EP4543904A1 - Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci - Google Patents

Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci

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Publication number
EP4543904A1
EP4543904A1 EP23744215.7A EP23744215A EP4543904A1 EP 4543904 A1 EP4543904 A1 EP 4543904A1 EP 23744215 A EP23744215 A EP 23744215A EP 4543904 A1 EP4543904 A1 EP 4543904A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
bacteria
arar
xylr
xylose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23744215.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alexandre DELAROUZEE
Nicolas Lopes Ferreira
François WASELS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP4543904A1 publication Critical patent/EP4543904A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C12P7/28—Acetone-containing products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the genetic modification of bacteria of the genus Clostridium, typically solventogenic bacteria of the genus Clostridium. It further relates to methods, tools and kits allowing the elimination or modification of coding sequence(s), or controlling the transcription of coding sequence(s), the XylR and/or AraR transcriptional repressors, the genetically modified bacteria obtained and their uses, in particular for simultaneously fermenting at least one hexose and one pentose or the carbon elements of a substrate comprising at least two carbon elements chosen from glucose, arabinose, xylose, mannose and galactose.
  • Clostridium contains Gram-positive, strictly anaerobic, spore-forming bacteria belonging to the phylum Bacillota. Clostridia are a group of importance to the scientific community for several reasons. The first is that a certain number of serious diseases (e.g. tetanus, botulism) are due to infections of pathogenic members of this family (John & Wood, 1986). The second is the possibility of using so-called acidogenic or solventogenic strains in biotechnology. These non-pathogenic Clostridia naturally have the capacity to transform a large variety of sugars to produce chemical species of interest, and more particularly acetone, butanol, and ethanol (John & Wood, 1986) during a so-called ABE fermentation. The bacterium Clostridium acetobutylicum is today considered a model representative of the solventogenic Clostridium.
  • Solventogenic Clostridium are capable of assimilating a wide variety of carbon sources, which is an asset for ABE fermentation processes (Keis, Shaheen and Jones 2001). This versatility allows them in theory to proliferate efficiently on wide ranges of substrates, in particular on co-products from agro-industry (Qureshi et al. 2008; Ezeji, Qureshi and Blaschek 2007; Ezeji and Blaschek 2008; Qureshi et al. al. 2006). Thanks to the rise of industrial fermentation processes, and more recently green chemistry, the incorporation of plant biomass into industrial processes is becoming more widespread. However, a categorization of plant substrates quickly became widespread throughout the industry, putting two “generations” of industrial substrates into opposition, on the basis of environmental and human considerations.
  • GI substrates bring together all carbon sources from plant reserve organs.
  • GI substrates can in particular come from corn, wheat, but also sugar cane or beet. Mainly made up of sucrose and starch, their fermentation on an industrial scale is today very efficient. On the other hand, the use of these substrates is controversial, since they require the use of arable land and foodstuffs exploited by the agri-food industry.
  • second generation substrates bring together all substrates from plant structural organs, or from agro-industry co-products. In doing so, this approach helps reduce tensions between the energy and food sectors.
  • 2G second generation substrates
  • lignocellulose a complex and recalcitrant polymeric matrix. Its degradation into fermentable sugars requires more or less expensive pretreatments, which can generate microbial growth inhibitors.
  • hemicellulose hydrolysates contain various carbon sources. Among these we find mainly xylose and glucose, accompanied by a mixture of minority sugars such as galactose, mannose and Arabinose. All of these sugars are fermentable by solventogenic Clostridium species.
  • Clostridium cellulovorans DSM 743B is described by Wen et al. (2020) as a strain capable of being manipulated in order to optimize the production of //-butanol from lignocellulose, and WO 2013/159710 describes a modified C. beijerinckii bacterium having an increased consumption capacity of xylose and/or arabinose.
  • CR Catabolic Repression
  • a biological process known as Catabolic Repression (CR) prevents the optimal and simultaneous use of all these carbon sources.
  • catabolic repression prevents the efficient metabolization of xylose contained in lignocellulose hydrolysates.
  • the bacterium C. acetobutylicum in particular is sensitive to this repression phenomenon (Qureshi et al. 2006; Grimmler et al. 2010).
  • Hu et al. (2011) teach that inactivation of the xylR gene (CA_C2613) within the ATCC 824 strain of C. acetobutylicum results in faster use of xylose which, however, does not impact the total quantity of fermented xylose.
  • WO 2013/159710 advises those skilled in the art against the inactivation of xylR (CAC3673) in C. acetobutylicum.
  • bacteria of the genus Clostridium typically solventogenic bacteria, capable of consuming, simultaneously, different carbon sources, in particular different sugars. They describe in particular, for the first time, a bacterium C. acetobutylicum capable of consuming, simultaneously, glucose and a pentose, preferably glucose and arabinose.
  • the inventors describe in particular a genetically modified bacterium, belonging to the genus Clostridium, in particular a solventogenic bacterium, not expressing the transcriptional repressors XylR and/or AraR or expressing non-functional versions thereof.
  • This genetically modified bacterium is a bacterium which does not express the products of the xylR and/or araR genes, in particular the products genes CA_C2613, CA_C3673 and/or CA_C1340, or expressing non-functional versions of said products.
  • a particular bacterium described by the inventors in the present text does not express the transcriptional repressor XylR or expresses a non-functional version thereof.
  • This genetically modified bacterium is a bacterium not expressing the products of the xylR genes, in particular the products of the CA_C2613 and/or CA_C3673 genes, or expressing non-functional versions of said products.
  • Another particular bacterium described by the inventors in the present text does not express the transcriptional repressor AraR or expresses a non-functional version thereof.
  • This genetically modified bacterium is a bacterium not expressing the araR gene product, in particular the CA_C1340 gene product, or expressing a non-functional version of said product.
  • Another preferred genetically modified bacterium according to the invention is a bacterium not expressing the transcriptional repressors XylR and AraR or expressing non-functional versions thereof.
  • This genetically modified bacterium is a bacterium not expressing the products of the xylR and araR genes, in particular the products of the CA_C2613, CA_C3673 and CA_C1340 genes, or expressing non-functional versions of said products.
  • Particularly preferred genetically modified bacteria according to the invention correspond to the strain identified in the present description as IFP 968 as registered on June 13, 2022 under the deposit number LMG P-32703 with the BCCM-LMG collection (also identified in this text as ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673 or araR AxylRl xylR2), and to the strain identified in this description as IFP 967 as registered on June 13, 2022 under the deposit number LMG P-32702 with the BCCM-LMG collection (also identified in this text as ACA_C1340 or t iraR), usable to prepare a strain equivalent to strain IFP 968.
  • the invention also targets any bacterium derived, clone, mutant or genetically modified version of these.
  • the inventors further describe a process for producing a recombinant bacteria as described in the present text, in particular a process comprising the deletion or inactivation of the xylR and/or araR genes so as to prevent or reduce the expression of functional XylR and/or AraR proteins, as well as the genetically modified bacteria capable of being obtained by this process, of which the bacteria IFP 967 and IFP 968 are examples.
  • a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium characterized in that it does not express the product of the xylR or araR gene, or expresses a non-functional version of the xylR or araR gene, such as strain IFP 967, to prepare a genetically modified bacterium according to the invention not expressing the products of the xylR and araR genes, or expressing non-functional versions thereof.
  • the invention also relates to a fermentation process involving the use of a genetically modified bacteria as described in the present text.
  • kits in particular a kit for transforming and preferably genetically modifying a bacterium belonging to the genus Clostridium, and a kit for producing a solvent, a sugar or a biosourced molecule using a bacterium belonging to the genus Clostridium, said kit comprising i) a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium according to the invention and ii) a medium, in particular a rich culture medium, preferably an RCM type culture medium, more preferably a culture medium of the type GAPES, even more preferably a CGM type culture medium, containing at least glucose and one pentose, preferably glucose and arabinose and/or xylose.
  • a medium in particular a rich culture medium, preferably an RCM type culture medium, more preferably a culture medium of the type GAPES, even more preferably a CGM type culture medium, containing at least glucose and one pentose, preferably glucose and arabinose and/or xylose.
  • Clostridium genus Although used in industry for more than a century, knowledge of bacteria belonging to the Clostridium genus, particularly solventogenic bacteria, remains very limited. A major constraint encountered by manufacturers concerns their inability to simultaneously use several distinct sources of carbon and therefore to efficiently metabolize different types of substrates, in particular different types of sugars.
  • a “raw biomass”, also called “native biomass”, preferred in the context of the invention is a plant biomass, in particular a lignocellulosic biomass.
  • the latter essentially comprises three natural constituents (polymers) present in varying quantities depending on its origin: cellulose (approximately 35 to 50% by dry mass of the biomass), which is a polysaccharide essentially made up of hexoses, hemicellulose (approximately 20 at 30% by dry mass of the biomass) which is a polysaccharide essentially made up of pentoses, and lignin (approximately 15 to 25% by dry mass of the biomass) which is a polymer of complex structure and high molecular weight, composed of aromatic alcohols linked by ether bonds.
  • Non-limiting examples of lignocellulosic biomasses include, for example, agricultural exploitation residues (in particular straw waste, corn cobs, sugar cane bagasse, etc.), but also logging residues, residues sawmills (typically wood chips) or any other type of woody residue of silvicultural, industrial, urban or household origin.
  • Cellulosic biomass can also be the product of a particular dedicated crop such as an energy crop, dedicated for example to the cultivation of annual plants (“whole plant” use for example wheat or corn).
  • a crop of perennial forage plants for example fescue, orchard grass or rye grass
  • a crop of herbaceous plants for example miscanthus or “elephant grass” or even switchgrass or “switchgrass”).
  • a shrub crop for example willow, poplar, chestnut or eucalyptus
  • biomass capable of being used in the context of the invention may be a 1 G substrate or a mixture of several GI substrates derived from sugar plants (such as for example sugar cane or sugar beet), cereals (such as for example corn or wheat) and/or oilseeds (such as for example soya, rapeseed, palm).
  • the biomass can be used alone or a mixture, for example of several different types of biomass.
  • the quantity of water contained in the raw biomass is between 1% and 70% of the total mass of raw biomass.
  • the inventors have thus advantageously succeeded in genetically modifying, in this sense, a solventogenic bacterium, the reference strain C. acetobutylicum. They have in particular made it capable of fermenting two carbon elements of different natures, for example at least one hexose and one pentose, or the carbon elements of a substrate comprising at least two distinct carbon elements chosen from glucose, arabinose, xylose , mannose and galactose, preferably chosen from glucose, arabinose and xylose, even more preferably glucose and arabinose.
  • genes related to xylose catabolism are organized in the form of a regulon (Gu et al. 2010).
  • the main operon involved in xylose assimilation is the CA_C2610- CA_C2612 locus, which contains the genes encoding xylose isomerase XylA (CA_C2610) and xylulokinase XylB (CA_C2612) (Gu et al. 2010).
  • CA_C1339 The genes encoding the permeases predicted to be involved in xylose import, AraEl (CA_C1339) and XylT (CA_C1345), are located on a second locus (CA_C1339- CA_C1349) also containing genes linked to arabinose assimilation.
  • a third operon (CA_C3451-CA_C3452) contains the genes encoding the proteins XynT and XynB, corresponding to a hypothetical permease and a 1,4-PD-xylosidase, respectively.
  • XBS XylR-binding-site
  • the CA_C2613 gene is located upstream of the xylB gene within the main xylose assimilation operon. This organization is very similar to what is observed in species possessing a xylose repressor (Gu et al. 2010).
  • the CA_C3673 gene has an XBS at its promoter, suggesting autoregulation of its transcription.
  • the product of this gene is also the repressor with the most identity to XylR homologs from closely related solventogenic Clostridia, such as C. beijerinckii NCIMB 8052.
  • the genes involved in arabinose assimilation are mostly located within the CA_C1339-CA_C1349 locus. This locus includes genes encoding the putative arabinose transporters AraEl and AraD (CA_C1341).
  • a second operon contains the genes CA_C1529 and CA_C1530 which encode the arabinofuranosidase Arb43 and the arabinoside transporter AraT.
  • C. acetobutylicum A particularity recently highlighted in C. acetobutylicum is the phenotypic difference that exists between growth on xylose and that on arabinose, although the metabolic pathways allowing the assimilation of these sugars have many common intermediates (Servinsky et al. 2010). . Indeed, while the generation time on arabinose is 78 min, it reaches 287 min on xylose (Servinsky et al. 2012). If xylose-permease and xylulokinase activities have been implicated, this difference can also be explained by the action of transcriptional regulatory factors.
  • the inventors show for the first time that the joint inactivation of the genes encoding the AraR and XylR repressors makes it possible to obtain a strain with astonishing coassimilation capacities, since it is capable of simultaneously assimilating and/or metabolizing two distinct carbon sources. such as arabinose and glucose, without lifting the catabolic repression on xylose assimilation.
  • An object described by the inventors thus targets a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium, in particular a species of Clostridium of industrial interest, in particular C. acetobutylicum, characterized in that it does not express the products of the xylR and /or araR, or expresses non-functional versions of these.
  • xylR gene refers in particular to the sequence SEQ ID NO: 1 (CA_C2613) or the sequence SEQ ID NO: 2 (CA_C3673).
  • xylR gene also refers to variants of said sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, in particular variants presenting sequence homology with one of said sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 .
  • arabin gene refers in particular to the sequence SEQ ID NO: 3 (CA_C1340) or a variant of said sequence, in particular a variant having sequence homology with said sequence SEQ ID NO: 3.
  • a typical example of a variant according to the invention has a sequence homology with the sequence SEQ ID NO: 1, with the SEQ ID NO: 2 or with the sequence SEQ ID NO: 3 of between 95% and 100%, and preferably between 96% and 100%.
  • the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and its variant are for example at least 95% homologous, for example at least 96%, at least 97%, at least 98 %, or at least 99%.
  • the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and its variant have sequences that are at least 96%, at least 97%, or at least 98% homologous.
  • xylR gene also refers to a sequence coding a functional fragment or variant of the XylR protein, in particular a protein capable of/capable of repressing, reducing or preventing (or involved in the repression of), for example in the absence of xylose, the expression of an enzyme of the xylose assimilation pathway, for example capable of/capable of repressing, reducing or preventing the transcription of at least a gene chosen from the gene encoding xylose isomerase “XylA” (encoded by the gene CA_C2610, SEQ ID NO: 4), the gene encoding xylulokinase “XylB” (encoded by the gene CA_C2612, SEQ ID NO: 5), a gene encoding a permease involved in the import of xylose such as for example the “AraEl” protein (encoded by the CA_C1339 gene, SEQ ID NO: 6), the “XylA
  • xylR gene also refers to a variant nucleotide sequence encoding a protein capable of binding in particular the promoter (SEQ ID NO: 10) of the “xylA” gene (CA_C2610, SEQ ID NO: 4), the promoter (SEQ ID NO: : 11) of the “xylB” gene (CA_C2612, SEQ ID NO: 5) or an operating sequence “XBS” (XylR-binding site) chosen for example from SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • the protein encoded by the variant nucleotide sequence is preferably capable of recognizing an of said genes.
  • arabinose gene also refers to a sequence coding a fragment or functional variant of the AraR protein, in particular a protein capable of/capable of repressing, reducing or preventing (or involved in the repression of), for example in the absence of arabinose, the expression of an enzyme of the xylose assimilation pathway or of the arabinose assimilation pathway, in particular capable of partially preventing the assimilation of xylose or arabinose.
  • arabinose gene also refers to a sequence capable of/capable of repressing, reducing or preventing, for example in the absence of arabinose, the transcription of at least one gene chosen from a gene encoding a transporter, or putative transporter.
  • arabin gene also refers to a variant nucleotide sequence encoding a protein capable of binding in particular the promoter of an “ara” gene such as “araEl”, “araAl”, “araA2”, “araK” or “araD”, for example a sequence chosen from SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 24, or an operating sequence “ABS” (AraR-binding site) chosen by example from SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, and SEQ ID NO: 27.
  • arabin gene a variant nucleotide sequence encoding a protein capable of binding in particular the promoter of an “ara” gene such as “araEl”, “araAl”, “araA2”, “araK” or “araD”, for example a sequence chosen from SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 24, or an operating sequence “ABS” (AraR-binding site) chosen by example from SEQ ID NO: 25,
  • the protein encoded by the variant nucleotide sequence is preferably capable of recognizing an ABS (AraR-binding site) sequence such as for example SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, and/or to repress, reduce or prevent the expression of one or more of said genes encoding an enzyme involved in the arabinose assimilation pathway.
  • ABS AdR-binding site
  • arabinose gene also refers to a sequence coding a functional fragment or variant of the AraR protein, in particular a protein capable of/capable of repressing, reducing or preventing (or involved in the repression of) , for example in the presence of arabinose, the expression of an enzyme as described above of the xylose assimilation pathway or of the arabinose assimilation pathway.
  • this text refers to a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium, characterized in that it does not express the products of the xylR and/or araR genes, or expresses non-functional versions thereof
  • the expression “non-functional version of the gene product” xylR, or araR designates a protein, typically a protein identified in the present text as “XylR” or “AraR”, non-functional, i.e., incapable of exercising the function of protein encoded by the wild version of the targeted gene.
  • the non-functional version of said product designates a protein incapable of repressing, reducing or preventing the expression of an enzyme of the xylose and/or arabinose assimilation pathway, for example incapable of repressing, reducing or preventing the transcription of at least one gene chosen from the gene encoding xylose isomerase "XylA”, the gene encoding xylulokinase "XylB”, a gene encoding a permease involved in the import of xylose such such as for example the “AraEl” protein, the “XylT” protein, or the “XynT” protein, and the gene encoding 1,4-P-D-xylosidase “XynB”.
  • the non-functional version of said product designates a protein incapable of repressing, reducing or preventing the expression of an enzyme of the xylose assimilation pathway and/or of the assimilation pathway. arabinose, in particular capable of partially preventing the assimilation of xylose.
  • This protein is for example incapable of repressing, reducing or preventing the transcription of at least one gene chosen from a gene encoding a transporter, or putative transporter, of arabinose “XylA”, such as “AraEl” or “XylT” ; a gene encoding an L-arabinose isomerase such as “AraAl” or “AraA2”; the gene encoding ribulokinase “AraK”; the gene encoding L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase “AraD”; the gene encoding arabinofuranosidase “Arb43”; the gene encoding the arabinoside transporter “AraT”; and the xfp gene encoding a phosphoketolase.
  • XylA such as “AraEl” or “XylT”
  • a gene encoding an L-arabinose isomerase such as “AraAl”
  • bacteria of the genus Clostridium we mean in particular the species of Clostridium said to be of industrial interest, typically the solventogenic or acetogenic bacteria of the genus Clostridium.
  • the expression “bacteria of the genus Clostridium” includes wild bacteria as well as strains derived from them, genetically modified with the aim of improving their performance.
  • Clostridium species of industrial interest or “Clostridium species of industrial interest” bacteria we mean species capable of producing, by fermentation, solvents such as ethanol, butanol, acetone or isopropanol and/or or acids such as butyric acid or acetic acid, from sugars or oses, typically from sugars comprising 5 carbon atoms such as xylose, arabinose or fructose, sugars comprising 6 carbon atoms such as glucose or mannose, polysaccharides or polysaccharides such as cellulose or hemicellulose, and/or any other source of carbon assimilable and usable by bacteria of the Clostridium genus (CO, CO2, and methanol for example ).
  • solvents such as ethanol, butanol, acetone or isopropanol and/or or acids such as butyric acid or acetic acid
  • sugars or oses typically from sugars comprising 5 carbon atoms such as xylose, arabinose or fructos
  • solventogenic bacteria of interest are bacteria of the genus Clostridium that produce acetone, butanol, ethanol and/or isopropanol, such as the strains identified in the literature as "ABE strain” [strains producing fermentations allowing the production of acetone, butanol and ethanol], “IBE strain” [strains carrying out fermentations allowing the production of isopropanol (by reduction of acetone), butanol and ethanol] and “ AIBE strain” [strains carrying out fermentations allowing the production of acetone, isopropanol, butanol and ethanol].
  • Solventogenic bacteria of the genus Clostridium can be selected for example from, but not limited to, C.
  • acetobutylicum C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum and C. tyrobutyricum, preferably from C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C. tyrobutyricum and C. cellulolyticum, and even more preferably from C. acetobutylicum and C. beijerinckii.
  • a most preferred solventogenic bacteria is C. acetobutylicum.
  • the acetogenic bacteria of interest are bacteria that produce acids and/or solvents from CO2 and H2.
  • Acetogenic bacteria of the genus Clostridium can be selected for example from C. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes and C. carboxidivorans.
  • the bacterium of the Clostridium genus concerned is an “ABE strain”, preferably the bacterium C. acetobutylicum, for example the strain DSM 792 (also designated strain ATCC 824 or even LMG 5710) of C. acetobutylicum.
  • the bacterium of the genus Clostridium concerned is an “ABE strain”, preferably the bacterium C. beijerinckii, for example the strain NCIMB 8052 of C. beijerinckii.
  • the bacterium of the genus Clostridium concerned is an “IBE strain”, preferably a subclade of C. beijerinckii selected from DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 and NCCB 27006.
  • the bacterium according to the invention belonging to the genus Clostridium is a Clostridium bacterium of industrial interest, in particular a solventogenic bacterium, capable, in the wild state, of producing solvents and/or acids by fermentation from a carbon source, said carbon source being chosen for example from a sugar, CO, CO2, an alcohol, and an organic acid.
  • the carbon source is a sugar, in particular a sugar comprising 5 carbon atoms such as xylose or arabinose, a sugar comprising 6 carbon atoms such as glucose, fructose or mannose, or a polysaccharide or polysaccharide such as cellulose or hemicellulose.
  • a particularly preferred bacteria according to the invention is a Clostridium bacteria capable of simultaneously fermenting at least one hexose and one pentose.
  • a particularly preferred bacterium according to the invention is a Clostridium bacterium capable of simultaneously fermenting the carbon elements of a substrate comprising at least two carbon elements chosen from glucose, arabinose, xylose, mannose and galactose, preferably chosen from glucose, arabinose and xylose .
  • Clostridium bacterium is a bacterium according to the invention, by culturing said bacterium on a substrate comprising several carbon sources (for example according to the method taught by Grimmler et al., 2010): if the bacteria ferments/assimilates at least two different carbon sources simultaneously (versus consecutively, ie, one after the other), it is a bacteria according to the invention.
  • a wild Clostridium bacterium placed in the presence of a substrate comprising glucose, arabinose and xylose first ferments glucose, then arabinose then xylose.
  • a bacterium according to the invention is capable of fermenting/assimilating simultaneously (ie at the same time) at least two of the three sugars present within the substrate, namely in the example provided glucose and arabinose ( xylose being assimilated in a second step).
  • Another simple way to easily check whether or not the Clostridium bacteria is a bacteria according to the invention consists of measuring the growth speed of the bacteria.
  • a wild Clostridium bacterium has a maximum growth rate of between approximately 0.10 and approximately 0.25; preferably around 0.15; on a medium comprising xylose as the sole carbon source (Servinsky et al, 2010).
  • the inventors have observed that a bacterium modified according to the invention has a maximum growth rate of between approximately 0.45 and approximately 0.60; preferably greater than approximately 0.50, on such a medium.
  • Clostridium bacteria is a bacteria according to the invention, consists of sequencing the loci CA_C1340, CA_C2613 and CA_C3673 and to check whether they have, or have not, been modified compared to their wild version, with a view to preventing or reducing the expression of functional XylR and AraR proteins.
  • a particularly preferred bacterium belongs to the species C. acetobutylicum and, as explained above, does not express the products of the genes of sequences SEQ ID NO: 1 (CA_C2613) or a sequence homologous to at least 95%, for example at least 96%, at least 97% or at least 98% thereof, of SEQ ID NO: 2 (CA_C3673) or a sequence homologous to at least 95%, for example at least 96%, at least 97% or at least 98% thereof, and of SEQ ID NO: 3 (CA_C1340) or a sequence homologous to at least 95%, for example at least 96%, at least 97% or at least 98 % thereof, or expresses non-functional versions of said expression products.
  • This particularly preferred bacterium has the technical abilities described above, i.e., it is capable of fermenting/assimilating at least two different carbon sources simultaneously, and it grows faster than a bacterium expressing a functional AraR protein, or a mixture of functional XylR and AraR proteins, on a medium comprising xylose as the sole carbon source.
  • Such a strain is characterized for the first time in the context of the present application.
  • This strain was registered on June 13, 2022 under the deposit number LMG P-32703 with the BCCM-LMG collection.
  • the xylR and araR genes were (jointly) inactivated.
  • the description also relates to any derived bacteria, clone, mutant or genetically modified version thereof, typically lacking the xylR and araR genes, or in which said genes have also been inactivated.
  • Another object of the invention relates to the use of a bacteria according to the invention to simultaneously ferment two distinct sources of carbon, for example at least one hexose and one pentose, or else the carbon elements of a substrate comprising at least two carbon elements chosen from glucose, arabinose, xylose, mannose and galactose.
  • the bacteria according to the invention is for example capable of simultaneously fermenting glucose and arabinose, glucose and xylose, glucose and mannose, glucose and galactose, arabinose and xylose, arabinose and mannose, arabinose and galactose, xylose and mannose, xylose and galactose or mannose and galactose.
  • the bacteria according to the invention is capable of fermenting a substrate comprising at least two sugars chosen from glucose, arabinose and xylose, for example glucose and arabinose, glucose and xylose, or arabinose and xylose.
  • the genetically modified bacteria according to the invention can be advantageously used to produce a solvent, for example a biofuel, or a mixture of solvents, for example a mixture of biofuels, in particular on an industrial scale.
  • the invention also relates to a fermentation process, typically an industrial process, involving the use of a bacteria according to the invention.
  • the present invention offers a welcome solution that will reduce tensions between the energy and food sectors.
  • a genetically modified bacterium according to the invention can also be advantageously used to produce a sugar or a biosourced molecule from a biomass, in particular a lignocellulosic biomass, or from a dedicated energy culture.
  • biosourced molecule means a molecule whose specificity is that the raw material used for its production necessarily comes from plant biomass, preferably from lignocellulosic biomass, and not from original resources. fossils such as oil, coal or natural gas.
  • Non-limiting examples of lignocellulosic biomasses include, for example, agricultural exploitation residues (in particular straw waste, corn cobs, sugar cane bagasse, etc.), but also logging residues, residues sawmills (typically wood chips) or any other type of wood residue.
  • agricultural exploitation residues in particular straw waste, corn cobs, sugar cane bagasse, etc.
  • residues sawmills typically wood chips
  • Cellulosic biomass can also be the product of a particular dedicated crop such as an energy crop, dedicated for example to the cultivation of annual plants (“whole plant” use for example wheat or corn). It may otherwise be for example a crop of perennial forage plants (for example fescue, orchard grass, rye grass), a crop of herbaceous plants (for example miscanthus or “elephant grass”, switchgrass or “switch grass”), or a shrub crop (short or very short rotation coppice, for example willow, poplar, chestnut or eucalyptus).
  • a particular dedicated crop such as an energy crop, dedicated for example to the cultivation of annual plants (“whole plant” use for example wheat or corn). It may otherwise be for example a crop of perennial forage plants (for example fescue, orchard grass, rye grass), a crop of herbaceous plants (for example miscanthus or “elephant grass”, switchgrass or “switch grass”), or a shrub crop (short or very short rotation
  • Another biomass capable of being used in the context of the invention may be a GI substrate derived from sugar plants (such as for example sugar cane or sugar beet), cereals (such as for example corn or wheat) and/or oilseeds (such as for example soya, rapeseed, or palm).
  • sugar plants such as for example sugar cane or sugar beet
  • cereals such as for example corn or wheat
  • oilseeds such as for example soya, rapeseed, or palm.
  • the invention further relates to a method for producing a recombinant bacterium according to the invention, comprising the deletion or inactivation of the xylR and araR genes so as to prevent or reduce the expression of functional XylR and AraR proteins.
  • the most efficient known modification methods for obtaining genetically modified strains are based on homologous recombination events, which make it possible to modify the genome in a precise and stable manner.
  • a particular production process according to the invention comprises a step of transforming the bacteria by introducing into said bacteria a nucleic acid of interest.
  • nucleic acid means any natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant DNA or RNA molecule, possibly chemically modified (ie including non-natural bases, modified nucleotides including for example modified linkage, modified bases and/or modified sugars), or optimized so that the codons of the transcripts synthesized from the coding sequences are the most frequently found codons in a bacterium of the genus Clostridium with a view to its use therein.
  • the optimized codons are typically codons rich in adenine (“A”) and thymine (“T”) bases.
  • C cysteine
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • F phenylalanine
  • G glycine
  • H histidine
  • I isoleucine
  • K lysine
  • L leucine
  • M methionine
  • N asparagine
  • P proline
  • Q glutamine
  • A arginine
  • S serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine.
  • the nucleic acid of interest comprises at least two complementary regions each of a target sequence, identical to 100% or identical to 80% at least, preferably 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% or 99% at least to said region/portion/targeted DNA sequence within the bacterial genome.
  • These regions are capable of hybridizing to all or part of the complementary sequence of said region/portion/sequence, typically to a sequence as described above comprising at least 1 nucleotide, preferably at least 100 nucleotides, typically between 100 and 1000 nucleotides.
  • the complementary regions of the target sequence present within the nucleic acid of interest can recognize, preferably target, the 5' and 3' flanking regions of the targeted sequence in a genetic modification tool known to man of the art, typically any tool based on homologous recombination.
  • a part of the nucleic acid of interest further recognizes (binds at least in part), and preferably targets, i.e. recognizes and allows cleavage, in the genome of a Clostridium bacterium d interest, of at least one strand i) of a target sequence, ii) of a sequence controlling the transcription of a target sequence, or iii) of a sequence flanking a target sequence.
  • targets i.e. recognizes and allows cleavage, in the genome of a Clostridium bacterium d interest, of at least one strand i) of a target sequence, ii) of a sequence controlling the transcription of a target sequence, or iii) of a sequence flanking a target sequence.
  • targets i.e. recognizes and allows cleavage, in the genome of a Clostridium bacterium d interest, of at least one strand i) of a target sequence, ii) of a sequence controlling the transcription of a target
  • the nucleic acid of interest comprises at least one region complementary to the target sequence identical to 100% or identical to 80% at least, preferably 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at least to the targeted region/portion/DNA sequence within the bacterial genome and is capable of hybridizing to all or part of the complementary sequence of said region/portion/ sequence, typically to a sequence comprising at least 5 nucleotides, preferably at least 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides, typically between 15 and 30 nucleotides, preferably to a sequence comprising 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 nucleotides.
  • the nucleic acid(s) of interest as described in the context of the present invention are capable of removing said target sequence(s) from the genome of the bacteria or of modifying their expression, for example of modulating/regulating them, in particular to inhibit them, preferably to modify them in such a way as to rendering said bacterium incapable of expressing one or more proteins, in particular one or more functional proteins, from said sequence(s).
  • nucleic acids of interest can be constructed by conventional techniques well known to those skilled in the art and can comprise one or more promoters, origins of bacterial replication (ORI sequences), termination sequences, selection genes, for example antibiotic resistance genes, and sequences (“flanked regions”) allowing targeted insertion of the cassette or vector.
  • ORI sequences of interest can for example be chosen from pIP404, pAMpi, repH (origin of replication in C. acetobutylicum), ColEl or rep (origin of replication in E. coli), or any other origin of replication allowing the maintenance of the vector, typically a plasmid, within a bacterial cell belonging to the genus Clostridium.
  • Termination sequences of interest can be chosen for example from those of the adc, thl genes, the bcs operon, or any other terminator, well known to those skilled in the art, allowing transcription to be stopped. within a bacterial cell belonging to the genus Clostridium.
  • Selection genes (resistance genes) of interest can be chosen from ermB, catP, bla, tetA, tetM, and/or any other resistance gene to ampicillin, erythromycin, chloramphenicol, thiamphenicol, with spectinomycin, tetracycline, or any other antibiotic, well known to those skilled in the art, which can be used to select bacteria of the Clostridium genus.
  • the nucleic acid of interest may be a natural, synthetic RNA or produced by a recombinant technique.
  • This nucleic acid of interest can be prepared by any method known to those skilled in the art such as, for example, chemical synthesis, in vivo transcription or amplification techniques.
  • RNA molecules mature or precursors
  • gRNA guide RNA
  • these molecules may contain modified nucleotides or chemical modifications allowing them, for example, to increase their resistance to nucleases and thus increase their lifespan in the cell.
  • They may in particular comprise at least one modified or unnatural nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylarnino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylarnino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • nucleic acids of interest used according to the invention can also be modified at the level of the internucleotide bond as are for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkyl-phosphonates, or at the level of the skeleton as are for example the alpha-oligonucleotides, 2'-O-alkyl riboses or PNAs (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al., 1992).
  • nucleic acid of interest used to transform and/or genetically modify a bacterium of interest, is a DNA fragment i) recognizing a coding sequence, ii) controlling the transcription of a coding sequence, or iii) flanking a coding sequence, the XylR repressor or the AraR repressor.
  • the nucleic acid of interest is selected from the plasmid pGRNA-ACA_C1340 of sequence SEQ ID NO: 28, the plasmid pGRNA-ACA_C2613 of sequence SEQ ID NO:
  • a nucleic acid of particular interest described by the inventors is for example a vector, preferably a plasmid, for example the plasmid pGRNA-ACA_C1340 of sequence SEQ ID NO: 28, the plasmid pGRNA-ACA_C2613 of sequence SEQ ID NO: 29 or the plasmid pGRNA-ACA_C3673 of sequence SEQ ID NO: 30, described in the experimental part of the present description.
  • the or one of the recognized sequences is preferably one of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 corresponding to the xylR and araR genes encoding respectively a XylR protein and the AraR protein, or an amino acid sequence identical to at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% of said protein, or a sequence comprising all or at least 95 %, 96%, 97%, 98% or 99% of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the recognized sequence may be a sequence comprising at least 1 nucleotide, preferably at least 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides, typically between 1 and 40 nucleotides, preferably a sequence comprising 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the target sequence can also be a sequence controlling the transcription of a coding sequence as described above, typically a promoter sequence, for example the promoter sequence (SEQ ID NO: 10) of the “XylA” gene ( CA_C2610, SEQ ID NO: 4), or that (SEQ ID NO: 11) of the “XylB” gene (CA_C2612, SEQ ID NO: 5).
  • the nucleic acid of interest then recognizes, and is therefore typically capable of binding to, a sequence controlling the transcription of a coding sequence as described previously.
  • the target sequence may be a sequence flanking a coding sequence as described previously, for example a sequence flanking the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a sequence identical to at least 70% of this one.
  • a flanking sequence typically comprises 1, 10 or 20 and 1000 nucleotides, for example between 1, 10 or 20 and 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 or 200 nucleotides, between 1, 10 or 20 and 100 nucleotides. , between 1, 10 or 20 and 50 nucleotides, or between 1, 10 or 20 and 40 nucleotides, for example between 10 and 40 nucleotides, between 10 and
  • nucleotides between 10 and 20 nucleotides, between 20 and 30 nucleotides, between 15 and 40 nucleotides, between 15 and 30 nucleotides or between 15 and 20 nucleotides.
  • the target sequence corresponds to the pair of sequences flanking such a coding sequence, each flanking sequence typically comprising at least 20 nucleotides, typically between 100 and 1000 nucleotides, preferably between 200 and 800 nucleotides.
  • the method according to the invention for producing a recombinant bacteria comprises the transformation of the bacterial cell using at least one nucleic acid of interest, for example two or three nucleic acids of interest as described above, said nucleic acid(s) of interest being capable of i) recognizing (and capable of binding at least in part) a coding sequence, controlling the transcription of a coding sequence, or flanking a coding sequence, the XylR repressor, and ii) recognizing (and capable of binding at least in part) a coding sequence, controlling the transcription of a coding sequence, or flanking a coding sequence, the AraR repressor.
  • the coding sequence controlling the transcription of a coding sequence, or flanking a coding sequence, the XylR repressor or the AraR repressor is also identified in the present text as a "target sequence” or “targeted sequence” .
  • the nucleic acid of interest as described in the context of the present invention is preferably capable of deleting said target sequence from the genome of the bacteria or of modifying its expression, for example of modulating/regulating it, in particular of inhibit, preferably modify it so as to render said bacterium incapable of expressing a protein (typically an AraR or XylR protein), in particular a functional protein, from said sequence.
  • a protein typically an AraR or XylR protein
  • the nucleic acid of interest is capable of modifying the bacteria so as to make it incapable of expressing one and/or the other of the AraR and XylR proteins.
  • the introduction into the bacteria of any nucleic acid of interest can be carried out by any method, direct or indirect, known to those skilled in the art, for example by transformation, conjugation, microinjection, transfection, electroporation, etc., preferably by electroporation (Mermelstein et al, 1993).
  • nucleic acids of interest for example DNA fragments, RNA fragments, expression cassettes or expression vectors
  • these nucleic acids of interest can be integrated into the bacterial genome by techniques which are also well known. the skilled person.
  • the method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacteria as described in the present text comprises a step of transforming the bacteria by introducing into said bacteria a nucleic acid of interest according to the invention as described above and involves a genetic modification tool, for example a genetic modification tool selected from a CRISPR tool, an insertional mutagenesis tool, for example based on the use of type II introns (for example example the Targetron® tool or the ClosTron® tool) and an allelic exchange tool (for example the ACE® tool).
  • a genetic modification tool for example a genetic modification tool selected from a CRISPR tool, an insertional mutagenesis tool, for example based on the use of type II introns (for example example the Targetron® tool or the ClosTron® tool) and an allelic exchange tool (for example the ACE® tool).
  • the method for transforming, and preferably furthermore genetically modifying, a Clostridium bacterium may further comprise a step of obtaining, recovering, selecting or isolating the transformed bacterium, i.e. the bacterium presenting the recombination(s)/ modifications/optimizations sought.
  • the method according to the invention is based on the use of (implements) the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) technology/genetic tool, in particular the CRISPR/ genetic tool.
  • Cas CRISPR-associated protein
  • the present invention can be implemented using a classic CRISPR/Cas genetic tool using a single plasmid comprising a nuclease, a gRNA and a repair template as described by Wang et al. (2015).
  • Those skilled in the art can easily define the sequence and structure of gRNAs according to the chromosomal region or the mobile genetic element to be targeted using well-known techniques (see for example the article by DiCarlo et al., 2013).
  • the inventors have otherwise developed and described a genetic tool for modifying bacteria, adapted to bacteria of the Clostridium genus, usable in the context of the present invention, based on the use of two plasmids (cf. WO2017/064439, Wasels and al., 2017).
  • the method according to the invention is based on the use of insertional mutagenesis tools, for example the use of type II introns, and for example implements the technology/tool ClosTron® genetics or the Targetron® genetic tool.
  • Targetron® technology is based on the use of a reprogrammable group II intron (based on the Ll.ltrB intron of Lactococcus lactis), capable of rapidly integrating the bacterial genome at a desired locus (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013), typically with the aim of inactivating a targeted gene.
  • the mechanisms of recognition of the edited zone as well as insertion into the genome by back-splicing are based on a homology between the intron and said zone on the one hand, and on the activity of a protein (ItrA) d 'somewhere else.
  • ClosTron® technology is based on a similar approach, supplemented by the addition of a selection marker in the intron sequence (Heap et al., 2007).
  • This marker makes it possible to select the integration of the intron into the genome, and therefore facilitates obtaining the desired mutants.
  • This genetic system also exploits type I introns. Indeed, the selection marker (called RAM for retrotransposition-activated marker) is interrupted by such a genetic element, which prevents its expression from the plasmid (a more precise description of the system: Zhong et al.). Splicing of this genetic element occurs before integration into the genome, which allows obtaining a chromosome presenting an active form of the resistance gene.
  • An optimized version of the system includes FLP/FRT sites upstream and downstream of this gene, allowing FRT recombinase to be used to eliminate the resistance gene (Heap et al., 2010).
  • the method according to the invention is based on the use of an allelic exchange tool, and for example implements the ACE® technology/genetic tool.
  • the ACE® technology is based on the use of an auxotrophic mutant (for uracil in C. acetobutylicum ATCC 824 by deletion of the pyrE gene, which also causes resistance to 5-fluoroorotic acid (A-5-FO) ; Heap et al., 2012).
  • This system uses the allelic exchange mechanism, well known to those skilled in the art. Following transformation with a pseudo-suicide vector (with very low copies), the integration of the latter into the bacterial chromosome by a first allelic exchange event can be verified using the resistance gene initially present on the plasmid.
  • the integration step can be carried out in two different ways, either within the pyrE locus or within another locus.
  • the pyrE gene is also placed on the plasmid, without however being expressed (no functional promoter).
  • the second recombination restores a functional pyrE gene and can then be selected by auxotrophy (minimal medium, containing no uracil).
  • the non-functional pyrE gene also presents a selectable character (sensitivity to A-5-FO), other integrations are then possible on the same model, by successively alternating the state of pyrE between functional and non-functional.
  • a genomic area allowing expression of the counter-selection marker after recombination is targeted (typically, in an operon after another gene, preferably a highly expressed gene). This second recombination is then selected by auxotrophy (minimum medium not containing uracil).
  • the targeted sequence is typically one of the sequences described in this text.
  • the invention further relates to a kit (kit) for transforming and/or genetically modifying a bacterium of the genus Clostridium comprising at least one nucleic acid of interest as described in the present text (for example two nucleic acids of interest, typically DNA fragment, each recognizing a target sequence) to transform and preferably genetically modify a bacterium of the Clostridium genus, and possibly one or more selection molecules.
  • kit for transforming and/or genetically modifying a bacterium of the genus Clostridium comprising at least one nucleic acid of interest as described in the present text (for example two nucleic acids of interest, typically DNA fragment, each recognizing a target sequence) to transform and preferably genetically modify a bacterium of the Clostridium genus, and possibly one or more selection molecules.
  • a particular kit includes the essential elements for the functioning of a CRISPR tool (typically at least one nucleic acid usable as gRNA, a nucleic acid usable as a repair template, at least one pair of primers, and an inducer allowing the expression of a Cas9 or MAD7 type nuclease), the essential elements for the functioning of a tool based on the use of type II introns (typically at least one type II intron, at least one pair of primers and an inducer allowing the expression of a retrotranscriptase, for example LtrA RT or Tel4c RT type), or the essential elements for the functioning of an allelic exchange tool (typically at least two nucleic acids usable as a matrix of homologous recombination, and at least one pair of primers).
  • a CRISPR tool typically at least one nucleic acid usable as gRNA, a nucleic acid usable as a repair template, at least one pair of primers, and an inducer allowing the
  • kits according to the invention may also include one or more consumables such as a culture medium, at least one competent bacterium of the Clostridium genus (i.e. packaged for transformation), or even an explanatory leaflet.
  • consumables such as a culture medium, at least one competent bacterium of the Clostridium genus (i.e. packaged for transformation), or even an explanatory leaflet.
  • the invention typically relates to a kit for implementing a transformation and/or genetic modification process described in the present text using a bacterium of the Clostridium genus.
  • the invention relates in particular to genetically modified bacteria belonging to the genus Clostridium having the essential characteristic of not expressing the products of the xylR and araR genes, or of expressing non-functional versions thereof, as well as any derived bacteria, clone , mutant or genetically modified version thereof, and uses thereof.
  • the application also describes the strain IFP 967, registered on June 13, 2022 under the deposit number LMG P-32702 with the BCCM-LMG collection, in which the araR gene has been inactivated, as well as any derived bacteria, clone, mutant or genetically modified version thereof, typically lacking the xylR and araR genes, or in which said genes have also been inactivated.
  • a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium characterized in that it does not express the product of the xylR or araR gene, or expresses a non-functional version of the xylR or araR gene, for example strain IFP 967, registered on June 13, 2022 under the deposit number LMG P-32702 with the BCCM-LMG collection, to prepare a genetically modified bacterium according to the invention not expressing the products of the xylR and araR genes, or expressing non-functional versions of these.
  • the invention further relates to a kit for producing a solvent, a sugar or a biosourced molecule using a bacterium belonging to the genus Clostridium, comprising i) a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium according to the invention, for example IPF968, and ii) a medium, typically a conservation medium or a culture medium for said bacteria.
  • the kit may also include an explanatory note.
  • the conservation or culture medium of the genetically modified bacteria (belonging to the genus Clostridium) according to the invention present within the kit is preferably supplemented with a carbon source composed of glucose and at least one pentose, preferably i ) glucose and ii) arabinose and/or xylose.
  • This medium preferably comprises between 0.1 and 250 g/L, more preferably between 1 and 100 g/L, of said carbon source (composed of glucose and at least one pentose).
  • the conservation or culture medium of the genetically modified bacteria is preferably an RCM type culture medium, more preferably a GAPES type culture medium, even more preferably a CGM type culture medium.
  • the invention also relates to a particular kit for producing a solvent or a biofuel, or a mixture of solvents or biofuels, using a bacteria belonging to the genus Clostridium, said kit comprising i) a bacteria (belonging to the genus Clostridium ) genetically modified according to the invention, characterized in that it does not express the products of the xylR and araR genes, or expresses non-functional versions of these, and ii) a rich culture medium, preferably a medium of RCM type culture, more preferably a GAPES type culture medium, even more preferably a CGM type culture medium, containing at least glucose and one pentose, preferably arabinose and/or xylose.
  • the invention further relates to the possible uses of the method or kit according to the invention for transforming and/or genetically modifying a bacterium of the genus Clostridium, typically a solventogenic bacterium of the genus Clostridium, for example to generate improved variants of said bacterium.
  • a bacterium of the genus Clostridium typically a solventogenic bacterium of the genus Clostridium
  • it relates to the possible uses of the process, the kit or a bacterium of the Clostridium genus transformed and preferably genetically modified according to the invention, in particular to allow the production of solvents or biofuels, or mixtures thereof, typically on an industrial scale.
  • Figure 1 represents the Map of the pBANak plasmid
  • Figure 2 represents the Map of the plasmid pGRNA_ACA_C1340
  • Figure 3 represents the Map of the plasmid pGRNA_ACA_C2613
  • Figure 4 represents the Map of the plasmid pGRNA_ACA_C3673
  • Figure 6 A represents the kinetics of consumption of a mixture of glucose, arabinose and xylose in the wild C. acetobutylicum strain DSM 792, on a CGM medium containing 25 mM glucose, 25 mM arabinose and 70 mM xylose
  • Figure 6B represents the kinetics of consumption of a mixture of glucose, arabinose and xylose in the C. acetobutylicum strain DSM 792 ACA_C2613 ACA_C3673, on a CGM medium containing 25 mM glucose, 25 mM arabinose and 70 mM xylose
  • Figure 6C represents the kinetics of consumption of a mixture of glucose, arabinose and xylose in the C. acetobutylicum strain DSM 792 ACA_C1340, on a CGM medium containing 25 mM glucose, 25 mM arabinose and 70 mM xylose
  • Figure 6D represents the kinetics of consumption of a mixture of glucose, arabinose and xylose in the C. acetobutylicum strain DSM 792 ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673, on a CGM medium containing 25 mM glucose, 25 mM arabinose and 70 mM xylose EXAMPLES
  • C. acetobutylicum DSM 792 was grown in 2YTG medium (Tryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1 ) and CGM (KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7H 2 O, 0.40 g; MnSO 4 H 2 O, 0.01 g; FeSO 4 -7 H 2 O, 0.01 g; NaCl, 1 .0 g; asparagine, 2.0 g; yeast extract, 5.0 g; (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.0 g; carbon source as specified).
  • 2YTG medium Teryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1
  • CGM KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7
  • Escherichia coli NEB 10-beta was cultured in LB medium (Tryptone 10 g L 1 , yeast extract 5 g L 1 , NaCl 10 g L 1 ).
  • the solid media were made by adding 15 g L 1 of agarose to the liquid media.
  • Erythromycin at concentrations of 40 mg.L 1 in 2YTG medium
  • chloramphenicol 25 or 12.5 mg L 1 respectively in solid or liquid LB medium
  • thiamphenicol 15 mg L 1 in 2YTG medium
  • CA_C2613_LHA_Rev TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO: 32)
  • CA_C2613_RHA_Fwd CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO: 33)
  • CA_C2613_RHA_Rev AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO: 34)
  • gRNA_CA_C2613_Fwd TCATGTTACACTTGGAACAAGGCGT (SEQ ID NO: 35)
  • gRNA_CA_C2613_Rev AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO: 36)
  • CA_C3673_LHA_Fwd AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO: 37)
  • CA_C3673_LHA_Rev TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO: 38)
  • CA_C3673_RHA_Fwd GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO: 39)
  • CA_C3673_RHA_Rev AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT
  • gRNA_CA_C3673_Fwd TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG
  • gRNA_CA_C3673_Rev AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC
  • CA_C2613_ver if_Fwd TCGGC AGO AAAAACTCC AGT
  • CA_C2613_verif_Rev GCAATTGCTGGCGGAATGAA
  • CA_C3673_verif Fwd TACTTCATACATATCTAACGCACTCT
  • CA_C3673_verif Rev AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA
  • It contains the pl5A origin of replication, as well as the ampR and kanR genes, respectively conferring resistance to ampicillin and kanamycin. It also contains an expression cassette for phi 3T I methyltransferase from Bacillus subtilis, necessary for the methylation of gene editing vectors before transformation into C. acetobutylicum.
  • CA_C2613 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO: 35) and gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO: 36) and integrated into the plasmid by the "golden gate assembly" technique, after digestion with BsaL II also contains an editing matrix allowing the inactivation of CA_C2613.
  • This editing matrix was constructed by cloning the LHA and RHA fragments obtained respectively by amplification with the PRIMER couples CA_C2613_LHA_FWD (SEQ ID No: 31) / CA_C2613_LHA_REV (SEQ ID No: 32) and CA_C2613_RHA_FWD (SEQ ID No: 33) / CA_C2613_RHA_RHA_RH_RHA (SEQ ID No: 34) from the C.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites.
  • CA_C3673 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO: 41) and gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO: 42) and integrated into the plasmid by the golden gate assembly technique, after digestion with Bsal. It also contains an editing matrix allowing the inactivation of CA_C3673.
  • This editing matrix was constructed by cloning the LHA and RHA fragments obtained respectively by amplification with the couples Primers CA_C3673_LHA_FWD (SEQ ID No: 37) / CA_C3673_LHA_REV (SEQ ID No: 38) and CA_C3673_RHA_FWD (SEQ ID No: 39) / CA_C3673_RHA_RH_RH_RHA (SEQ ID No: 40) From the C.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites.
  • the plasmids prepared in the NEB 10-beta strain were methylated by transformation into a NEB 10-beta strain also containing the pBANak plasmid.
  • the methylated plasmids thus extracted will then be used to transform the C. acetobutylicum strain.
  • the transformation is carried out according to the protocol described by Wasels et al. 2020.
  • CA_C2613 SEQ ID NO: 1
  • CA_C3673 SEQ ID NO: 2
  • the inactivations of the CA_C2613 and CA_C3673 genes in the ACA_C2613-ACA_C3673 strains were carried out by genetic editing according to the protocol described by Wasels et al. 2020, respectively using the primer pairs CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO: 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO: 44); CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO: 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO: 46) when validating the edition.
  • results reveal an improvement in generation time when growing on xylose as a carbon source.
  • joint inactivation of the CA_C2613 and CA_C3673 genes allows a 33% improvement in generation time compared to the wild strain.
  • Example no. 2 strain IFP 967 (LMG P-32702), C. acetobutylicum ACA C1340
  • C. acetobutylicum DSM 792 was grown in 2YTG medium (Tryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1 ) and CGM (KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7H 2 O, 0.40 g; MnSO 4 H 2 O, 0.01 g; FeSO 4 -7 H 2 O, 0.01 g; NaCl, 1 .0 g; asparagine, 2.0 g; yeast extract, 5.0 g; (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.0 g; carbon source as specified).
  • 2YTG medium Teryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1
  • CGM KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7
  • Escherichia coli NEB 10-beta was cultured in LB medium (Tryptone 10 g L 1 , yeast extract 5 g L 1 , NaCl 10 g L 1 ).
  • the solid media were made in adding 15 g L 1 of agarose to the liquid media.
  • Erythromycin at concentrations of 40 mg.L 1 in 2YTG medium
  • chloramphenicol 25 or 12.5 mg L 1 respectively in solid or liquid LB medium
  • thiamphenicol 15 mg L 1 in 2YTG medium
  • CA_C1340_LHA_Fwd AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO: 48)
  • CA_C1340_LHA_Rev AGAAGTAGAAGAATTAAAAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO: 49)
  • CA_C1340_RHA_Fwd TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO: 50)
  • CA_C1340_RHA_Rev AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO: 51)
  • gRNA_CA_C1340_Fwd TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO: 52)
  • gRNA_CA_C1340_Rev AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO: 53)
  • C A_C 1340_verif_Fwd CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO: 54)
  • CA_C 1340_verif_Rev TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO: 55)
  • It contains the pl5A origin of replication, as well as the ampR and kanR genes, respectively conferring resistance to ampicillin and kanamycin. It also contains an expression cassette for phi 3T I methyltransferase from Bacillus subtilis, necessary for the methylation of gene editing vectors before transformation into C. acetobutylicum.
  • CA_C1340 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO: 52) and gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) and integrated into the plasmid by the “golden gate assembly” technique, after digestion with Bsal. It also contains an editing template allowing the inactivation of CA_C1340.
  • This editing template was constructed by cloning the LHA fragments and RHA obtained respectively by amplification with the pairs of primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO: 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO: 49) and CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO: 50) / CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO: 51) from gDNA from C. acetobutylicum DSM 792.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites. Transformation of C. acetobutylicum strains
  • the plasmids prepared in the NEB 10-beta strain were methylated by transformation into a NEB 10-beta strain also containing the pBANak plasmid.
  • the methylated plasmids thus extracted will then be used to transform the C. acetobutylicum strain.
  • the transformation is carried out according to the protocol described by Wasels et al. 2020.
  • CA_C1340 gene Genetic editing of the CA_C1340 gene (SEQ ID NO: 3):
  • results reveal an improvement in generation time when growing on xylose as a carbon source.
  • inactivation of the gene encoding the AraR repressor allows an improvement of +152% in generation time compared to the wild strain.
  • C. acetobutylicum DSM 792 was grown in 2YTG medium (Tryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1 ) and CGM (KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7H 2 O, 0.40 g; MnSO 4 H 2 O, 0.01 g; FeSO 4 -7 H 2 O, 0.01 g; NaCl, 1 .0 g; asparagine, 2.0 g; yeast extract, 5.0 g; (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.0 g; carbon source as specified).
  • 2YTG medium Teryptone 16 g L 1 , yeast extract 10 g L 1 , glucose 5 g L 1 , NaCl 4 g L 1
  • CGM KH 2 PO 4 , 0.75 g ; K 2 HPO 4 , 0.75 g; MgSO 4 -7
  • Escherichia coli NEB 10-beta was cultured in LB medium (Tryptone 10 g L 1 , yeast extract 5 g L 1 , NaCl 10 g L 1 ).
  • the solid media were made by adding 15 g L 1 of agarose to the liquid media.
  • Erythromycin at concentrations of 40 mg.L 1 in 2YTG medium
  • chloramphenicol 25 or 12.5 mg L 1 respectively in solid or liquid LB medium
  • thiamphenicol 15 mg L 1 in 2YTG medium
  • CA_C1340_LHA_Fwd AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO: 48)
  • CA_C1340_LHA_Rev AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO: 49)
  • CA_C1340_RHA_Fwd TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO: 50)
  • CA_C1340_RHA_Rev AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO: 51)
  • gRNA_CA_C1340_Fwd TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA
  • gRNA_CA_C1340_Rev AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO: 53)
  • C A_C 1340 _verif_Fwd CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO: 54)
  • CA_C 1340_verif_Rev TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO: 55)
  • CA_C2613_LHA_Rev TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO: 32)
  • CA_C2613_RHA_Fwd CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO: 33)
  • CA_C2613_RHA_Rev AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO: 34)
  • gRNA_CA_C2613_Fwd TCATGTTACACTTGGAACAAGGCGT (SEQ ID NO: 35)
  • gRNA_CA_C2613_Rev AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO: 36)
  • CA_C2613_verif_Fwd TCGGC AGO AAAAACTCC AGT (SEQ ID NO: 42)
  • CA_C3673_LHA_Fwd AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO: 37)
  • CA_C3673_LHA_Rev TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO: 38)
  • CA_C3673_RHA_Fwd GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39)
  • CA_C3673_RHA_Rev AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO: 40)
  • gRNA_CA_C3673_Fwd TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO: 41)
  • gRNA_CA_C3673_Rev AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO: 42)
  • It contains the pl5A origin of replication, as well as the ampR and kanR genes, respectively conferring resistance to ampicillin and kanamycin. It also contains an expression cassette for phi 3T I methyltransferase from Bacillus subtilis, necessary for the methylation of gene editing vectors before transformation into C. acetobutylicum.
  • CA_C1340 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO: 52) and gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO: 53) and integrated into the plasmid by the “golden gate assembly” technique, after digestion with Bsal. It also contains an editing template allowing the inactivation of CA_C1340.
  • This editing template was constructed by cloning the fragments LHA and RHA obtained respectively by amplification with the pairs of primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO: 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO: 49) and CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO: 50) / CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO: 51) from gDNA from C. acetobutylicum DSM 792.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites.
  • CA_C2613 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO: 35) and gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO: 36) and integrated into the plasmid by the "golden gate assembly” technique, after digestion with Bsal. It also contains an editing matrix allowing the inactivation of CA_C2613.
  • This editing matrix was constructed by cloning the LHA and RHA fragments obtained respectively by amplification with the pairs of primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO: 31) / CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO: 32) and CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO: 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO: 34) from the gDNA of C. acetobutylicum DSM 792.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites.
  • CA_C3673 Oligo-20-mer obtained by hybridization of the primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO: 41) and gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO: 42) and integrated into the plasmid by the golden gate assembly technique, after digestion with Bsal. It also contains an editing matrix allowing the inactivation of CA_C3673.
  • This editing matrix was constructed by cloning the LHA and RHA fragments obtained respectively by amplification with the couples Primers CA_C3673_LHA_FWD (SEQ ID No: 37) / CA_C3673_LHA_REV (SEQ ID No: 38) and CA_C3673_RHA_FWD (SEQ ID No: 39) / CA_C3673_RHA_RH_RH_RHA (SEQ ID No: 40) From the C.
  • the editing template was cloned between the BamHI and SalI restriction sites.
  • the plasmids prepared in the NEB 10-beta strain were methylated by transformation into a NEB 10-beta strain also containing the pBANak plasmid.
  • the methylated plasmids thus extracted will then be used to transform the C. acetobutylicum strain.
  • the transformation is carried out according to the protocol described by Wasels et al. 2020.
  • CA_C2613 SEQ ID NO: 1
  • CA_C3673 SEQ ID NO: 2
  • CA_C1340 SEQ ID NO: 3
  • CA_C1340, CA_C2613 and CA_C3673 genes in the strain ACA_C1340-ACA_C2613-ACA_C3673 was carried out by genetic editing according to the protocol described by Wasels et al. 2020, respectively using the primer pairs CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO: 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO: 55); CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO: 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO: 44); CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO: 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO: 46) when validating the edition.
  • ACA_C3673 were carried out in quintuplicate on CGM medium containing 30 mM xylose ( Figure 5). The results reveal an improvement in generation time when growing on xylose as a carbon source. In addition, the joint inactivation of the genes encoding the AraR and XylR repressors allows an improvement of +171% in generation time compared to the wild strain.

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Abstract

La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l'élimination ou la modification de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d'un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.

Description

BACTERIES CLOSTRIDIUM MODIFIEES POUR ASSIMILER PLUSIEURS SUCRES
SIMULTANEMENT, PREPARATION ET UTILISATIONS DE CELLES-CI
La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination ou la modification de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Le genre Clostridium contient des bactéries à Gram positif, anaérobies strictes et sporulantes, appartenant au phylum des Bacillota. Les Clostridia sont un groupe d’importance pour la communauté scientifique pour plusieurs raisons. La première est qu’un certain nombre de maladies graves (e.g. tétanos, botulisme) sont dues à des infections de membres pathogènes de cette famille (John & Wood, 1986). La deuxième est la possibilité d’utiliser des souches dites acidogènes ou solvantogènes en biotechnologie. Ces Clostridia, non pathogènes, ont naturellement la capacité de transformer une variété importante de sucres pour produire des espèces chimiques d’intérêt, et plus particulièrement de l’acétone, du butanol, et de l’éthanol (John & Wood, 1986) au cours d’une fermentation dite ABE. La bactérie Clostridium acetobutylicum est aujourd’hui considérée comme un représentant modèle des Clostridium solvantogènes.
Les Clostridium solvantogènes sont capables d’assimiler une large variété de sources carbonées, ce qui est un atout pour les procédés de fermentation ABE (Keis, Shaheen et Jones 2001). Cette versatilité leur permet en théorie de proliférer efficacement sur de larges gammes de substrats, notamment sur des co-produits issus de l’agro-industrie (Qureshi ét al. 2008; Ezeji, Qureshi et Blaschek 2007; Ezeji et Blaschek 2008; Qureshi et al. 2006). Grâce à l’essor des procédés industriels de fermentation, et plus récemment de la chimie verte, l’incorporation de la biomasse végétale dans les procédés industriels tend à se répandre. Or, une catégorisation des substrats végétaux s’est vite généralisée à l’ensemble de l’industrie, mettant en opposition deux « générations » de substrats industriels, sur la base de considérations environnementales et humaines.
Les substrats dits de première génération (« IG »), regroupent toutes les sources carbonées issues des organes de réserve des végétaux. Les substrats IG peuvent en particulier être issus de maïs, de blé, mais aussi de canne à sucre ou de betterave. Majoritairement constitués de saccharose et d’amidon, leur fermentation à l’échelle industrielle est aujourd’hui très efficace. En revanche, l’utilisation de ces substrats est sujette à controverse, puisqu’ils nécessitent l’utilisation de terres arables et de denrées exploitées par l’industrie agroalimentaire.
En opposition à ce paradigme, les substrats de seconde génération (« 2G ») rassemblent tous les substrats issus d’organes de structure de plantes, ou de co-produits de F agro-industrie. Ce faisant, cette approche contribue à réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation. Leur utilisation est cependant beaucoup moins aisée que les substrats IG. En cause, la source de carbone majoritaire de ces substrats : la lignocellulose, matrice polymérique complexe et récalcitrante. Sa dégradation en sucres fermentescibles nécessite des prétraitements plus ou moins coûteux, et pouvant générer des inhibiteurs de croissance microbienne.
Du fait de la nature complexe des différentes fractions dont ils sont issus, les hydrolysats d’hémicellulose contiennent diverses sources carbonées. Parmi celles-ci on trouve majoritairement le xylose et le glucose, accompagnés d’un mélange de sucres minoritaires comme le galactose, le mannose et F arabinose. Tous ces sucres sont fermentescibles par les espèces solvantogènes de Clostridium. Par exemple, Clostridium cellulovorans DSM 743B est décrite par Wen et al. (2020) comme une souche susceptible d’être manipulée afin d’optimiser la production de //-butanol à partir de lignocellulose, et WO 2013/159710 décrit une bactérie C. beijerinckii modifiée présentant une capacité de consommation augmentée de xylose et/ou d’ arabinose. En pratique cependant, un processus biologique connu sous le terme de Répression Catabolique (RC), empêche l’utilisation optimale et simultanée de toutes ces sources de carbone. En particulier, la répression catabolique empêche la métabolisation efficace du xylose contenu dans les hydrolysats de lignocellulose. La bactérie C. acetobutylicum en particulier est sensible à ce phénomène de répression (Qureshi et al. 2006; Grimmler et al. 2010). Hu et al. (2011) enseignent que l’inactivation du gène xylR (CA_C2613) au sein de la souche ATCC 824 de C. acetobutylicum entraîne une utilisation plus rapide du xylose qui n’impacte toutefois pas la quantité totale de xylose fermentée. WO 2013/159710 déconseille à l’homme du métier l’inactivation de xylR (CAC3673) chez C. acetobutylicum.
RESUME DE L’INVENTION
Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries du genre Clostridium, typiquement les bactéries solvantogènes, aptes à consommer, de manière simultanée, des sources de carbone différentes, en particulier des sucres différents. Ils décrivent en particulier, pour la première fois, une bactérie C. acetobutylicum apte à consommer, de manière simultanée, du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de F arabinose.
Les inventeurs décrivent en particulier une bactérie génétiquement modifiée, appartenant au genre Clostridium, en particulier une bactérie solvantogène, n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR et/ou araR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et/ou CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel XylR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR, en particulier les produits des gènes CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Une autre bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel AraR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas le produit du gène araR, en particulier le produit du gène CA_C1340, ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit.
Une autre bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est une bactérie n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Des bactéries génétiquement modifiées particulièrement préférées selon l’invention correspondent à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 968 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673 ou araR AxylRl xylR2), et à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 967 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ACA_C1340 ou t iraR), utilisable pour préparer une souche équivalente à la souche IFP 968. L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci.
Les inventeurs décrivent en outre un procédé de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier un procédé comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et/ou araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et/ou AraR fonctionnelles, ainsi que les bactéries modifiées génétiquement susceptibles d’être obtenues par ce procédé, dont les bactéries IFP 967 et IFP 968 sont des exemples.
Ils décrivent aussi l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprime une version non fonctionnelle du gène xylR ou araR, telle que la souche IFP 967, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
Les inventeurs décrivent par ailleurs l’utilisation d’un bactérie selon l’invention pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée par exemple à partir i) d’une biomasse lignocellulosique, ii) du produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, une culture de plantes pérennes fourragères, une culture d’herbacées ou une culture arbustive, ou iii) de substrat(s) IG issu(s) d’une ou plusieurs plantes sucrières, céréalières, ou oléagineuses, ou iv) d’un mélange de telles sources carbonées. Ils décrivent aussi rutilisation des bactéries selon l’invention pour fermenter simultanément (ou en d’autres termes, pour « cofermenter ») au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. De telles bactéries peuvent être avantageusement utilisées pour produire un solvant ou un mélange de solvants, en particulier à l’échelle industrielle.
L’invention concerne aussi un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte.
Les inventeurs décrivent enfin des kits, en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, et un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention et ii) un milieu, en particulier un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de 1’ arabinose et/ou du xylose.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genre Clostridium, en particulier sur les bactéries solvantogènes, restent très limitées. Une contrainte majeure rencontrée par les industriels concerne leur incapacité à utiliser simultanément plusieurs sources distinctes de carbone et donc à métaboliser efficacement différents types de substrats, en particulier différents types de sucres.
Malgré les difficultés, bien connues de l’homme du métier, rencontrées pour modifier génétiquement les bactéries appartenant au genre Clostridium, les inventeurs sont parvenus, pour la première fois dans le contexte de la présente invention, à obtenir une bactérie C. acetobutylicum capable d’utiliser simultanément, i.e., de coassimiler, cométaboliser ou cofermenter (ces termes étant utilisés de manière indistincte dans le présent texte) plusieurs sources distinctes de carbone, en particulier issues de biomasse, notamment de biomasse végétale, par exemple de biomasse lignocellulosique.
Une « biomasse brute », dite aussi « biomasse native », préférée dans le cadre de l’invention est une biomasse végétale, en particulier une biomasse lignocellulosique. Cette dernière comprend essentiellement trois constituants naturels (polymères) présents en quantités variables selon son origine: la cellulose (environ 35 à 50% en masse sèche de la biomasse), qui est un polysaccharide essentiellement constitué d’hexoses, l’hémicellulose (environ 20 à 30% en masse sèche de la biomasse) qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses, et la lignine (environ 15 à 25% en masse sèche de la biomasse) qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d’alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s’organisent en un enchevêtrement complexe. Parmi ces trois polymères de base qui intègrent la biomasse lignocellulosique, la cellulose et l’hémicellulose sont ceux qui permettent la production de jus sucrés 2G et d’ alcool 2G.
Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux d’origine sylvicole, industrielle, urbaine ou ménagère. La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle ou ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple le miscanthus ou « herbe à éléphant » ou encore le switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).
Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat 1 G ou un mélange de plusieurs substrats IG issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, la palme). Dans le contexte de l’invention, la biomasse peut être utilisée seule ou un mélange, par exemple de plusieurs types de biomasse différents. La quantité d’eau contenue dans la biomasse brute est comprise entre 1% et 70 % de la masse totale de biomasse brute.
Les inventeurs sont ainsi avantageusement parvenus à modifier génétiquement, en ce sens, une bactérie solvantogène, la souche de référence C. acetobutylicum. Ils l’ont en particulier rendue apte à fermenter deux éléments carbonés de natures différentes, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés distincts choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose, encore plus préférentiellement du glucose et de 1’ arabinose.
Chez C. acetobutylicum, les gènes liés au catabolisme du xylose sont organisés sous la forme d’un régulon (Gu et al. 2010). Le principal opéron impliqué dans l’assimilation du xylose est le locus CA_C2610- CA_C2612, qui contient les gènes codant la xylose isomérase XylA (CA_C2610) et la xylulokinase XylB (CA_C2612) (Gu et al. 2010). Les gènes codant les perméases prédites comme impliquées dans l’import de xylose, AraEl (CA_C1339) et XylT (CA_C1345), sont localisés sur un second locus (CA_C1339- CA_C1349) contenant également des gènes liés à l’assimilation de l’arabinose. Un troisième opéron (CA_C3451-CA_C3452) contient les gènes codant les protéines XynT et XynB, correspondant respectivement à une perméase hypothétique et à une 1,4-P-D-xylosidase.
A l’exception de xylT, tous ces gènes possèdent dans leur promoteur ou leur séquence codante des séquences opératrices XylR-binding-site (XBS) (Gu et al. 2010). La présence du XBS a pour effet de placer ces gènes sous le contrôle d’un répresseur xylose, nommé XylR, capable d’empêcher la transcription en T absence de xylose dans le milieu.
Le gène CA_C2613 est situé en amont du gène xylB au sein de l’opéron principal d’assimilation du xylose. Cette organisation est très similaire à ce qui est observé chez les espèces possédant un répresseur du xylose (Gu et al. 2010).
Le gène CA_C3673 possède un XBS au niveau de son promoteur, suggérant une autorégulation de sa transcription. Le produit de ce gène est également le répresseur présentant le plus d’identité avec des homologues de XylR appartenant à des Clostridium solvantogènes proches, tels que C. beijerinckii NCIMB 8052.
Les gènes impliqués dans l’assimilation de 1’ arabinose sont pour la plupart situés au sein du locus CA_C1339-CA_C1349. Ce locus comprend les gènes codants les transporteurs présumés de l’arabinose AraEl et XylT, les L-arabinose isomérases AraAl (CA_C1342) et AraA2 (CA_C1346), la ribulokinase AraK (CA_C1344) et la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase AraD (CA_C1341).
Un second opéron contient les gènes CA_C1529 et CA_C1530 qui codent l’arabinofuranosidase Arb43 et le transporteur d’ arabinoside AraT.
Tous ces gènes, ainsi que le gène codant la phosphocétolase Xfp sont placés sous contrôle du répresseur transcriptionnel AraR (CA_C1340), actif en l’absence d’ arabinose (Zhang et al. 2012).
Une particularité récemment mise en évidence chez C. acetobutylicum est la différence phénotypique qui existe entre la croissance sur xylose et celle sur arabinose, bien que les voies métaboliques permettant l’assimilation de ces sucres possèdent de nombreux intermédiaires communs (Servinsky et al. 2010). En effet, alors que le temps de génération sur arabinose est de 78 min, celui-ci atteint 287 min sur xylose (Servinsky et al. 2012). Si les activités xylose-perméase et xylulokinase ont été mises en cause, cette différence s’explique également par l’action de facteurs de régulation transcriptionnels.
L’analyse transcriptomique de cultures de C. acetobutylicum ATCC 824 en présence de glucose, de xylose ou d’ arabinose révèle que la voie des pentoses phosphate est induite de façon analogue par le xylose et l’arabinose (Servinsky et al. 2010). En revanche, l’expression de la phosphocétolase Xfp présente un profil d’expression différent. En effet, xfp est faiblement induit par le xylose (d’un facteur 3 comparé au glucose) mais fortement induit par l’arabinose (d’un facteur 185 comparé au glucose) (Servinsky et al. 2012). Le contraste marquant d’induction de l’expression du gène xfp en absence d’ arabinose peut être expliqué par la présence d’un AraR-binding-site en amont de ce gène. Ainsi, Tune des conséquences les plus remarquables lors de l’analyse transcriptomique d’un mutant dont le gène araR a été inactivé est l’amélioration de la transcription du gène xfp d’un facteur supérieur à 1000 (Zhang et al. 2012). Cette régulation transcriptionnelle de la phosphocétolase contribue à entraver partiellement l’assimilation du xylose en absence d’ arabinose.
Des travaux récents montrent en outre qu’en plus de subir une répression partielle en l’absence d’ arabinose, l’assimilation du xylose est réduite en présence d’ arabinose. En effet, des cultures réalisées en présence de xylose et d’ arabinose montrent une consommation minime de xylose, alors que le taux d’assimilation de 1’ arabinose ne diffère pas du taux observable sur arabinose seul (Aristilde et al. 2014). Une analyse des flux métaboliques confirme l’assimilation préférentielle de 1’ arabinose par rapport au xylose de culture sur ces deux sucres (Aristilde et al. 2014). Servinsky et al. ont également montré que la préférence de l’arabinose sur le xylose ne peut pas s’expliquer entièrement par les taux de croissance inhérents à ces deux hydrates de carbone. Ils ont ainsi mis en évidence le fait que l’arabinose serait capable d’inhiber spécifiquement l’expression de gènes d’assimilation d’autres sucres, dont ceux du xylose.
Les inventeurs montrent pour la première fois que l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet d’obtenir une souche présentant des capacités de coassimilation étonnantes, puisque capable d’assimiler et/ou de métaboliser de manière simultanée deux sources carbonées distinctes telles que l’arabinose et le glucose, sans lever la répression catabolique sur l’assimilation du xylose.
Un objet décrit par les inventeurs vise ainsi une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, en particulier une espèce de Clostridium d’intérêt industriel, en particulier C. acetobutylicum, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et/ou araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène xylR » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou la séquence SEQ ID NO : 2 (CA_C3673). Le terme « gène xylR » vise aussi les variants desdites séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec l’une desdites séquences SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène araR » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou un variant de ladite séquence, en particulier un variant présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 3.
Un exemple typique de variant selon l’invention présente une homologie de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec la SEQ ID NO : 2 ou avec la séquence SEQ ID NO : 3 comprise entre 95% et 100%, et de préférence entre 96% et 100%. La séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant sont par exemple homologues à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, ou à au moins 99%. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant présentent des séquences homologues à au moins 96%, au moins 97%, ou au moins 98%.
Le terme « gène xylR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose, par exemple apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA » (codée par le gène CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le gène codant la xylulokinase « XylB » (codée par le gène CA_C2612, SEQ ID NO : 5), un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraEl » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6), la protéine « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7), ou la protéine « XynT » (codée par le gène CA_C3451, SEQ ID NO : 8), et le gène codant la 1,4-P-D-xylosidase « XynB » (codée par le gène CA_C3452, SEQ ID NO : 9).
Le terme « gène xylR » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur (SEQ ID NO : 10) du gène « xylA » (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le promoteur (SEQ ID NO : 11) du gène « xylB » (CA_C2612, SEQ ID NO : 5) ou une séquence opératrice « XBS » (XylR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaître une séquence XBS (XylR- Binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 12 ou la SEQ ID NO : 13, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression desdits gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène xylR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose telle que décrite ci-dessus.
Le terme « gène araR » vise aussi une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence d’arabinose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de F arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose ou de F arabinose.
Le terme « gène araR » vise aussi une séquence apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, par exemple en l’absence d’arabinose, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de F arabinose « XylA », tel que « AraEl » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6) ou « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7) ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraAl » (codée par le gène CA_C1342, SEQ ID NO : 14) ou « AraA2 » (codée par le gène CA_C1346, SEQ ID NO : 15) ; le gène codant la ribulokinase « AraK » (codée par le gène CA_C1344, SEQ ID NO : 16) ; le gène codant la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase « AraD » (codée par le gène CA_C1341, SEQ ID NO : 17) ; le gène codant F arabinofuranosidase « Arb43 » (codée par le gène CA_C1529, SEQ ID NO : 18) ; le gène codant le transporteur d’arabinoside « AraT » (codée par le gène CA_C1530, SEQ ID NO : 19) ; et le gène xfp (CA_C1343, SEQ ID NO : 20) codant une phosphocétolase .
Le terme « gène araR » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur d’un gène « ara » tel que « araEl », « araAl », « araA2 », « araK » ou « araD », par exemple une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, et SEQ ID NO : 24, ou une séquence opératrice « ABS » (AraR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, et SEQ ID NO : 27. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaître une séquence ABS (AraR-binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 25 ou la SEQ ID NO : 26, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’un ou plusieurs desdits gènes codant une enzyme impliquée dans la voie d’assimilation de F arabinose.
Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène araR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence d’ arabinose,, l’expression d’une enzyme telle que décrite ci-dessus de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de F arabinose.
Lorsque le présent texte fait référence à une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et/ou araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, l’expression « version non fonctionnelle du produit du gène » xylR, ou araR, désigne une protéine, typiquement une protéine identifiée dans le présent texte en tant que « XylR » ou « AraR », non fonctionnelle, i.e., incapable d’exercer la fonction de la protéine codée par la version sauvage du gène visé. Dans le cas du produit du gène xylR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de F arabinose, par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA », le gène codant la xylulokinase « XylB », un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraEl », la protéine « XylT », ou la protéine « XynT », et le gène codant la 1,4-P-D-xylosidase « XynB ».
Dans le cas du produit du gène araR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de la voie d’assimilation de l’arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose. Cette protéine est par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de l’arabinose « XylA », tel que « AraEl » ou « XylT » ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraAl » ou « AraA2 » ; le gène codant la ribulokinase « AraK » ; le gène codant la L-ribulose-5- phosphate 4-epimerase « AraD » ; le gène codant l’arabinofuranosidase « Arb43 » ; le gène codant le transporteur d’ arabinoside « AraT » ; et le gène xfp codant une phosphocétolase.
Par « bactérie du genre Clostridium », on entend en particulier les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genre Clostridium. L’expression « bactérie du genre Clostridium » englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles- ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance.
Par « espèce de Clostridium d’intérêt industriel » ou bactérie « Clostridium d’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants tels que l’éthanol, le butanol, l’acétone ou l’isopropanol et/ou des acides tels que l’acide butyrique ou l’acide acétique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, 1’ arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polysaccharides ou polyosides tels que la cellulose ou une hémicellulose, et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genre Clostridium (CO, CO2, et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genre Clostridium productrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol, telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol], « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (par réduction de l’acétone), de butanol et d’éthanol] et « souche AIBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, d’isopropanol, de butanol et d’éthanol]. Des bactéries solvantogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi, sans être limitées à, C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum et C. tyrobutyricum, de manière préférée parmi C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C. tyrobutyricum et C. cellulolyticum, et de manière encore plus préférée parmi C. acetobutylicum et C. beijerinckii. Une bactérie solvantogène préférée entre toutes est C. acetobutylicum.
Les bactéries acétogènes d’intérêt sont des bactéries productrices d’acides et/ou de solvants à partir de CO2 et H2. Des bactéries acétogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi C. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes et C. carboxidivorans .
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche ABE », de préférence la bactérie C. acetobutylicum, par exemple la souche DSM 792 (également désignée souche ATCC 824 ou encore LMG 5710) de C. acetobutylicum.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche ABE », de préférence la bactérie C. beijerinckii, par exemple la souche la souche NCIMB 8052 de C. beijerinckii.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche IBE », de préférence un sous-clade de C. beijerinckii sélectionné parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 et NCCB 27006. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la bactérie selon l’invention appartenant au genre Clostridium est une bactérie Clostridium d’intérêt industriel, en particulier une bactérie solvantogène, capable, à l’état sauvage, de produire des solvants et/ou des acides par fermentation à partir d’une source de carbone, ladite source de carbone étant choisie par exemple parmi un sucre, du CO, du CO2, un alcool, et un acide organique. Dans un mode de réalisation particulier préféré, la source de carbone est un sucre, en particulier un sucre comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose ou 1’ arabinose, un sucre comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose, le fructose ou le mannose, ou un polysaccharide ou polyoside tels que la cellulose ou l’ hémicellulose.
Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérie Clostridium apte à fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose. Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérie Clostridium apte à fermenter simultanément les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
L’homme du métier peut ainsi aisément vérifier si ladite bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, en mettant en culture ladite bactérie sur un substrat comprenant plusieurs sources de carbone (par exemple selon la méthode enseignée par Grimmler et al., 2010) : si la bactérie fermente/ assimile aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée (versus consécutive, i.e., les unes à la suite des autres), il s’agit d’une bactérie selon l’invention. Ainsi, une bactérie Clostridium sauvage mise en présence d’un substrat comprenant du glucose, de 1’ arabinose et du xylose, fermente d’abord le glucose, puis l’arabinose puis le xylose. Au contraire, une bactérie selon l’invention est capable de fermenter/ d’assimiler simultanément (i.e. en même temps) au moins deux des trois sucres présents au sein du substrat, à savoir dans l’exemple fourni le glucose et l’arabinose (le xylose étant assimilé dans un second temps). Une autre manière simple de vérifier facilement si la bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, consiste à mesurer la vitesse de croissance de la bactérie. L’observation chez cette bactérie d’une croissance plus rapide qu’une croissance observable chez une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone, sera considérée comme un indice d’obtention de la bactérie à l’aide d’un procédé selon l’invention (comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles). Concrètement, l’homme du métier considère qu’une bactérie Clostridium sauvage présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,10 et environ 0,25 ; préférentiellement d’environ 0,15 ; sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone (Servinsky et aL, 2010). Les inventeurs ont observé qu’une bactérie modifiée selon l’invention présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,45 et environ 0,60 ; préférentiellement supérieur à environ 0,50, sur un tel milieu. Une autre méthode permettant de vérifier si la bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, consiste à séquencer les loci CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 et à vérifier s’ils ont, ou n’ont pas, été modifiés par rapport à leur version sauvage, en vue d’empêcher ou de diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
Une bactérie particulièrement préférée appartient à l’espèce C. acetobutylicum et, comme expliqué ci- dessus, n’exprime pas les produits des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, ou exprime des versions non fonctionnelles desdits produits d’expression.
Cette bactérie particulièrement préférée présente les aptitudes techniques décrites ci-dessus, i.e., elle est capable de fermenter/ assimiler aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée, et elle croît plus vite qu’une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone.
Une telle souche est caractérisée pour la première fois dans le cadre de la présente demande.
Cette souche a été enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG. Dans cette souche, les gènes xylR et araR ont été (conjointement) inactivés. La description concerne également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènes xylR et araR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.
Un autre objet de l’invention vise l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour fermenter simultanément deux sources distinctes de carbone, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est par exemple capable de fermenter simultanément du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, du glucose et du mannose, du glucose et du galactose, de l’arabinose et du xylose, de l’arabinose et du mannose, de l’arabinose et du galactose, du xylose et du mannose, du xylose et du galactose ou du mannose et du galactose.
Dans un mode de réalisation particulier préféré, la bactérie selon l’invention est apte à fermenter un substrat comprenant au moins deux sucres choisis parmi glucose, arabinose et xylose, par exemple du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, ou de l’arabinose et du xylose.
La bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut être avantageusement utilisée pour produire un solvant, par exemple un biocarburant, ou un mélange de solvants, par exemple un mélange de biocarburants, en particulier à l’échelle industrielle. L’invention vise aussi un procédé de fermentation, typiquement un procédé industriel, impliquant F utilisation d’une bactérie selon l’invention.
Grâce à la présente invention, l’utilisation de substrats de seconde génération (« 2G »), notamment de lignocellulose, est désormais grandement facilitée. La présente invention offre une solution bienvenue qui permettra de réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation.
Une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut aussi être avantageusement utilisée pour produire un sucre ou une molécule biosourcée à partir d’une biomasse, en particulier une biomasse lignocellulosique, ou à partir d’une culture énergétique dédiée.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par « molécule biosourcée » une molécule dont la spécificité est que la matière première utilisée pour sa production est obligatoirement issue de biomasse végétale, préférentiellement de biomasse lignocellulosique, et non pas issue de ressources d’origines fossiles telles que le pétrole, le charbon ou le gaz naturel.
Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux.
La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle, ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple miscanthus ou « herbe à éléphant », switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).
Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat IG issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, ou la palme).
L’invention vise par ailleurs un procédé de production d’une bactérie recombinante selon l’invention, comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
Les procédés de modification connus les plus performants pour obtenir des souches modifiées génétiquement sont basés sur des événements de recombinaison homologue, ceux-ci permettant de modifier le génome de manière précise et stable.
Un procédé de production particulier selon l’invention comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt.
Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genre Clostridium en vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genre Clostridium, les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »).
Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.
Dans un mode de réalisation particulier décrit, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique connu de l’homme du métier, typiquement tout outil basé sur la recombinaison homologue.
Dans un mode de réalisation particulier préféré, une partie de l’acide nucléique d’intérêt reconnaît en outre (lie au moins en partie), et de préférence cible, i.e. reconnaît et permet la coupure, dans le génome d’une bactérie Clostridium d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence cible, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence cible, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence cible. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».
Dans ce même mode de réalisation particulier préféré, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 15 et 30 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides.
Le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables de supprimer la ou lesdites séquences cibles du génome de la bactérie ou de modifier leur expression, par exemple de les moduler/ réguler, en particulier de les inhiber, de préférence de les modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences.
Les « acides nucléiques d’intérêt », typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Des séquences ORI d’intérêt peuvent par exemple être choisies parmi pIP404, pAMpi, repH (origine de réplication chez C. acetobutylicum), ColEl ou rep (origine de réplication chez E. colï), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium. Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies par exemple parmi celles des gènes adc, thl, de l’opéron bcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmi ermB, catP, bla, tetA, tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline, ou à tout autre antibiotique, bien connu de l’homme de l’art, pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genre Clostridium.
L’acide nucléique d’intérêt peut être un ARN naturel, synthétique ou produit par une technique de recombinaison. Cet acide nucléique d’intérêt peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’amplification. Lorsque le ou les acides nucléiques d’intérêt sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), par exemple d’ARN guide (ARNg), ces molécules peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et d’augmenter ainsi leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l’inosine, la méthyl-5-désoxy cytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l’hybridation.
Les acides nucléiques d’intérêt utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme le sont par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme le sont par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2’-O-alkyl riboses ou les PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al., 1992).
Dans le contexte de la présente description, un exemple particulier d’acide nucléique d’intérêt, utilisé pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR. Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique d’intérêt est sélectionné parmi le plasmide pGRNA- ACA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-ACA_C2613 de séquence SEQ ID NO :
29 ou le plasmide pGRNA-ACA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30.
Un acide nucléique d’intérêt particulier décrit par les inventeurs est par exemple un vecteur, de préférence un plasmide, par exemple le plasmide pGRNA-ACA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-ACA_C2613 de séquence SEQ ID NO : 29 ou le plasmide pGRNA-ACA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30, décrits dans la partie expérimentale de la présente description.
La ou l’une des séquences reconnues (séquence(s) cible(s)) est de préférence l’une des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 correspondant aux gènes xylR et araR codant respectivement une protéine XylR et la protéine AraR, ou une séquence d’acides aminés identique à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à ladite protéine, ou une séquence comprenant tout ou au moins 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3. Autrement formulé, la séquence reconnue peut être une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.
Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut aussi être une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment, typiquement une séquence promotrice, par exemple la séquence promotrice (SEQ ID NO : 10) du gène « XylA » (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), ou celle (SEQ ID NO : 11) du gène « XylB » (CA_C2612, SEQ ID NO : 5). L’acide nucléique d’intérêt reconnaît alors, et est donc typiquement capable de se lier à une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment.
Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut être une séquence flanquant une séquence codante telle que décrite précédemment, par exemple une séquence flanquant la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, ou une séquence identique à au moins 70% à celle-ci. Une telle séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et
30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides.
Selon un aspect particulier, la séquence cible correspond à la paire de séquences flanquant une telle séquence codante, chaque séquence flanquante comprenant typiquement au moins 20 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides, de préférence entre 200 et 800 nucléotides.
De préférence, le procédé selon l’invention de production d’une bactérie recombinante comprend la transformation de la cellule bactérienne à l’aide d’au moins un acide nucléique d’intérêt, par exemple deux ou trois acides nucléiques d’intérêt tels que décrits précédemment, le ou lesdits acides nucléiques d’intérêt étant capables i) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR, et ii) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur AraR.
Comme expliqué plus haut, la séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR est également identifié dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».
L’acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le cadre de la présente invention est de préférence capable de supprimer ladite séquence cible du génome de la bactérie ou de modifier son expression, par exemple de la moduler/ réguler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une protéine (typiquement une protéine AraR ou XylR), en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’acide nucléique d’intérêt est capable de modifier la bactérie de manière à la rendre incapable d’exprimer l’une et/ou l’autre des protéines AraR et XylR.
L’introduction dans la bactérie de tout acide nucléique d’intérêt peut être réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelstein et al, 1993).
Par ailleurs, ces acides nucléiques d’intérêt (par exemple les fragments d’ADN, fragments d’ ARN, cassettes d’expression ou vecteurs d’expression) peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques elles-aussi bien connues de l’homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie telle que décrite dans le présent texte, comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt selon l’invention tel que décrit plus haut et fait intervenir un outil de modification génétique par exemple un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple basé sur l’utilisation d’introns de type II (par exemple l’outil Targetron® ou l’outil ClosTron®) etun outil d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®).
Le procédé pour transformer, et de préférence en outre modifier génétiquement, une bactérie Clostridium peut comprendre en outre une étape d’obtention, de récupération, de sélection ou d’isolement de la bactérie transformée, i.e. de la bactérie présentant la ou les recombinaisons/modifications/optimisations recherchées.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation de (met en œuvre) la technologie / l’outil génétique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats), en particulier l’outil génétique CRISPR/Cas (CRISPR-associated protein). La présente invention peut être mise en œuvre à l’aide d’un outil génétique CRISPR/Cas classique utilisant un unique plasmide comprenant une nucléase, un ARNg et une matrice de réparation tel que décrit par Wang et al. (2015). L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarlo et al., 2013). Les inventeurs ont autrement mis au point et décrit un outil génétique de modification de bactéries, adapté aux bactéries du genre Clostridium, utilisable dans le contexte de la présente invention, basé sur l’utilisation de deux plasmides (cf. WO2017/064439, Wasels et al., 2017).
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple l’utilisation d’introns de type II, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®.
La technologie Targetron® repose sur rutilisation d’un intron de groupe II (basé sur l’intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis) reprogrammable, capable d’intégrer le génome bactérien rapidement à un locus désiré (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013), typiquement dans le but d’inactiver un gène ciblé. Les mécanismes de reconnaissance de la zone éditée ainsi que d’insertion dans le génome par rétro-épissage sont basés sur une homologie entre l’intron et ladite zone d’une part, et sur l’activité d’une protéine (ItrA) d’autre part. La technologie ClosTron® repose sur une approche similaire, complétée par l’ajout d’un marqueur de sélection dans la séquence de l’intron (Heap et al., 2007). Ce marqueur permet de sélectionner l’intégration de l’intron dans le génome, et facilite donc l’obtention des mutants désirés. Ce système génétique exploite également les introns de type I. En effet, le marqueur de sélection (appelé RAM pour retrotransposition- activated marker) est interrompu par un tel élément génétique, qui empêche son expression depuis le plasmide (une description plus précise du système : Zhong et al.). L’épissage de cet élément génétique se produit avant intégration dans le génome, ce qui permet l’obtention d’un chromosome présentant une forme active du gène de résistance. Une version optimisée du système comprend des sites FLP/FRT en amont et en aval de ce gène, ce qui permet d’utiliser la recombinase FRT pour éliminer le gène de résistance (Heap et al., 2010).
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®.
Fa technologie ACE® repose sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chez C. acetobutylicum ATCC 824 par délétion du gène pyrE, qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heap et al., 2012). Ee système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide (à très faibles copies), l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique peut être vérifiée grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. E’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locus pyrE soit au sein d’un autre locus. Dans le cas de l’intégration au locus pyrE, le gène pyrE est également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gène pyrE fonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gène pyrE non-fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état de pyrE entre fonctionnel et non-fonctionnel. Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, en opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile).
Dans les modes de réalisation décrits basés sur rutilisation d’introns de type II, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®, ou basés sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®, la séquence ciblée est typiquement l’une des séquences décrites dans le présent texte.
L’invention concerne par ailleurs un kit (trousse) pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium comprenant au moins un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte (par exemple deux acides nucléiques d’intérêt, typiquement fragment d’ADN, reconnaissant chacun une séquence cible) pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, et éventuellement une ou plusieurs molécules de sélection. Un kit particulier comprend les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil CRISPR (typiquement au moins un acide nucléique utilisable en tant qu’ARNg, un acide nucléique utilisable en tant que matrice de réparation, au moins une paire d’amorces, et un inducteur permettant l’expression d’une nucléase de type Cas9 ou MAD7), les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil basé sur l’utilisation d’ introns de type II (typiquement au moins un intron de type II, au moins une paire d’amorces et un inducteur permettant l’expression d’un rétrotranscriptase, par exemple type LtrA RT ou Tel4c RT), ou les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil d’échange allélique (typiquement au moins deux acides nucléiques utilisables en tant que matrice de recombinaison homologue, et au moins un couple d’amorces).
Les kits selon l’invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture, au moins une bactérie compétente du genre Clostridium (i.e. conditionnée en vue de la transformation), ou encore une notice explicative.
L’invention concerne typiquement un kit pour la mise en œuvre d’un procédé de transformation et/ou de modification génétique décrit dans le présent texte à l’aide d’une bactérie du genre Clostridium.
L’invention vise en particulier la bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium ayant pour caractéristique essentielle de ne pas exprimer les produits des gènes xylR et araR, ou d’exprimer des versions non fonctionnelles de ceux-ci, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, et leurs utilisations. La demande décrit aussi la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P- 32702 auprès de la collection BCCM-LMG, dans laquelle, le gène araR a été inactivé, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènes xylR et araR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.
Elle vise en particulier l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprime une version non fonctionnelle du gène xylR ou araR, par exemple la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
L’invention concerne par ailleurs un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention, par exemple IPF968, et ii) un milieu, typiquement un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie. Le kit peut en outre comprendre une notice explicative.
Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement (appartenant au genre Clostridium) selon l’invention présent au sein du kit est de préférence supplémenté en une source de carbone composée de glucose et d’au moins un pentose, de préférence i) de glucose et ii) d’ arabinose et/ou de xylose. Ce milieu comprend de préférence entre 0,1 et 250 g/L, plus préférentiellement entre 1 et 100 g/L, de ladite source de carbone (composée de glucose et d’au moins un pentose).
Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement est de préférence un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM.
L’invention concerne aussi un kit particulier pour produire un solvant ou un biocarburant, ou un mélange de solvants ou de biocarburants, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie (appartenant au genre Clostridium) modifiée génétiquement selon l’invention, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, et ii) un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement de F arabinose et/ou du xylose.
L’invention concerne par ailleurs les utilisations possibles du procédé ou du kit selon l’invention pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, typiquement une bactérie solvantogène du genre Clostridium, par exemple pour générer des variants améliorés de ladite bactérie. Elle concerne enfin les utilisations possibles du procédé, du kit ou d’une bactérie du genre Clostridium transformée et de préférence modifiée génétiquement selon l’invention, en particulier pour permettre la production de solvants ou biocarburants, ou de mélanges de ceux-ci, typiquement à l’échelle industrielle.
Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée. En particulier, ces exemples présentent l’obtention et la caractérisation de bactéries selon l’invention, dans lesquels l’inactivation de gènes araR et/ou xylR est réalisée selon un mode de réalisation particulier préféré à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9. Lesdits gènes peuvent être inactivés selon d’autres modes de réalisation particuliers, bien connus de l’homme de métier, basés par exemple sur l’inactivation de gène par recombinaison homologue ou par mutagénèse insertionnelle, comme expliqué ci-dessus.
FIGURES
[Fig 1] La Figure 1 représente la Carte du plasmide pBANak
[Fig 2] La Figure 2 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C1340
[Fig 3] La Figure 3 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C2613
[Fig 4] La Figure 4 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C3673
[Fig 5] La Figure 5 montre la Cinétique de croissance sur milieu CGM xylose 30 mM
[Fig 6 A] La Figure 6 A représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 sauvage, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose
[Fig 6B] La Figure 6B représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose
[Fig 6C] La Figure 6C représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C1340, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose
[Fig 6D] La Figure 6D représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose EXEMPLES
EXEMPLE n°l : Souche C. ACA C2613 ACA C3673
Matériels et méthodes
Conditions de culture
C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L 1, extrait de levure 10 g L 1, glucose 5 g L 1, NaCl 4 g L 1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4-7H2O, 0,40 g; MnSO4 H2O, 0,01 g; FeSO4-7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L 1, extrait de levure 5 g L 1, NaCl 10 g L 1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L 1 d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L 1 en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L 1 respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L 1 en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :
C A_C2613_LH A_Fwd : A A A A A AG A ATTC ATTTGTCC ACTTAT ACC A ATTCCT (SEQ ID NO : 31 )
CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)
CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)
CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34) gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35) gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)
CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37)
CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38)
CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39)
CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40) gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41) gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42) CA_C2613_verif_Fwd : TCGGC AGO AAAAACTCC AGT (SEQ ID NO : 43) CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 44) CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 45) CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 46) Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)
Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.
- Plasmide N°2 : pGRNA_ACA_C2613 (SEQ ID NO : 29)
Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaL II contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.
- Plasmide N°3 : pGRNA_ACA_C3673 (SEQ ID NO : 30)
Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.
Transformation des souches de C. acetobutylicum
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.
Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1) et CA_C3673 (SEQ ID NO : 2) Les inactivations des gènes CA_C2613 et CA_C3673 dans les souches ACA_C2613-ACA_C3673, ont été réalisées par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C2613 et CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.
Résultats
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C2613 ACA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5).
Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes CA_C2613 et CA_C3673 permet une amélioration de 33 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Suivi de consommation d’un mélange de sucres
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que l’inactivation conjointe de CA_C2613 et CA_C3673 ne présente pas de modification phénotypique significative par rapport à la souche sauvage.
Exemple n°2 : souche IFP 967 (LMG P-32702), C. acetobutylicum ACA C1340
Matériels et méthodes
Conditions de culture
C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L 1, extrait de levure 10 g L 1, glucose 5 g L 1, NaCl 4 g L 1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4-7H2O, 0,40 g; MnSO4 H2O, 0,01 g; FeSO4-7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L 1, extrait de levure 5 g L 1, NaCl 10 g L 1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L 1 d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L 1 en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L 1 respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L 1 en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :
CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48) CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)
CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50) CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51) gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52) gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53) C A_C 1340_verif_Fwd : CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO : 54) CA_C 1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)
Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)
Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.
- Plasmide N°4 : pGRNA_ACA_C1340 (SEQ ID NO : 28)
Il contient tous les éléments du pGRNAmd (Wasels et al. 2020) avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali. Transformation des souches de C. acetobutylicum
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.
Edition génétique du gène CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :
L’inactivation du gène CA_C1340 dans les souches ACA_C1340 a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus le produit du gène CA_C1340 ou exprimant une version non fonctionnelle de celui-ci.
Résultats
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5).
Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation du gène codant le répresseur AraR permet une amélioration de + 152 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Suivi de consommation d’un mélange de sucres
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que l’inactivation de CA_C1340 permet d’obtenir une cinétique de consommation de 1’ arabinose en présence de glucose plus rapide que celle observée chez la souche sauvage. Tl
3 : souche IFP 968 ACA C1340-ACA C2613-
ACA C3673
Matériels et méthodes
Conditions de culture
C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L 1, extrait de levure 10 g L 1, glucose 5 g L 1, NaCl 4 g L 1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4-7H2O, 0,40 g; MnSO4 H2O, 0,01 g; FeSO4-7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L 1, extrait de levure 5 g L 1, NaCl 10 g L 1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L 1 d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L 1 en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L 1 respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L 1 en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :
CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48)
CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)
CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50)
CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51) gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52) gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53) C A_C 1340_verif_Fwd : CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO : 54) CA_C 1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)
C A_C2613_LH A_Fwd : A A A A A AG A ATTC ATTTGTCC ACTTAT ACC A ATTCCT (SEQ ID NO : 31 )
CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)
CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)
CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34) gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35) gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)
CA_C2613_verif_Fwd : TCGGC AGO AAAAACTCC AGT (SEQ ID NO : 42)
CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 43)
CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37) CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38) CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39) CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40) gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41) gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42) CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 44) CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 45)
Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 52)
Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.
- Plasmide N°4 : pGRNA_ACA_C1340 (SEQ ID NO : 28)
Il contient tous les éléments du pGRNAhd (Wasels et al. 2020) avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.
- Plasmide N°2 : pGRNA_ACA_C2613 (SEQ ID NO : 29)
Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali. - Plasmide N°3 : pGRNA_ACA_C3673 (SEQ ID NO : 30)
Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.
Transformation des souches de C. acetobutylicum
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.
Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1), CA_C3673 (SEQ ID NO : 2) et/ou CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :
Les inactivations des gènes CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 dans la souche ACA_C1340- ACA_C2613-ACA_C3673, a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) ; CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C1340, CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.
Résultats
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage, et ACA_C1340 ACA_C2613
ACA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5). Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet une amélioration de + 171 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Suivi de consommation d’un mélange de sucres
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que la coassimilation simultanée de 1’ arabinose et du glucose, est rendue possible lors de l’inactivation conjointe de CA_C1340 et des gènes CA_C2613 et CA_C3673.
La répression catabolique empêchant la coassimilation du xylose en présence des deux autres sucres est cependant maintenue. Ce résultat inattendu indique que la synergie entre l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet la levée de la répression catabolique pesant sur 1’ arabinose, tout en la maintenant pour le xylose.
Conclusions
Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer l’intérêt de l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR chez la souche C. acetobutylicum DSM 792, décrivant ainsi que la combinaison de ces modifications génétiques permet l’obtention d’une souche de C. acetobutylicum réalisant la coassimilation glucose/arabinose et présentant une croissance accélérée sur xylose seul. L’inactivation du gène araR seule ne permet pas une co-assimilation de l’arabinose et du glucose, qui n’est obtenue que lorsque les copies des gènes codant le répresseur XylR sont également inactivées. De plus, l’inactivation des deux copies du gène codant XylR n’est pas suffisante pour diminuer de façon significative le temps de génération du micro-organisme lorsqu’il croit sur un milieu contenant du xylose comme seule source de carbone. L’inactivation du gène codant AraR est nécessaire.
Ce résultat est important puisque cette souche souffre naturellement d’une incapacité à assimiler simultanément des pentoses et des hexoses tels que le glucose, l’arabinose et le xylose, impactant drastiquement les performances lors de fermentation sur des substrats composés d’un mélange de ces sucres, tels les substrats industriels de procédés de production de sucres à partir de biomasse. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie est une bactérie solvantogène, de manière préférée C. acetobutylicum.
3. Bactérie selon la revendication 1 ou 2, caractérisée i) en ce que la bactérie appartient à l’espèce C. acetobutylicum et n’exprime pas les produits des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci, de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci, et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci, ou ii) exprime des versions non fonctionnelles desdits produits d’expression.
4. Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu’elle est apte à fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose.
5. Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu’elle est apte à fermenter simultanément les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
6. Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu’elle croît plus vite qu’une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone.
7. Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la bactérie est la souche IFP 968 enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG.
8. Utilisation d’une bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le substrat comprend au moins deux sucres choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, pour produire un solvant, par exemple un biocarburant, ou un mélange de solvants, par exemple un mélange de biocarburants.
11. Utilisation d’une bactérie selon l’une des revendications 1 à 6 pour produire un sucre ou une molécule biosourcée à partir i) d’une biomasse lignocellulosique, ii) du produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, une culture de plante pérenne fourragère, une culture d’herbacées, une culture arbustive, ou iii) de substrat(s) IG issu(s) d’une ou plusieurs plantes sucrières, céréalières, ou oléagineuses, ou iv) d’un mélange de telles sources carbonées.
12. Procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie telle que décrite dans l’une quelconque des revendications 1 à 7.
13. Procédé de production d’une bactérie recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
14. Bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium susceptible d’être obtenue par le procédé selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite bactérie est une bactérie telle que décrite dans l’une des revendications 1 à 6.
15. Utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprime une version non fonctionnelle du produit du gène xylR ou araR, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’une des revendications 1 à 6 n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la bactérie modifiée génétiquement n’exprimant pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprimant une version non fonctionnelle du produit du gène xylR ou araR, est la souche IFP 967 enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P- 32702 auprès de la collection BCCM-LMG.
17. Kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à F aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, comprenant une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon la revendication 1 et un milieu de conservation de ladite bactérie.
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