EP4499806A1 - Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques - Google Patents

Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques

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Publication number
EP4499806A1
EP4499806A1 EP23711737.9A EP23711737A EP4499806A1 EP 4499806 A1 EP4499806 A1 EP 4499806A1 EP 23711737 A EP23711737 A EP 23711737A EP 4499806 A1 EP4499806 A1 EP 4499806A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrolysis
sucrose
aqueous medium
acidic
glucose
Prior art date
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Pending
Application number
EP23711737.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Mohamed Fadhel BEN CHAABANE
Etienne JOURDIER
Celine Cohen
Bernard Chaussepied
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IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP4499806A1 publication Critical patent/EP4499806A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the production of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes, particularly in the context of the production of sugars from cellulosic or lignocellulosic materials involving enzymatic hydrolysis of these materials.
  • Sugars can be used/recovered as is or continue their conversion into alcohol, particularly ethanol, by fermentation.
  • Lignocellulosic materials are cellulosic materials, that is to say made up of more than 90% by weight of cellulose, and/or lignocellulosic materials, that is to say made up of cellulose and hemicelluloses, which are essentially polysaccharides consisting of pentoses and hexoses, as well as lignin, which is a macromolecule of complex structure and high molecular weight, based on phenolic compounds.
  • biomass For the sake of brevity, in this text we can group them under the generic term biomass.
  • Wood, straw, corncobs are the most used lignocellulosic materials, but other resources, dedicated forest crops, residues of alcoholic, sugar and cereal plants, products and residues from the paper industry and processing products lignocellulosic materials can be used. They are mostly made up of about 35 to 50% cellulose, 20 to 30% hemicellulose and 15 to 25% lignin.
  • the biochemical transformation process of lignocellulosic materials into sugars and then possibly into ethanol includes a physico-chemical pretreatment step, followed by an enzymatic hydrolysis step using an enzymatic cocktail. It can continue with a step of ethanolic fermentation of the sugars released, the ethanolic fermentation and the enzymatic hydrolysis being able to be carried out simultaneously, and a purification step ethanol.
  • An example of such a process converting biomass into ethanol is described in patent EP 3,484,945, to which reference may be made for more details.
  • the enzymatic cocktail used for hydrolysis is a mixture of cellulolytic (also called cellulases) and/or hemicellulolytic enzymes.
  • Cellulolytic enzymes exhibit three main types of activities: endoglucanases, exoglucanases and cellobiases, the latter also being called p-glucosidases.
  • Hemicellulolytic enzymes notably exhibit xylanase activities.
  • Enzymatic hydrolysis is efficient and takes place under mild conditions.
  • the cost of producing enzymes remains very high, representing at least 20% of the cost of converting biomass into ethanol, for example.
  • a lot of work has been carried out to reduce this cost: firstly optimizing the production of enzymes, by selecting hyperproducing microorganisms and improving the production processes of said enzymes, reducing the quantity of enzymes in hydrolysis then, by optimizing the pretreatment step, by improving the specific activity of these enzymes, and by optimizing the implementation of the enzymatic hydrolysis step.
  • the cellulolytic microorganism most used for the industrial production of the enzymatic cocktail is the fungus Trichoderma reesei. Wild strains have the ability to secrete, in the presence of an inducing carbonaceous substrate, cellulose for example, the enzymatic cocktail considered best suited to the hydrolysis of cellulose. Other proteins with properties essential to the hydrolysis of lignocellulosic materials are also produced by Trichoderma reesei, xylanases for example.
  • the presence of an inducing carbon substrate is essential for the expression of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes.
  • the nature of the carbon substrate has a strong influence on the composition of the enzymatic cocktail. This is the case of xylose, which, associated with an inducing carbon substrate such as cellulose or lactose, makes it possible to significantly improve the so-called xylanase activity.
  • Recombinant strains were obtained from Trichoderma reesei strains Qm9414 (Mandels M. (1975). Microbial sources of cellulase. Biotechnol. Bioeng.5, 81 -105), RutC30 (Montenecourt, BS and Eveleigh, DE, Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782), CL847 (Durand et al, 1984, Proc. SFM Colloquium "Genetics of industrial microorganisms". Paris. H.
  • invertase into Trichoderma gives it the property of being able to consume sucrose, and therefore effluents including sweet juices from the washing of beets or sugar canes, and/or sugar molasses, the cost of which is less and/or greater availability. This is what has been verified, for example, in patent EP 2 222 865.
  • Lactose and glucose remain, in an industrial enzymatic cocktail production process, among the most suitable carbon substrates. Their cost, particularly that of glucose, is high and is likely to vary significantly.
  • the enzyme cocktail production process is also dependent on external carbon sources.
  • second-generation biofuel production sites can be the same as first-generation production sites, the whole constituting a “biorefinery” where all of the plant material is valorized.
  • biorefinery where all of the plant material is valorized.
  • the invention firstly relates to a process for producing cellulolytic and/or hemicellulytic enzymes by a cellulolytic and/or hemicellulolytic microorganism, said process comprising at least
  • sucrose a source of carbonaceous substrate
  • sucrose is a less expensive compound and has a more stable price than that of glucose, and similar in its sweetening properties.
  • sucrose is a disaccharide composed of glucose and fructose molecules combined via a glycosidic bond.
  • sucrose cannot be assimilated as it is by microorganisms of the type filamentous fungi like Trichoderma, because these microorganisms do not naturally have the invertase gene.
  • a first solution may consist of genetically modifying microorganisms to provide them with this gene.
  • the publication by Lucas Miranda Fonseca and al. “Rational engineering of the Trichoderma reesei RUT-C30 strain into an industrially relevant platform for cellulase production” published in the journal Biotechnology for biofuels (2020) thus proposes to make several genetic modifications on the RUT-C30 strain of T. reesei, allowing in particular the expression of the invertase gene, and therefore to be able to use at least partly sucrose as a carbon substrate in the process of producing enzymes from this modified strain.
  • this technique of targeted genetic modification is effective, it is complex to implement, and must be repeated as soon as we want to change the strain.
  • the invention therefore consisted not of modifying the strains, but of modifying the sucrose to make it assimilable.
  • This modification is an acid hydrolysis, which makes it possible to cut the glycosidic bond of the molecule so that it decomposes into glucose and fructose, both of which can be assimilated by the microorganisms targeted by the invention.
  • the cellulolytic and/or hemicellulolytic microorganism can be chosen to implement the invention from among the strains of fungi belonging to the genera Trichoderma, Aspergillus, Penicillium or Schizophyllum, and preferably belonging to the species Trichoderma reesei.
  • aqueous solution comprising glucose and fructose which can be used directly or after possible operations such as concentration adjustment (or other treatment such as filtration, etc.).
  • concentration adjustment or other treatment such as filtration, etc.
  • At least one inducing substrate can be added, in particular lactose, to the aqueous solution comprising glucose and fructose obtained at the end of phase c) of preparation, to use said solution as a substrate for the stage b) of production.
  • lactose can also be used as a carbonaceous growth substrate.
  • the process according to the invention can implement steps a) of growth and b) of production in the same bioreactor.
  • it can be implemented with a first bioreactor dedicated to step a) of growth, and a second bioreactor dedicated to step b) of production.
  • at least one inducing substrate in particular lactose, can be added to the acidic aqueous medium during step c1) of sucrose hydrolysis.
  • lactose is a disaccharide, like sucrose, but which is the combination of a glucose and a galactose via a glycosidic bond, which can be assimilated by the strains of fungus targeted by the invention.
  • lactose is significantly more difficult to hydrolyze under acidic conditions than sucrose. Even if a small part of lactose is hydrolyzed, the glucose and galactose resulting from its hydrolysis can also be assimilated by the strains.
  • This embodiment can be combined with the previous one, by adding the inducing substrate partly during the hydrolysis, partly at the end of the hydrolysis.
  • the aqueous solution obtained can be used immediately in the enzyme production installation. It can also be stored for later use, and the hydrolysis can advantageously continue during storage if necessary, generally at room temperature, the solution preferably being maintained at an acidic pH until use to limit the risk of contamination.
  • step d) of hydrolysis of sucrose can be carried out in an acidic aqueous medium at pH less than or equal to 5, in particular less than or equal to 4, in particular less than or equal to 3.5 or 3, of preferably between 1 and 3.
  • a strong acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid
  • hydrochloric acid or sulfuric acid is added to an aqueous solution in a sufficient quantity to adjust the pH of the solution to the chosen value.
  • a weak acid of organic acid type can be added.
  • Yet another alternative can be to acidify the aqueous solution by introducing carbon dioxide CO2 in gaseous form (bubbling): it is in fact a (weak) acid and it comes from the fermentation of sugars into alcohol in the process. conversion of biomass into alcohol. It is therefore available if the production of enzymes takes place at the biomass conversion site.
  • step c1) of hydrolysis of sucrose is carried out in an acidic aqueous medium at a temperature of at least 110°C, in particular between 110 and 125°C, in particular between 110 and 120°C, in order to also ensure the sterilization of said medium.
  • hydrolysis is accelerated if we heat the medium in which the hydrolysis is carried out, but not necessarily at such high temperatures. But carrying out the hydrolysis at at least 110°C makes it possible to carry out at the same time the sterilization of the solution, which is necessary for its introduction into the enzyme production process.
  • step c1) of hydrolysis of sucrose is carried out in an acidic aqueous medium comprising at least in part, in particular only, an acidic hemicellulosic hydrolyzate.
  • this hemicellulosic hydrolyzate comes from an acid pretreatment step of a lignocellulosic biomass, and it comprises monomers and oligomers of sugars mainly in C5.
  • this hydrolyzate is not used here directly as a carbonaceous substrate, but firstly as providing a (strongly) acidic medium for the prior hydrolysis of sucrose.
  • this hydrolyzate is acidic, because the pretreatment of biomass from which it is derived preferably includes an acid impregnation step, as an example is described in the aforementioned patent EP 3,484,945.
  • step c1) of hydrolysis can be carried out at a temperature less than or equal to 100°C, in particular less than or equal to 80°C, in particular between 30 and 60°C, because it does not It is no longer necessary to sterilize the solution obtained before using it.
  • hemicellulosic hydrolysates are acidic environments, which contain sugars, but also inhibitors generated during the acidic pretreatment of the biomass, such as acetic acid, furfural, 5-HMF or even phenolic compounds, which which greatly limits the risks of contamination.
  • the two variants can also be combined, using as acid hydrolysis medium a possibly diluted, concentrated hemicellulosic hydrolyzate, etc. and adding an acid or CO2.
  • different operating conditions can be selected, in particular depending on the variant chosen.
  • the temperature at which hydrolysis takes place, as well as the pH of the medium in which it takes place and the duration of hydrolysis are the most significant operating conditions. In general, it has been observed that hydrolysis occurs more quickly as the temperature is high and the pH is low.
  • step d) of hydrolysis of sucrose can be carried out in an acidic aqueous medium at a temperature of at least 110°C, at a pH of at most 5 and for a duration of preferably between 10 minutes and 10 hours. It is preferred for the implementation of the first variant, where it is necessary to sterilize the medium, or when (very) rapid hydrolysis is desired. And we note that in this case, where the temperature is high, we can adopt a slightly less acidic pH than with a lower temperature (when we are not trying to sterilize).
  • step c1) of hydrolysis of sucrose can be carried out in an acidic aqueous medium at a temperature of at most 100°C, in particular between 30 and 60°C, at a pH of at most 4, and for a duration preferably between 1 hour and 24 hours. It is preferred for the implementation of the second variant, particularly in the case where it is desired to have a relatively rapid hydrolysis duration.
  • Figure 1 represents the evolution of the biomass concentration (in the following examples, these are microorganisms in the form of fungi) over time in an enzyme production process with different carbon substrate solutions, (on the abscissa, the duration in hours, on the ordinate the quantity of biomass in g/l).
  • Figure 2 represents the evolution of the concentration of enzymes over time in a process for producing enzymes with different solutions of carbonaceous substrate (on the abscissa, the duration in hours, on the ordinate the quantity of enzymes in g/l ).
  • sucrose and lactose were first carried out (for comparison), in aqueous solutions of sulfuric acid at different pH and different temperatures, according to the first variant of the invention.
  • the solutions are separated into four, and the pH is adjusted with sulfuric acid, aiming for the following four pHs: 1.5; 2.0; 2.5-; 3.0.
  • Table 1 indicates the percentage of hydrolysis of sucrose for the different solutions, depending on whether they were sterilized according to conditions (1) or (2) - Table 2 indicates the percentage of hydrolysis of lactose, in a similar manner in table 1
  • sucrose is completely hydrolyzed into glucose + fructose, whatever the pH among the four pH values tested,
  • sucrose is completely hydrolyzed, as soon as the pH is less than or equal to 2.5.
  • lactose hydrolysis does not take place, or only little, unless a very acidic pH is adopted, at most 2.
  • the strain of fungus used in the following examples is described in patent WO2015/193587: it is the variant referenced 130G9 (SEQ ID No. 7 in nucleic acid, SEQ ID No. 8 in polypeptide in Table 1 of this patent) of Trichoderma reesei. It will subsequently be referred to as “the strain”. It does not have the invertase gene and does not have the ability to assimilate sucrose.
  • the preculture phase of the strain is carried out as follows: The strain is precultured in a Fernbach for 72 h at 30°C and stirred at a stirring speed of 150 rpm.
  • composition of the preculture medium is composition of the preculture medium
  • cornsteep (corn proteins), commercially available from the company Roquette under the trade name Solulys.
  • the mineral medium (called “4N medium”) has the following composition: KOH 1.66 g/L, H3PO4 85% 2 mL/L, (NH 4 ) 2 SO 4 2.8 g/L, MgSO 4 , 7 H 2 O 0.6 g/L, CaCl 2 0.6 g/L, MnSO 4 3.2 mg/L, ZnSO 4 , 7 H 2 O 2.8 mg/L, CoCI 2 10 H 2 O 4.0 mg/L, FeSO 4 , 7 H 2 O 10 mg/L
  • the pH is adjusted to 5 with soda before sterilization.
  • the preculture is transferred into 4 1.5 L mechanically stirred bioreactors of the CSTR type (Anglo-Saxon acronym for “continuous stirred-tank reactor”, that is to say a continuous stirred tank reactor), with a volume of seeding of 10% (v/v).
  • composition of the culture medium :
  • the pH is maintained at 4.4 by the addition of a 5.5 N ammonia solution.
  • the pO 2 concentration of dissolved O 2 expressed in relation to the saturation concentration
  • the temperature is stabilized at 27°C.
  • the production phase After consumption of glucose, the production phase begins with induction with the continuous addition of a sugar solution at approximately 400 g/kg, at a flow rate of 1.25 mL/h.
  • the pH is regulated at 4 and the temperature at 25°C.
  • Fed-batch solutions are prepared by dissolving lactose and sucrose or glucose in a solution of hemicellulosic hydrolyzate from straw pretreated by steam explosion under acidic conditions.
  • This hemicellulosic hydrolyzate called “BHS 7.3” juice, is obtained after washing a straw pretreated with water at 185°C for 5 minutes after impregnation with sulfuric acid (acidity of 1.8%).
  • MS for Dry Matter corresponds to the solid part of a liquid/solid mixture which is soluble in the liquid + the solid part insoluble in the liquid in question
  • MSI for Insoluble Dry Matter, only includes the solid part insoluble in the liquid/solid mixture.
  • a 1 kg solution was prepared by dissolving, in 450 g of BHS 7.3 juice, 330 g of glucose monohydrate, 120 g of water and 100 g of lactose (lactose as inducing substrate). The dissolution is done in a beaker at room temperature using a magnetic bar. The solution obtained is not sterilized. This is the positive control.
  • Example 3 Heating sucrose + C5 juice to hydrolyze it then adding lactose to the solution (without sterilization)
  • a solution of 900 g was prepared by dissolving, in 450 g of BHS 7.3 juice, 300 g of sucrose + 150 g of water, then the solution was heated at 110° C. for 20 minutes, then added in no condition.
  • a 1 kg solution was prepared by dissolving, in 450 g of water, 300 g of sucrose, 150 g of water and 100 g of lactose, then heating (autoclaving) at 120°C and 20 minutes of the solution.
  • the solution is sterile. There is therefore no bringing the sucrose into contact with an acidic medium prior to its introduction into the bioreactor.
  • the fed-batch solution is maintained at room temperature.
  • Cellulolytic activities are determined by:
  • the UPF activity is measured on Whatman No. 1 paper (Procedure recommended by the IUPAC biotechnology commission) at the initial concentration of 50 g/L: the test portion of the enzymatic solution to be analyzed is determined which releases the equivalent of 2 g/L of glucose (colorimetric dosage) in 60 minutes.
  • the principle of the filter paper activity is to determine by DNS (dinitrosalicylic acid) dosage the quantity of reduced sugars from Whatman N°1 paper.
  • aryl p-glucosidase activity is p-nitrophenyl-B-D-glucopyranoside (PNPG). It is cleaved by B-glucosidase which releases p-nitrophenol.
  • One unit of aryl p-glucosidase activity is defined as the amount of enzyme required to produce 1 pmol of p-nitrophenol from PNPG per minute and is expressed in lU/mL.
  • the specific activities are obtained by dividing the activities expressed in lU/mL by the protein concentration. They are expressed in lU/mg. The cultures progressed well until the end of the experiments.
  • Figure 1 represents the monitoring of the concentration in g / 1 of mushrooms in the bioreactor as a function of time in hours.
  • the curve with diamonds corresponds to example 1 (control)
  • the curve with triangles corresponds to example 3
  • the curve with solid circles to example 4 comparative
  • sucrose hydrolyzed without heating it produces fewer enzymes than the other examples, but in comparable quantities with them, which is surprising. Looking at the final dosages of residual sugar, we see that there is an accumulation of sucrose during the time not consumed, which explains the lower production performance. However, if the sucrose was not hydrolyzed at all in the fed-batch solution, the final sucrose concentration would have been theoretically equal to 86 g/L (instead of 27 g/L), because the strain tested does not have does not invertase and is therefore unable to consume sucrose. The final sugar dosage of the fed-batch solution maintained at room temperature throughout the experiment after 215 hours ultimately contains very little sucrose: 50 g/L instead of the 350 g/L added initially.
  • the acidic pH of the fed-batch solution allowed the hydrolysis of sucrose, just like when hydrolysis is carried out with heating (sterilization), but at a slower rate.
  • the curve with circles corresponds to the evolution of the sucrose concentration in the fed-batch solution measured in its storage tank (in fluid connection with the bioreactor in order to supply it).
  • the curve with squares corresponds to the theoretical sucrose accumulation in the bioreactor.
  • the curve with triangles corresponds to the accumulation of sucrose measured in the bioreactor.
  • sucrose only hydrolyzes in the tank where the fed-batch solution is, and not in the bioreactor which is at pH 4, and using the measurement of the accumulation of sucrose over time in the bioreactor, we can thus estimate the kinetics of sucrose hydrolysis in the fed-batch solution.
  • Table 5 groups together for examples 1 to 5 the specific enzyme production rates q p . This is calculated by dividing the protein production rate expressed in g/L/h by the microorganism concentration (as is known to those skilled in the art). They are of the same order for the fermentations of examples 1 to 4, but approximately 2 times lower for example 5, which indicates that the lack of assimilable sugar did not make it possible to obtain good production performance.
  • HPLC analysis of the fed-batch solutions at the end of fermentation confirms that the lactose of Example 4 has not been degraded (concentration “100 g/L), after autoclaving or without autoclaving, and that the sucrose is completely hydrolyzed into glucose and fructose after autoclaving, thanks to the strongly acidic pH of the solution, equal to 2.9.
  • Example 2 An additional experiment was carried out by preparing a fed-batch solution similar to that of Example 2. This solution was divided into two parts: a part incubated at 20°C for 215 hours, and a part incubated at 50°C. C for 215 hours. It appears that after 24 h at 50°C, all the sucrose is hydrolyzed, while 60% of the sucrose is hydrolyzed after 215 h at 20°C.
  • the invention consisting of hydrolyzing sucrose in an acidic medium makes it assimilable by the mushroom strain without having to modify it genetically to add the invertase gene.
  • this hydrolysis is favored/accelerated by heating, either at a moderate temperature or at a higher temperature, particularly if it is also necessary to sterilize the substrate solution before bringing it into contact with the strain.
  • the invention offers great flexibility of implementation,

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques par un microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique, ledit procédé comprenant au moins - a) une phase de croissance du microorganisme en présence d'au moins un substrat carboné, puis - b) une phase de production des enzymes en présence d'au moins un substrat inducteur, et également : - c) une phase de préparation d'un substrat carboné comprenant du glucose et/ou du fructose, substrat carboné qu'on utilise dans l'une et/ou l'autre des phases a) de croissance et b) de production, ladite phase de préparation comprenant une étape c1) d'hydrolyse en milieu aqueux acide de saccharose en glucose et fructose.

Description

Description
Titre : Procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques
Domaine technique
La présente invention concerne la production des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, notamment dans le cadre de la production de sucres à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques faisant intervenir une hydrolyse enzymatique de ces matériaux. Les sucres peuvent être utilisés/valorisés tels quels ou poursuivre leur conversion en alcool, notamment en éthanol, par fermentation.
Technique antérieure
Depuis les années 1970, la transformation de matériaux lignocellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de très nombreux travaux. On peut citer par exemple les travaux de référence du National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economies for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, May 201 1 ).
Les matériaux lignocellulosiques sont des matériaux cellulosiques, c'est-à-dire constitués à plus de 90% poids de cellulose, et/ou lignocellulosiques, c'est-à-dire constitués de cellulose et d’hémicelluloses, qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses, ainsi que de lignine, qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, à base de composés phénoliques. Par soucis de concision, on pourra dans le présent texte les regrouper sous le terme générique de biomasse.
Le bois, les pailles, les rafles de maïs sont les matériaux lignocellulosiques les plus utilisés, mais d'autres ressources, cultures forestières dédiées, résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, produits et résidus de l'industrie papetière et des produits de transformation des matériaux lignocellulosiques sont utilisables. Ils sont constitués pour la plupart d'environ 35 à 50 % de cellulose, de 20 à 30 % d'hémicellulose et de 15 à 25 % de lignine.
Le procédé de transformation biochimiques des matériaux lignocellulosiques en sucres puis éventuellement en éthanol comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique utilisant un cocktail enzymatique. Il peut se poursuivre par une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés, la fermentation éthanolique et l’hydrolyse enzymatique pouvant être conduites simultanément, et d'une étape de purification de l'éthanol. Un exemple d’un tel procédé convertissant de la biomasse en éthanol est décrit dans le brevet EP 3 484 945, auquel on pourra se reporter pour plus de détails.
Le cocktail enzymatique utilisé pour l’hydrolyse est un mélange d’enzymes cellulolytiques (également appelées cellulases) et/ou hémicellulolytiques. Les enzymes cellulolytiques présentent trois grands types d'activités : endoglucanases, exoglucanases et cellobiases, ces dernières étant également appelées p glucosidases. Les enzymes hémicellulolytiques présentent notamment des activités xylanases.
L'hydrolyse enzymatique est efficace et s'effectue dans des conditions douces. En revanche, le coût de production des enzymes reste très élevé, pouvant représentant au moins 20 % du coût de conversion de la biomasse en éthanol par exemple. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : l’optimisation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant les microorganismes hyperproducteurs et en améliorant les procédés de production desdites enzymes, la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant l’étape de prétraitement, en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes, et en optimisant la mise en oeuvre de l’étape d’hydrolyse enzymatique.
Le microorganisme cellulolytique le plus utilisé pour la production industrielle du cocktail enzymatique est le champignon Trichoderma reesei. Les souches sauvages ont la faculté de sécréter, en présence d'un substrat carboné inducteur, la cellulose par exemple, le cocktail enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux lignocellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat carboné inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du cocktail enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase.
Des souches recombinantes ont été obtenues à partir des souches de Trichoderma reesei Qm9414 (Mandels M. (1975). Microbial sources of cellulase. Biotechnol. Bioeng.5, 81 -105), RutC30 (Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782), CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50) en clonant des gènes hétérologues, l'invertase d' Aspergillus niger par exemple, pour diversifier la source de carbone nécessaire à la production de cellulases et/ ou surexprimant la p-glucosidase afin d'améliorer le rendement d'hydrolyse enzymatique, les Pglucosidases étant considérées comme les enzymes limitantes dans la réaction. Ces souches ont conservé leur hyperproductivité et leur aptitude à être cultivées en fermenteur.
L’incorporation de l’invertase à Trichoderma lui confère la propriété de pouvoir consommer le saccharose, et donc des effluents comprenant des jus sucrés issus des lavages de betteraves ou de cannes à sucre, et/ou des mélasses de sucrerie, dont le coût est moindre et/ou la disponibilité plus grande. C’est ce qui a été vérifié, par exemple, dans le brevet EP 2 222 865.
Le lactose et le glucose restent, dans un procédé de production industriel de cocktail enzymatique, parmi les substrats carbonés les plus appropriés. Leur coût, notamment celui du glucose, est élevé et est susceptible de varier cependant de manière importante. Le procédé de production de cocktail enzymatique se trouve également dépendant de sources de carbone extérieures.
De ce fait, l'utilisation de substrats carbonés issus du procédé de conversion biochimique de matériaux lignocellulosiques est une voie intéressante, et il a été ainsi proposé dans le brevet WO 2013/190214 un procédé de production d’enzymes comprenant une phase de croissance des microorganismes en présence d’un substrat carboné de croissance, puis une phase de production des enzymes avec un substrat carboné inducteur sous forme d’un résidu liquide issu d’un prétraitement de matériau lignocellu losique comprenant des sucres en C5.
La logique économique actuelle veut que les sites de production de biocarburants de seconde génération puissent être les mêmes que ceux de production de première génération, l’ensemble constituant une "bioraffinerie" où l’intégralité du matériau végétal est valorisée. Ainsi, en partant d’une plante sucrière, on cherche à valoriser la canne à sucre et les résidus lignocellulosiques de canne, et des effluents contenant du saccharose peuvent être disponibles sur site.
Ce n’est cependant pas la seule voie d’amélioration possible dans la production d’enzymes, et elle peut présenter certains inconvénients, ou tout au moins des limitations dans son application. Ainsi, elle impose généralement, de fait, que la production d’enzymes ait lieu dans l’installation de conversion de biomasse, ce qui n’est pas toujours le cas rencontré/envisagé. Ensuite, elle prélève une partie des sucres, destinée, dans le procédé de conversion de la biomasse, à être valorisée/convertie par ailleurs. Enfin, ce liquide sucré peut ne pas suffire à assurer à lui seul à la fois la croissance du champignon et sa production en enzymes : ces sucres doivent être complémentés, notamment par un substrat inducteur comme le lactose, dans la phase de production des enzymes. Le but de l’invention est alors d’améliorer un procédé de production d’enzymes, notamment en remédiant aux inconvénients précités, en cherchant notamment à simplifier le procédé, à en réduite les coûts, à le rendre plus flexible dans sa mise en oeuvre industrielle.
Résumé de l’invention
L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques par un microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique, ledit procédé comprenant au moins
- a) une phase de croissance du microorganisme en présence d’au moins un substrat carboné, puis
- b) une phase de production des enzymes en présence d’au moins un substrat inducteur, ledit procédé comprenant également :
- c) une phase de préparation d’un substrat carboné comprenant du glucose et/ou du fructose, substrat carboné qu’on utilise dans l’une et/ou l’autre des phases a) de croissance et b) de production, ladite phase de préparation comprenant une étape c1 ) d’hydrolyse en milieu aqueux acide de saccharose en glucose et fructose.
L’invention a cherché à exploiter une source de substrat carbonée, le saccharose, pour remplacer le glucose, car le saccharose est un composé moins onéreux et d’un prix plus stable que celui du glucose, et similaire dans ses propriétés sucrantes. En effet, le saccharose est un disaccharide composé de molécules de glucose et de fructose combinées via une liaison glycosidique Mais un simple remplacement du glucose par du saccharose ne suffit pas : en effet, le saccharose n’est pas assimilable tel quel par des microorganismes du type champignons filamenteux comme Trichoderma, car ces microorganismes ne sont naturellement pas dotés du gène de l’invertase.
Une première solution peut consister à modifier génétiquement les microorganismes pour les doter de ce gène. La publication de Lucas Miranda Fonseca and al. « Rational engineering of the Trichoderma reesei RUT-C30 strain into an industrially relevant platform for cellulase production” publiée dans la revue Biotechnology for biofuels (2020) propose ainsi d’apporter plusieurs modifications génétiques sur la souche RUT-C30 de T. reesei, permettant notamment l’expression du gène de l’invertase, et donc de pouvoir recourir au moins en partie à du saccharose comme substrat carboné dans le procédé de production d’enzymes à partir de cette souche modifiée. Si cette technique de modification génétique ciblée est efficace, elle est complexe à mettre en oeuvre, et doit être répétée dès que l’on veut changer de souche. L’invention a donc consisté non pas à modifier les souches, mais à modifier le saccharose pour le rendre assimilable. Cette modification est une hydrolyse acide, qui permet de couper la liaison glycosidique de la molécule pour qu’elle se décompose en glucose et fructose, tous deux assimilables par les microorganismes visés par l’invention.
Avantageusement, le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique d’intérêt pour l’invention est choisi parmi les microorganismes dépourvus du gène de l’invertase et capables de consommer du glucose et/ou du fructose : on peut donc utiliser dans l’invention des souches non modifiées, ou, plus précisément, non modifiées pour les rendre capables d’assimiler le saccharose. Les microorganismes visés par l’invention sont de préférence des microorganismes de type champignon, notamment de type champignon filamenteux.
Le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique peut être choisi pour mettre en oeuvre l’invention parmi les souches de champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium ou Schizophyllum, et appartenant de préférence à l’espèce Trichoderma reesei.
Avantageusement, on obtient, à l’issue de la phase c) de préparation, une solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose qui est utilisable directement ou après d’éventuelles opérations de type ajustement de concentration (ou autre traitement type filtration...) comme substrat carboné à l’étape a) de croissance et/ou b) de production.
L’hydrolyse peut être totale, ou partielle : dans ce cas, une quantité (faible) de saccharose peut être encore présente dans la solution obtenue en fin d’hydrolyse.
Selon un mode de réalisation, on peut ajouter au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, à la solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose obtenue à l’issue de la phase c) de préparation, pour utiliser ladite solution comme substrat à l’étape b) de production. On a ainsi une solution de substrat carboné prête à l’emploi pour l’étape b) de production, avec un mélange de substrats inducteurs et non inducteurs. Elle peut aussi être utilisée pour l’étape a), le lactose pouvant aussi être utilisé comme substrat carboné de croissance. Dans ce cas, on n’a plus qu’une seule solution venant alimenter le bioréacteur pour les deux étapes, ce qui simplifie sa préparation, son stockage et son mode d’introduction dans le bioréacteur.
A noter que le procédé selon l’invention peut mettre en oeuvre les étapes a) de croissance et b) de production dans un même bioréacteur. Alternativement, il peut être mis en oeuvre avec un premier bioréacteur dédié à l’étape a) de croissance, et un deuxième bioréacteur dédié à l’étape b) de production. Selon un autre mode de réalisation, on peut ajouter au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, au milieu aqueux acide pendant l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose. L’intérêt est que le lactose est un disaccharide, comme le saccharose, mais qui est la combinaison d’un glucose et d’un galactose via une liaison glycosidique, qui est assimilable par les souches de champignon visées par l’invention. Or les inventeurs ont montré que le lactose est nettement plus difficile à hydrolyser en conditions acides que le saccharose. Quand bien même une faible part de lactose s’hydrolyserait, le glucose et le galactose résultant de son hydrolyse sont également assimilables par les souches.
Ce mode de réalisation peut se combiner au précédent, en ajoutant le substrat inducteur en partie pendant l’hydrolyse, en partie à la fin de l’hydrolyse.
A noter également qu’en fin d’hydrolyse, la solution aqueuse obtenue peut être utilisée immédiatement, dans l’installation de production d’enzymes. Elle peut aussi être stockée pour une utilisation ultérieure, et l’hydrolyse peut avantageusement se poursuivre pendant le stockage au besoin, généralement à température ambiante, la solution étant de préférence maintenue à un pH acide jusqu’à utilisation pour limiter les risques de contamination.
Selon une première variante, on peut réaliser l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à pH inférieur ou égal à 5, notamment inférieur ou égal à 4, notamment inférieur ou égal à 3,5 ou 3, de préférence compris entre 1 et 3.
Pour obtenir un milieu d’hydrolyse à pH acide, on ajoute par exemple un acide fort, de type acide chlorhydrique ou acide sulfurique, à une solution aqueuse en quantité suffisante pour régler le pH de la solution à la valeur choisie.
Alternativement, on peut ajouter un acide faible de type acide organique.
Une autre alternative encore peut être d’acidifier la solution aqueuse en y introduisant du gaz carbonique CO2 sous forme gazeuse (bullage) : c’est en effet un acide (faible) et il est issu de la fermentation des sucres en alcool dans le processus de conversion de biomasse en alcool. Il est donc disponible si la production d’enzymes se fait sur le site de conversion de biomasse.
Il est également possible de cumuler entre elles deux au moins de ces différentes alternatives : ajout dans une solution aqueuse d’au moins un acide fort, d’au moins un acide faible, introduction de CO2.
Avantageusement, notamment avec cette première variante, on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 1 10°C, notamment compris entre 110 et 125°C, notamment entre 110 et 120°C, afin d’assurer également la stérilisation dudit milieu. En effet, l’hydrolyse est accélérée si l’on chauffe le milieu dans lequel on opère l’hydrolyse, mais pas nécessairement à de si hautes températures. Mais procéder à l’hydrolyse à au moins 110°C permet de réaliser en même temps la stérilisation de la solution, ce qui est nécessaire pour son introduction dans le procédé de production d’enzymes. Il est alors avantageux, comme évoqué plus haut, d’ajouter un ou plusieurs substrats inducteurs, comme le lactose, à ce milieu avant stérilisation, ce qui permet d’introduire la solution stérile comprenant tous les substrats nécessaires dans le bioréacteur (et ce qui évite donc de devoir opérer une stérilisation à part du ou des substrats inducteurs).
Dans une deuxième variante, on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide comportant au moins pour partie, notamment seulement, un hydrolysat hémicellulosique acide.
Avantageusement, cet hydrolysat hémicellulosique est issu d’une étape de prétraitement acide d’une biomasse lignocellulosique, et il comporte des monomères et oligomères de sucres majoritairement en C5. Contrairement au brevet WO 2013/1900214 précité, cet hydrolysat n’est pas utilisé ici directement corne substrat carboné, mais d’abord comme offrant un milieu (fortement) acide pour l’hydrolyse préalable du saccharose. A noter que cet hydrolysat est acide, car le prétraitement de biomasse dont il est issu comprend de préférence une étape d’imprégnation acide, comme un exemple est décrit dans le brevet EP 3 484 945 précité.
On obtient ainsi en final une solution contenant les sucres en C5 de l’hydrolysat, qui sont assimilables par les souches (microorganismes), et du glucose et du fructose issus de l’hydrolyse du saccharose (et éventuellement aussi du saccharose non hydrolysé). Cette variante est très intéressante par sa flexibilité : on peut doser la proportion de sucres en C5 et la proportion de glucose/fructose de la solution obtenue en final, en dosant la quantité d’hydrolysat et la quantité de saccharose ajoutée à celui-ci, en fonction de la disponibilité de l’un et de l’autre des sources de carbone.
Il y a un autre avantage à utiliser un hydrolysat comme milieu acide d’hydrolyse du saccharose : on peut réaliser l’hydrolyse en chauffant la solution, pour l’accélérer/l’amplifier, mais jusqu’à des températures moindres que dans le cas de la première variante : ainsi, on peut réaliser l’étape c1 ) d’hydrolyse à une température inférieure ou égale à 100°C, notamment inférieure ou égale à 80°C, notamment entre 30 et 60°C, car il n’est plus nécessaire de procéder à la stérilisation de la solution obtenue avant de l’utiliser. En effet, les hydrolysats hémicellulosiques sont des milieux acides, qui contiennent des sucres, mais aussi des inhibiteurs générés lors du prétraitement acide de la biomasse, tels que l’acide acétique, le furfural, le 5-HMF ou encore des composés phénoliques, ce qui limite fortement les risques de contamination.
On peut aussi combiner les deux variantes, en utilisant comme milieu d’hydrolyse acide un hydrolysat hémicellulosique éventuellement dilué, concentré, ... et en y ajoutant un acide ou du CO2.
On voit qu’on peut ajuster au mieux le taux d’hydrolyse du saccharose pendant l’étape d ) en jouant sur les conditions opératoires, à savoir en ajustant le pH du milieu à un pH plus ou moins acide (par ajout d’acide et/ou d’hydrolysat à concentration variable) et/ou en ajustant la température à laquelle est opérée l’hydrolyse et/ou en ajustant la durée de l’hydrolyse.
Selon l’invention, on peut sélectionner différentes conditions opératoires, notamment selon la variante choisie. La température à laquelle s’opère l’hydrolyse, ainsi que le pH du milieu dans laquelle elle s’opère et la durée de l’hydrolyse sont les conditions opératoires les plus significatives. De façon générale, on a constaté que l’hydrolyse s’opère d’autant plus rapidement que la température est élevée et que le pH est faible.
Selon un premier mode de réalisation, on peut réaliser l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 1 10°C, à un pH d’au plus 5 et pendant une durée de préférence comprise entre 10 minutes et 10 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la première variante, où il est nécessaire de stériliser le milieu, ou quand une hydrolyse (très) rapide est souhaitée. Et on note que dans ce cas, où la température est élevée, on peut adopter un pH un peu moins acide qu’avec une température moins élevée (quand on ne cherche pas à stériliser).
Selon un deuxième mode de réalisation, on peut réaliser l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au plus 100°C, notamment comprise entre 30 et 60°C, à un pH d’au plus 4, et pendant une durée de préférence comprise entre 1 heure et 24 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la deuxième variante, notamment dans le cas où il est souhaité d’avoir une durée d’hydrolyse relativement rapide.
Selon un troisième mode de réalisation, on peut réaliser réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température comprise entre 10 et 30°C, à un pH d’au plus 4 et pendant une durée de préférence de plus de 24 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la deuxième variante, notamment dans le cas où l’hydrolyse peut être réalisée sur une durée longue. Ici, il n’est donc pas nécessaire de chauffer le milieu d’hydrolyse. C’est un mode de réalisation intéressant quand on a une cuve de stockage du saccharose dans lequel on peut laisser l’hydrolyse s’effectuer jusqu’à utilisation, à température ambiante (par alimentation du bioréacteur où s’effectue la production d’enzymes).
Liste des figures
[Fig 1]
La figure 1 représente l’évolution de la concentration en biomasse (dans les exemples suivants, ce sont les microorganismes sous forme de champignons) au cours du temps dans un procédé de production d’enzymes avec différentes solutions de substrat carboné, (en abscisse, la durée en heure, en ordonnée la quantité de biomasse en g/l).
[Fig 2]
La figure 2 représente l’évolution de la concentration en enzymes au cours du temps dans un procédé de production d’enzymes avec différentes solutions de substrat carboné (en abscisse, la durée en heure, en ordonnée la quantité d’enzymes en g/l).
[Fig 3]
La figure 3 représente l’évolution de la concentration en saccharose au cours du temps : en abscisse, la durée en heure, en ordonnée à gauche du graphe l’estimation de la quantité de saccharose dans la solution de fed-batch en g/l, et en ordonnée à droite du graphe l’estimation de la quantité de saccharose dans le bioréacteur où sont opérées à la fois l’étape de croissance des microorganismes et l’étape de production des enzymes, en g/l.
Description des modes de réalisation
Tests d’hydrolyse de saccharose en milieu acide
Il a d’abord été procédé à des tests d’hydrolyse préliminaires de saccharose et de lactose (à titre de comparaison), dans des solutions aqueuses d’acide sulfurique à différents pH et différentes températures, selon la première variante de l’invention.
Le mode opératoire est le suivant :
3 solutions à environ 220 g/L sont préparées avec :
- 100% saccharose : solution appelée « pur saccharose » dans les tableaux suivants
- 100% lactose : solution appelée « pur lactose » dans les tableaux suivants
- 75% saccharose + 25% poids lactose : solution appelée « en mélange » dans les tableaux suivants
Les solutions sont séparées en quatre, et le pH est ajusté avec de l'acide sulfurique, en visant les quatre pH suivants : 1 ,5 ; 2,0 ; 2,5- ; 3,0. On prend un aliquot puis on sépare en deux chacune des 4 solutions pour tester deux conditions de stérilisation : (la stérilisation ici se fait en même temps que l’hydrolyse des disaccharides).
- conditions (1 ) : 1 10°C pendant 35 minutes - conditions (2) :121 °C pendant 20 minutes
Les résultats sont les suivants :
Après stérilisation, on observe visuellement une coloration des solutions pour des pH inférieurs à 2,0, que ce soit avec le saccharose ou avec le lactose, et quelles que soient les conditions (1 ) ou (2) choisies. On dose les sucres résiduels après stérilisation/hydrolyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC selon l’acronyme anglo-saxon)
Ces résultats sont détaillés dans les deux tableaux ci-dessous :
- le tableau 1 indique le pourcentage d’hydrolyse du saccharose pour les différentes solutions, selon qu’elles ont été stérilisées selon les conditions (1 ) ou (2) - le tableau 2 indique le pourcentage d’hydrolyse du lactose, de façon analogue au tableau 1
[Table 1]
[Table 2]
On constate que :
- à 121 °C, avec les conditions (2), le saccharose est totalement hydrolysé en glucose + fructose, quel que soit le pH parmi les quatre valeurs de pH testées,
- à 110°C, avec les conditions (1 ), le saccharose est totalement hydrolysé, dès que le pH est inférieur ou égal à 2,5.
Ces tests démontrent donc qu’on peut hydrolyser en totalité ou en quasi-totalité du saccharose en milieu acide, en choisissant un pH fortement acide (au plus 5, de préférence au plus 4, de préférence au plus 3,5 ou 3), une température élevée permettant de réaliser la stérilisation en même temps, et cela dans une durée de 20 minutes, donc de façon rapide.
On constate aussi que l’hydrolyse du lactose ne se fait pas, ou peu, sauf à adopter un pH très acide, d’au plus 2.
Exemples
On décrit tout d’abord le procédé de production d’enzymes utilisé pour illustrer l’invention à l’aide des exemples qui vont suivre.
Ces exemples concernent la deuxième variante de l’invention avec hydrolyse du saccharose par un hydrolysat hémicellulosique (appelé aussi « jus de sucres en C5 » ou « jus de C5 »).
La souche
La souche de champignon utilisée dans les exemples suivants est décrite dans le brevet WO2015/193587 : c’est le variant référencé 130G9 (SEQ ID No. 7 en acide nucléique, SEQ ID No. 8 en polypeptide dans le tableau 1 de ce brevet) de Trichoderma reesei. Elle sera désignée par la suite par le terme « la souche ». Elle ne possède pas le gène de l’invertase et n’a pas la capacité d’assimiler le saccharose.
La phase de préculture La phase de préculture de la souche est réalisée de la façon suivante : La souche est mise en préculture dans un Fernbach pendant 72 h à 30°C et sous agitation à une vitesse d’agitation de 150 rpm.
Composition du milieu de préculture :
Dans un Fernbach :
- 62, 5mL de milieu 4N (composition donnée ci-dessous)
- 1 ,25g de phtalate de dipotassium
- 1 g de « cornsteep » (protéines de maïs), disponible commercialement auprès de la société Roquette sous la dénomination commerciale Solulys.
- quantité suffisante : 200 mL d’eau distillée
Le milieu minéral (dit « milieu 4N ») a la composition suivante : KOH 1 ,66 g/L, H3PO4 85 % 2 mL/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/L, CaCI2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/L, CoCI2 10 H2O 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H2O 10 mg/L
Le pH est ajusté à 5 avec de la soude avant stérilisation.
Dans une fiole séparée :
- 8,5 g de glucose dans 50 mL d’eau distillée
Les cultures en bioréacteurs :
La phase de croissance
La préculture est transférée dans 4 bioréacteurs de 1 ,5 L agités mécaniquement de type CSTR (acronyme anglo-saxon pour « continuous stirred-tank reactor », c’est-à-dire un réacteur à cuve agitée continue), avec un volume d’ensemencement de 10% (v/v).
Composition du milieu de culture :
- 400 mL de milieu 4N
- 320 mL de glucose à 37,5 g/L soit une concentration initiale en glucose de 15g/L
- 1 g de cornsteep Roquette
- 80 mL issus de la préculture en Fernbach
Le pH est maintenu à 4,4 par l’ajout d’une solution d'ammoniaque à 5,5 N. La pO2 (concentration en O2 dissous exprimée par rapport à la concentration à saturation) est régulée à 40% par l’agitation. La température est stabilisée à 27°C.
La phase de production Après consommation du glucose, la phase de production démarre par l’induction avec l’ajout en continu d’une solution de sucre à environ 400 g/kg, à un débit de 1 ,25 mL/h. Le pH est régulé à 4 et la température à 25°C.
Les solutions de fed-batch sont préparées en dissolvant du lactose et du saccharose ou du glucose dans une solution d’hydrolysat hémicellulosique issu d’une paille prétraitée par explosion à la vapeur en conditions acides. Cet hydrolysat hémicellulosique, dit jus « BHS 7.3 », est obtenu après lavage à l’eau d’une paille prétraitée à 185°C pendant 5 minutes après imprégnation à l’acide sulfurique (acidité de 1 ,8%).
La composition du jus BHS 7.3 est donnée dans le tableau 3 ci-dessous.
L’acronyme MS pour Matière Sèche correspond à la partie solide d’un mélange liquide/solide qui est soluble dans le liquide + la partie solide insoluble dans le liquide en question
L’acronyme MSI, pour Matière Sèche Insoluble, ne comprend que la partie solide insoluble dans le mélange liquide/solide.
[Table 3]
Les compositions des solutions sont détaillées ci-dessous :
Exemple 1 : Témoin avec glucose + lactose (non stérilisé)
On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 330 g de glucose monohydrate, 120 g d’eau et 100 g de lactose (le lactose en tant que substrat inducteur). La dissolution se fait dans un bêcher à température ambiante à l’aide d’un barreau aimanté. La solution obtenue n’est pas stérilisée. Il s’agit du témoin positif.
On comprend par « température ambiante » dans tout le présent texte une température comprise usuellement entre 10 et 30°C, généralement entre 15 et 25°C, et dans le cas présent vers 20°C.
Exemple 2 : Utilisation du saccharose + lactose (sans stérilisation) On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose, 150 g d’eau et 100 g de lactose. Il n’y a pas d’étape de chauffage pour hydrolyser le saccharose à pH acide. La solution de fed-batch est maintenue à température ambiante. Celui-ci va s’hydrolyser partiellement et lentement tout au long des 215 heures d’expérience.
Exemple 3 : Chauffage saccharose+ jus de C5 pour l’ hydrolyser puis ajout lactose à la solution (sans stérilisation)
On a préparé une solution de 900 g en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose + 150 g d’eau, puis on chauffe la solution à 1 10°C pendant 20 minutes, puis on ajoute en condition non stérile 100 g de lactose.
Exemple 4 : Utilisation du Saccharose et du lactose avec stérilisation
On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose + 150 g d’eau-i- 100 g de lactose, puis on procède à un chauffage (autoclavage) à 120°C et 20 minutes de la solution. La solution est stérile (limite les risques de contaminations) et le saccharose est hydrolysé en glucose et fructose.
Exemple 5 (comparatif) : Utilisation du saccharose + lactose sans hydrolyse acide du saccharose
On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g d’eau, 300 g de saccharose, 150 g d’eau et 100 g de lactose, puis on procède à un chauffage (autoclavage) à 120°C et 20 minutes de la solution. La solution est stérile. Il n’y a donc pas ici de mise en contact du saccharose avec un milieu acide préalablement à son introduction dans le bioréacteur. La solution de fed-batch est maintenue à température ambiante.
Le suivi
Sur les prélèvements effectués quotidiennement, les mesures suivantes ont été réalisées :
- Détermination de la biomasse par filtration sur membrane
- Dosage du sucre résiduel par HPLC
- Dosage des enzymes extracellulaires par la méthode de Lowry après précipitation au TCA et standard BSA, après séparation du microorganisme par filtration ou centrifugation
Les activités cellulolytiques sont déterminées par :
- L'activité papier filtre (UPF : unité papier filtre), qui permet de doser l'activité globale du cocktail enzymatique : endoglucanases et exoglucanases
- L'activité aryl p-glucosidase, pour les activités spécifiques.
L'activité UPF est mesurée sur papier Whatman n° 1 (Procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC) à la concentration initiale de 50 g/L : on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique à analyser qui libère l'équivalent de 2 g/L de glucose (dosage colorimétrique) en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage au DNS (acide dinitrosalicylique) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N°1 .
Le substrat utilisé pour déterminer l'activité aryl p-glucosidase est le p-nitrophenyl-B-D- glucopyranoside (PNPG). Il est clivé par la B-glucosidase qui libère le p-nitrophenol. Une unité d'activité aryl p-glucosidase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire 1 pmol de p-nitrophenol à partir de PNPG par minute et est exprimé en lU/mL.
Les activités spécifiques sont obtenues en divisant les activités exprimées en lU/mL par la concentration en protéines. Elles sont exprimées en lU/mg. Les cultures se sont bien déroulées jusqu’au terme des expérimentations.
La figure 1 représente le suivi de la concentration en g / 1 en champignons dans le bioréacteur en fonction du temps en heure. Le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, comprenant une première phase de croissance des champignons de 24 heures, avec une alimentation du bioréacteur en substrat carboné (que du glucose comme mentionné plus haut) en une fois, dite alimentation batch, puis une deuxième phase de production des enzymes, avec une alimentation du réacteur en substrat carboné dite alimentation n fed-batch, selon les compositions définies plus haut (alimentation progressive selon une fréquence d’ajouts donnée). La courbe avec les losanges correspond à l’exemple 1 (témoin), la courbe avec des carrés à l’exemple 2, la courbe avec les triangles correspond à l’exemple 3, la courbe avec des ronds pleins à l’exemple 4, et la courbe avec des ronds vides à l’exemple 5 (comparatif). La figure 2 représente le suivi de la concentration en g / 1 en enzymes, dans le bioréacteur en fonction du temps en heure, le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, avec les mêmes conventions que pour la figure 1 (24 heures de croissance, puis production) pour les exemples 1 à 5.
Pour les cinq fermentations, comme on le voit des figures 1 et 2, la production d’enzymes des exemples 3 et 4 avec saccharose hydrolysé avant l’expérience est identique à celle de l’exemple 1 qui est le témoin (avec glucose). Quant à l’exemple 5, on voit qu’il conduit à une production de champignons et d’enzymes bien moindres que les autres exemples, ce qui démontre que, dans ce cas, le saccharose non hydrolysé n’est pas assimilé par les champignons, et que la croissance des champignons et la production d’enzymes n’est due qu’à la présence de lactose dans la solution de fed-batch.
En ce qui concerne l’exemple 2, avec le saccharose hydrolysé sans chauffage: il produit moins d’enzymes que les autres exemples, mais cependant en quantité comparables avec eux, ce qui est surprenant. En regardant les dosages finaux du sucre résiduel, on constate qu’il y a une accumulation de saccharose au cours du temps non consommé, qui explique la moindre performance de production. Toutefois, si le saccharose n’était pas du tout hydrolysé dans la solution de fed-batch, la concentration finale en saccharose aurait été théoriquement égale à 86 g/L (au lieu de 27 g/L), car la souche testée ne possède pas l’invertase et n’est donc pas en mesure de consommer le saccharose. Le dosage final de sucres de la solution de fed-batch maintenue à température ambiante tout au long de l’expérience après 215 heures contient finalement très peu de saccharose : 50 g/L au lieu des 350 g/L ajoutés initialement.
Le pH acide de la solution de fed-batch a permis l’hydrolyse du saccharose, tout comme lorsqu’on procède à l’hydrolyse avec chauffage (stérilisation), mais à une vitesse plus lente.
La figure 3 représente, pour cet exemple 2, un graphe, avec en abscisse la durée en heure, en ordonné la concentration du saccharose dans la solution de fed-batch (à gauche du graphe) en g/l, et dans le bioréacteur (à droite du graphe) en g/l également, le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, avec les mêmes conventions que pour es figures 1 et 2 (24 heures de croissance, puis production)
La courbe avec des ronds correspond à l’évolution de la concentration en saccharose dans la solution de fed-batch mesurée dans sa cuve de stockage (en connexion fluidique avec le bioréacteur afin de l’alimenter).
La courbe avec des carrés correspond à l’accumulation de saccharose théorique dans le bioréacteur. La courbe avec des triangles correspond à l’accumulation de saccharose mesurée dans le bioréacteur.
En supposant que le saccharose ne s’hydrolyse que dans la cuve où est la solution de fed- batch, et non dans le bioréacteur qui est à pH 4, et en utilisant la mesure de l’accumulation de saccharose au cours du temps dans le bioréacteur, on peut ainsi estimer la cinétique d’hydrolyse du saccharose dans la solution de fed-batch.
On voit ainsi que, dans ces conditions, il a fallu environ une semaine pour hydrolyser totalement le saccharose dans sa cuve de stockage à température ambiante.
Les activités p-glucosidase et UFP spécifiques sont indiquées dans le tableau 4 ci-dessous pour les exemples 1 à 5. Elles sont toutes du même ordre, quelle que soit la fermentation, ce qui indique que les enzymes produites sont de qualité équivalente.
[Table 4]
Le tableau 5 ci-dessous regroupe pour les exemples 1 à 5 les vitesses spécifiques de production d’enzymes qp. Celle -ci est calculée en divisant la vitesse de production de protéines exprimée en g/L/h par la concentration en microorganisme (comme cela est connu de l’homme de l’art). Elles sont du même ordre pour les fermentations des exemples 1 à 4, mais environ 2 fois plus faible pour l’exemple 5, ce qui indique que le manque de sucre assimilable n’a pas permis d’obtenir de bonnes performances de production.
[Table 5]
L’analyse HPLC des solutions de fed-batch en fin de fermentation confirme que le lactose de l’exemple 4 n’a pas été dégradé (concentration « 100 g/L), après autoclavage ou sans autoclavage, et que le saccharose est totalement hydrolysé en glucose et fructose après autoclavage, grâce au pH fortement acide de la solution, égal à 2,9.
Une expérience complémentaire a été réalisée en préparant une solution de fed-batch analogue à celle de l’exemple 2. Cette solution a été divisée en deux parties : une partie incubée à 20°C pendant 215 heures, et une partie incubée à 50°C pendant 215 heures. Il apparaît qu’après 24 h à 50°C, tout le saccharose est hydrolysé, alors que 60% du saccharose est hydrolysé après 215 h à 20°C.
De ces différents exemples et résultats, on comprend que l’invention consistant à hydrolyser le saccharose en milieu acide permet de le rendre assimilable par la souche de champignon sans avoir à la modifier génétiquement pour lui adjoindre le gène de l’invertase. On comprend aussi que cette hydrolyse est favorisée/accélérée par un chauffage, soit à température modérée, soit à température plus élevée, notamment si on a également besoin de stériliser la solution de substrat avant de la mettre en contact avec la souche.
L’invention offre une grande flexibilité de mise en oeuvre,
- en utilisant deux types de milieu acide possible : fait par ajout d’acide, ou obtenu directement par un jus de sucres en C5 obtenu lors de la conversion de la biomasse, et qui est de fait au pH suffisamment acide pour cette hydrolyse,
- et en utilisant des conditions opératoires (notamment la température d’hydrolyse) différentes selon les besoins (haute température si stérilisation requise, température plus basse ou même à la température ambiante si on peut laisser l’hydrolyse se faire plus lentement, pH qui peut être choisi d’autant plus acide que la température est moins élevée...).

Claims

Revendications
1 . Procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques par un microorganisme cellulolytique et/ou hém icellu lolytique, ledit procédé comprenant au moins
- a) une phase de croissance du microorganisme en présence d’au moins un substrat carboné, puis
- b) une phase de production des enzymes en présence d’au moins un substrat inducteur, caractérisé en ce que ledit procédé comprend également :
- c) une phase de préparation d’un substrat carboné comprenant du glucose et/ou du fructose, substrat carboné qu’on utilise dans l’une et/ou l’autre des phases a) de croissance et b) de production, ladite phase de préparation comprenant une étape c1 ) d’hydrolyse en milieu aqueux acide de saccharose en glucose et fructose,
- le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique étant choisi parmi les microorganismes dépourvus du gène de l’invertase et capables de consommer du glucose et/ou du fructose, notamment des souches de champignons,
- et on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide comportant au moins pour partie un hydrolysat hémicellulosique acide.
2. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique est choisi parmi les souches de champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium ou Schizophyllum, et appartenant de préférence à l’espèce Trichoderma reesei.
3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on obtient, à l’issue de la phase c) de préparation, une solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose, et en ce qu’on utilise ladite solution, directement ou après d’éventuelles opérations de type ajustement de concentration, comme substrat carboné à l’étape a) de croissance et/ou b) de production.
4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’on ajoute au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, à la solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose obtenue à l’issue de la phase c) de préparation, notamment pour utiliser ladite solution comme substrat à l’étape b) de production.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on ajoute au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, au milieu aqueux acide pendant l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose.
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à pH inférieur ou égal à 5, notamment inférieur ou égal à 4, notamment inférieur ou égal à 3,5 ou 3, de préférence compris entre 1 et 3.
7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le pH acide du milieu aqueux acide de l’étape c1 ) d’hydrolyse est obtenu par ajout dans une solution aqueuse d’au moins un acide fort et/ou d’au moins un acide faible et/ou de gaz carbonique gazeux, notamment issu d’une fermentation.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on réalise l’étape c1) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 110°C, notamment compris entre 1 10 et 125°C, notamment entre 1 10 et 120°C, afin d’assurer également la stérilisation dudit milieu.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on réalise l’étape c1) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide comportant seulement un hydrolysat hémicellulosique acide.
10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’hydrolysat hémicellulosique est issu d’une étape de prétraitement acide d’une biomasse lignocellulosique, et en ce qu’il comporte des monomères et oligomères de sucres majoritairement en C5.
11 . Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que qu’on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse à une température inférieure ou égale à 100°C, notamment inférieure ou égale à 80°C, notamment entre 30 et 60°C, ou entre 10 et 30°C.
12. Procédé selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu’on réalise l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 110°C, à un pH d’au plus 5 et pendant une durée de préférence comprise entre 10 minutes et 10 heures.
13. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’on réalise l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au plus 100°C, notamment comprise entre 30 et 60°C, à un pH d’au plus 4, et pendant une durée de préférence comprise entre 1 heure et 24 heures.
14. Procédé selon l’une des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce qu’on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température comprise entre 10 et 30°C, à un pH d’au plus 4 et pendant une durée de préférence de plus de 24 heures.
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