol supplémentés, ou non, avec des concentrations croissantes d’EBS. La croissance des cellules dans le milieu respiratoire liquide a été suivie avec le système bioscreen sur une période de 80 h pendant laquelle les densités cellulaires (ODôOOnm) ont été prises toutes les 20 minutes. Respiration cellulaire :
L’intensité respiratoire correspond à la quantité d’oxygène consommée par rapport au temps et au nombre de cellules. Elle reflète le métabolisme oxydatif mitochondrial des cellules. La consommation d’oxygène est mesurée à l’aide d’un système oxygraphique OROBOROS. Les cellules sont cultivées pendant 7-8 générations à 28°C pendant 24 ou 48 h dans un milieu YPA Ethanol complémenté par du DMSO ou de l’EBS (IpM). 107 cellules sont introduites dans l’oxygraphe. La consommation d’CL est enregistrée avec ou sans CCCP (taux maximal de consommation d’oxygène). Le taux de consommation d’CL est calculé sur la base de la partie linéaire de la consommation d’O2.
Accumulation de la protéine Cox2 :
Les extraits protéiques totaux de la souche de levure mutante ont été analysés par SDS- PAGE (50 pg par puits) en utilisant des anticorps contre les protéines indiquées. Les gels présentés sont représentatifs d’au moins 3 expériences. Les niveaux protéiques ont été quantifiés à l’aide du logiciel ImageJ. Les niveaux de Cox2 sont normalisés par rapport à Adel3p et exprimés par rapport à la souche sauvage (WT).
RESULTATS
Comme illustré à la Figure 2 A, l’EBS est toxique à partir de 27 pM et active entre 1 nM et 3 pM, avec une concentration optimale de 1 pM sur la souche mutante tazl.
En outre et comme illustré à la Figure 2B, l’EBS IpM augmente l’accumulation de la protéine Cox2, une sous-unité du complexe IV de la chaine respiratoire mitochondriale, dans la souche mutante tazl.
EXEMPLE 3 : Effet de l’ebselen (EBS) sur la souche de levure mutante syml
Les expériences décrites à l’exemple 2 ont été mises en œuvre sur la souche de levure mutante syml.
Les résultats sont montrés à la Figure 3.
Les données sont les moyennes ± SEM d’au moins trois expériences indépendantes. La signification des variations entre les échantillons et les contrôles a été estimée à l’aide du test multifactoriel Anova : Tukey.
Comme pour la souche mutante tazl, à la concentration optimale d’EBS (1 pM), la respiration cellulaire et le niveau de Cox2 sont augmentés par rapport aux cellules non traitées. EXEMPLE 4 : Modèle PODOSPORA ANSERINA
La levure Saccharomyces cerevisiae, utilisée dans les exemples 1 à 3, ne possède pas le complexe I de la chaine respiratoire mitochondriale. L’EBS a donc été testé sur le modèle de champignon filamenteux aérobie strict Podospora anserina.
La souche utilisée dans les exemples qui suivent contient une mutation spécifique modélisant une mutation humaine dans la sous-unité NDUF V 1 du complexe I entraînant une maladie mitochondriale. Cette souche présente un défaut de croissance à une température non permissive supérieure à 31,5°C.
Souche P. anserina mutée : nuo-51 A357V: La mutation A357V a été introduite dans le gène nuo-51 de la souche sauvage S en association avec une cassette de résistance à la nourseothricine (NatR). Afin de mimer au mieux la maladie humaine NDUFV1 A341 V, les gènes NDI-1 etAOX ont été inactivés (El-Khoury et al., (2008) Curr Genet. 53:249-58)
Génotype de la souche: S, mat~, nuo-51 A35TV t \ndi-l, \aox, Naf, Hygrc
MATERIEL ET METHODES
Le mutant thermosensible Pa nuo-51A357V a été étalé de manière homogène avec des billes de verre stériles sur une boîte de Petri carrée contenant un milieu minimal solide (M2). De petits filtres stériles ont ensuite été placés sur la surface de la gélose et 20 nmoles d’EBS ont été ajoutées. Le DMSO (le véhicule du composé) est utilisé comme contrôle négatif. La plaque a ensuite été incubée à la température non-permissive de 33°C pendant 4-5 jours, puis photographiée.
Le mutant Pa nuo-51A357V a ensuite été cultivé à 32°C où sa croissance est réduite par rapport à la souche sauvage (WT). L’effet de l’EBS sur la vitesse de croissance du mutant a été déterminé sur un milieu minimal supplémenté ou non avec des concentrations croissantes d’EBS et estimé en centimètres de croissance par jour (cm/jour).
RESULTATS
La figure 4 A montre un effet positif de l’EBS sur la croissance du mutant. Plus précisément, entre 0,003 et 0,03pM, l’EBS montre une amélioration significative de la croissance du mutant Pa nuo-51A357V (Figure 4B). EXEMPLE 5 : Modèle de cellules humaines
MATERIEL ET METHODES
Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le test statistique ANOVA à deux facteurs mixtes et en appliquant la correction des tests multiples de Bonferroni, ou avec le logiciel graphpad prism 9.5.1.
Le nombre d’étoiles indique la valeur de la p-value < 0.05 (*), < 0.001 (**), < 0.0001 (***), < 0.0001 (****).
Fibroblastes et myoblastes de patients TAZ :
L’EBS a été testé pour son effet sur la croissance respiratoire de fibroblastes de patients TAZ, en l’occurrence de fibroblastes issus de huit patients différents porteurs de mutations dans le gène TAZ (atteints du syndrome de Barth). Les données représentent le pourcentage de croissance par rapport à T0.
Le taux de prolifération a été mesuré dans un milieu à faible teneur en glucose (Ig/L ; pour forcer les cellules à utiliser le système OXPHOS plutôt que la glycolyse) dans des plaques de microtitration à 384 puits (1200 cellules/puits à T0) en utilisant le protocole de coloration à la Sulforhodamine B (SRB) à 24, 48, 72 ou 96 heures après le placement des cellules avec ou sans 12,15 nM d’EBS.
Le taux de prolifération a ensuite été mesuré dans les mêmes conditions expérimentales mais avec des concentrations variables en EBS : Les cellules ont été analysées 96 heures après le traitement avec des doses croissantes d’EBS (de 150 pM à 234,9 pM). Les données sont la moyenne de 8 patients ou 3 contrôles en triplicat, dans 4 expériences indépendantes.
Le taux de prolifération a également été mesuré dans les mêmes conditions expérimentales mais avec des concentrations variables en ethaselen : Les cellules ont été analysées 96 heures après le traitement avec des doses croissantes d’ ethaselen (de 150 pM à 26, 1 pM). Les barres représentent la moyenne de 4 réplicats issus de 2 patients dans 3 expériences indépendantes.
Les niveaux d’ATP mitochondriaux dans les fibroblastes des patient TAZ ont été évalués à l’aide du kit Promega CellTiter-Glo. Les cellules en plaques de 96 puits (5000/puits) ont été traitées ou non avec 12,15 nM d’EBS pendant 96 heures puis ont été incubées en présence d’Antimycine A (100 pM), de Roténone (0,5 pM) ou d’oligomycine A (3 pM).
L’EBS a également été testé pour sa capacité à restaurer la croissance cellulaire d’une lignée de myoblastes de patients portant des mutations dans le gène TAZ. Le taux de prolifération a été mesuré dans un milieu à faible teneur en glucose dans des plaques de microtitration à 384 puits (1200 cellules/puits à T0) en utilisant le protocole de coloration à la Sulforhodamine B (SRB) à 48, 72, 96 et 120 heures après la mise en place des cellules. Le graphique représente le taux de croissance à 120 heures, correspondant à la moyenne de 3 expériences indépendantes.
Lignée cellulaire KO (« knock-out ») FMC1 :
La lignée cellulaire HeLa KO FMC1, mimant des maladies humaines liées à une déficience de l’ATP synthase (syndromes NARP, MILS), a été générée par la méthode de CRISPR-Cas9. La lignée cellulaire HeLa KO FMC1 est cultivée dans du milieu DMEM contenant 4,5 g/L de glucose et 110 mg/1 de pyruvate et 50 mg/1 d'uridine.
Le taux de prolifération de cette lignée cellulaire HeLa dans laquelle le gène FMC1 a été délété a été mesuré dans un milieu contenant soit une faible teneur en glucose ( 1 g/L), ou du galactose dans des microplaques de 384 puits (4500 cellules/cm2 à T0) en utilisant le protocole de coloration à la Sulforhodamine B (SRB) 96 heures après l'ensemencement et le traitement des cellules. Les barres représentent la moyenne de 8 réplicats dans 3 expériences indépendantes. Les données représentent le pourcentage de croissance par rapport à T0.
Lignée cellulaire KO (« knock-out ») CI (complexe I) :
L’EBS a également été testé pour sa capacité à restaurer la respiration mitochondriale de lignées de fibroblastes de patients portant des mutations dans le gène nucléaire NDUFV1 du complexe I mitochondrial. Les lignées humaines NDUFV1 mimant des maladies humaines liées à un déficit mitochondrial du complexe I (syndrome de Leigh) sont porteuses de mutations génétiques affectant le gène NDUFV1. Ces lignées cellulaires sont cultivées dans un milieu de culture DMEM contenant 1,0 g/L de glucose et ImM sodium pyruvate et 50pg/mL uridine (Sigma Aldrich, Lyon, France).
La respiration a été mesurée à l’aide d’un analyseur métabolique de flux extracellulaire XF96 Seahorse en plaques 96 puits selon le protocole du fabricant (Agilent Technologies). Les cellules déficientes ont été exposées durant 48h à différentes concentrations avec une courbe dose réponse associant une gamme de concentrations de 25 nM à 10 pM. En (A) est représenté le taux de consommation d’oxygène, en (B) la respiration basale, en (C) la respiration liée à l’ATP synthase, et en (D) la respiration maximale. Les étoiles représentent la moyenne de 4 réplicats indépendants.
Les fibroblastes primaires en phase exponentielle de croissance ont été détachés par l'ajout de 2 ml de trypsine à 0,05%. Ces fibroblastes ont été utilisés pour ensemencer des plaques XF96 (30 x io3 cellules/puits) gardées en culture pendant 4 heures. Les cellules ont ensuite été incubées dans du DMEM sans bicarbonate (Sigma-Aldrich) supplémenté avec 5,5 mM de glucose, 2 mM de L-glutamine, dans un incubateur sans CO2 pendant 1 h. La mesure du taux de consommation d'oxygène (OCR) a été enregistré dans des conditions basales pour évaluer l'activité respiratoire mitochondriale puis les cellules ont été traitées séquentiellement avec 4 pg/mL d'oligomycine et 1,5 pM de cyanure de carbonyle p-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) (Sigma- Aldrich). L’OCR basale, la respiration liée à l'ATP, la capacité respiratoire maximale et la respiration par fuite de protons ont été déterminées. La respiration non mitochondriale (OCR après traitement avec 2 pg/mL d'antimycine A), a été soustraite de toutes les mesures d’OCR. La respiration liée à la production ATP (R-O) a été estimée à partir de la différence entre les taux de respiration basale et inhibée par l'oligomycine, et la respiration par fuite de protons a été obtenue en soustrayant la respiration non-mitochondriale de la ROC mesurée après traitement à l'oligomycine. La capacité respiratoire maximale a été déterminée comme le taux de respiration en présence du découplant FCCP. Les résultats ont été normalisés en fonction du nombre de cellules.
RESULTATS
La figure 5A montre que l’EBS à 12,15 nM améliore la croissance respiratoire de fibroblastes de patients TAZ. A cette concentration, l’EBS est efficace à partir de 24 heures et l’amélioration de la prolifération cellulaire est plus prononcée aux trois autres temps de prélèvement (48, 72 et 96 heures).
La figure 5B montre qu’à 96 heures, l’EBS améliore la croissance respiratoire des fibroblastes de patients TAZ dans une large gamme de concentrations : L’EBS a des effets bénéfiques de 1,35 nM à 8,7 pM avec une toxicité au-delà de 234,9 pM, par rapport au contrôle négatif DMSO.
La figure 5C montre qu’à 96 heures, l’ethasalen améliore également la prolifération des cellules de patients atteints du syndrome de Barth dans une large gamme de concentrations allant d’environ 1 nM à 3 pM.
La figure 5D montre que l’EBS, à la concentration de 12,15 nM, augmente la production d’ ATP mitochondrial dans les fibroblastes de patients TAZ.
L’effet de l’EBS sur la restauration de la croissance d’une lignée de myoblastes de patients portant des mutations dans le gène TAZ est illustré à la Figure 5E : elle montre que l’EBS de 450 pM à 8,7 pM a des effets bénéfiques en comparaison avec le contrôle négatif DMSO, avec une toxicité au-delà de 78,3 pM.
La figure 6 montre que l’ebselen améliore la prolifération des cellules modèle d’une déficience en ATP synthase (syndromes NARP, MILS) et ce de façon dose-dépendante et dans une large gamme de concentrations (pM au pM). La figure 7 révèle que l’ebselen améliore la respiration cellulaire des cellules modèles des pathologies mitochondriales liées au complexe I de 25 nM à 100 nM et devient toxique au-delà de 10 pM.
EXEMPLE 6 : Synergies entre différents composés
Le disulfirame (DSF) et l’alvérine (ALV) ont été rapportés dans les documents WO2020/254632 et W02022/018297, respectivement, comme utiles dans la prise en charge des pathologies associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Par conséquent, un éventuel effet synergique entre l’ebselen (EBS) et ces composés a été testé dans différents modèles :
- dans un modèle de levure mutante taz
- dans un mutant du complexe I de Podospora anserina (Pa nuo-51 S5 V)
- dans un modèle cellulaire mammifère mutant taz.
MATERIEL ET METHODES
Levure taz :
Comme dans la Figure 1, la souche de levure mutante tazl a été étalée sur un milieu solide respiratoire contenant de l’éthanol comme source carbonée. La souche a ensuite été exposée à des filtres sur lesquels ont été déposés soit le disulfirame (DSF 5 nmoles), l’ebselen (EBS 30 nmoles) ou l’alvérine (ALV 30 nmoles), seuls ou en association par deux ou trois. Les boîtes ont ensuite été incubées à la température à 36°C puis scannées après 5 jours d’incubation. Le DMSO (solvant) est utilisé comme contrôle négatif (filtre supérieur gauche).
Pa nuo-51A357V :
Les taux de croissance à 32°C, estimés en centimètres de croissance par jour, ont été déterminés dans un milieu minimal supplémenté avec de l’EBS (0.003 pM, 0.01 pM ou 0.03 pM), de l’ALV (I pM) ou une combinaison de concentrations des deux, en comparaison avec une même concentration de DMSO (VEH) par boîte.
Cellule mammifère taz :
L’EBS, l’ALV et le DSF ont été testés pour leur effet synergique sur la croissance respiratoire de myoblastes de patients TAZ porteurs de mutations dans le gène TAZ. Le taux de prolifération a été mesuré dans un milieu à faible teneur en glucose (pour encourager les cellules à utiliser le système OXPHOS plutôt que la glycolyse) dans des plaques de microtitration à 384 puits (1200 cellules/puits à T0) en utilisant le protocole de coloration à la Sulforhodamine B (SRB) à 120 heures après l’ensemencement des cellules avec ou sans les différents composés seuls ou en association aux concentrations indiquées. RESULTATS
La figure 8A montre que la combinaison des 3 molécules EBS, ALV et DSF augmente le halo de croissance autour du filtre où elles ont été déposées en association, suggérant un effet synergique de ces 3 candidats médicaments sur la croissance respiratoire du modèle de levure déficient en tafazzine.
La figure 8B montre que la combinaison 1 pM ALV + 0.003 pM EBS augmente de façon significative la croissance du mutant Pa nuo-51A357V, comparé à IpM ALV seul, suggérant un effet synergique sur la croissance de ce mutant du complexe I.
EXEMPLE 7 : Modèle murin du syndrome de Barth
MATERIEL ET METHODES
Les souris dépourvues du gène TAZ (KO, modèle du syndrome de Barth) ou sauvage (WT) ont été gavées 2 fois par jour avec 10 mg/kg d’Ebselen à partir de l’âge de 51 jours. Le poids a été suivi régulièrement pendant 1 mois de traitement.
RESULTATS
Comme le montre la figure 9, les souris KO traitées avec EBS semblent prendre plus de poids que les souris traitées avec le solvant.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant un composé ayant un groupement de formule : pour utilisation dans le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement mitochondrial.
2. Composition pour son utilisation selon la revendication 1, selon laquelle le composé est de formule : dans laquelle
E est O, S, SO, SO2, Se ou SeO chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br.
3. Composition pour son utilisation selon la revendication 2, selon laquelle le composé est l’ethaselen ou un de ses dérivés, par exemple le MAD423.
4. Composition pour son utilisation selon la revendication 1, selon laquelle le composé est de formule : dans laquelle
E est O, S, SO, SO2, Se ou SeO chacun des anneaux phényliques A et B est substitué éventuellement par un ou plusieurs substituants, dans lequel chaque substituant est sélectionné de manière indépendante parmi :
- un halogène, qui est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br
- un alcool
- une amine
- un nitro
- un alkyle C1-C4, tel qu’un alkyle C1-C2 ou un alkyle Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br ; et
- un alkoxy C1-C4, tel qu’un alkoxy C1-C2 ou un alkoxy Cl, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d’halogène, dont chacun est de préférence sélectionné parmi F, Cl et Br.
5. Composition pour son utilisation selon la revendication 4, selon laquelle le composé est :
- le 2-phényl-l, 2-benzisosélenazol-3(2H)-one ou ebselen de formule : OU
- le l-oxyde-2-phényl-l, 2-benzisosélenazol-3(2H)-one ou ebselen oxyde ou ebselen sélénoxyde de formule :
6. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, selon laquelle la maladie est une maladie de la chaine respiratoire mitochondriale, avantageusement associée à une déficience du complexe I.
7. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, selon laquelle la maladie est une maladie génétique.
8. Composition pour son utilisation selon la revendication 7, selon laquelle la maladie génétique comprend au moins une mutation dans au moins un des gènes suivants : MTND1 (ou ND1 MTND2 (ou ND2 MTND3 (ou ND3 MTND4 (ou ND4), MTND5 (ou ND5), MTND6 (ou ND6), MTND4L (ou ND4E), NDUFA1, NDUFA2, NDUFA3, NDUFA4, NDUFA5, NDUFA6, NDUFA7, NDUFA8, NDUFA9, NDUFA10, NDUFA11, NDUFA12, NDUFA13, NDUFAB1, NDUFB1, NDUFB2, NDUFB3, NDUFB4, NDUFB5, NDUFB6, NDUFB7, NDUFB8, NDUFB9, NDUFB10, NDUFB11, NDUFC1, NDUFC2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS4, NDUFS5, NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NDUFV3, NDUFAF1, NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, NDUFAF5, NDUFAF6, NDUFAF7, NDUFAF8, NUBPL, ACAD9, TMEM70, TMEM126B, FOXRED1, ECSIT, AIF, TIMMDC1.
9. Composition pour son utilisation selon la revendication 7, selon laquelle la maladie génétique comprend au moins une mutation dans au moins un des gènes suivants : MTTL1, ATP6, FMC1, 1AZ, C0X2, SURF1, POI.G, MPV17, OPA1, COA6, ND6 et BCS1L, avantageusement A TP6, FMC1, PAZ, C0X2, SURF1 ou MPV17.
10. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, selon laquelle la maladie est choisie dans le groupe constitué par : le syndrome MELAS, la myopathie et cardiomyopathie héritées de la mère, le syndrome NARP ou MILS, le syndrome de Leigh, la neuropathie optique héréditaire de Leber (NHOL), le syndrome de Barth, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial notamment 4A (type Alpers) et 4B (type MNGIE), le syndrome d’ataxie récessive mitochondriale, la neuropathie ataxique sensorielle, la dysarthrie et l’ophtalmoplégie, l’ataxie spinocérébelleuse avec épilepsie, l’ophtalmoplégie externe progressive, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial-6, la neuropathie de type Navajo, le syndrome de Behr, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial 14, la cardioencéphalomyopathie infantile due à un déficit en cytochrome c oxydase (mutations COA6), la déficience nucléaire du complexe III mitochondrial de type 1, le syndrome de GRACILE et le syndrome de Bjomstad.
11. Composition pour son utilisation selon la revendication 10, selon laquelle la maladie est choisie dans le groupe constitué par : Le syndrome de Leigh, la neuropathie optique héréditaire de Leber (NHOL), le syndrome MELAS, le syndrome NARP ou MILS, le syndrome de Barth, le syndrome de déplétion de l’ADN mitochondrial et la neuropathie type Navajo.
12. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, selon laquelle la maladie est choisie dans le groupe constitué par :
- les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique (maladie de Lou Gehrig) et l’ataxie de Friedreich ;
- les maladies cardiovasculaires, telles que l’athérosclérose et d’autres affections cardiaques et vasculaires ;
- le diabète et le syndrome métabolique ;
- les maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux systémique et le diabète de type 1 ;
- les maladies neurocomportementales et psychiatriques, telles que les troubles du spectre autistique, la schizophrénie, les troubles bipolaires et de l’humeur ;
- les troubles gastro-intestinaux ;
- les maladies de la fatigue, telles que le syndrome de fatigue chronique et les maladies de la guerre du Golfe ; les maladies musculo-squelettiques, telles que la fibromyalgie et l’hypertrophie/atrophie des muscles squelettiques ;
- les dystrophies musculaires,
- le cancer ; et
- les infections chroniques.
13. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle la composition comprend un autre composé pour traiter la même maladie, avantageusement de l’alvérine et/ou du disulfirame.
14. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle la composition est administrée par voie orale.
15. Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle la composition se présente sous une forme solide telle qu’un comprimé, encore plus avantageusement comprenant 200 mg d’ebselen.
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